Summary
Em situ bioindications permitem a determinação da adequação de um ambiente para as espécies ameaçadas de extinção do mexilhão. Descrevemos dois métodos baseados sobre a exposição juvenil dos mexilhões de pérolas de água doce em gaiolas para habitats Rio oligotróficas. Ambos os métodos são implementados nas variantes para águas abertas e ambientes de água hyporheic.
Abstract
Conhecimento de aptidão de habitat para mexilhões de água doce é um passo importante para a conservação deste grupo de espécies ameaçadas de extinção. Descreveremos um protocolo para a realização de testes in situ exposição juvenil dentro de bacias hidrográficas do Rio oligotróficas sobre períodos de um mês e três meses. Dois métodos (em ambas as modificações) são apresentados para avaliar a taxa de crescimento e sobrevivência de juvenis. Os métodos e modificações diferem em valor para a localidade de bioindicação e cada um tem seus benefícios, bem como limitações. O método de gaiola areia funciona com um grande conjunto de indivíduos, mas somente alguns dos indivíduos são medidos e os resultados são avaliados em massa. No método da gaiola de malha, os indivíduos são mantidos e medidos separadamente, mas um número baixo de individual é avaliado. A modificação de exposição de águas abertas é relativamente fácil de aplicar; Isso mostra o crescimento juvenil potencial dos sites e também pode ser eficaz para testes de toxicidade de água. A modificação de exposição dentro-cama precisa de uma alta carga de trabalho, mas está mais perto para as condições de um ambiente natural e juvenil e é melhor para relatar a real adequação das localidades. Por outro lado, são necessárias mais replicações esta modificação devido a sua variabilidade do ambiente de alta-hyporheic.
Introduction
A exposição de organismos experimentais em situ , com a subsequente avaliação de sua condição é uma maneira de obter informações sobre a qualidade ambiental e (especialmente) a adequação do local para uma espécie. Nos animais, tal uma bioindicação é aplicável principalmente para pequenos invertebrados que são capazes de viver em um espaço limitado limitado. Estágios jovens de moluscos bivalves (Bivalvia) são um grupo tal organismo adequado1.
Moluscos bivalves da família Unionidae são um componente muito importante dos ecossistemas aquáticos2. No entanto, estas espécies são muitas vezes em perigo crítico, especialmente em córregos e rios. Alguns deles são caracterizados como 'espécies guarda-chuva' cuja conservação está intimamente relacionada com a conservação do biótopo fluxo inteiro e que exigem uma abrangente abordagem3. Estes animais têm um ciclo de vida associado com muitos componentes do ambiente, da água química4,5 a mudanças nas populações de peixes que servem de hospedeiros de larvas de mexilhão6. Porque os juvenis de mexilhão geralmente representam uma fase crítica do ciclo de vida de mexilhão, a adequação do local para o seu desenvolvimento nesta fase é crucial para um desenvolvimento de população de espécies bem sucedidas em uma localidade.
O mexilhão pérola de água doce (FWPM, Margaritifera margaritifera; Unionida, Bivalvia) é um ocorrendo bivalves criticamente em perigo em riachos europeus oligotróficos. Seus números caíram drasticamente durante os 20 do séculoXIX em toda a área de ocorrência. Parece que o actual declínio na reprodução de espécies, na maioria das populações europeias centrais é principalmente causado pelo muito baixo para zero sobrevivência de juvenis durante os primeiros anos da sua vida. Presume-se que FWPMs juvenis vivem por muitos anos no hyporheic rasa zona7, dos quais as condições e a sua variabilidade ainda não estão bem descritos. Além disso, até o segundo ano de vida, os juvenis só têm uma dimensão de até cerca de 1 mm, então eles são muito difíceis de encontrar em grandes volumes de sedimentos sob condições naturais8. Portanto, experiências com juvenis em cativeiro são necessárias para o estudo de sua ecologia.
Dentro Checa plano de acção para Pearl bivalve9, existem milhares de juvenis crescente a cada ano a partir de um programa de reprodução seminaturais. No entanto, há uma pergunta de que as localidades e habitats são adequados para suporte de população bem sucedido por esses menores ou para reintrodução de espécies eventual. Em situ bioindications apresentar uma maneira de encontrar a resposta.
Apesar do fato de que as taxas de sobrevivência inconsistente de mexilhões juvenis em gaiolas de exposição foram observadas em alguns trabalhos anteriores que questionaram a adequação de mexilhões juvenis como bioindicadores10, vários estudos recentes têm confirmado o aplicabilidade dos métodos de exposição juvenil para qualidade de água teste11,12,13. Além disso, foi demonstrado que vários fatores precisam ser considerados ao interpretar os resultados destes estudos particulares, tais como a origem das ações14 e os efeitos persistentes de condições larval15.
Surge a questão de como instalar juvenis experimentais em localidades testadas e como mais efetivamente avaliar a sua condição. A primeira aplicação rigorosa em situ métodos de exposição com FWPMs juvenis foi publicada pela Buddensiek16. Indivíduos FWPM juvenis foram mantidos em gaiolas de folha, expostos na água fluindo livremente de fluxos, e sua sobrevivência e crescimento foram quantificados após várias semanas de exposição. A abordagem foi originalmente desenvolvida como um método de reprodução artificial semi, mas o autor também destacou sua aplicabilidade para a avaliação dos requisitos de habitat e qualidade da água. Embora a sobrevivência de juvenis de FWPM é naturalmente muito baixa na escala de meses/anos e apenas um número muito pequeno de animais vai sobreviver, a taxa de sobrevivência pode ser um bom marcador do efeito ambiental em uma escala de várias semanas16. Ao longo de anos de pesquisa, métodos de exposição foram desenvolvidos na sequência dos habitats de fluxo de mexilhão juvenil experimental espera e avaliar suas taxas de crescimento e sobrevivência; Estes incluem caixas de areia17, silos de mexilhão com base em um princípio de afloramento18e vários outros exposição gaiolas (resumidas por chiclete e colegas)11. Porque os juvenis ocorrem naturalmente em hyporheic superficial zona7, a aplicação de dispositivos experimentais dentro da parte inferior do fluxo é muito desejável.
Em nosso artigo, descrevemos o uso de dois dispositivos de exposição para FWPMs: eu) modificado gaiolas de folha de Buddensiek ("gaiolas de malha") também permitindo bioindicação testes em condições de hyporheal; e ii) caixas de areia Hruška ("gaiolas de areias"). O protocolo descreve a aplicação de ambos os métodos em condições de água e hyporheic abertos (ou seja, quatro variantes de exposição são descritos). Os métodos foram gradualmente modificados e expandidos ao longo de mais de 15 anos de aplicação dentro do plano de acção para a Checa para Pearl bivalve9 e verificados por um conjunto de experiências.
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Protocol
1. malha gaiola
Nota: Consulte a Figura 1.
- Preparar o material
- Preparar o material para a parte no laboratório da experiência: ~ 1-2 L de Rio de água por malha gaiola, gaiolas de malha (1 principal corpo de plástico, 2 tampas de plástico, 2 folhas de peneiras de técnicas especiais com 340 µm de poros, 4 parafusos e 4 porcas por gaiola), alicate , uma chave inglesa, pipetas Pasteur, um filtro, uma câmera digital, um trinocular dissecando zoom microscópio estéreo, uma grade de calibração (equipamento de microscópio), 5 placas de Petri de 50 mm de diâmetro, copos de vidro, 2 pratos de plástico (~ 25 cm x 15cm x 3 - 5 cm) e uma caixa de plástico.
- Para executar a instalação hyporheal, prepare uma mangueira de borracha e uma malha de 100 µm-poros e uma garrafa de esguicho. Para a construção do dispositivo, consulte complementar arquivo 1: S.1. Construção de gaiolas de malha.
- Monte o fundo e a parte central das gaiolas malha. Monte a parte da gaiola que mantém os indivíduos. Inserir uma capa de plástico em primeiro lugar, em seguida, Peneire uma folha de plástico, e finalmente o principal corpo em cima. Use os quatro parafusos para fixá-lo.
- Preparar material biológico
- Colocar a gaiola de malha para o prato de plástico contendo água do rio. Certifique-se de que as câmaras estão pela metade. Leve os juvenis FWPM (ver complementar arquivo 1: S.6. Material biológico) fora da caixa isolada termicamente e colocá-los na caixa de Petri.
Nota: Certifique-se que as mudanças bruscas de temperatura não exceda ~ 2 ° C. - Usando uma garrafa de esguicho e filtro, Peneire os juvenis para limpar os detritos.
- Colocar a gaiola de malha para o prato de plástico contendo água do rio. Certifique-se de que as câmaras estão pela metade. Leve os juvenis FWPM (ver complementar arquivo 1: S.6. Material biológico) fora da caixa isolada termicamente e colocá-los na caixa de Petri.
- Configure o microscópio e câmera. Realizar uma calibração dos instrumentos (ver arquivo1 complementares: 5 s... Microscópio e phototechnics). Coloque uma placa de Petri contendo um pouco de água sob o microscópio.
- Colocar os juvenis em gaiolas (trabalho de laboratório experimental)
- Use uma pipeta Pasteur para remover um indivíduo de uma placa de Petri e com cuidado, coloque-o na caixa de Petri sob o microscópio.
- Verificar a aptidão do indivíduo olhando dentro da ocular (~ 40 ampliação de X).
Nota: Aptidão "Bom" significa que o indivíduo se move, gira de um lado para o outro, empurra o pé fora do shell, etc. Remove morto ou baixa aptidão, os indivíduos com um Pasteur pipeta e colocá-los em um prato de Petri separado (juvenis FWPM com um aberto Shell, sem movimento, o pé não é puxado para fora, uma casca fragmentada, os juvenis que incontrolavelmente flutuam na água, uma decomposição visível da concha, descalcificação parcial). - Tome duas fotografias de um FWPM individual, mostrando boa aptidão usando uma ampliação constante de ~ 80 X. Ver complementar arquivo 1: S.5. Microscópio e phototechnics. Salve as fotos.
Nota: Para uma boa medida do seu comprimento, os menores devem ser colocadas longitudinalmente (vista lateral). O objetivo principal é tirar uma foto de alta qualidade do comprimento máximo casca boa o suficiente para permitir uma análise de imagens depois. - Inserir o juvenil na câmara apropriada na gaiola, assim como as fotos são tiradas. Os números das fotos e da câmara de registro.
- Repita este passo com cada indivíduo para todas as câmaras utilizadas na gaiola malha.
Nota: ver complementar arquivo 1: S.1. Construção de gaiolas de malha. - Uma vez que todas as câmaras usadas tem pérolas mexilhões, coloque a peneira de plástico da gaiola, em seguida, delicadamente ponha a tampa de plástico e proteger todas as partes, juntamente com as porcas.
- No caso de uma instalação em uma zona de hyporheic, passar uma das extremidades da mangueira por uma das câmaras e corrigi-lo nesta posição, em seguida, levar a malha anti-obstrução e vinculá-lo na extremidade inferior (ver complementar arquivo 1: S.1. Construção de gaiolas de malha).
- Juvenis de loja
- Colocar a gaiola em caixa plástica com água do rio, para que os juvenis estão totalmente imersos e mantém-lo no thermobox. Antes da instalação, deixe os juvenis adaptar em situ rio a temperatura da água no local de instalação (gradual arrefecimento, Max 5 ° C em 24h).
- Instalar as gaiolas de malha
- Preparar o material de campo, incluindo as gaiolas de malha com os juvenis, pontas de aço, parafusos e porcas de metal, uma chave inglesa, campo dataloggers de temperatura (ver Tabela de materiais e complementares 1 arquivo: S.4.2. Medição de água), uma cadeia de caracteres, uma câmera, o protocolo de campo, um martelo e uma pá.
- Transportar os juvenis FWPM para o site em um campo thermobox (caixa isolada), mantendo uma temperatura da água estável com variações < ~ 2 ° C. Colocar as caixas térmicas com as gaiolas de malha no rio no site para deixar os juvenis a adaptar-se às condições ambientais locais (pH, condutividade, etc.).
- Instale a gaiola de malha.
- Retire a gaiola de malha o campo thermobox. Fornecê-lo com duas pontas de aço e fixe o datalogger de campo. Ancore a gaiola em um habitat com condições típicas para FWPMs na área de estudo (por exemplo, na borda do fluxo fluxo principal, não no fluxo direto de água, não em água parada, não na luz solar direta).
- Para águas abertas, usando um par das pontas de aço, consertar a gaiola para o fundo do Rio; Coloque-o no seu lado e o nível com o fundo do rio, a jusante em um ângulo de 45° para o fluxo do rio, em direção ao centro do rio. A borda horizontal inferior deve ser de cerca de 10-15 cm acima da superfície de fundo do rio. Manter uma distância mínima de 2 m entre cada gaiola em uma localidade (ver complementar arquivo 1: S.4. Gaiolas de manutenção).
- Para a zona de hyporheic, cavar as gaiolas no fundo do rio em uma posição perpendicular paisagem, perpendicular ao fluxo de água, para que a borda horizontal superior da gaiola é paralela à superfície de fundo do rio e as câmaras estão localizadas na hyporheic profundidade que deve ser testada. Retire a extremidade superior do tubo de borracha acima da superfície de fundo a possibilidade de amostragem de água durante o experimento (ver complementar arquivo 1: S.4.2. Medição de água).
Nota: Recomenda-se realizar verificações regulares e manutenção em gaiolas (ver complementar arquivo 1: S. 4. Gaiolas de manutenção).
- Retire a gaiola de malha o campo thermobox. Fornecê-lo com duas pontas de aço e fixe o datalogger de campo. Ancore a gaiola em um habitat com condições típicas para FWPMs na área de estudo (por exemplo, na borda do fluxo fluxo principal, não no fluxo direto de água, não em água parada, não na luz solar direta).
- Desinstalar as gaiolas e os juvenis de transporte após a exposição. Para isso, puxe as gaiolas fora da água, limpá-los bem sedimentos, bem como a partir de material Duna e colocá-los no thermobox campo preenchido com água do rio. Transportar as gaiolas imediatamente para o laboratório e iniciar a avaliação de taxa de mortalidade e crescimento.
Nota: Ver arquivo complementar de 1: S.3. Duração da exposição. No caso de uma diferença de temperatura de mais de 5 ° C entre as gaiolas e o ambiente de laboratório, é primeiro necessário para deixar a temperatura equalizar. - Avaliar a experiência, verificando a vida/fitness de cada juvenil (consulte as etapas 1.5.2 e 1.5.3) e tomar 2 imagens de cada juvenil ao vivo em um prato de Petri usando uma ampliação constante de ~ 80 X. Grave a aptidão e os números das fotos e câmaras.
- Completar o experimento (comum a todos os métodos)
- Realize as medições em software de análise de imagem. Use o software de análise de imagem para a determinação do tamanho de corpo de cada avaliado juvenil em ambas as imagens de entrada (etapa 1.5.3) e sobre as imagens de saída (etapa 1,9). O comprimento máximo total de casca são registados em ambas fotografias como valores de tamanho de corpo de entrada e saída.
- Inserir os valores medidos para o processador de mesa e calcular o incremento de crescimento (%) para sobreviver a cada juvenil.
- Estime a taxa de sobrevivência (%) por gaiola de malha usando a relação entre o número de indivíduos sobreviventes para todos os indivíduos experimentais na gaiola malha.
Nota: Após o experimento, retornar os sobreviventes para o programa de reprodução
(ver complementar arquivo 1: S.6. Material biológico).
2. Sandy gaiola
Nota: Consulte a Figura 2.
- Preparar o material
- Preparar o material para a parte no laboratório da experiência: 2 pratos de Petri (diâmetro ~8.5 cm), pipetas Pasteur, um coador, 25 L de água do rio, uma caixa de plástico, peneiras (malha tamanho 1 e 2 mm), uma caixa plástica grande (25L), uma gaiola de areia (veja complementar arquivo 1 : S.2. Sandy gaiolas construção), uma câmera digital, um trinocular dissecando zoom microscópio estéreo, uma grade de calibração (equipamento do microscópio), classificados Rio areia da área de estudo (ver passo 2.1.3) e o protocolo. Consulte tabela de materiais e arquivo complementar 1: S. 2. Sandy gaiolas de construção.
- Preparar o material para o processo de isolamento: redondo recipientes (1 para cada gaiola mais 1 extra), 2 placas de Petri (diâmetro ~ 14 cm), uma pipeta Pasteur, lupas e 1 L de água do rio.
- Peneire a areia do rio através de uma peneira de 2mm e então através de uma peneira de 1 mm para obter uma granulometria de 1-2 mm. secar a areia e salvá-lo em uma forma seca até necessária.
- Leve os juvenis (ver complementar arquivo 1: S.6. Material biológico) fora do thermobox e colocá-los na caixa de Petri. Usando uma garrafa de esguicho e filtro, Peneire os juvenis para limpar os detritos.
- Configurar o microscópio e câmera (ver complementar arquivo 1: S.5. Microscópio e phototechnics).
- Colocar os juvenis em gaiolas (trabalho de laboratório experimental)
- Coloque a gaiola areia na caixa plástica. Espalhe a areia classificada (veja etapa 2.1.3) até a um terço da altura da gaiola areia. Despeje água na caixa. Certifique-se de que a superfície da areia é cerca de 10 mm abaixo do nível da água. Insira a gaiola areia na caixa 25 L de água do rio e expô-lo à mesma temperatura como as FWPMs juvenis (ver complementar arquivo 1: S.6.2. Armazenamento do material biológico) para 12 h. evitar qualquer exposição de areia à luz solar.
- Leve o prato de Petri com os juvenis FWPM preparados.
- Verificar a aptidão dos indivíduos olhando dentro da ocular (consulte a etapa 1.5.2).
- Realize a documentação fotográfica da seguinte maneira. Tirar uma foto de todos os indivíduos descoberto (consulte a etapa 1.5.3) e escolher 10 dos maiores indivíduos. Alternativamente, tirar fotos de todos os juvenis juntamente com ampliação baixa (~ 40 X) para uma avaliação de volume e escolher os 10 indivíduos maiores. Salvar todas as fotos e gravar seus números.
- Usando uma garrafa de esguicho, mova os juvenis FWPM no ringue de areia preparada.
- Juvenis de loja
- Colocar a gaiola em caixa plástica grande com água do rio para que a gaiola está totalmente imerso e mantê-lo no thermobox. Deixe os juvenis adaptar em situ rio a temperatura da água (gradual arrefecimento, Max 5 ° C por 24 h) antes da instalação.
- Instalar as gaiolas de areias
- Preparar o material para a instalação de campo: gaiolas de areias, um campo de 25 ~-L thermobox, uma pedra plana (mínimo 1 kg de peso), uma rede (malha tamanho 10 x 10 mm), um frasco de esguicho, campo dataloggers de temperatura (ver Tabela de materiais e complementares 1 arquivo: Medição de água de S.4.2.), uma pá e o protocolo de campo.
- Transporte as gaiolas com os juvenis para o site no thermobox campo, mantendo uma temperatura da água estável (mudança de ~ 2 ° C). Colocar o campo thermobox com gaiolas de areia no rio, no local do campo para deixar os juvenis FWPM adaptar-se às condições ambientais locais (pH, condutividade, etc.).
- Instale as gaiolas de areias em habitats com condições típicas para FWPMs (por exemplo, na borda do córrego principal fluxo em um meandro, não no fluxo direto de água, não em água parada, não na luz solar direta).
- Para águas abertas, apertem as gaiolas de areias a uma pedra plana, usando uma rede e colocá-lo no fundo do rio. Certifique-se de que o lado maior da gaiola forma um ângulo de 45° com o fluxo.
- Para Hyporheal, cave as gaiolas no fundo do Rio perpendicular ao fluxo de água para que a tampa da gaiola é o nível com a superfície inferior do rio.
Nota: Recomenda-se realizar verificações regulares e manutenção em gaiolas (ver complementar arquivo 1: S. 4. 1. verificações do site).
- Desinstalar o gaiolas e juvenis de transporte após a exposição
Nota: ver complementar arquivo 1: S.3. Duração da exposição.- Puxe as gaiolas fora da água, eliminá-los do material Duna e colocá-los no thermobox campo preenchido com água do rio.
- As gaiolas para o laboratório de transportes e iniciar a avaliação de taxa de mortalidade e crescimento.
Nota: No caso de uma diferença de temperatura de mais de 5 ° C entre as gaiolas e o ambiente de laboratório, é necessário deixar as temperaturas equalizar.
- Juvenis FWPM separados da areia
- Prepare um recipiente redondo com uma profundidade de água de 50 mm (para cada gaiola separadamente) e um recipiente extra redondo. Transferi a areia da gaiola dentro do recipiente redondo. Use um movimento turbilhão para lavar para fora as partículas mais leves em um recipiente extra.
- O conteúdo desse contêiner da amostra gradualmente e procurar juvenis passo a passo usando uma pipeta Pasteur e uma lupa. Colocar os juvenis na prato de Petri com a pipeta de Pasteur. Repita este passo até que o último juvenil foi encontrado e depois outra x 10 na primeira constatação negativa. Após cada etapa de lavagem, adicione água limpa para o recipiente original com areia.
Nota: Especialmente após a primeira lavagem, devidamente examinar o conteúdo e limpar de reator como sedimento fino e outros aluviões.
- Avaliar a experiência
- Verificar a adequação de cada juvenil (consulte as etapas 2.4.3 e 1.5.2) e contar o número de sobreviventes.
- Tirar uma foto (consulte a etapa 2.4.4.) de cada indivíduo separadamente, embora isto significa que não há nenhuma identidade clara de cada indivíduo. Alternativamente, tirar fotos em massa e escolher um subconjunto dos 10 indivíduos mais crescidos dos resultados definitivos.
Nota: Ambas as possibilidades têm um valor de emissão de relatórios semelhante. Possibilidade 1 tem uma limitação de uma carga de trabalho maior, mas também o benefício da maior ampliação da foto e assim também maior precisão.
- Completar a experiência
- Realize medições em software de análise de imagem. Completar a experiência como feito em gaiolas de malha (consulte a etapa 1.10) com a seguinte exceção: não avaliar a taxa de crescimento (%) de cada juvenil, mas avaliar o grupo como um todo, o experimento de gaiola areia.
Nota: Após a experiência, os sobreviventes devem ser retornados para o programa de reprodução
(ver S.6.1 de arquivo complementar. Selectora de um material biológico).
- Realize medições em software de análise de imagem. Completar a experiência como feito em gaiolas de malha (consulte a etapa 1.10) com a seguinte exceção: não avaliar a taxa de crescimento (%) de cada juvenil, mas avaliar o grupo como um todo, o experimento de gaiola areia.
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Representative Results
Os quatro métodos de bioindicação (gaiolas de águas abertas e arenosas, gaiolas de areias dentro da cama, abrir as gaiolas de malha de água e gaiolas de malha dentro da cama) foram aplicados para investigar a adequação de condições de ambiente para FWPMs na bacia do alto Vltava Rio (floresta da Boêmia, Checa República). Este rio representa uma localidade residual de FWPM dentro de Europa central19. Aqui, apresentamos um conjunto especialmente selecionado de resultados ilustrando os aspectos mais importantes dos quatro métodos. Mais detalhes estão descritos em um amplo estudo por Černá et al 13.
O ambiente do rio, estudou-se a dois níveis:
(I) um perfil longitudinal do rio foi representada pelo fluxo principal as localidades (sites A - E) e afluentes de poluição diferente fases (sites R e V). As localidades foram testadas por gaiolas de areias e pela malha gaiolas instaladas no fluxo livre de água. Além disso, uma zona de hyporheic de cascalho foi testada por dentro-cama sandy gaiolas em localidades, B, C e D.
(II) um ambiente de hyporheic foi testado na localidade selecionada C. A adequação dos diferentes substratos (areia, cascalho, pedras) foi testada por gaiolas de malha dentro-cama.
A taxa de crescimento e taxa de sobrevivência de > 1 anos juvenis (ver complementar arquivo 1: S.6. Material biológico) foram testados. O experimento foi realizado para toda a sua extensão no verão de 2014 e repetiu-se em menor medida em algumas localidades no verão de 2015. Dentro do nível de (I), 2-6 sandy gaiolas com um mínimo de 100 juvenis e 6 (2014) ou 4 (2015) gaiolas de malha com 6 juvenis foram aplicadas em cada localidade testada pelo método apropriado. Dentro do nível (II), 7 gaiolas de malha com 6 juvenis foram instaladas em cada ambiente testado. O tempo de exposição foi um mês para as gaiolas de malha e três meses para as gaiolas de areias.
A análise estatística foi realizada em R, versão 3.1.020. Foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis, Wilcoxon-Mann-Whitney e Kruskal-Nemenyi. Para dados com distribuição normal, foi realizada regressão linear ou quadrática.
As localidades podem ser claramente distinguidas com base na taxa de crescimento, as gaiolas de malha de águas abertas apesar da variabilidade alta dentro da gaiola, mesmo em diferentes períodos de crescimento favorável (Figura 3). A exposição mais favoráveis de crescimento em 2015 (taxa de crescimento 19,3-41,8%), descobriu-se uma tendência significativa no perfil longitudinal onde a taxa de crescimento aumentou a jusante (teste Kruskal-Wallis, p < 0,001). Importante, a taxa de sobrevivência foi equivalentemente alta em ambas as estações (de 83%) (Figura 4A).
Por outro lado, as gaiolas de areia de águas abertas mostraram uma tendência diferente entre as localidades de córrego principal em 2014: a taxa de crescimento aumentou a jusante da localidade, um (52%) através da localidade média C (153%) e posteriormente diminuiu novamente até a localidade E (46%) (uma regressão quadrática dos valores de crescimento absoluto: r2adj = 0,77, F2,13 = 25.66, d.f. = 16, p < 0,001). Esta tendência foi confirmada também em 2015, quando a maior taxa de crescimento foi gravada na localidade de média C novamente. Além disso, os valores de taxa de crescimento absoluto não diferiram muito entre 2014 e 2015. Por outro lado, a taxa de sobrevivência diferiu entre os anos, sendo muito maior em 2015 (de 48% para 72%) do que em 2014 (cerca de 25%) (Figura 4B).
Efeito de dois métodos diferentes de exposição também é claramente visível no afluente poluído (localidade V). As gaiolas de areias aqui expostas durante os três meses mostraram 0% de sobrevivência, enquanto uma taxa de sobrevivência de 83% com algum crescimento foi gravada pela exposição de gaiolas de malha aberta água aqui durante os 30 dias.
Resultados do dentro-leito arenosas gaiolas ilustram condições diferentes no ambiente hyporheic em comparação com águas abertas nas localidades relevantes. A taxa de crescimento foi sempre inferior nos sites de hyporheal do que em águas abertas, e a taxa de sobrevivência foi muito mais variável (de quase 50% para 0%, Figura 4B).
Um estudo de microhabitats hyporheic usando as gaiolas de malha dentro-cama mostrou um efeito significativo da composição do substrato na sobrevivência infantil. As melhores condições foram registradas do fundo pedregoso saturada com oxigênio (uma taxa de sobrevivência perto de 100%) enquanto o pior (um < 40% de sobrevida) foram indicado na areia pouco oxigenada onde uma muito alta variabilidade em sobreviver também foi detectada. Oxigenação de água Hyporheic, que foi medida repetidamente durante o experimento, explica esta tendência (Figura 5).
Figura 1. Gaiola de malha bioindicação com câmaras individuais. Veja o arquivo complementar 1 para mais detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Gaiola de bioindicação areia. Veja o arquivo complementar 1 para mais detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Variabilidade individual na taxa de crescimento juvenil gravada por gaiolas de malha aberta de água em localidades B e E durante duas temporadas. Os meios e o desvio padrão são descritos para cada gaiola de malha. Os valores são baseados na medição de 6 juvenis (ou 4-5 juvenis se a taxa de mortalidade > 0%) em cada gaiola de malha.
Figura 4. Resultados do exemplo de um campo de bioindicação experimentarem com gaiolas de malha e sandy. (A), este painel mostra resultados de exemplo de um campo experimental de bioindicação com gaiolas de malha. Um total de 6 localidades (B, C, D, E, R e V) na bacia hidrológica Rio Vltava foram testadas em 2 ocasiões separadas (em 2014 e 2015). O tempo de exposição foi de 30 dias durante a temporada de verão. As localidades de B - E representam (em ordem), um perfil longitudinal de um trecho de aproximadamente 20 km do fluxo principal do rio. As localidades R e V representam perfis de 2 afluentes. Capitais marcam a localidade mesma no painel (A) e (B). Todas as localidades foram testadas com gaiolas de malha de águas abertas. Além disso, localidade C também foi testada usando gaiolas de malha dentro camas instaladas em 3 tipos diferentes de leito de Rio (Cs = areia, Cg = cascalho, Cst = pedras) em 2014. As gaiolas foram instaladas em 4-7 repetições em cada site. 6 juvenis de pérolas de água doce do mexilhão de 1 + anos de idade foram usados por gaiola de malha. As taxas médias de crescimento são marcadas para os 3 indivíduos maiores (máx. 3) de cada gaiola malha testado (colunas, eixo esquerdo) e a taxa de sobrevivência média por gaiola de malha (pontos de azul, eixo certo). (B), este painel mostra exemplo de resultados de um campo de bioindicação experimentarem com gaiolas de areias. Um total de of7 as localidades (A, B, C, D, E, R e V) na bacia hidrológica Rio Vltava foram testados sobre em 2 ocasiões separadas (em 2014 e 2015). O tempo de exposição foi 3 meses durante a temporada de verão. Sites de A - E representam (em ordem), um perfil longitudinal de um longo trecho de cerca de 30 km do fluxo principal do rio. Sites R e V representam perfis de 2 afluentes. Capitais marcam a mesma localidade, no presente e no painel anterior. Todas as localidades foram testadas com gaiolas de areia de águas abertas. Além disso, localidades, B, C e D foram também testados usando dentro-cama areias gaiolas instaladas em substrato de cama de Rio martelo (Bg, Cg e Dg) em 2014. As gaiolas foram instaladas em 2-4 repetições em cada site. Pelo menos 100 juvenis de pérolas de água doce do mexilhão estiveram presentes em cada gaiola areia. A taxa média de crescimento para os 10 maiores indivíduos (máx. 10) de cada gaiola areia testado (colunas, eixo esquerdo) e a taxa de sobrevivência média por gaiola areia (pontos de azul, eixo direito) são marcadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Saturação de oxigênio. Este painel mostra a relação entre os valores mínimos de saturação de oxigênio durante 30 dias de exposição de gaiolas de malha e a taxa de sobrevivência por gaiola em gaiolas de malha dentro-cama expostos em microhabitats cama diferente em 2014. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 2014 | 2015 | |||
| localidade | 3 meses exposição de gaiolas de areias | 1 mês exposição de gaiolas de malha | 3 meses exposição de gaiolas de areias | 1 mês exposição de gaiolas de malha |
| A | 13,9 | - | - | - |
| B | 14,4 | 13.4 | 13,9 | 17.5 |
| C | 15 | 13,8 | 14,4 | 18,3 |
| D | 15 | 13,8 | 14.3 | 18,3 |
| E | 15.5 | 14 | - | 18,7 |
| R | 13.5 | 12,8 | - | - |
| V | 14 | 13.2 | - | - |
Tabela 1. Temperatura da água de superfície média (° C) em localidades durante a exposição em 2014 e 2015.
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Discussion
Tempo de exposição:
Até mesmo um mês expostos malha gaiolas mostrar um crescimento visível refletindo diferenças entre as localidades (Figura 3), então eles são muito úteis para a detecção rápida e fácil de uma caracterização da localidade. No entanto, a relevância dos resultados depende do estado a curto prazo das condições, que pode oscilar. Em particular, os eventos de precipitação curto podem desempenhar um papel. Em contraste, poluição episódica imprevisível pode não sempre ser gravada. Na localidade de V (Figura 4A), a análise química da água detectado uma onda curta de amónio forte aumento13. Isto foi provavelmente responsável para a mortalidade em gaiolas de areias expostas a três meses, mas não afetou as gaiolas expostas malha 30 dias.
Flutuações de temperatura também podem afetar os resultados de exposição a curto prazo. A temperatura média de um mês, durante a exposição de gaiola malha difere entre os anos (tabela 1). A taxa de crescimento também varia onde temperaturas mais altas foram acompanhadas por maiores taxas de crescimento (teste de Kruskal-Wallis p < 0,001). Por outro lado, a temperatura de água média em localidades mesmas durante a exposição de três meses de gaiola areia era muito similar em ambos os exercícios (tabela 1) e a taxa de crescimento não diferiu significativamente (Figura 4B).
Benefícios e as falhas dos métodos descritos:
Uma exposição de águas abertas é relativamente fácil de executar, mas é de valor limitado para bioindicação de habitat. O método de gaiolas de malha de mar aberto é relativamente antigo16 e tem sido usado repetidamente com pequenas modificações,10,11,12,13,21,22 , 23. no entanto, estas gaiolas não são limitadas pelo oxigênio, cuja deficiência é provavelmente responsável por muitas mortes juvenis em condições de hyporheic. Assim, as gaiolas de malha de águas abertas podem mostrar bom desenvolvimento mesmo em localidades com aumento da mortalidade e uma taxa de crescimento decrescente em gaiolas de areia de águas abertas (localidade E) ou uma taxa de mortalidade de 100% na cama dentro areia gaiolas, como na localidade D em 2014 (Figura 4B). Aparentemente, as gaiolas de malha de águas abertas mostram crescimento de localidade potencial, mas isso pode não ser realista como é dependente da disponibilidade real de microhabitats hyporheic dentro de uma localidade. Porque as gaiolas de malha aberta de água tem a capacidade de sobrevivência elevada (Figura 4A), até uma taxa de sobrevivência de 100%13, podem servir bem para a bioindicação de toxicidade crónica (ou toxicidade aguda se é esperado em um determinado momento). Além disso, eles podem ser uma presença de fonte de alimento útil testar em certa medida.
Como um método novo e incomum, as gaiolas de águas abertas areia melhor simulam hyporheic condições de habitat. Movimento dos juvenis entre grãos de areia é possível neste aparelho, que ajuda a reduzir o crescimento do biofilme na shell do juvenil. Uma deficiência de oxigênio de hyporheic pode ser causada pela atividade dos micróbios colonizar os grãos de areia; Este efeito pode ocorrer também parcialmente em gaiolas colocadas acima um fundo do rio. No entanto, devido a necessária limpeza periódica do entupimento material deriva de uma gaiola, sedimentos finos também são removidos e, portanto, as condições são alteradas em comparação com o habitat natural de hyporheic. Então, a taxa de crescimento também pode ser considerada como o crescimento da localidade potencial em gaiolas de areia de águas abertas. No entanto, isto está mais para adequação de localidade real do que em água aberta gaiolas de malha. Portanto, os gradientes de taxa de crescimento longitudinal gravados por gaiolas de areias (Figura 4B) também parecem ser mais plausível e indicar um trecho de rio mais adequado. Além disso, em gaiolas de areias, a possibilidade de juvenis e subadultos de criação até a maturidade sexual é verificada9, para que gaiolas de areias podem servir como um método seguro de reprodução e de biomonitorização simultaneamente.
Sandy jaulas e gaiolas de malha colocadas na posição de dentro-cama são mais próximas das condições reais em uma hyporheal superficial. Permitindo o movimento do juvenil, gaiolas de areias, em particular, para oferecer os dois um gradiente vertical e horizontal de vários centímetros na escala. Esta capacidade de mover pode ser muito importante para a fuga temporária de microzonas de deficiência de oxigênio. Esta possibilidade está ausente na cama dentro de gaiolas de malha. Portanto, um número relativamente elevado de unidades bioindicação é necessário, porque as condições de hyporheic são muito variável13,24 (Figura 5) e as perdas devido a uma localização inadequada são comuns.
Em resumo, os métodos de bioindicação utilizados nesta pesquisa correspondem a presumido juvenis condições naturais na seguinte ordem:
1. abrir gaiolas de malha de água,
2. abrir gaiolas água arenosa,
3. gaiolas de malha dentro-cama,
4. areias gaiolas dentro-cama.
A carga de trabalho por unidade aumenta na mesma ordem. Além disso, o número de juvenil exigido para um teste estatístico dos resultados obtidos aumento nos riscos de dentro-cama também. Parece que o dentro-cama areia jaulas representam um mais cara, mas o método exato de bioindicação. Este novo método precisa de mais testes no futuro e comparação com outros tipos de estudos hyporheic baseia o piezômetro medições25,26. Em particular, há uma necessidade de estudar o grau de similaridade usando uma sonda direta condições físico-químicas nas gaiolas e o meio ambiente de hyporheic de medição.
O número de indivíduos medidos em uma gaiola:
Comparado para gaiolas de malha, não é possível medir o incremento de crescimento de juvenis específicos em gaiolas de areias, como não há nenhuma informação sobre qual indivíduo do conjunto de entrada é qual na saída. É necessário trabalhar com um valor médio. Se contados para todos os indivíduos, esse valor pode ser muito baixa devido a uma série de espécimes muito lentamente crescentes; no entanto, alguns indivíduos podem crescer muito rapidamente (saltadores de crescimento). Tal crescimento desigual é típico para mexilhões27. A variabilidade de crescimento entre os juvenis se eleva com o aumento do tempo de exposição e grandes diferenças podem ocorrer, especialmente em épocas de crescimento favoráveis. Além disso, uma longa exposição leva a maior taxa de mortalidade as gaiolas de malha (para uma revisão ver Ana, Moorkens, Ramsey, Sinclair e doçura28), para que possamos trabalhar com um número significativamente menor de indivíduos no final do experimento em comparação com o entrada de conjunto dos juvenis. Medindo apenas os vários juvenis mais crescentes é um método possível.
A experiência de criação de FWPM dentro do plano de ação da Checa para Pearl bivalve9,29, bem como os resultados de experimentos no mar bivalves30,31, sugere que deficiência de crescimento juvenil moluscos bivalves têm uma alta taxa de mortalidade, e há apenas uma chance insignificante de sua vida até a maturidade. Em contraste, os jumpers de crescimento têm uma maior taxa de sobrevivência e eles são cruciais para a recuperação da população. O parâmetro 10 MAX (as 10 mais-rapidamente crescente de indivíduos) contempla os jumpers de crescimento e pode aumentar o valor informativo do experimento, mesmo que a alta mortalidade ocorre (Figura 4B, temporada 2014). Deve notar-se que a estimativa de crescimento obtida por esse método não pode ser um falso positivo. Ele pode apenas ser ligeiramente subestimado porque muitos dos juvenis maiores no final do experimento já tinha crescido um pouco mais neste caso. Além disso, a carga de trabalho é menor se apenas 10 indivíduos são avaliados. Da mesma forma, uma medida de três indivíduos màxima crescentes (máx. 3) provou para ser adequado em gaiolas de malha, eliminando a influência dos indivíduos lentamente crescentes, não-perspectiva, que poderia influenciar a imagem real do potencial de crescimento local.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Michal Bílý e Ondřej P. Simon foram apoiados por subsídios da Checa Universidade de Ciências da vida [interno Grant agência da faculdade de ciências ambientais, CULS Praga (42110 1312 3175 (20164236))]. Suporte para Karel Douda veio a Fundação científica checa (13-05872S). A bioindicação e presente ocorrência de mexilhões pérolas foram recolhidos durante a execução do plano de ação Checa para mexilhões de pérola de água doce, gerido pela Agência de conservação da natureza da República Checa, que é financiado pelo governo da República Checa e está disponível em
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| biological material maintenance and care | |||
| Freshwater pearl mussel juveniles | any | NA | from a FWPM breeding programme |
| plastic boxes | any | NA | |
| thermobox | MERCI | 212,070,600,030 | There are many possibilities. This is one example only. |
| field thermobox (ca25 l) | any | NA | cold box (insulated box) commonly used for food transport |
| river water | any | NA | |
| Petri dishes | any | NA | |
| plastic Pasteur pipettes with balloon bulb (droppers) | any | NA | hole diameter 1 mm |
| hydrogen peroxide | any | NA | |
| plastic container (ca 50 l) for river water | any | NA | |
| plastic tea strainer | any | NA | commonly used in kitchen |
| mesh cages construction | |||
| main plastic bodies | any | NA | |
| plactic covers | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| special technical sieves 100 µm | Silk &Progress | UHELON 67 M | |
| rubber hose (diameter 5.5 mm) | any | NA | |
| steel bolts | any | NA | |
| steel nuts | any | NA | |
| spanner | any | NA | |
| steel spikes | any | NA | |
| pliers | any | NA | |
| beakers | any | NA | |
| plastic dishes (ca. 25x15x3-5cm) | any | NA | |
| squirt bottle | any | NA | |
| field protocols | any | NA | |
| stationery | any | NA | |
| plastic container | any | NA | |
| string | any | NA | |
| hammer | any | NA | |
| sandy cages construction and use | |||
| sieve 1 mm | any | NA | |
| sieve 2 mm | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| plastic boxes with tight-fitting lid | any | NA | |
| hot melt adhesive | any | NA | |
| plastic box (ca 250 x 150 x 100 cm) | |||
| big plastic box (ca 25 l) | any | NA | |
| flat stone | any | NA | |
| net | any | NA | |
| river sand | any | NA | |
| round containers | any | NA | |
| magnifying glasses | Carson | Carson CP 60 | There ar many possibilities. This is one example only |
| cages installation and maintenance | |||
| field temperature dataloggers | ONSET | UA-001-64 | http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 |
| spade | any | NA | |
| toothbrush | any | NA | |
| experiment evaluation | |||
| trinocular dissecting zoom stereo microscope | Bresser optic | ICD 10x-160x | There are many possibilities. This is one example only. |
| digital camera/ electronic eyepiece | Bresser optic | MikroCamLab 5M | There are many possibilities. This is one example only. |
| Calibration gird | Am Scope | SKU: MR100 | There are many possibilities. This is one example only. |
| external power source with two movable light guides | Arsenal | K1309010150021 | There are many possibilities. This is one example only. |
| Image software | ImageJ software | There are many possibilities. This is one example only. | |
| table processor | MS excel | There are many possibilities. This is one example only. |
References
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