Summary
Här presenterar vi ett protokoll för tillverkning av gradient nanopattern plattor via termisk nanoimprinting och metoden för screening Svaren av mänskliga endothelial stamceller till nanostrukturerna. Med den beskrivna tekniken, är det möjligt att producera en byggnadsställning som kan manipulera cell beteende av fysikaliska stimuli.
Abstract
Nanotopography kan hittas i olika extracellulära matriser (ECMs) runt kroppen och är kända för att ha viktiga lagstiftningsåtgärder på cellulära reaktioner. Det är dock svårt att bestämma förhållandet mellan storleken på en nanostruktur och svaren från celler på grund av bristen på lämplig screening verktyg. Här visar vi utvecklingen av reproducerbara och kostnadseffektiva gradient nanopattern plattor för manipulering av cellulära svar. Med anodisk aluminiumoxid (AAO) som en herre mögel, gradient nanopattern plattor med nanopillars ökande diameter varierar [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) och 280-360 nm (GP 280/360)] var fabricerade av en termisk imprinting teknik. Dessa gradient nanopattern pläterar var utformade för att efterlikna olika storlekar av nanotopography i ECM och användes till skärmen svaren från mänskliga kolonibildande endotelceller (hECFCs). I detta protokoll beskriver vi det stegvisa tillvägagångssättet av fabricera gradient nanopattern plattor för cell ingenjörsvetenskap, tekniker för odla hECFCs från perifert blod och odling hECFCs på nanopattern plåtar.
Introduction
Svaret från celler av fysisk stimulering av ytans topografi har nyligen varit fokuserade i fältet cell engineering1,2,3,4. Mer uppmärksamhet har därför fokuserat på tredimensionella nanostrukturer på cell fastsättning yta5. Det har rapporterats att integrin, som enhetens yta erkännande av cellen, överför den fysiska stimulans som drivs av mikro-nano strukturer ECM genom mechano-transduktion6. Denna mekanisk stimulering reglerar cell beteende genom kontakt vägledning7 och inducerar cytoskeletal omorganisation att ändra form, förutom fokal sammanväxningar och stelhet i celler8.
Mänskliga endothelial stamceller (hEPCs) i kroppen interagera noga med närmiljön av omgivande ECM9. Detta indikerar att det fysiska tillståndet av ECM fungerar som en viktig parameter för särskilda cell-matrix vidhäftning komplexa bildande som skjuvspänning som härrör från blod flöde10. Det rapporteras att surface nanotopography förstärker i vitro bildandet av omfattande kapillärrör nät av hEPCs11 och att en ECM/bio lösliga faktor kombinerat system gör det möjligt för hEPCs att erkänna dysfunktionella substrat och främjar Wound healing12,13. Förhållandet mellan ECM och hEPCs är dock inte klart förstått.
Även om många forskare försökte klargöra förhållandet mellan cell svaren och fysiska signaler från olika substrat14,15,16, dessa studier används endast en nanostruktur fast storlek eller nanopatterns med oregelbundna arrangemang som har en begränsning att klarlägga förhållandet mellan storleken på beteendet nanostruktur och cell. Problemet här är brist på lämpliga verktyg för screening cellulära svar som kan ersätta befintlig långtråkig och iterativa metoder för att hitta den optimala storleken av nanostrukturen. Därför krävs en enkel teknik för screening cell reaktioner på fysisk stimuli utan upprepning.
Här beskriver vi en metod som används i våra tidigare rapporter17,18,19 för att producera en gradient nanopattern där diametern på den ordnade nanopillars gradvis ökar. Dessutom beskrev vi också hur man odlar och analysera beteendet hos hECFCs på lutning nanopattern tallrikar att avgöra effekten av fysisk stimuli på cellerna. En mild anodisering, gradvis etsning och anti klibba lager beläggning metod användes för att fabricera gradient AAO mögel. Genom att anta en termisk imprinting litografi teknik, producerades identiska polystyren gradient nanopatterns i ett kostnadseffektivt och lättköpt sätt. Med hjälp av gradient nanopatterns, är det möjligt att avgöra vilken storlek av nanostruktur har en stor effekt på cellen beteende i en uppsättning av experiment. Vi förväntar oss att denna gradient nanopattern kommer att vara till hjälp för att förstå mekanismerna för interaktion mellan blod-derived hECFC eller andra celler och olika storlekar av nanostrukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den institutionella Review Board vid Korea University Anam Hospital (IRB No. ED170495). Alla förfaranden genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och dess senare ändringar.
1. beredning av aluminium (Al) substrat av Electropolishing
Varning: Electropolishing lösning är frätande och giftigt. Använd personlig skyddsutrustning inklusive nitrilhandskar, labbrock. Utför det här steget om du i ett dragskåp.
- Förbered electropolishing lösning genom att blanda ethyl alkohol (C2H5OH, 99,9%) och perklorsyra (HClO4, 60%) i en 1 L dubbel jacka bägare (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
- Anslut dubbel jacka bägaren till en Cirkulationspump och Ställ in temperaturen på 7 ° C. Lägg dubbel jacka bägaren på en magnetomrörare. Låt lösningen under omrörning i minst 30 min tills temperaturen sjunker till 7 ° C.
- Fördjupa den ultrarena Al-plattan (99,999%, 20 × 50 × 1 mm3) och kol counter elektrod i electropolishing lösning med crocodile clips och koppartråd. Justera positionen för Al plattan och kol counter elektroden att möta varandra.
Obs: Det är nödvändigt att installera klipp försiktigt så att inte röra lösningen. Vid kontakt med lösningen, kan orenheter som strömmar ut från klippen förorena Al plattan. - Anslut Al plattan till pluspolen och kol counter elektroden till minuspolen, av en likström (DC) strömförsörjning.
- Stäng av magnetomröraren och tillämpa en spänning på 20 V. upprätthålla detta tillstånd för 4 min.
- Slå på magnetomröraren, och tillåter strömmen att flyta för en annan 6 min.
Obs: Det statiskt tillståndet tar bort de flesta av föroreningar och ojämnheter från Al plattan och dynamiska villkoret förbättrar den slutliga kvaliteten på electropolishing. - Stäng av strömförsörjningen och manuellt separat Al plattan från klippet. Noggrant tvätta Al plattan med avjoniserat vatten för att avlägsna alla återstående lösning.
- Torr Al plattan med kväve och butiken under inert gas. Genomföra detta torkningen i slutet av alla experiment i steg 1 och 2.
Obs: När du injicerar tryckluft, göra luftflödet från den polerade delen till motsatt sida. I det motsatta fallet, kan orenheter fly från den icke-polerad delen och förorena Al plattan.
2. tillverkning av Gradient AAO mögel med fosforsyra elektrolyt
Varning: Metylalkohol och dess rök är okulär giftiga. Kontinuerlig exponering för krom kan leda till allvarliga krom förgiftning. Utför det här steget om du i ett dragskåp.
- Primära anodisering
- För att förbereda 1 L av fosforsyra elektrolyt, Fyll på 590 mL avjoniserat vatten i en glasflaska.
- Tillsätt 400 mL metylalkohol (CH3OH, 99%) och 10 mL fosforsyra (H3PO4, 85%) i glasflaska. Blanda lösningen väl genom att skaka manuellt eller med magnetisk omrörning.
- Häll 500 mL elektrolyten i en 1-litersbägare dubbel jacka. Fördjupa polerad Al plattan och kol counter elektroden i lösningen med crocodile clips och koppartråd.
- Häll ytterligare elektrolyten för att hitta gränsen för electropolishing 2-3 mm över ytan av lösningen.
Obs: Om anodisering utförs med gränsen för electropolishing att röra lösningen, tenderar Al plattan att bränna under anodisering. - Installera en vertikal axel på en U-formad piedestal. Bifoga en overhead omrörare och pumphjulet med metall klämmor. Ställning propellern pumphjulet nära den nedre änden av båda elektroderna. Ange rotationshastighet overhead omröraren mellan 200 och 300 rpm.
- Anslut dubbel jacka bägaren till en Cirkulationspump och ställa in temperaturen på-10 ° C. Låt systemet för minst 1 h under omrörning tills temperaturen sjunker till-10 ° C.
Obs: Använd inte vatten som kylmedel. Eftersom vattnet fryser vid låga temperaturer, kommer cirkulationen inte fungera normalt. Det är rekommenderat att använda en blandning av vatten och etanol i förhållandet 1:1 som kylvätska. - Applicera en spänning på 195 V under omrörning för 16 h.
Obs: Om nuvarande stiger mer än 50 mA inom 2 eller 3 h efter applicering spänningen, sannolikheten att bränna kommer att inträffa är mycket hög. Omedelbart stoppa processen och ersätta Al plattan med en ny. Om problemet uppstår upprepade gånger, kontrollera att det inte finns någon abnormitet i temperaturkontroll av cirkulationspumpen. Om det finns någon abnormitet, ändra elektrolyten. - Stoppa strömförsörjningen och manuellt separat Al plattan från klippet. Tvätta eloxerad Al plattan med avjoniserat vatten för att avlägsna alla återstående lösning.
- Aluminiumoxid etsning
- Förbereda kromsyra etsning lösning av upplösning 9,0 g kromoxid (CrO3) och 20,3 mL fosforsyra (H3PO4, 85%) i 500 mL avjoniserat vatten.
- Häll över etsning lösningen i 1 L dubbel jacka bägaren. Ställ in temperaturen på 65 ° C.
- Fördjupa eloxerad Al plattan i etsning lösningen för minst 10 h under omrörning. Försegla toppen av bägaren med aluminiumfolie.
- Skölj etsade Al plattan flera gånger med avjoniserat vatten.
- Sekundära anodisering
- Ange samma experimentella villkor som steg 2.1.1 till 2.1.7.
- Ladda etsade Al plattan till anoden av systemet och Använd en spänning på 195 V för 6 h. Sedan stänga av strömförsörjningen och manuellt separat Al plattan från klippet. Tvätta omedelbart eloxerad Al plattan med avjoniserat vatten.
Obs: När tiden för tvätt är försenat, ökar porstorlek av AAO oavsiktligt på grund av den kvarvarande Fosforsyran.
- Gradient pore breddning
- Bered en pore breddning genom upplösning 5.765 g fosforsyra i 500 mL avjoniserat vatten. Häll lösningen i en 1-litersbägare dubbel jacka.
- Anslut dubbel jacka bägaren till cirkulationspumpen och Ställ in temperaturen på 30 ° C. Placera en linjär rörelse scenen vertikalt bredvid bägaren. Fäst en fästet till den rörliga delen av linjär scenen.
- Ange den rörliga delen av linjär scenen till utgångsläget. Fästa klämman till fästet och ladda eloxerad Al plattan.
- Manipulera positionen för Al plattan manuellt så att Al plattan kommer ända ovanför ytan av lösningen.
Obs: I det här steget bör Al plattan inte röra lösningen. Pore breddning processen börjar så snart Al plattan når lösningen. - Gradvis fördjupa Al plattan i lösningen med en hastighet av 4,86 µm/s för 120 min att göra en 35 mm AAO mögel med en storlek gradient från 120 nm till 200 nm (GP 120/200). Starta ett stoppur för tillfället Al plattan vidrör ytan av lösningen.
- För att göra GP 200/280 och GP 280/360 formar, fördjupa det hela området av GP 120/200 mögel i pore breddning lösning för 2 eller 4 h, respektive.
- Skölj gradient Al plattan flera gånger med avjoniserat vatten.
3. deponering av anti sticker lagret på Gradient AAO mögel med själv monterade enskiktslager
Obs: Utför steg 3.2.1 till 3.3.3 i ett handskfacket. Anslut en vakuumpump och torrt kväve gas spridare till handskfacket. Placera alla prover, reagenser och apparaturar i handskfacket före avfuktning processen. Upprepa evakuering och kväve gas injection cykeln mer än tre gånger tillräckligt att för den skull ta fukt ur handskfacket. Låt det torra kvävgasen flödet genom experiment.
- Hydroxyl modifiering av AAO mögel med Piranha behandling
- Häll 140 mL svavelsyra (H2SO4, 95%) i en bägare på polytetrafluoreten (PTFE). Tillsätt 60 mL väteperoxid droppvis (H2O2, 30%). Lämna den för 30 min tills lösningen har svalnat.
Varning: Var extremt försiktig när du gör Piranha lösning. Från ögonblicket att lägga till väteperoxid, lösningen kraftigt kokar och genererar höga temperaturer. Utför experimentet i dragskåp. - Fördjupa AAO mögel i lösningen för 30 s med en icke-metalliska pincett.
- Skölj AAO formen flera gånger med avjoniserat vatten. Blötlägg mögel i avjoniserat vatten i 30 min och lägga den i metylalkohol för en annan 30 min.
Varning: När du kasserar begagnade Piranha lösningen, späd lösningen med en kopiös mängd kranvatten. - Helt torr AAO mögel under vakuum för 3 h.
- Häll 140 mL svavelsyra (H2SO4, 95%) i en bägare på polytetrafluoreten (PTFE). Tillsätt 60 mL väteperoxid droppvis (H2O2, 30%). Lämna den för 30 min tills lösningen har svalnat.
- Beredning av 20 × HDFS stamlösning
Obs: HDFS är en förkortning av (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silane- Fyll en tredjedel av en 1 L n-hexan flaska med molekylsiktar. Förslut flaskan med paraffin filma och förvara det under torra kväve för 24 h.
- Filtrera 200 mL n-hexan med hjälp av en spruta av glas och 0,2 µm PTFE spruta filter.
- Häll på 80 mL filtrerade n-hexan i en 100 mL glasflaska. Tillsätt 2 mL av HDFS.
- Själv monterade enskiktslager nedfall
- Ladda 57 mL filtrerade n-hexan i en 100 mL-glasbägare. Fördjupa AAO mögel i lösningsmedlet.
- Tillsätt 3 mL HDFS stamlösning till n-hexan att göra 2,9 mM HDFS lösning. Vänta 10 min för reaktionen att gå vidare.
- Överföra AAO mögel till färska n-hexan. Nära och täta alla reagensflaskor. Stäng ventilen kväve, och dra sedan ut prover från handskfacket.
Obs: HDFS är extremt känslig för fukt. Lagra alla reagenser som innehåller HDFS i exsickator. - Blötlägg AAO mögel i 60 mL methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Ultraljud rena AAO mögel i en bägare för 10 s per en gång för att ta bort fysiskt adsorberat HDFS molekyler. Upprepa rengöringsproceduren 10 gånger.
Obs: Utsätta AAO mögel att ultraljud under lång tid utan mellanrum kommer att skada oxidskiktet. - Helt torr AAO mögel under vakuum för 24 h.
Obs: Ett framgångsrikt deponerade anti klibba lager är super vattenavvisande och stabil i månader när de lagras i en exsickator. Protokollet kan pausas här.
4. tillverkning av Gradient Nanopattern plattor av termiska Imprinting
Obs: Utför steg 4,2 till 4,7 i ett rent rum.
- Skär ett 1,1 mm tjocka polystyren ark till en storlek på 2,9 mm bred med 3,7 mm lång med en tryckt krets styrelse (PCB) fräs.
- Skär AAO mögel 35 mm från botten med hjälp av en tång. Märk provet namn och tillverkningsdatum på baksidan.
- Ren en 8.0 ”wafer med en liten dos av etylalkohol. Sätt polystyren arken på rånet, sedan montera AAO mögel.
- Lägg botten filmen i lådan av en termisk imprinter. Fäst den övre filmen packningen.
- Pålagda botten filmen rånet. Placera packningen på rånet. Kontrollera att det finns inget damm på rånet.
- Stäng lådan av den termiska imprinter. Tillämpa 165 ° C värme och 620.52 kPa tryck för 100 s.
- Cool provet till rumstemperatur. Vrid försiktigt bladet polystyren för att släppa AAO mögel.
5. sterilisering och hydrofil modifiering av Gradient Nanopattern plattor
- Placera nanopattern plattorna på en fyrkantig maträtt. Häll 100 mL 70% etylalkohol och utsätt för ultraviolett ljus i 30 min.
- Torr nanopattern plattorna med kväve. Överföra nanopattern plattorna till en syre plasma generator.
- Evakuera kammaren tills den når 1.33 Pa. Injicera sedan, syre med en hastighet av 30 cm3/min. tillämpa en radiofrekvens makt 60 W. underhåll syre plasma för 90 s.
Obs: Det rekommenderas att använda plasma-behandlade nanopattern pläterar inom 14 dagar. - Bifoga nanopattern plattan i botten av en cell kultur maträtt med en droppe av toluen.
- Försegla proverna i en påse och sterilisera med låg temperatur plasma autoklaven.
6. odling av hECFCs
Obs: Genomföra alla centrifuging förfaranden vid 4 ° C om inte annat anges.
- Innan isolera perifera Inkubera mononukleära celler (PBMC), en kollagen-belagd 12-väl kultur maträtt vid 37 ° C i 1 h.
- Tvätta 12-väl kultur skålen med 1 × steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Samla 50 mL blod med hjälp av ett heparin-hämmare rör.
- Lägg 6 mL hydrofil polysackarid lösning i en 15 mL tub och tillsätt 8 mL blod till hydrofil polysackarid lösningen.
Obs: Långsamt Pipettera blodet i hydrofil polysackarid lösningen. - Centrifugera röret vid 1020 x g i 20 min till pellet cellerna.
- Skörda den ogenomskinlig cellager, och överför till en ny 15 mL tub.
- Lägga till 10% fetalt bovint serum (FBS)-innehöll PBS och centrifugera röret vid 1020 x g i 10 min till pellet cellerna.
- Avlägsna supernatanten och lägga till röd-blodkroppar lyseringsbuffert. Hålla på is för 5 min.
- Tillsätt 10% FBS-innehöll PBS och centrifugera röret vid 1020 x g i 5 min till pellet cellerna.
- Avlägsna supernatanten och lägga till 10% FBS-innehöll PBS. Centrifugera röret vid 1020 x g i 5 min till pellet cellerna.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL av endotelceller expansion medium kompletteras med 10% FBS. Utsäde 8,0 × 106 celler per brunn för varje kollagen-belagd maträtt.
- Ändra odlingssubstratet varje dag i 1 vecka. Sedan ändra odlingssubstratet varannan dag.
Obs: hECFCs kan hittas efter kultur dag 10-14. hECFCs visar typiska kullersten morfologi och bilda en koloni som kan observeras i fas kontrast mikroskopi. Immunofluorescens färgning av vaskulär endotelial cadherin (CD144) och von Willebrands faktor (vWF) kan också utföras för karakterisering av hECFCs efter ytterligare cell expansion. - För att odla hECFCs, Använd endotelceller expansion medium kompletteras med 5% FBS och penicillin/streptividin vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2. Ersätta medlet en gång om dagen.
- Efter hECFC induktion, odla cellerna till passage 7 för ytterligare experiment.
7. cell sådd och kultur på lutning Nanopattern plattorna
Obs: Steg 7 beskriver kulturen av hECFCs på lutning nanopattern plattan, men andra cell källor kan också användas.
- Coat gradient nanopattern plattorna med 1 mL 0,1% protein beläggning i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.
Obs: 0,1% protein beläggningen täcker inte de nanopillar funktionerna. - Gör en hECFCs suspension från kultur skålen av en cell-delning standardmetod använder trypsin.
- Späd cellsuspensionen för att uppnå önskad sammanflödet. Utsäde av hECFCs på lutning nanopattern plåtar och platta kontroll (t.ex. 1,0 × 104 celler/cm2).
Obs: När hECFCs är seedade på 1,0 × 104 celler/cm2 på lutning nanopattern tallrikar, når den cell konfluens vanligtvis till 70-80% efter 2 dagar. - Odla cellerna på platt eller lutning nanopattern tallrikar för 2 dagar i inkubatorn.
8. observation och analys
- Svepelektronmikroskop (SEM) imaging
- Fixa hECFCs odlade på platt eller lutning nanopattern plattor med 2,5% glutaraldehyd vid 4 ° C för övernattning.
- Behandla 1% osmium vanligtvis för 1 h i rumstemperatur. Tvätta prover med PBS.
- Torkar ut prover med etylalkohol från låg till hög koncentration (50%, 70%, 80%, 90% och 100%) i 10 min per varje steg.
- Behandla hexamethyldisilazane (HMDS) under 15 minuter vid rumstemperatur. Efter att tvätta prover med färska HMDS och lämna prover under spiskåpa minst 1 dag tills den kvarvarande HMDS avdunstar helt.
- Päls av prov med platina fräsande bestrykare för 5 min och undersöka proverna med en SEM.
- Överföring elektronmikroskop (TEM) imaging
- Fixa hECFCs odlade på platt eller lutning nanopattern plattor med 2% PARAFORMALDEHYD och 2,5% glutaraldehyd blandning i PBS vid 4 ° C för övernattning.
- Utföra efter fixering med 1% osmium vanligtvis och torkar ut prover med metoden i 8.1.3.
- Bädda in prover i epoxiharts. Gör 60 nm tjocka sektioner från block och placera ett avsnitt på en TEM rutnät.
- Fläcken avsnittet med blandningen av 10 mg uranyl acetat i 100 mL metylalkohol och 0,1 mg bly citrat i 100 mL destillerat vatten. Hämta bilder med en TEM.
- Fluorescens färgning
- Fixa hECFCs odlade på platt eller lutning nanopattern plattor med 4% PARAFORMALDEHYD i rumstemperatur i 15 min.
- Permeabilize och blockera prover med 5% get serum och 0,1% oktylfenol ethoxylate i PBS (PBST) i rumstemperatur i 30 min.
- Inkubera prover med anti-humant vinculin primär antikropp (1: 500 i PBST) i rumstemperatur i 2 h. Skölj prover tre gånger med PBST.
- Inkubera prover med fluorescens-konjugerad phalloidin (1:1, 000 i PBST), fluorescens-konjugerad sekundär antikropp (1:1, 000 i PBST) i rumstemperatur i 2 h. Skölj prover tre gånger med PBST.
- Inkubera prover med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, 1:1,000 i PBST) vid rumstemperatur i 5 min.
- Släpp 10 µL monteringsmedium på ytan av gradient nanopattern. Placera ett täckglas på monteringsmedium.
- Placera provet uppochner på prov scenen och förvärva bilder med confocal fluorescens Mikroskop.
- Bildanalys
- Överföra tagna bilder av hECFCs till en bild analyssystem.
- Välj fältet slumpmässigt av phalloidin färgning bild. Justera tröskeln och skapa en binär bild där celler skiljer sig från bakgrunden.
- Rita konturer runt celler att mäta cell area och omkrets och manuellt räkna antalet filopodia per cell.
- Välj fältet slumpmässigt av vinculin färgning bild. Justera tröskeln och skapa en binär bild av fokal vidhäftning områden.
Obs: Justera bilden tröskeln på lämpligt sätt för att undvika konstgjord över - eller under - filling av fokal vidhäftning områden. - Räkna antalet fokal vidhäftning i varje cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar SEM-bilder av påhittade gradient AAO formarna enligt sin typ och position. Figur 2 visar SEM-bilder av gradient nanopattern plattor med regelbunden rundade nanopillars, och figur 3 är kvantifiering data av nanopillar diameter. Tabell 1 visar egenskaperna hos den påhittade nanopillars.
Figur 4A visar systematiken i odling av blod-derived hECFCs. Figur 4B visar fas kontrast bilden av thecultivated hECFCs. Figur 4 c visar hECFC markörer färgas med CD144 (grön), vWF (röd) och nucleus (blå). Figur 5A visar representativa SEM-bilder av hECFCs efter 2 dagar av kultur på plan, GP 120/200, GP 200/280 och GP 280/360 plåtar. Figur 5B och C skildra kvantitativa uppgifter om cellen area och omkrets jämfört med lägenheten. Rapporteringsgräns data visade att celler som odlas på nanopillar ytor av mindre storlek visade minskad cell area och omkrets. Figur 5 d är de representativa SEM-bilderna av hECFCs som visar morfologi av befintliga filopodia. Figur 5E skildrar den kvantitativa uppgifter om filopodia antal jämfört med lägenheten. Betydande filopodial utväxt hos celler odlade på GP 120/200, medan ingen signifikant förändring observerades i GP200/280 eller GP280/360 jämfört med lägenheten. Figur 5F visar representativa TEM bilder av hECFCs efter 2 dagar av kultur på platt och lutning nanopattern plattor.
Figur 1. Gradient AAO mögel. SEM-bilder av gradient AAO formar för GP 120/200, GP 200/280 och GP 280/360 plattor enligt positionen för formar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Lutning nanopattern tallrikar. SEM-bilder av pelare-typ gradient nanopattern plattor för GP 120/200, GP 200/280 och GP 280/360 plattor enligt position av plattor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Storlek gradient av nanopillar diameter. Rapporteringsgräns data visar lutningen av nanopillar diametrar för GP 120/200, GP 200/280 och GP 280/360 plåtar, respektive. Staplarna representerar medelfelet. Denna siffra ändrades från [Acta Biomaterialia] 20. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Youngs modul (GPa) | Nanopillar Diameter (nm) | Nanopillar Pitch (nm) | Centrum till centrum distans (nm) | Nanopillar höjd (nm) | Nanopillar styvhet (N/m) | |
| Platt | 2.43±0.19 | – | – | – | – | – |
| GP 120/200 | 1.74±0.11 | 120 – 200 | 320 – 240 | 440 | 276.9±21.9 | 9,35 |
| GP 200/280 | 2.01±0.05 | 200 – 280 | 240 – 160 | 440 | 268.1±25.9 | 55.78 |
| GP 280/360 | 2.1±0.13 | 280-360 | 160 – 80 | 440 | 293.6±23.6 | 134.15 |
Tabell 1. Kännetecken för påhittade nanopillars. Kvantifierade uppgifter visar Youngs modul, diameter, pitch, centrum till centrum avstånd, höjd och stelhet i påhittade nanopillars. Den här tabellen ändrades från [Acta Biomaterialia] 20.
Figur 4 . Karakterisering av hECFCs. (A) Schematiskt diagram visar schemat för hECFCs härrör från vuxna perifert blod. (B) fas kontrast bild av hECFC koloni, härrör från vuxna perifert blod på dag 14. (C) Immunofluorescerande bilder visar CD144 (grön), vWF (röd) och cellkärnan fläckade DAPI (blå). Denna siffra ändrades från [Acta Biomaterialia] 20. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 . hECFCs odlade på platt och lutning nanopattern tallrikar för 2 dagar. (A) representativa SEM-bild av hECFCs odlade på platt, GP 120/200, GP 200/280 och GP 280/360 plåtar. (B och C) Rapporteringsgräns data av area och omkrets av hECFCs (n = 50). * p <.05 jämfört med lägenheten. (D) representativa SEM-bilder av framkanten av hECFCs på platta och lutning nanopattern tallrikar. (E) kvantifiering data av antalet filopodia per en hECFC (n = 20). * p <.05 jämfört med lägenheten. (F) representant TEM bild av hECFC odlade på platt och lutning nanopattern plattor. Vita pilar visar punkterna som samspelet mellan hECFCs och substrat yta. Denna siffra ändrades från [Acta Biomaterialia] 20. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur 1. Vatten kontaktvinkel orörda AAO och HDFS behandlas AAO. Kontaktvinkel mätningar visar hydrofoba egenskaper av HDFS monterade själv enskiktslager (A) innan, samt (B) efter behandling. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande diagram 2. SEM-bilder av påhittade gradient nanopattern plattor med samma AAO mögel. Jämförande SEM-bild anger för att kontrollera hållbarhet av AAO mögel. (A) Gradient nanopattern plattan produceras med nygjorda mögel. (B) Gradient nanopattern plattan produceras med AAO mögel efter imprinting 15 gånger. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3. Påverkan av proteinet beläggning. SEM-bilder av hECFCs som odlades på GP 120/200, GP 200/280 eller GP 280/360 gradient nanopattern pläterar (A) utan eller (B) med proteinet beläggning. Denna siffra ändrades från [Acta Biomaterialia] 20 Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillverkning av en AAO ofta lider av defekter såsom sprickor, oregelbundna former av porer, och bränning. Den främsta orsaken till dessa defekter kallas en elektrolytisk fördelning, som påverkas starkt av de metall substrat att vara eloxerad karaktär och resistivitet av elektrolyt21. Eftersom resistivitet av elektrolyten varierar beroende på dess temperatur, är eliminera värme kontinuerligt från elektroder den kritiska punkten att hålla platsindikerande temperaturen av elektrolyten som stabil i sådant högspännings-anodisering skick. I detta protokoll fabricerade vi AAO formar genom att ändra Masuda's two-step anodisering22,23. Ersätter nästan hälften elektrolyten med metylalkohol inte bara hindrar syran från att frysa vid låga temperaturer men också berövar elektroden av värme genom avdunstning på botten av den pore24. Skälet för att använda en overhead omrörare och impeller i stället för en magnetisk omrörare är också att säkerställa temperaturkontroll. Den typiska magnetisk omröraren har en hög sannolikhet för tomgång på grund av oavsiktlig feljusteringen av magnetiska baren under långsiktig drift. Problemet inducerar felaktig cirkulationen av elektrolyten, höja dess temperatur, och leder till bränning.
För att ge en storlek övertoning till AAO mögel, nedsänkt vi gradvis i AAO i en phosphoric syra etsning lösning. Porerna är bredare i förhållande till den tid som AAO stannar i etsning lösningen, som visas i figur 1. Under detta tillstånd är den genomsnittliga pore-breddning 0,67 nm/min. manipulera nedsänks hastighet och tid kommer att ändra lutningen på storlek lutning och högsta pordiameter AAO. Den högsta möjliga pordiameter är 400 nm. När pordiameter överstiger 400 nm, avstånd väggen mellan porer blir så tunn att den inte tål trycket under den termiska prägling processen.
En HDFS själv monterade enskiktslager är känd för att kunna lägga till en hydrofoba egenskap de materiella yta25. HDFS molekylen gör en stark kovalent bindning med hydroxylgrupperna på AAO ytan infördes genom den Piranha behandling26. Därför, som visas i kompletterande Figur1, en solid själv monterade enskiktslager kan bildas när ett stort antal hydroxylgrupperna är närvarande på substrat yta. För optimal kvalitet med en HDFS själv monterade enskiktslager föreslår vi genomföra reaktionen i en avfuktad atmosfär. När HDFS utsätts för fukt, en sidoreaktion med vatten bildar dimerer, trimerer och även oligomerer av silan molekyler och minskar den övergripande kvaliteten på de själv monterade enskiktslager.
När du använder AAO mögel med en storlek gradient i termisk nanoimprinting, erhölls cell kultur plattor med en gradient av nanopillars figur 2 och figur 3. Metoden termiska nanoimprinting har en fördel i att det kan producera en stor mängd identiska nanopattern plattor med hjälp av en AAO herre mögel. Kompletterande bild 2 visar att det finns ingen skillnad i kvaliteten på de nanopattern som produceras, även efter femton imprinting processer, jämfört med den nanopattern som produceras av nya AAO mögel. Anledningen till att välja polystyren som material för att överföra en nanopattern är att polystyren har en lämplig glasomvandlingstemperatur (100 ° C) för termisk imprinting, och den används ofta i kommersiella cell kultur rätter på grund av dess transparent och giftfritt egenskaper.
Det är svårt att tillverka nanostrukturer med hög bildförhållande med termisk nanoimprinting metod. Eftersom, när processen förhållanden, såsom tryck och tiden ökar, blir mögel djupt inbäddade i polymer substratet, vilket gör det svårt att separera mögel från underlaget. Därför är det mycket utmanande att producera nanopatterns med ett bildförhållande på 1:3 eller mer med hjälp av vår nanoimprinting teknik. Men enligt TEM bilder vi observerade figur 5 c, vi har hittat ett intressant faktum att membranet i celler på nanopatterns inte var i kontakt med botten av nanopattern. Med andra ord, var alla fysiska stimuli som kan manipulera ett svar av celler härstammar från de övre delarna av nanopattern. Därför i denna studie behövde vi inte tänka på proportionerna i studera Svaren av cellen till nanopattern. I kompletterande diagram 3visas 0,1% protein beläggning lösning hade inget inflytande på infästningen av hECFCs på nanopillar ytor. Dessa nanoscaled stimuli från gradient nanopattern plattorna minskade dessutom cell area och omkrets av hECFCs och ökad filopodial utväxt figur 5.
Sammanfattningsvis etablerat vi gradient nanopattern plattor genom att manipulera ett svar av hECFCs in vitro. För att veta exakt vilken storlek av nanostrukturer cellerna påverkas kraftigt, krävs en framtida arbete att utforma en cell-specifika-storlek nanopillar genom att justera lutningen på storlek lutning och lägsta-högsta diametern på nanopillars. Vi förväntar oss denna gradient nanopattern vara ett fascinerande verktyg till skärmen samspelet mellan celler och nanostrukturer samt ge avancerad cell nischer där nanostrukturer fritt kan stämmas i storlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av grundläggande vetenskap forskningsprogrammet genom den nationella forskning stiftelsen av Korea (NRF) finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] och Bio & medicinsk teknikutveckling Program för det nya regelverket finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT & framtida planering [NRF-2017M3A9C6029563].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J.
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
