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Bioengineering

थर्मल Nanoimprinting तकनीक और मानव Endothelial कॉलोनी के गठन की प्रतिक्रिया की स्क्रीनिंग द्वारा ढाल Nanopattern के निर्माण कोशिकाओं

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57661
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 1
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम थर्मल nanoimprinting के माध्यम से ढाल nanopattern प्लेटों के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और nanostructures के लिए मानव endothelial जनक कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं स्क्रीनिंग की विधि । वर्णित प्रौद्योगिकी का उपयोग करके, यह एक पाड़ है कि शारीरिक उत्तेजनाओं से सेल व्यवहार में हेरफेर कर सकते है उत्पादन संभव है ।

Abstract

Nanotopography शरीर के आसपास विभिन्न extracellular मैट्रिक्स (ECMs) में पाया जा सकता है और सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर महत्वपूर्ण नियामक कार्रवाई करने के लिए जाना जाता है । हालांकि, यह एक nanostructure के आकार और उचित जांच उपकरणों की कमी के कारण कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए मुश्किल है । यहां, हम सेलुलर प्रतिक्रियाओं के हेरफेर के लिए reproducible और लागत प्रभावी ढाल nanopattern प्लेटों के विकास को दिखाते हैं । एक मास्टर मोल्ड के रूप में anodic एल्यूमिनियम ऑक्साइड (ऐ) का प्रयोग, ढाल nanopattern प्लेटें बढ़ती व्यास पर्वतमाला के nanopillars के साथ [120-200 एनएम (जीपी 120/200), 200-280 एनएम (जीपी 200/280), और 280-360 एनएम (जीपी 280/360)] एक थर्मल प्रिंटिंग तकनीक द्वारा गढ़े थे । इन ढाल nanopattern प्लेटों को ECM में nanotopography के विभिंन आकारों की नकल डिजाइन किए थे और मानव endothelial कॉलोनी बनाने की कोशिकाओं (hECFCs) के प्रतिक्रियाओं स्क्रीन इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल में, हम सेल इंजीनियरिंग, मानव परिधीय रक्त से hECFCs की खेती की तकनीक, और nanopattern प्लेटों पर संवर्धन hECFCs के लिए ढाल nanopattern प्लेटों के निर्माण के कदम दर कदम प्रक्रिया का वर्णन ।

Introduction

हाल ही में, सतह स्थलाकृति के शारीरिक उत्तेजना द्वारा कोशिकाओं की प्रतिक्रिया सेल इंजीनियरिंग1,2,3,4के क्षेत्र में सुर्खियों में रहा है । इसलिए, अधिक ध्यान तीन-आयामी nanostructures पर कक्ष अनुलग्नक सरफ़ेस5पर ध्यान केंद्रित किया गया है । इसमें बताया गया है कि integrin, जो कोशिका की सतह पहचान यंत्र है, mechano-transduction६के माध्यम से ECM की सूक्ष्म नैनो संरचनाओं द्वारा संचालित भौतिक उत्तेजना को पहुंचाता है. इस यांत्रिक उत्तेजना से संपर्क मार्गदर्शन7 के माध्यम से सेल व्यवहार को नियंत्रित करता है और cytoskeletal पुनर्गठन के लिए आकार बदलने के लिए, फोकल आसंजन और कोशिकाओं की कठोरता के अलावा8।

शरीर में मानव endothelial जनक कोशिकाएं (hEPCs) बारीकी से microenvironment आसपास के ECM9के साथ बातचीत करते हैं । यह इंगित करता है कि ECM की शारीरिक स्थिति विशिष्ट कोशिका के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में कार्य करता है-मैट्रिक्स आसंजन जटिल गठन के रूप में उतना कतरनी तनाव रक्त प्रवाह से व्युत्पंन10। यह सूचना दी है कि सतह nanotopography hEPCs11 के व्यापक केशिका ट्यूब नेटवर्क के इन विट्रो गठन को बढ़ाता है और एक ECM/जैव घुलनशील कारक प्रणाली संयुक्त सिस्टम सक्षम बनाता है hEPCs बेकार सब्सट्रेट पहचान करने के लिए और बढ़ावा देता है घाव भरने12,13. इसके बावजूद ECM और hEPCs के बीच संबंध स्पष्ट रूप से समझ में नहीं आ रहा है.

हालांकि कई शोधकर्ताओं ने सेल प्रतिक्रियाओं और विभिन्न सब्सट्रेट14,15,16से भौतिक संकेतों के बीच संबंध को स्पष्ट करने की कोशिश की, इन अध्ययनों से एक nanostructure के केवल निश्चित आकार का उपयोग किया या अनियमित व्यवस्था के साथ nanopatterns कि nanostructure और कोशिका व्यवहार के आकार के बीच संबंध स्पष्ट करने के लिए एक सीमा है । समस्या यहां सेलुलर प्रतिक्रियाओं कि मौजूदा थकाऊ और चलने दृष्टिकोण nanostructure के इष्टतम आकार को खोजने के लिए प्रतिस्थापित कर सकते है स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त उपकरणों की कमी है । इसलिए, एक सीधी तकनीक पुनरावृत्ति के बिना शारीरिक उत्तेजना पर सेल प्रतिक्रियाओं स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक है ।

यहां, हम एक ढाल nanopattern जिसमें व्यवस्था की nanopillars का व्यास धीरे से बढ़ जाती है उत्पादन के लिए एक हमारी पिछली रिपोर्ट में इस्तेमाल किया विधि का वर्णन17,18,19 । इसके अलावा, हम यह भी बताया कि कैसे खेती और ढाल nanopattern प्लेटों पर hECFCs के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं पर शारीरिक उत्तेजनाओं के प्रभाव का निर्धारण । एक हल्के यांग, क्रमिक नक़्क़ाशी, और विरोधी परत कोटिंग विधि चिपके हुए ढाल ऐ मोल्ड निर्माण किया गया । एक थर्मल प्रिंटिंग लिथोग्राफी तकनीक अपनाने से, समान polystyrene ढाल nanopatterns एक लागत प्रभावी और सतही तरीके से उत्पादित किया गया । ग्रैडिएंट nanopatterns का उपयोग करना, यह निर्धारित करने के लिए संभव है कि nanostructure का कौन सा आकार प्रयोग के एक सेट में सेल व्यवहार पर एक महान प्रभाव है । हमें उंमीद है कि इस ढाल nanopattern रक्त व्युत्पंन hECFC या अंय कोशिकाओं और nanostructures के विभिंन आकारों के बीच बातचीत तंत्र को समझने में मददगार होगा ।

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Protocol

यह अध्ययन कोरिया विश्वविद्यालय के अनं य अस्पताल में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित (आईआरबी No. ED170495) । सभी प्रक्रियाओं को हेलसिंकी घोषणा और उसके बाद के संशोधनों के अनुसार किया गया ।

1. एल्यूमिनियम की तैयारी (Al) सब्सट्रेट द्वारा Electropolishing

सावधानी: Electropolishing समाधान संक्षारक और विषाक्त है । nitrile दस्ताने, चश्मे और लैब कोट सहित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें । एक धुएं डाकू में इस कदम का प्रदर्शन ।

  1. एथिल शराब (सी2एच5ओह, ९९.९%) और perchloric एसिड (HClO4, ६०%) एक 1 एल डबल जैकेट चोंच में (सी2एच5ओह: HClO4 = 4:1) मिश्रण से electropolishing समाधान तैयार करें ।
  2. एक परिचालित करने के लिए डबल जैकेट चोंच कनेक्ट और 7 डिग्री सेल्सियस पर तापमान निर्धारित किया है । एक चुंबकीय सरगर्मी पर डबल जैकेट चोंच रखो । जब तक तापमान 7 ° c के लिए गिरता है, कम से 30 मिनट के लिए सरगर्मी के तहत समाधान छोड़ दें ।
  3. ultrapure अल प्लेट (९९.९९९%, 20 × ५० × 1 मिमी3) और electropolishing मगरमच्छ क्लिप और तांबे के तार का उपयोग कर समाधान में कार्बन काउंटर इलेक्ट्रोड विसर्जित कर दिया । अल प्लेट की स्थिति और कार्बन काउंटर इलेक्ट्रोड एक दूसरे का सामना करने के लिए समायोजित करें ।
    नोट: यह क्लिप को ध्यान से स्थापित करने के लिए आवश्यक है ताकि समाधान को स्पर्श न करें । जब समाधान के साथ संपर्क में, अशुद्धियों क्लिप से बाहर बहने अल थाली दूषित कर सकते हैं ।
  4. सकारात्मक टर्मिनल के लिए अल प्लेट कनेक्ट, और कार्बन काउंटर इलेक्ट्रोड नकारात्मक टर्मिनल के लिए, एक प्रत्यक्ष वर्तमान (DC) बिजली की आपूर्ति की.
  5. चुंबकीय सरगर्मी बंद करें और 20 वी के एक वोल्टेज लागू 4 मिनट के लिए इस राज्य को बनाए रखें ।
  6. चुंबकीय सरगर्मी चालू करें, और एक और 6 मिनट के लिए प्रवाह करने के लिए वर्तमान अनुमति देते हैं ।
    नोट: स्थिर हालत अल प्लेट से अशुद्धियों और किसी न किसी के अधिकांश निकालता है, और गतिशील हालत electropolishing के अंतिम गुणवत्ता में सुधार ।
  7. बिजली की आपूर्ति बंद करें और मैंयुअल रूप से क्लिप से अल थाली अलग । कड़ाई से सभी शेष समाधान निकालने के लिए पानी के साथ अल प्लेट धो लें ।
  8. सूखी अल प्लेट नाइट्रोजन और निष्क्रिय गैस के तहत की दुकान के साथ । चरण 1 और 2 में सभी प्रयोगों के अंत में इस सुखाने की प्रक्रिया आचरण ।
    नोट: जब संपीड़ित हवा इंजेक्शन, पॉलिश भाग से विपरीत दिशा में हवा का प्रवाह करना । विपरीत मामले में, अशुद्धियों गैर पॉलिश भाग से बच सकते है और अल थाली दूषित ।

2. फास्फोरस ले आओ मोल्ड के निर्माण के साथ फॉस्फोरस एसिड इलेक्ट्रोलाइट

सावधानी: मिथाइल अल्कोहल और इसके धुएं में आंख विषैली होती है । क्रोमियम के लिए सतत जोखिम गंभीर क्रोमियम विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. एक धुएं डाकू में इस कदम का प्रदर्शन ।

  1. प्राथमिक यांगता
    1. फास्फोरस अम्ल इलेक्ट्रोलाइट के 1 एल तैयार करने के लिए, एक गिलास बोतल में पानी की ५९० मिलीलीटर लोड ।
    2. ४०० मिलीलीटर अल्कोहल (CH3OH, ९९%) और फास्फोरस एसिड की 10 मिलीलीटर (एच3पीओ4, ८५%) के गिलास की बोतल में जोड़ें । हल अच्छी तरह से मिलाते हुए मैंयुअल रूप से या चुंबकीय सरगर्मी के साथ मिश्रण ।
    3. एक 1 एल डबल जैकेट चोंच में इलेक्ट्रोलाइट के ५०० मिलीलीटर डालो । पॉलिश अल प्लेट और मगरमच्छ क्लिप और तांबे के तार के साथ समाधान में कार्बन काउंटर इलेक्ट्रोड विसर्जित कर दिया ।
    4. समाधान की सतह के ऊपर electropolishing 2-3 mm की सीमा का पता लगाने के लिए अतिरिक्त इलेक्ट्रोलाइट डालो ।
      नोट: यदि यांग electropolishing की सीमा के साथ बाहर किया जाता है समाधान छू, अल थाली को यांग के दौरान जला जाता है ।
    5. एक ऊर्ध्वाधर शाफ्ट एक U-आकार कुरसी पर स्थापित करें । एक उपरि सरगर्मी देते हैं, और उत्तेजित देनेवाला धातु clamps का उपयोग कर । दोनों इलेक्ट्रोड के निचले छोर के पास उत्तेजित देनेवाला की स्थिति प्रोपेलर । २०० और ३०० rpm के बीच उपरि सरगर्मी के रोटेशन की गति निर्धारित करें ।
    6. एक परिचालित करने के लिए डबल जैकेट चोंच कनेक्ट और-10 डिग्री सेल्सियस पर तापमान निर्धारित किया है । तापमान को-10 ° c के लिए गिरता है जब तक सरगर्मी के तहत 1 से कम घंटे के लिए प्रणाली को छोड़ दें ।
      नोट: शीतलक के रूप में पानी का उपयोग न करें । क्योंकि पानी कम तापमान पर जमा हो जाता है, संचलन सामान्य रूप से काम नहीं करेगा । यह शीतलक के रूप में 1:1 के अनुपात में पानी और एथिल शराब का एक मिश्रण का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।
    7. लागू एक वोल्टेज १९५ वी के लिए सरगर्मी के तहत 16 ज.
      नोट: यदि वोल्टेज लागू करने के बाद 2 या 3 ज के भीतर वर्तमान से अधिक ५० mA उगता है, संभावना है कि जलन हो जाएगा बहुत अधिक है । तुरंत प्रक्रिया बंद करो और एक नया एक साथ अल थाली की जगह । यदि यह समस्या बार-बार होती है, तो जाँचें कि संचारकर्ता के तापमान नियंत्रण में कोई विषमता नहीं है. यदि विषमता न हो तो इलेक्ट्रोलाइट बदलें ।
    8. बिजली की आपूर्ति बंद करो और मैंयुअल रूप से क्लिप से अल थाली अलग । सभी शेष समाधान को दूर करने के लिए जल के साथ यांग ऑक्सीकरण अल प्लेट धो लें ।
  2. एल्यूमिना नक़्क़ाशी
    1. क्रोमियम ऑक्साइड के ९.० जी भंग करके क्रोमिक एसिड नक़्क़ाशी समाधान तैयार (CrO3) और फॉस्फोरस एसिड के २०.३ मिलीलीटर (एच3पीओ4, ८५%) में पानी की ५०० मिलीलीटर ।
    2. 1 एल डबल जैकेट चोंच में नक़्क़ाशी समाधान डालो । ६५ डिग्री सेल्सियस पर तापमान सेट करें ।
    3. सरगर्मी के तहत कम से कम 10 घंटे के लिए नक़्क़ाशी समाधान में ऑक्सीकरण अल थाली विसर्जित कर दिया । एल्यूमीनियम पंनी के साथ चोंच के ऊपर सील ।
    4. पानी के साथ कई बार धंसा हुआ अल प्लेट कुल्ला ।
  3. द्वितीयक यांगता
    1. 2.1.7 के लिए 2.1.1 कदम के रूप में ही प्रयोगात्मक शर्तों निर्धारित करें ।
    2. प्रणाली के anode के लिए धंसा अल प्लेट लोड और १९५ वी के 6 एच के लिए एक वोल्टेज लागू होते हैं । फिर, बिजली की आपूर्ति बंद करें और मैंयुअल रूप से क्लिप से अल थाली अलग । तत्काल पानी से भरे हुए अल प्लेट को धो लें ।
      नोट: जब धोने के समय में देरी हो रही है, ऐ का आकार ताकना अवशिष्ट फास्फोरस एसिड के कारण अनजाने में बढ़ जाती है ।
  4. ढाल ताकना चौड़ा करना
    1. एक को भंग करके एक ताकना चौड़ी समाधान तैयार ५.७६५ ग्राम में फॉस्फोरस एसिड की ५०० मिलीलीटर पानी की । एक 1 एल डबल जैकेट चोंच में समाधान डालो ।
    2. डबल जैकेट चोंच के लिए संचारकर्ता कनेक्ट और 30 डिग्री सेल्सियस पर तापमान निर्धारित किया है । एक रैखिक चलती मंच खड़ी चोंच के बगल में रखें । रेखीय चरण के चलायमान भाग में एक कोष्ठक अनुलग्न करें ।
    3. रेखीय चरण के चलायमान भाग को घर की स्थिति में सेट करें. कोष्ठक के लिए क्लिप संलग्न और यांग ऑक्सीकरण अल थाली लोड ।
    4. अल प्लेट मैंयुअल रूप से इतना है कि अल प्लेट समाधान की सतह के ऊपर आ जाएगा की स्थिति में हेरफेर ।
      नोट: इस चरण में अल प्लेट का समाधान नहीं छूना चाहिए । जैसे ही अल प्लेट समाधान पहुंचता है ताकना चौड़ा करने की प्रक्रिया शुरू होता है ।
    5. धीरे से समाधान में अल थाली विसर्जित ४.८६ µm/एस की गति से १२० मिनट के लिए १२० एनएम से एक आकार ढाल के साथ एक ३५ mm आओ मोल्ड बनाने के लिए २०० एनएम (जीपी 120/200) । इस समय एक स्टॉपवॉच शुरू अल प्लेट समाधान की सतह को छू लेती है ।
    6. जीपी 200/280 और जीपी 280/360 मोल्ड बनाने के लिए, क्रमशः 2 या 4 एच के लिए ताकना चौड़ा समाधान में जीपी 120/200 मोल्ड के पूरे क्षेत्र विसर्जित कर दिया ।
    7. ग्रैडिएंट अल प्लेट कई बार पानी के साथ कुल्ला ।

3. विरोधी के बयान ढाल ऐ मोल्ड पर चिपके हुए स्व के साथ परत-इकट्ठे Monolayer

नोट: एक दस्ताने बॉक्स में 3.3.3 करने के लिए 3.2.1 चरण निष्पादित करें । एक वैक्यूम पंप और सूखी नाइट्रोजन गैस इंजेक्टर को दस्ताने बॉक्स से कनेक्ट करें । dehumidification प्रक्रिया से पहले दस्ताने बॉक्स में सभी नमूनों, रिएजेंटों, और उपकरणों प्लेस । निकासी और नाइट्रोजन गैस इंजेक्शन चक्र को अधिक से अधिक तीन बार पर्याप्त रूप से दस्ताने बॉक्स से नमी को हटाने के लिए दोहराएँ । प्रयोग के माध्यम से सूखी नाइट्रोजन को प्रवाहित कर दें ।

  1. पिरांहा उपचार के साथ ऐ मोल्ड के हाइड्रॉक्सिल संशोधन
    1. एक polytetrafluoroethylene (PTFE) चोंच में सल्फर एसिड (एच2इतना4, ९५%) की १४० मिलीलीटर डालो । हाइड्रोजन पेरोक्साइड dropwise की ६० मिलीलीटर जोड़ें (एच2ओ2, 30%) । 30 मिनट के लिए छोड़ दो जब तक समाधान ठंडा है ।
      सावधानी: पिरांहा समाधान बनाते समय अत्यंत सावधानी बरतें । हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ने के क्षण से, समाधान जोरदार फोड़े और उच्च तापमान उत्पंन करता है । एक धुएं डाकू में प्रयोग करते हैं ।
    2. एक धातु नोचना का उपयोग 30 एस के लिए समाधान में ऐ मोल्ड विसर्जित कर दिया ।
    3. ऐ मोल्ड कुल्ला पानी के साथ कई बार । 30 मिनट के लिए पानी में ढालना भिगोएं और एक और 30 मिनट के लिए मिथाइल अल्कोहल में डाल दिया ।
      सावधानी: जब इस्तेमाल किया पिरांहा समाधान खारिज, नल का पानी की प्रचुर मात्रा के साथ समाधान पतला ।
    4. पूरी तरह से 3 एच के लिए वैक्यूम के तहत ऐ मोल्ड सूखी ।
  2. 20 × HDFS शेयर समाधान की तैयारी
    नोट: HDFS का संक्षिप्त रूप है (heptadecafluoro-1, 1, 2, 2,-tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silane
    1. आणविक छलनी के साथ एक-तिहाई एक 1 एल एन-hexane बोतल भरें । आयल फिल्म के साथ बोतल सील और यह सूखी नाइट्रोजन के तहत 24 घंटे के लिए स्टोर ।
    2. एक ग्लास सिरिंज और ०.२ µm PTFE सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर एन-hexane के २०० मिलीलीटर फिल्टर.
    3. एक १०० मिलीलीटर कांच की बोतल में छान एन-hexane की ८० मिलीलीटर डालो । HDFS के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. सेल्फी इकट्ठे monolayer साठा
    1. एक १०० मिलीलीटर यूरिन में फ़िल्टर्ड एन-hexane की ५७ मिलीलीटर लोड । विलायक में ऐ मोल्ड विसर्जित कर दिया ।
    2. २.९ mM HDFS सॉल्यूशन बनाने के लिए n-hexane के लिए 3 मिलीलीटर HDFS स्टॉक सॉल्यूशन जोड़ें । आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया के लिए 10 मिनट रुको ।
    3. ऐ मोल्ड को फ्रेश एन-hexane पर ट्रांसफर कर दीजिये । बंद करो और सभी एजेंट की बोतलें सील । नाइट्रोजन वाल्व बंद है, तो बाहर दस्ताने बॉक्स से नमूने खींच ।
      नोट: HDFS नमी के प्रति बेहद संवेदनशील है । HDFS में एक desiccator में शामिल सभी एजेंट संग्रहीत है ।
    4. ऐ मोल्ड सोख methoxynonafluorobutane के ६० मिलीलीटर में (सी10एच6एफ18ओ2, ९९%) । अल्ट्रासोनिक एक चोंच में ऐ मोल्ड साफ 10 एस प्रति एक बार के लिए शारीरिक रूप से adsorbed HDFS अणुओं को दूर करने के लिए । सफाई प्रक्रिया को 10 बार दोहराएं ।
      नोट: अंतराल के बिना एक लंबे समय के लिए अल्ट्रासोनिक के लिए ऐ मोल्ड उजागर ऑक्साइड परत को नुकसान होगा ।
    5. पूरी तरह से 24 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत ऐ मोल्ड सूखी
      नोट: एक सफलतापूर्वक जमा विरोधी परत चिपके सुपर पानी से बचाने वाली क्रीम और महीनों के लिए स्थिर है जब एक desiccator में संग्रहीत । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है ।

4. थर्मल प्रिंटिंग द्वारा ढाल Nanopattern प्लेटों का निर्माण

नोट: चरण ४.२ करने के लिए ४.७ एक साफ़ कक्ष में निष्पादित करें ।

  1. एक मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) कटर का उपयोग कर २.९ मिमी चौड़ा के एक आकार के लिए एक १.१ मिमी मोटी polystyrene शीट में ३.७ मिमी तक कटौती ।
  2. एक निप्र का उपयोग कर नीचे से ऐ मोल्ड ३५ mm कट । नमूना नाम और निर्माण की तारीख पर पीठ पर निशान ।
  3. एथिल शराब की एक छोटी सी खुराक के साथ एक ८.० "वेफर साफ । वेफर पर polystyrene चादरें रखो, तो ले आओ मोल्ड माउंट ।
  4. एक थर्मल प्रिंटर के दराज में नीचे फिल्म रखो । गैसकेट के लिए शीर्ष फिल्म देते हैं ।
  5. नीचे की फिल्म पर वेफर लगा दें । वेफर पर गैसकेट प्लेस । सुनिश्चित करें कि वहां वेफर पर धूल नहीं है ।
  6. थर्मल रिप्रिंटर के दराज बंद करो । १०० s के लिए दबाव के १६५ ° c गर्मी और ६२०.५२ केपीए लागू करें ।
  7. कमरे के तापमान के लिए नमूना ठंडा । धीरे polystyrene शीट ट्विस्ट को ऐ मोल्ड रिलीज ।

५. ढाल Nanopattern प्लेटों का बंध्याकरण एवं हाइड्रोफिलिक संशोधन

  1. एक चौकोर पकवान पर nanopattern प्लेट रखें । डालो १०० ७०% एथिल शराब की मिलीलीटर और 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश को बेनकाब ।
  2. nanopattern प्लेट्स को नाइट्रोजन के साथ सुखा लें । एक ऑक्सीजन प्लाज्मा जनरेटर के लिए nanopattern प्लेटों स्थानांतरण ।
  3. चैंबर खाली जब तक यह १.३३ पीए तक पहुंचता है । फिर, 30 सेमी3/min. की एक दर पर ऑक्सीजन इंजेक्षन ६० डब्ल्यू के एक रेडियो आवृत्ति शक्ति लागू ९० एस के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा बनाए रखने के ।
    नोट: यह 14 दिनों के भीतर प्लाज्मा इलाज nanopattern प्लेटों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।
  4. टोल्यूनि की एक बूंद का उपयोग कर एक कोशिका संस्कृति पकवान के नीचे करने के लिए nanopattern प्लेट संलग्न करें ।
  5. एक थैली में नमूने सील और कम तापमान प्लाज्मा नसबंदी के साथ निष्फल ।

6. hECFCs की खेती

नोट: 4 ° c पर सभी केंद्रापसारक प्रक्रियाओं आचरण जब तक अंयथा उल्लेख किया ।

  1. परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) को अलग करने से पहले, 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक कोलेजन-लेपित 12-अच्छी तरह से संस्कृति पकवान मशीन ।
  2. धो 12-अच्छी तरह से संस्कृति 1 × बाँझ फॉस्फेट (पंजाब) खारा बफर का उपयोग कर पकवान ।
  3. एक हेपरिन अवरोध करनेवाला ट्यूब का उपयोग कर मानव रक्त की ५० मिलीलीटर लीजिए.
  4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हाइड्रोफिलिक polysaccharide समाधान के 6 मिलीलीटर रखो और हाइड्रोफिलिक polysaccharide समाधान के लिए रक्त की 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: धीरे से खून को हाइड्रोफिलिक polysaccharide सॉल्यूशन में पिपेट ।
  5. 20 मिनट के लिए १०२० x g पर ट्यूब के लिए कोशिकाओं की गोली केंद्रापसारक ।
  6. फसल अपारदर्शी सेल परत, और एक नया 15 एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  7. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) शामिल-पंजाबियों समाहित और 10 मिनट के लिए १०२० x g पर ट्यूब के लिए कोशिकाओं की गोली केंद्रापसारक ।
  8. supernatant निकालें और लाल-रक्त कोशिका lysis बफर जोड़ें । 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखो ।
  9. 10% FBS शामिल-पंजाबियों निहित है और 5 मिनट के लिए १०२० x g पर ट्यूब के लिए कोशिकाओं गोली केंद्रापसारक ।
  10. supernatant को हटाएं और 10% FBS-निहित पंजाबियों जोड़ें । 5 मिनट के लिए १०२० x g पर ट्यूब के लिए कोशिकाओं को गोली ।
  11. supernatant निकालें और endothelial सेल विस्तार मध्यम 10% FBS के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर जोड़ें । बीज ८.० × 10 प्रत्येक कोलेजन के लिए अच्छी तरह से प्रति6 कोशिकाओं लेपित पकवान ।
  12. 1 सप्ताह के लिए संस्कृति माध्यम हर दिन बदलें । फिर, संस्कृति माध्यम हर 2 दिन बदल जाते हैं ।
    नोट: hECFCs संस्कृति दिवस 10-14 के बाद पाया जा सकता है । hECFCs ठेठ cobblestone की तरह आकृति विज्ञान दिखाने के लिए और एक कॉलोनी है जो चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी में मनाया जा सकता है फार्म । संवहनी endothelial cadherin (CD144) और वॉन Willebrand फैक्टर (vWF) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला भी आगे सेल विस्तार के बाद hECFCs के लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है ।
  13. hECFCs खेती करने के लिए, endothelial सेल विस्तार मध्यम 5% FBS के साथ पूरक का उपयोग करें और 5% सह2युक्त एक humidified वातावरण में ३७ ° c पर पेनिसिलिन/streptavidin । मध्यम एक दिन में एक बार बदलें ।
  14. hECFC प्रेरण के बाद, आगे के प्रयोगों के लिए 7 बीतने के लिए कोशिकाओं को विकसित.

7. कोशिका बोने और ढाल Nanopattern प्लेटों पर संस्कृति

नोट: चरण 7 ग्रेडिएंट nanopattern प्लेट पर hECFCs की संस्कृति का वर्णन करता है, लेकिन अंय सेल स्रोतों का भी उपयोग किया जा सकता है ।

  1. कोट 10 मिनट के लिए पंजाब में ०.१% प्रोटीन कोटिंग समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ ढाल nanopattern प्लेटें कमरे के तापमान पर ।
    नोट: ०.१% प्रोटीन कोटिंग nanopillar सुविधाओं को कवर नहीं करता है ।
  2. trypsin का उपयोग करके एक मानक सेल-विभाजन विधि द्वारा संस्कृति पकवान से एक hECFCs निलंबन बनाओ ।
  3. वांछित संगम को प्राप्त करने के लिए सेल सस्पेंशन को पतला करें । बीज ढाल nanopattern प्लेटें और फ्लैट नियंत्रण पर hECFCs (जैसे, १.० × 104 कोशिकाओं/
    नोट: जब hECFCs ढाल nanopattern प्लेटों पर १.० × 104 कोशिकाओं/सेमी2 पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, कोशिका प्रवाह आमतौर पर 2 दिनों के बाद ७०-८०% तक पहुंचता है ।
  4. संस्कृति फ्लैट या ढाल nanopattern प्लेटों पर मशीन में 2 दिनों के लिए कोशिकाओं ।

8. प्रेक्षण और विश्लेषण

  1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) इमेजिंग
    1. तय hECFCs सपाट या ढाल nanopattern प्लेटों पर २.५% glutaraldehyde के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात के लिए प्रसंस्कृत ।
    2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1% आज़मियम tetroxide का इलाज । पंजाबियों के साथ नमूने धो लें ।
    3. एथिल शराब के साथ निर्जलीकरण के नमूनों को कम से उच्च एकाग्रता (५०%, ७०%, ८०%, ९०%, और १००%) प्रति 10 मिनट के लिए प्रत्येक चरण के लिए ।
    4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए hexamethyldisilazane (HMDS) का इलाज करें । उसके बाद, ताजा HMDS के साथ नमूनों को धोने और धुएं हूड के तहत नमूने छोड़ने के लिए जब तक अवशिष्ट HMDS पूरी तरह से वाष्पित हो जाता है ।
    5. कोट 5 मिनट के लिए प्लेटिनम धूम कोट के साथ नमूने और एक SEM के साथ नमूनों की जांच ।
  2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग
    1. तय hECFCs फ्लैट या ढाल nanopattern प्लेटों पर 2% paraformaldehyde और २.५% glutaraldehyde मिश्रण के साथ पंजाब में रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. 1% आज़मियम tetroxide और निर्जलीकरण 8.1.3 में विधि का उपयोग कर नमूने का उपयोग कर पोस्ट-निर्धारण करते हैं ।
    3. epoxy राल में एंबेड नमूने । ब्लॉकों से ६० एनएम मोटी वर्गों बनाओ और एक उनि ग्रिड पर एक खंड जगह है ।
    4. १०० मिलीलीटर मिथाइल अल्कोहल में 10 मिलीग्राम uranyl एसीटेट के मिश्रण के साथ अनुभाग दाग और १०० मिलीलीटर आसुत पानी में ०.१ मिलीग्राम सीसा साइट्रेट । एक उनि के साथ छवियों को प्राप्त करें ।
  3. प्रतिदीप्ति धुंधला
    1. फिक्स hECFCs 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% paraformaldehyde के साथ फ्लैट या ढाल nanopattern प्लेटों पर प्रसंस्कृत ।
    2. Permeabilize और ब्लॉक नमूनों के साथ 5% बकरी सीरम और ०.१% octylphenol ethoxylate में पंजाब (PBST) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए.
    3. PBST के साथ तीन बार 2 एच कुल्ला नमूनों के लिए कमरे के तापमान पर विरोधी मानव vinculin प्राथमिक एंटीबॉडी (1:500 में PBST) के साथ मशीन के नमूने ।
    4. प्रतिदीप्ति के साथ मशीन नमूने-संयुग्मित phalloidin (1: PBST में 1000), प्रतिदीप्ति-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:1000 PBST में) 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कुल्ला नमूने PBST के साथ तीन बार ।
    5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 PBST में) के साथ मशीन नमूने ।
    6. छोड़ 10 ढाल nanopattern की सतह पर बढ़ते माध्यम के µ एल । बढ़ते मध् यम पर एक coverslip लगाएं ।
    7. नमूना चरण पर उल्टा नीचे रखें और फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण ।
  4. छवि विश्लेषण
    1. एक छवि विश्लेषण प्रणाली के लिए hECFCs के कब्जा छवियों स्थानांतरण ।
    2. phalloidin धुंधला छवि के यादृच्छिक क्षेत्र चुनें । थ्रेशोल्ड समायोजित करें और एक बाइनरी छवि बनाएं जिसमें कक्ष पृष्ठभूमि से अलग हों ।
    3. कक्ष क्षेत्र और परिधि को मापने के लिए कक्षों के चारों ओर आकृति आरेखित करें और कक्ष प्रति filopodia संख्या मैन्युअल रूप से गिनना.
    4. vinculin धुंधला छवि के यादृच्छिक क्षेत्र चुनें । सीमा को समायोजित और फोकल आसंजन क्षेत्रों के एक द्विआधारी छवि बनाने के लिए ।
      नोट: कृत्रिम से बचने के लिए उचित रूप से छवि थ्रेशोल्ड समायोजित करें-या फोकल आसंजन क्षेत्रों के तहत भरने ।
    5. प्रत्येक कक्ष के फोकल आसंजन की संख्या की गणना ।

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Representative Results


1 चित्रा अपने प्रकार और स्थिति के अनुसार गढ़े ढाल आओ मोल्ड के SEM छवियों से पता चलता है । चित्रा 2 नियमित रूप से गोल nanopillars के साथ ढाल nanopattern प्लेट की SEM छवियों से पता चलता है, और चित्रा 3 nanopillar व्यास के ठहराव डेटा है । तालिका 1 गढ़े nanopillars की विशेषताओं को सूचीबद्ध करता है ।

चित्रा 4a रक्त व्युत्पंन hECFCs की खेती की योजना से पता चलता है । चित्रा 4B thecultivated hECFCs के चरण विपरीत छवि से पता चलता है । चित्र 4c CD144 (हरा), vWF (लाल), और नाभिक (नीला) के साथ सना हुआ hECFC मार्करों से पता चलता है । चित्रा 5 फ्लैट, जीपी 120/200, जीपी 200/280, और जीपी 280/360 प्लेटों पर संस्कृति के 2 दिनों के बाद hECFCs के प्रतिनिधि SEM छवियों से पता चलता है । चित्रा 5B और सी कक्ष क्षेत्र और परिधि पर मात्रात्मक डेटा के रूप में फ्लैट की तुलना में चित्रित । ठहराव डेटा से पता चला है कि छोटे आकार के nanopillar सतहों पर उगाई कोशिकाओं कम सेल क्षेत्र और परिधि दिखाया । चित्रा 5d hECFCs के प्रतिनिधि SEM छवियों जो मौजूदा filopodia की आकृति विज्ञान दिखा रहा है । चित्रा 5E फ्लैट की तुलना में filopodia संख्या पर मात्रात्मक डेटा को दर्शाया गया है । GP200/280 या GP280/360 में फ़्लैट के साथ तुलना में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया, जबकि महत्वपूर्ण filopodial वृद्धि GP 120/200 पर cultureed कक्षों में स्वीकार्य किया गया था । चित्रा 5F फ्लैट और ढाल nanopattern प्लेटों पर संस्कृति के 2 दिनों के बाद hECFCs के प्रतिनिधि उनि छवियों से पता चलता है.

Figure 1
चित्र 1. ढाल ले आओ मोल्ड । , जीपी 120/200, जीपी 200/280, और जीपी के लिए ढाल ऐ molds के SEM छवियां 280/360 प्लेटें molds की स्थिति के अनुसार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . ग्रैडिएंट nanopattern प्लेट्स । स्तंभ प्रकार ग्रैडिएंट nanopattern प्लेट्स gp 120/200, gp 200/280, और gp 280/360 प्लेटों की स्थिति के अनुसार के लिए के SEM छवियां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . nanopillar व्यास का आकार ढाल । ठहराव डेटा gp 120/200, gp 200/280, और gp 280/360 प्लेटें, क्रमशः के लिए nanopillar व्यास के ढाल दिखा रहा है । पट्टियां मानक त्रुटि दर्शाती हैं । यह आंकड़ा [Acta Biomaterialia] से संशोधित किया गया था 20. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कामवाली की मापांक (GPa) Nanopillar व्यास (एनएम) Nanopillar पिच (एनएम) केंद्र से मध्य दूरी (एनएम) Nanopillar ऊँचाई (एनएम) Nanopillar कठोरता (एन एम/
फ्लैट 2.43 ± 0.19 – – – – –
जीपी 120/200 1.74 ± 0.11 120 – 200 320 – 240 ४४० 276.9 ± 21.9 ९.३५
जीपी 200/280 2.01 ± 0.05 200 – 280 240 – 160 ४४० 268.1 ± 25.9 ५५.७८
जीपी 280/360 2.1 ± 0.13 280 – 360 160 – 80 ४४० 293.6 ± 23.6 १३४.१५

तालिका 1. गढ़े nanopillars के लक्षण । Quantified है युवा मापांक, व्यास, पिच, केंद्र के लिए केंद्र दूरी, ऊंचाई, और गढ़े nanopillars की कठोरता दिखा डेटा । इस सारणी से संशोधित किया गया [Acta Biomaterialia] 20।

Figure 4
चित्र 4 . hECFCs के लक्षण वर्णन । (क) योजनाबद्ध वयस्क परिधीय रक्त से व्युत्पंन hECFCs की अनुसूची दिखा आरेख । (ख) hECFC कॉलोनी के चरण विपरीत छवि, 14 दिन पर वयस्क परिधीय रक्त से व्युत्पंन । (ग) Immunofluorescent छवियां दिखा CD144 (हरा), vWF (लाल), और सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग । यह आंकड़ा [Acta Biomaterialia] से संशोधित किया गया था 20. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 . hECFCs 2 दिनों के लिए फ्लैट और ढाल nanopattern प्लेटों पर कल्चर्ड । (एक) hECFCs के प्रतिनिधि SEM छवि फ्लैट, जीपी 120/200, जीपी 200/280, और जीपी 280/360 प्लेटों पर कल्चरित । (B और C) hECFCs (n = ५०) के क्षेत्र और परिधि के ठहराव डेटा । * के रूप में फ्लैट की तुलना में p < .05 । (घ) प्रतिनिधि SEM फ्लैट और ढाल nanopattern प्लेटों पर hECFCs के अग्रणी धार के चित्र । (ङ) filopodia प्रति एक hECFC (n = 20) की संख्या का ठहराव डेटा. * के रूप में फ्लैट की तुलना में p < .05 । (च) समतल और ग्रैडिएंट nanopattern प्लेटों पर hECFC कल्चरल की प्रतिनिधि उनि छवि. सफेद तीर hECFCs और सब्सट्रेट सतह के बीच बातचीत अंक संकेत मिलता है । यह आंकड़ा [Acta Biomaterialia] से संशोधित किया गया था 20. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 1. प्राचीन ऐ के जल संपर्क कोण और HDFS ले आओ । संपर्क कोण HDFS स्व इकट्ठे monolayer के hydrophobic गुण दिखा माप (एक) से पहले और, (ख) उपचार के बाद । कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़ा 2 । एक ही ले आओ मोल्ड के साथ गढ़े ढाल nanopattern प्लेट्स के SEM छवियां । ऐ मोल्ड के स्थायित्व की पुष्टि के लिए तुलनात्मक SEM छवि सेट । (क) ढाल nanopattern प्लेट हौसले से बनाया मोल्ड के साथ उत्पादित । (ख) ग्रैडिएंट nanopattern थाली 15 बार अंकित करने के बाद आओ मोल्ड के साथ उत्पादित । कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़ा 3 । प्रोटीन कोटिंग के प्रभाव । hECFCs कि जीपी 120/200, जीपी 200/280, या जीपी 280/360 ढाल nanopattern प्लेट्स (एक) के बिना या (ख) प्रोटीन कोटिंग के साथ पर कल्चरित थे SEM छवियां । यह आंकड़ा [Acta Biomaterialia] से संशोधित किया गया था 20 कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एक आओ के निर्माण अक्सर ऐसी दरारें के रूप में दोषों से ग्रस्त है, pores के अनियमित आकार, और जलती हुई । इन दोषों के लिए मुख्य कारण एक इलेक्ट्रोलाइटिक टूटने कहा जाता है, जो धातु सब्सट्रेट और इलेक्ट्रोलाइट21के प्रतिरोधकता की प्रकृति से दृढ़ता से प्रभावित है । इलेक्ट्रोलाइट के प्रतिरोधकता के तापमान पर निर्भर करता है के बाद से, इलेक्ट्रोड से लगातार गर्मी को नष्ट करने के लिए इस तरह के एक उच्च वोल्टेज ऑक्सीकरण हालत में स्थिर के रूप में इलेक्ट्रोलाइट के स्थानीय तापमान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण बिंदु है । इस प्रोटोकॉल में, हम है मसुदा दो कदम को संशोधित करने के द्वारा ऐ मोल्ड गढ़े,22,23। लगभग आधा मिथाइल अल्कोहल के साथ इलेक्ट्रोलाइट की जगह न केवल कम तापमान पर ठंड से इलेक्ट्रोलाइट रोकता है, लेकिन यह भी24ताकना के तल पर वाष्पीकरण से गर्मी के इलेक्ट्रोड वंचित । एक उपरि सरगर्मी और उत्तेजित करने के बजाय एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग करने के लिए कारण भी तापमान नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए है । ठेठ चुंबकीय सरगर्मी लंबी अवधि के आपरेशन के दौरान चुंबकीय पट्टी के आकस्मिक ग़लत संरेखण के कारण सुस्ती के एक उच्च संभावना है । यह समस्या इलेक्ट्रोलाइट के अनुचित संचलन लाती है, अपने तापमान को बढ़ाने, और जलने के लिए अग्रणी ।

ऐ मोल्ड करने के लिए एक आकार ढाल देने के लिए, हम धीरे से एक फॉस्फोरस एसिड नक़्क़ाशी समाधान में ऐ ले डूबे । pores समय ऐ के अनुपात में चौड़ा कर रहे है नक़्क़ाशी समाधान में रहता है, जैसा कि 1 चित्रमें दिखाया गया है । इस हालत के तहत, औसत ताकना-चौड़ा करने की दर है ०.६७ एनएम/विसर्जित गति और समय के आकार ढाल और ऐ के अधिकतम ताकना व्यास की ढलान बदल जाएगा । अधिकतम संभव ताकना व्यास ४०० एनएम है । जब एक प्रकार का व्यास ४०० एनएम से अधिक है, pores के बीच की रिक्ति दीवार इतनी पतली हो जाता है कि यह थर्मल प्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान दबाव बर्दाश्त नहीं कर सकता ।

एक HDFS स्व-इकट्ठे monolayer सामग्री25सतह के लिए एक hydrophobic संपत्ति जोड़ने के लिए सक्षम होने के लिए जाना जाता है । HDFS अणु पिरांहा उपचार26द्वारा पेश ऐ सतह पर हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ एक मजबूत आबंध बांड बनाता है । इसलिए, के रूप में अनुपूरक चित्रा 1 में दिखाया गया है, एक ठोस स्वयं इकट्ठे monolayer जब हाइड्रॉक्सिल समूहों की एक बड़ी संख्या सब्सट्रेट सतह पर मौजूद है गठन किया जा सकता है । एक HDFS आत्म इकट्ठे monolayer के साथ इष्टतम गुणवत्ता के लिए, हम एक dehumidified वातावरण में प्रतिक्रिया आयोजित करने का सुझाव । जब HDFS नमी, पानी रूपों dimers, ट्रिमर, और यहां तक कि silane अणुओं के oligomers के साथ एक तरफ प्रतिक्रिया के संपर्क में है, और आत्म इकट्ठे monolayer की समग्र गुणवत्ता घट जाती है ।

थर्मल nanoimprinting में एक आकार ढाल के साथ ऐ मोल्ड का उपयोग करने पर, nanopillars के एक ढाल के साथ सेल संस्कृति प्लेटें चित्रा 2 और चित्रा 3प्राप्त किए गए थे । थर्मल nanoimprinting विधि में एक लाभ यह है कि यह समान nanopattern प्लेटों की एक बड़ी मात्रा में एक ऐ मास्टर मोल्ड का उपयोग करके उत्पादन कर सकते हैं । अनुपूरक आंकड़ा 2 से पता चलता है कि वहां का उत्पादन nanopattern की गुणवत्ता में कोई फर्क नहीं है, यहां तक कि पंद्रह मुद्रण प्रक्रियाओं के बाद, नए ऐ मोल्ड द्वारा उत्पादित nanopattern की तुलना में । एक nanopattern के हस्तांतरण के लिए एक सामग्री के रूप में polystyrene चुनने के लिए कारण यह है कि polystyrene थर्मल प्रिंटिंग के लिए एक उपयुक्त ग्लास संक्रमण तापमान (१०० ° c) है, और यह व्यापक रूप से वाणिज्यिक सेल संस्कृति के कारण व्यंजन में प्रयोग किया जाता है इसके पारदर्शी और विषैले गुण ।

थर्मल nanoimprinting विधि का उपयोग कर उच्च पहलू अनुपात के साथ nanostructures बनाना मुश्किल है । क्योंकि, जब इस तरह के दबाव और समय में वृद्धि के रूप में प्रक्रिया की स्थिति, मोल्ड गहरा बहुलक सब्सट्रेट में एंबेडेड हो जाता है, यह कठिन सब्सट्रेट से मोल्ड अलग करने के लिए बना । इसलिए, यह बहुत 1:3 या हमारे nanoimprinting तकनीक का उपयोग कर के एक पहलू अनुपात होने nanopatterns उत्पादन चुनौतीपूर्ण है । हालांकि, के अनुसार उनि छवियां हम चित्रा 5Cमनाया, हम एक दिलचस्प तथ्य यह है कि nanopatterns पर कोशिकाओं की झिल्ली nanopattern के नीचे के साथ संपर्क में नहीं था पाया है । दूसरे शब्दों में, सभी भौतिक उत्तेजनाओं कि कोशिकाओं की प्रतिक्रिया में हेरफेर कर सकते है nanopattern के शीर्ष भागों से उत्पंन किया गया । इसलिए, इस अध्ययन में, हम nanopattern को सेल के अध्ययन प्रतिक्रियाओं में पहलू अनुपात पर विचार नहीं किया था । के रूप में अनुपूरक आंकड़ा 3में दिखाया गया है, ०.१% प्रोटीन कोटिंग समाधान nanopillar सतहों पर hECFCs के लगाव पर कोई प्रभाव नहीं था । इसके अलावा, ढाल nanopattern प्लेटों से इन nanoscaled उत्तेजनाओं कोशिका क्षेत्र और hECFCs और वृद्धि हुई filopodial वृद्धि चित्रा 5की परिधि में कमी आई ।

संक्षेप में, हम इन विट्रो मेंhECFCs की प्रतिक्रिया में हेरफेर द्वारा ढाल nanopattern प्लेट की स्थापना की । पता करने के लिए वास्तव में nanostructures कोशिकाओं का क्या आकार बहुत प्रभावित कर रहे हैं, एक भविष्य के काम के आकार ढाल और ंयूनतम nanopillars की अधिकतम व्यास की ढलान का समायोजन करके एक सेल विशेष आकार nanopillar डिजाइन करने के लिए आवश्यक है । हम इस ढाल nanopattern की उंमीद करने के लिए एक आकर्षक उपकरण के लिए कोशिकाओं और nanostructures के बीच बातचीत स्क्रीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में उंनत सेल niches जिसमें nanostructures स्वतंत्र रूप से आकार में देखते हो सकता है प्रदान हो ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित शिक्षा मंत्रालय, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (MEST) [एनआरएफ-2015R1D1A1A01060397] और बायो एंड मेडिकल टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट के माध्यम से किया गया था विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ के कार्यक्रम, आईसीटी और भविष्य की योजना [एनआरएफ-2017M3A9C6029563].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perchloric acid 60% Daejung Chemicals & Metals 6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9% Daejung Chemicals & Metals 4118-4100
Phosphoric acid 85% Daejung Chemicals & Metals 6532-4400
Methyl alcohol 99.5% Daejung Chemicals & Metals 5558-4400
Chromium(VI) oxide Daejung Chemicals & Metals 2558-4400
Sulfuric acid 95% Daejung Chemicals & Metals 7781-4100
Hydrogen peroxide 30% Daejung Chemicals & Metals 4104-4400
n-hexane 95% Daejung Chemicals & Metals 4081-4400
Toluene 99.5% Daejung Chemicals & Metals 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane Gelest SIH5840.4 Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99% Sigma aldrich 464309
Collagen solution Stemcell #4902
Gelatin Sigma aldrich G1890 Protein coating solution
Ficoll-Paque GE Heathcare 17-1440-03 Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV Lonza CC-3202 Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline Gibco 10010031
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Paraformaldehyde Sigma aldrich P6148
Glutaraldehyde Sigma aldrich G5882-100ML
Osmium tetroxide Sigma aldrich 201030-1G
Hexamethyldisilazane Sigma aldrich 440191
Triton X-100 Sigma aldrich X100-100ML Octylphenol ethoxylate 
Goat serum Gibco 26050-088
anti-human vinculin primary antibody  Sigma aldrich V9131
F-actin probe Molecular Probes A12379 Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Molecular Probes A11001 Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole  Sigma aldrich D9542
Mounting medium DAKO S3023
Anti-human vWF primary antibody  DAKO A0082
Anti-human CD144 primary antibody  BD Biosciences #555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA Ted Pella 18012 Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g Ted Pella 19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g Ted Pella 19312
Ultra pure aluminum plate Goodfellow 26050-088
Polystyrene sheet Goodfellow ST313120
8.0" silicon wafer Siltron 29-01024-03 Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L Kartell KA.230
Vacuum pump Vacuumer V3.VOP100
Power supply Unicorntech UDP-3003
Magnetic stirrer Daihan scientific SL.SMS03022
Overhead stirrer Daihan scientific HT120DX
Circulator Daihan scientific WCR-P12
Linear moving stage Zaber A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees Zaber AB90M Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm Vitlab 67995 Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL Cowie CW007.25
Ultrasonic cleaner Branson B2510MTH
PCB cutter Hozan Tool Industrial K-110
Nanoimprint device Nanonex NX-2000
Oxygen plasma generator Femto Science CUTE
Low temperature sterilizer Lowtem Crystal 50
CO2 Incubator Panasonic MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope Carl Zeiss LSM700
Scanning electron microscope JEOL JSM6701
Transmission electron microscope Hitachi H-7500

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References

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इंजीनियरिंग अंक १३७ anodic एल्यूमिनियम ऑक्साइड nanoimprint लिथोग्राफी ढाल nanopattern प्लेटें extracellular मैट्रिक्स शारीरिक उत्तेजना मानव endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं
थर्मल Nanoimprinting तकनीक और मानव Endothelial कॉलोनी के गठन की प्रतिक्रिया की स्क्रीनिंग द्वारा ढाल Nanopattern के निर्माण कोशिकाओं
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Kim, D. H., Cui, L. H., Seo, H. R.,… More

Kim, D. H., Cui, L. H., Seo, H. R., Joo, H. J., Choi, S. C., Lim, D. S., Lee, K. B. Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells. J. Vis. Exp. (137), e57661, doi:10.3791/57661 (2018).

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