Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصنيع لوحات نانوباتيرن التدرج عبر نانويمبرينتينج الحرارية وطريقة فحص استجابات الخلايا البشرية السلف بطانية للنانو. باستخدام هذه التكنولوجيا الموصوفة، من الممكن لإنتاج سقالة التي يمكن التعامل مع سلوك الخلية بالمحفزات المادية.
Abstract
نانوتوبوجرافي يمكن العثور عليها في مختلف المصفوفات خارج الخلية (ECMs) في جميع أنحاء الجسم، ومن المعروف أن لديها الإجراءات التنظيمية الهامة عليها التفاعلات الخلوية. ومع ذلك، من الصعب تحديد العلاقة بين حجم نانوستروكتوري والردود الواردة من الخلايا نظراً لعدم وجود أدوات الفحص السليم. وهنا نعرض وضع لوحات نانوباتيرن التدرج استنساخه وفعالة من حيث التكلفة للتلاعب بالاستجابات الخلوية. استخدام أكسيد الألومنيوم انوديك (AAO) كقالب رئيسي، لوحات نانوباتيرن التدرج مع نانوبيلارس لزيادة قطرها يتراوح [120-200 نانومتر (GP 120/200) و 200-280 نانومتر (سباق الجائزة الكبرى 200/280) 280-360 نانومتر (GP 280/360)] كانت ملفقة من حرارية ولﻷخذ تقنية. هذه اللوحات نانوباتيرن التدرج صممت لتحاكي مختلف الأحجام من نانوتوبوجرافي في إدارة المحتوى في المؤسسة واستخدمت لفحص استجابات الخلايا البطانية البشرية تشكيل مستعمرة (هيكفكس). في هذا البروتوكول، يمكننا وصف الإجراء خطوة بخطوة من اختﻻق لوحات نانوباتيرن التدرج للخلية الهندسة وتقنيات زراعة هيكفكس من الدم المحيطي البشري، واستزراع هيكفكس على لوحات نانوباتيرن.
Introduction
في الآونة الأخيرة، قد تم الأضواء استجابة الخلايا بالتحفيز المادي لتضاريس السطح في مجال الخلية الهندسة1،2،،من34. ولذلك، انصب الاهتمام أكثر في النانو ثلاثية الأبعاد في الخلية السطحية المرفق5. وأفيد أن إنتغرين، الذي هو الجهاز التعرف على سطح الخلية، ويحيل الحافز المادي مدفوعا بهياكل نانو الصغيرة لإدارة المحتوى في المؤسسة من خلال توصيل mechano6. ينظم سلوك الخلية من خلال التوجيه الاتصال7 هذا التحفيز الميكانيكي والحث على إعادة تنظيم سيتوسكيليتال تغيير الشكل، بالإضافة إلى التنسيق الالتصاقات وتصلب الخلايا8.
الخلايا البشرية السلف غشائي (هيبكس) في الجسم التفاعل عن كثب مع المكروية ECM المحيطة بها9. وهذا يشير إلى أن الحالة المادية لإدارة المحتوى في المؤسسة مثابة معياراً هاما للخلية المحددة-المصفوفة المعقدة التصاق تشكيل قدر إجهاد القص المستمدة من تدفق الدم10. وأفيد أن نانوتوبوجرافي السطحية ويعزز تشكيل شبكات أنابيب شعرية واسعة من هيبكس11 في المختبر وأن عاملاً لذوبان ECM/بيو مجتمعة نظام يتيح هيبكس الاعتراف بركائز مختلة ويعزز الجرح الشفاء12،13. ومع ذلك، لا يفهم وضوح العلاقة بين إدارة المحتوى في المؤسسة وهيبكس.
على الرغم من أن العديد من الباحثين حاولوا توضيح العلاقة بين استجابات الخلية والرموز المادية من ركائز مختلفة14،،من1516، هذه الدراسات تستخدم فقط في حجم ثابت من نانوستروكتوري أو نانوباتيرنس مع الترتيبات غير النظامية التي لها حد توضيح العلاقة بين حجم السلوك نانوستروكتوري وخلية. والمشكلة هنا هو الافتقار إلى الأدوات المناسبة لفحص الاستجابات الخلوية التي يمكن استبدال النهج القائمة مملة ومتكررة لإيجاد الحجم الأمثل نانوستروكتوري. ولذلك، مطلوب تقنية مباشرة لفحص ردود الفعل خلية على التحفيز الجسدي دون تكرار.
هنا، يمكننا وصف أسلوب يستخدم في أعمالنا السابقة تقارير18،،من1719 لإنتاج نانوباتيرن تدرج فيها قطر نانوبيلارس مرتبة يزيد تدريجيا. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا وصف كيفية زراعة وتحليل سلوك هيكفكس في لوحات نانوباتيرن التدرج لتحديد تأثير المحفزات المادية على الخلايا. واستخدمت anodization معتدل، والنقش تدريجيا، وأسلوب طلاء طبقة اللصق المضادة اختﻻق التدرج AAO العفن. وباعتماد حرارية ولﻷخذ تقنية الطباعة الحجرية، أنتجت نانوباتيرنس التدرج البوليستيرين متطابقة بطريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة. استخدام التدرج نانوباتيرنس، أنه من الممكن لتحديد حجم نانوستروكتوري له تأثير كبير على سلوك الخلية في مجموعة واحدة من التجربة. ونحن نتوقع أن هذا التدرج نانوباتيرن سوف تكون مفيدة في فهم آليات التفاعل بين هيكفك المستمدة من الدم أو الخلايا الأخرى وأحجام مختلفة من النانو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر "مجلس المراجعة المؤسسية" في مستشفى أنام جامعة كوريا (رقم الكندي هذه الدراسة ED170495). وأجريت جميع الإجراءات وفقا "إعلان هلسنكي" وتعديلاته اللاحقة.
1-إعداد الركازة الألومنيوم (Al) من اليكتروبوليشينج
تنبيه: اليكتروبوليشينج والحل التآكل والسامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك النتريل قفازات ونظارات واقية ومعطف المعمل. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان.
- إعداد حل اليكتروبوليشينج بخلط إيثيل الكحول (2ح ج5أوه، 99.9 ٪) وحمض بيرتشلوريك (هكلو4، 60 في المائة) في كوب سترة مزدوجة 1 لتر (ج2ح5OH:HClO4 = 4:1).
- الاتصال الكأس سترة مزدوجة مدوار وضبط درجة الحرارة عند 7 درجة مئوية. وضعت الكأس سترة مزدوجة محرض مغناطيسية. اترك الحل تحت التحريك لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 7 درجات مئوية.
- تزج لوحة بن عالي النقاوة (99.999%، 20 × 50 × 1 مم3) والكربون العداد الكهربائي في اليكتروبوليشينج الحل باستخدام مقاطع التماسيح والأسلاك النحاسية. ضبط موضع لوحة ال ومسرى الكربون مضادة لمواجهة بعضها البعض.
ملاحظة: من الضروري تثبيت القصاصات بعناية حتى لا تتعرض للمس الحل. عند اتصال مع الحل، يمكن أن تلوث الشوائب المتدفقة من القصاصات لوحة ال. - توصيل لوحة ال إلى محطة إيجابية، والكربون العداد الكهربائي إلى المحطة الطرفية السلبية، التيار المباشر (DC) إمدادات الطاقة.
- إيقاف محرض المغناطيسية وتطبيق جهد 20 ف الحفاظ على هذا الوضع لمدة 4 دقائق.
- تشغيل محرض المغناطيسية، والسماح للتيار بالتدفق لآخر دقيقة 6.
ملاحظة: إزالة شرط ثابت معظم الشوائب وخشونة من لوحة ال، والشرط الحيوي يحسن نوعية اليكتروبوليشينج النهائية. - إيقاف الإمداد بالطاقة وفصل لوحة ال يدوياً من القصاصة. دقة تغسل لوحة ال مع المياه لإزالة جميع الحلول المتبقية.
- الجاف للوحة ال مع النيتروجين وتخزين تحت غاز خامل. إجراء عملية التجفيف هذه في نهاية كل التجارب في الخطوة 1 و 2.
ملاحظة: عندما حقن الهواء المضغوط، وجعل تدفق الهواء من الجزء المصقول إلى الجانب الآخر. وفي حالة العكس، يمكن الهروب من الجزء غير مصقول الشوائب وتلويث لوحة ال.
2-تلفيق العفن AAO التدرج مع حمض الفوسفوريك المنحل بالكهرباء
تنبيه: الدخان والكحول الميثيل هي العين السامة. يمكن أن يؤدي التعرض المستمر للكروم للتسمم بالكروم خطيرة. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان.
- أنوديزيشن الأساسي
- لتحضير 1 لتر من حامض الفوسفوريك المنحل بالكهرباء، تحميل مل 590 من المياه في زجاجة زجاج.
- إضافة 400 مل الكحول الميثيل (CH3أوه، 99 في المائة) و 10 مل حامض الفوسفوريك (ح3ص4، 85 في المائة) في زجاجة زجاج. مزيج الحل كذلك بالهز يدوياً أو بإثارة المغناطيسية.
- صب 500 مل الكهرباء في كوب سترة مزدوجة 1 لتر. تزج Al مصقول لوحة والكربون مسرى العداد في الحل مع مقاطع التماسيح والأسلاك النحاسية.
- صب اﻻلكتروﻻيت إضافية لتحديد حدود اليكتروبوليشينج 2-3 مم فوق سطح الحل.
ملاحظة: إذا نفذ أنوديزيشن مع حدود اليكتروبوليشينج لمس الحل، لوحة ال يميل إلى حرق خلال أنوديزيشن. - تثبيت رمح عمودي على شكل U قاعدة التمثال. إرفاق محرض علوية، والمكره استخدام المشابك المعدنية. موقف المكره بالقرب من نهاية السفلي من كل أقطاب المروحة. تعيين سرعة دوران محرض النفقات العامة بين 200 و 300 دورة في الدقيقة.
- الاتصال الكأس سترة مزدوجة مدوار وضبط درجة حرارة في-10 درجة مئوية. ترك نظام على الأقل 1 ح تحت إثارة حتى تنخفض درجة الحرارة إلى-10 درجة مئوية.
ملاحظة: لا تستخدم الماء كالمبرد. نظراً لأن الماء يتجمد عند درجات حرارة منخفضة، لن تعمل على تداول عادة. من المستحسن استخدام خليط من الماء والكحول الاثيلي بنسبة 1:1 كالمبرد. - تطبيق جهد 195 الخامس تحت التحريك ح 16.
ملاحظة: إذا الحالي ارتفع أكثر من 50 mA ضمن 2 أو 3 ح بعد تطبيق الجهد، احتمال حدوث حرق مرتفع جداً. توقف العملية فورا واستبدال لوحة شركة واحدة جديدة. إذا كانت هذه المشكلة تحدث بشكل متكرر, تحقق من أن ليس هناك أي شذوذ في التحكم في درجة الحرارة مدوار. إذا لم يكن هناك لا شذوذ، تغيير الكهرباء. - وقف إمدادات الطاقة وفصل لوحة ال يدوياً من القصاصة. أغسل لوحة ال المؤكسد مع المياه لإزالة جميع الحلول المتبقية.
- شركة ألومينا النقش
- تحضير حمض الكروميك النقش الحل بتذويب ز 9.0 من أكسيد الكروم (CrO3) و 20.3 مل من حامض الفوسفوريك (ح3ص4، 85 في المائة) في 500 مل مياه.
- من أجل الحل النقش في الكأس سترة مزدوجة 1 لتر. تعيين درجة الحرارة عند 65 درجة مئوية.
- تزج لوحة ال المؤكسد في الحل النقش لمالا يقل عن 10 ح تحت التحريك. ختم الجزء العلوي من الكأس مع رقائق الألومنيوم.
- شطف لوحة ال محفوراً عدة مرات مع المياه.
- أنوديزيشن الثانوية
- تعيين نفس الشروط التجريبية كخطوة 2.1.1 إلى 2.1.7.
- تحميل لوحة ال محفوراً على اﻷنود للنظام وتطبيق جهد 195 الخامس ح 6. ثم إيقاف الإمداد بالطاقة وفصل لوحة ال يدوياً من القصاصة. فورا أغسل لوحة ال المؤكسد مع المياه.
ملاحظة: عندما تأخر الوقت للغسيل، زيادة حجم المسام AAO عن غير قصد نتيجة لحمض الفوسفوريك المتبقية.
- توسيع المسام التدرج
- تحضير حلاً اتساع مسام بتذويب 5.765 ز حامض الفوسفوريك في 500 مل مياه. صب الحل أخلطه سترة مزدوجة 1 لتر.
- الاتصال مدوار الكأس سترة مزدوجة وضبط درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية. ضع مرحلة الانتقال خطي عمودياً بجوار الكأس. إرفاق قوس للجزء المتحرك من المرحلة الخطية.
- تعيين الجزء المتحرك من مرحلة الخطي إلى موقع المنزل. إرفاق المقطع القوس وتحميل لوحة ال المؤكسد.
- التعامل مع موقف لوحة ال يدوياً حيث أن لوحة ال سيأتي الحق فوق السطح للحل.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يجب أن لا تلمس اللوحة الحل. يبدأ المسام اتساع عملية أسرع لوحة يصل إلى الحل. - تزج تدريجيا لوحة ال في الحل بسرعة 4.86 ميكرومتر/s لمدة 120 دقيقة لجعل العفن AAO 35 ملم مع حجم التدرج من 120 نانومتر إلى 200 نانومتر (GP 120/200). بدء تشغيل ساعة توقيت في هذه اللحظة لوحة ال يمس سطح الحل.
- جعل قوالب سباق 200/280 و GP 280/360، تزج المنطقة بأكملها من العفن GP 120/200 في المسام توسيع الحل ح 2 أو 4، على التوالي.
- شطف لوحة ال التدرج عدة مرات مع المياه.
3-ترسيب طبقة مضادة الشائكة على العفن AAO التدرج مع تجميع ذاتي أحادي الطبقة
ملاحظة: نفذ الخطوات 3.2.1 إلى 3.3.3 في صندوق القفازات. توصيل مضخة فراغ وحاقن غاز النيتروجين الجاف إلى مربع القفازات. ضع جميع العينات والكاشفات والأجهزة في مربع القفازات قبل عملية إزالة الرطوبة. تكرار دورة حقن الغاز الإجلاء والنيتروجين أكثر من ثلاث مرات إزالة الرطوبة الكافية من مربع القفازات. واسمحوا النيتروجين الجاف التدفق من خلال التجربة.
- تعديل هيدروكسيل العفن AAO مع العلاج البيرانا
- صب 140 مل حامض الكبريتيك (ح2هكذا4, 95%) في كوب تترافلوروايثيلين (PTFE). إضافة 60 مل بيروكسيد الهيدروجين دروبويسي (ح2س2، 30%). اتركه لمدة 30 دقيقة حتى يبرد الحل.
تنبيه: كن حذراً للغاية عند إجراء الحل البيرانا. قوة الحل يغلي من لحظة إضافة فوق أكسيد الهيدروجين، ويولد ارتفاع درجات الحرارة. إجراء التجربة في غطاء دخان. - تزج العفن AAO في الحل ل 30 s استخدام الملاقط غير معدنية.
- شطف العفن AAO عدة مرات مع المياه. نقع العفن في المياه لمدة 30 دقيقة ووضعها في الكحول الميثيل لآخر 30 دقيقة.
تنبيه: عندما تجاهل الحل البيرانا المستخدمة، تمييع الحل مع كمية وفيرة من ماء الصنبور. - جاف تماما العفن AAO تحت الفراغ ح 3.
- صب 140 مل حامض الكبريتيك (ح2هكذا4, 95%) في كوب تترافلوروايثيلين (PTFE). إضافة 60 مل بيروكسيد الهيدروجين دروبويسي (ح2س2، 30%). اتركه لمدة 30 دقيقة حتى يبرد الحل.
- إعداد 20 × هي الحل الأسهم
ملاحظة: هي عبارة عن اختصار ل (heptadecafluoro-1,1,2,2-تيتراهيدروديسيل) ديميثيلتشلورو-سيلاني- ملء ثلث زجاجة الهكسين ن 1 لتر مع ثقب سيتا الجزيئية. ختم الزجاجة مع الفيلم البارافين وتخزينها تحت النيتروجين الجاف ح 24.
- تصفية 200 مل من n-الهكسين استخدام المحاقن زجاجية و 0.2 ميكرون PTFE حقنه التصفية.
- صب 80 مل الهكسين ن التي تمت تصفيتها في زجاجة زجاج 100 مل. إضافة 2 مل هي.
- ترسب تجميع ذاتي أحادي الطبقة
- تحميل 57 مل الهكسين ن التي تمت تصفيتها في كوب 100 مل. تزج العفن AAO في المذيب.
- أضف 3 مل من محلول الأسهم هي ن الهكسين جعل 2.9 مم هي الحل. انتظر 10 دقائق لرد الفعل على المضي قدما.
- نقل القالب AAO إلى الهكسين ن جديدة. إغلاق وختم كل كاشف زجاجات. إغلاق صمام النيتروجين، ثم سحب عينات من مربع القفازات.
ملاحظة: هي حساس جداً للرطوبة. تخزين جميع المواد الكاشفة التي تحتوي على هي في مجفف. - نقع العفن AAO في 60 مل ميثوكسينونافلوروبوتاني (ج10ح6و18س2، 99%). يتم تنظيف العفن AAO في كوب لمدة 10 ثانية لكل مرة واحدة لإزالة جسديا تمتز الجزيئات هي. كرر الإجراء تنظيف 10 مرات.
ملاحظة: تعريض العفن AAO بالموجات فوق الصوتية لفترة طويلة دون فترات سيضر على طبقة أكسيد. - جاف تماما العفن AAO تحت الفراغ ح 24.
ملاحظة: طبقة مضادة الشائكة المودعة بنجاح سوبر طارد المياه ومستقرة لمدة أشهر عند تخزينها في مجفف. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
4-تصنيع لوحات نانوباتيرن التدرج بالطباعة الحرارية
ملاحظة: نفذ الخطوات 4.2 إلى 4.7 في غرفة نظيفة.
- خفض 1.1 مم سميكة البوليستيرين ورقة بحجم 2.9 مم طويلة باستخدام دوائر المطبوعة مجلس (PCB) قاطع 3.7 ملم.
- قص العفن AAO 35 ملم من أسفل باستخدام القراص. وضع علامة باسم العينة وتاريخ الصنع على ظهره.
- تنظيف يفر 8، 0 "مع جرعة صغيرة من الكحول الاثيلي. وضع ألواح البوليسترين على يفر، ثم تحميل القالب AAO.
- وضع الفيلم أسفل الدرج طابعة حرارية. إرفاق الفيلم الأعلى طوقا.
- وضعت يفر على الفيلم أسفل. وضع طوقا على يفر. تأكد من أن هناك لا غبار على يفر.
- قم بإغلاق الدرج طابعة حرارية. تطبيق 165 درجة مئوية من الحرارة والكوري 620.52 للضغط من أجل 100 s.
- تبريد العينة لدرجة حرارة الغرفة. تطور الورقة البوليستيرين بالإفراج عن العفن AAO برفق.
5-التعقيم والتعديل ماء من لوحات نانوباتيرن التدرج
- وضع لوحات نانوباتيرن على صحن مربع. من أجل 100 مل كحول الاثيلي 70% وتعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- لوحات نانوباتيرن مع النيتروجين الجاف. نقل لوحات نانوباتيرن لمولد بلازما الأوكسجين.
- إخلاء الدائرة حتى تصل إلى 1.33 السلطة الفلسطينية. ثم ضخ الأكسجين بمعدل 30 سم3/دقيقة تطبيق قوة ترددات الراديوية من 60 دبليو الحفاظ على البلازما الأوكسجين ل 90 ثانية.
ملاحظة: من المستحسن استخدام ألواح المعالجة بالبلازما نانوباتيرن في غضون 14 يوما. - إرفاق لوحة نانوباتيرن إلى الجزء السفلي من صحن ثقافة الخلية باستخدام قطره تولوين.
- ختم العينات في حقيبة وتعقيم مع معقم البلازما درجات الحرارة المنخفضة.
6-زراعة هيكفكس
ملاحظة: إجراء كافة الإجراءات سينتريفوجينج في 4 درجات مئوية إلا إذا ذكر خلاف ذلك.
- قبل عزل الدم المحيطي احتضان الخلايا وحيدات النوى (ببمكس)، طبق المغلفة بالكولاجين ثقافة 12-جيدا في 37 درجة مئوية ح 1.
- أغسل الطبق الثقافة 12-جيدا باستخدام الفوسفات العقيمة × 1 مخزنة المالحة (PBS).
- جمع 50 مل دم البشري باستخدام أنبوب الهيبارين المانع.
- وضعت 6 مل من محلول السكاريد ماء في أنبوب 15 مل وإضافة 8 مل دم إلى الحل السكاريد ماء.
ملاحظة: ببطء "الماصة؛" الدم في المحلول السكاريد ماء. - الطرد المركزي الأنبوب في 1020 x ز لمدة 20 دقيقة بيليه الخلايا.
- الحصاد في طبقة الخلية معتمة، ونقل إلى أنبوب 15 مل جديدة.
- إضافة 10% مصل بقرى الجنين (FBS)--يتضمن برنامج تلفزيوني والطرد المركزي الأنبوب في 1020 x ز لمدة 10 دقيقة بيليه الخلايا.
- إزالة المادة طافية وإضافة المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء. الحفاظ على الجليد لمدة 5 دقائق.
- إضافة 10% FBS-يتضمن برنامج تلفزيوني والطرد المركزي الأنبوب في 1020 x ز لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
- إزالة المادة طافية وإضافة 10% FBS-يتضمن برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الأنبوب في 1020 x ز لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
- إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل من الخلية البطانية التوسع المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS. بذور 8.0 × 106 خلايا كل بئر لكل طبق المغلفة بالكولاجين.
- تغيير ثقافة المتوسط كل يوم لمدة أسبوع واحد. ثم تغيير المتوسطة الثقافة كل يومين.
ملاحظة: هيكفكس ويمكن الاطلاع على بعد الثقافة اليوم 10-14. إظهار نموذجية حصاة كبيرة تشبه مورفولوجيا هيكفكس وتشكل مستعمرة التي يمكن ملاحظتها في الطوري. الفلورة تلطيخ كادهيرين بطانية والأوعية الدموية (CD144) وعامل فون ويليبراند (vWF) يمكن أيضا إجراء لتوصيف هيكفكس بعد التوسع في الخلية. - لزراعتها في هيكفكس، استخدم المتوسطة توسيع الخلية البطانية تستكمل مع 5% FBS والبنسلين/ستريبتافيدين في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2. استبدال في المتوسط مرة واحدة في يوم.
- بعد التعريفي هيكفك، تنمو الخلايا لمرور 7 لإجراء مزيد من التجارب.
7-الخلية البذر والثقافة على لوحات نانوباتيرن التدرج
ملاحظة: الخطوة 7 يصف ثقافة هيكفكس على لوحة نانوباتيرن التدرج، ولكن يمكن استخدام مصادر خلية أخرى أيضا.
- معطف لوحات نانوباتيرن التدرج مع 1 مل من 0.1% بروتين طلاء الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: طلاء البروتين 0.1% لا تشمل الميزات نانوبيلار. - جعل تعليق هيكفكس من طبق الثقافة بأسلوب تقسيم الخلية قياسي باستخدام التربسين.
- تمييع تعليق خلية لتحقيق التقاء المرجوة. البذور هيكفكس على لوحات نانوباتيرن التدرج والتحكم مسطح (على سبيل المثال، 1.0 × 104 خلايا/سم2).
ملاحظة: عندما يتم المصنف هيكفكس في 1.0 × 104 خلايا/سم2 على لوحات نانوباتيرن التدرج، كونفلوينسي خلية عادة ما يصل إلى 70-80% بعد يومين. - ثقافة الخلايا على لوحات مسطحة أو التدرج نانوباتيرن لمدة يومين في الحاضنة.
8-رصد وتحليل
- فحص التصوير بالمجهر الإلكتروني (SEM)
- فيكس هيكفكس مثقف على لوحات مسطحة أو التدرج نانوباتيرن مع glutaraldehyde 2.5% عند 4 درجة مئوية لبين عشية وضحاها.
- معالجة أكسيد الاوزميوم 1% ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل العينات مع برنامج تلفزيوني.
- يذوي عينات مع الكحول الاثيلي من انخفاض إلى تركيزات عالية (50% و 70%، 80%، 90% و 100%) لمدة 10 دقائق في كل خطوة.
- علاج هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد ذلك، غسل العينات مع همدس الطازجة وترك العينات تحت غطاء الدخان يوم واحد على الأقل حتى يتبخر همدس المتبقية تماما.
- معطف العينات مع الرش البلاتين المغطى لمدة 5 دقائق وفحص العينات مع sem.
- التصوير بالمجهر الإلكتروني (TEM) انتقال
- فيكس هيكفكس مثقف لوحات نانوباتيرن مسطحة أو التدرج مع 2% بارافورمالدهيد و 2.5 ٪ glutaraldehyde المخلوط في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية على ليلة وضحاها.
- إجراء التثبيت بعد استخدام أكسيد الاوزميوم 1% ويذوي العينات باستخدام الأسلوب في 8.1.3.
- تضمين عينات في راتنج الإيبوكسي. جعل 60 نانومتر أبواب سميكة من كتل ومكان مقطع على شبكة TEM.
- وصمة عار المقطع مع المزيج من خلات اليورانيل 10 ملغ في 100 مل الكحول الميثيل وسترات الرصاص 0.1 ملغ في 100 مل مقطر من الماء. الحصول على صور ذات ال.
- تلوين الأسفار
- فيكس هيكفكس مثقف على لوحات مسطحة أو التدرج نانوباتيرن مع بارافورمالدهيد 4% في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- بيرميبيليزي وكتلة عينات مع الماعز 5% 0.1% والمصل أوكتيلفينول اثوكسيلاتي في "برنامج تلفزيوني" (ببست) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- احتضان عينات مع جسم فينكولين المضادة الإنسان الأولية (1: 500 في ببست) في درجة حرارة الغرفة لعينات شطف حاء 2 ثلاث مرات مع ببست.
- احتضان عينات مع فالويدين fluorescence مترافق (1:1، 000 في ببست)، مترافق fluorescence جسم الثانوي (1:1، 000 في ببست) في درجة حرارة الغرفة لعينات شطف حاء 2 ثلاث مرات مع ببست.
- احتضان عينات مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 1:1,000 في ببست) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إسقاط 10 ميليلتر من تصاعد المتوسطة على سطح نانوباتيرن التدرج. مكان ساترة في المتوسط المتصاعدة.
- ضع العينة رأسا على المسرح عينة والحصول على الصور باستخدام مجهر الأسفار [كنفوكل].
- تحليل الصور
- نقل الصور التي تم التقاطها من هيكفكس لنظام تحليل صورة.
- اختر حقل عشوائي لتلطيخ صورة فالويدين. ضبط العتبة وخلق صورة ثنائية الخلايا التي تكون متميزة عن الخلفية.
- رسم معالم حول الخلايا قياس المساحة الخلية والمحيط، وحساب عدد فيلوبوديا كل خلية يدوياً.
- اختر حقل عشوائي لتلطيخ صورة فينكولين. ضبط العتبة وخلق صورة ثنائية للمجالات المحورية الالتصاق.
ملاحظة: ضبط عتبة الصورة على نحو مناسب لتجنب اصطناعية أكثر-أو وكيل-فيلينج من المجالات المحورية الالتصاق. - عد التصاق المحورية لكل خلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 الصور SEM قوالب AAO التدرج ملفقة وفقا لنوع والموقف. ويبين الشكل 2 الصور SEM لوحات نانوباتيرن التدرج مع تقريب العادية نانوبيلارس، و الرقم 3 بيانات القياس الكمي لقطر نانوبيلار. يسرد الجدول 1 خصائص نانوبيلارس ملفقة.
ويبين الشكل 4A مخطط زراعة هيكفكس المستمدة من الدم. يبين الشكل 4 باء صورة التباين المرحلة هيكفكس ثيكولتيفاتيد. ويبين الشكل 4 علامات هيكفك ملطخة CD144 (الأخضر)، فوف (أحمر)، ونواة (أزرق). ويبين الشكل 5A ممثل وزارة شؤون المرأة الصور من هيكفكس بعد يومين من الثقافة على الشقة, GP 120/200، "سباق الجائزة الكبرى" 200/280، ولوحات GP 280/360. الشكل 5 باء وجيم تصوير البيانات الكمية في منطقة الخلية ومحيط مقارنة بالشقة. وكشفت البيانات الكمي أن الخلايا التي نمت على أسطح نانوبيلار من حجم أصغر وأظهرت خلية انخفاض المساحة والمحيط. الرقم 5 هو الصور SEM الممثل من هيكفكس التي تظهر مورفولوجية فيلوبوديا القائمة. ويصور الشكل 5E البيانات الكمية في عدد فيلوبوديا مقارنة بالشقة. ولوحظ ثمرة فيلوبوديال كبيرة في الخلايا المستزرعة في 120 GP/200، في حين لم يلاحظ أي تغيير ملموس في GP200/280 أو GP280/360 مقارنة بالشقة. يظهر الشكل 5F الممثل تيم الصور من هيكفكس بعد يومين ثقافة على لوحات مسطحة والتدرج نانوباتيرن.
رقم 1. التدرج AAO العفن. صور SEM التدرج AAO قوالب لوحات GP 120/200، و "سباق الجائزة الكبرى" 200/280، و "سباق الجائزة الكبرى" 280/360 وفقا لموضع قوالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . التدرج لوحات نانوباتيرن. صور SEM من الأعمدة من نوع التدرج نانوباتيرن لوحات لوحات GP 120/200، و "سباق الجائزة الكبرى" 200/280، و "سباق الجائزة الكبرى" 280/360 وفقا لموقف لوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . حجم التدرج من قطر نانوبيلار. تحديد مقدار البيانات عرض تدرج أقطار نانوبيلار GP 120/200 و "سباق الجائزة الكبرى" 200/280، ولوحات GP 280/360، على التوالي. تمثل أشرطة الخطأ القياسي. تم تعديل هذا الرقم من [Acta بيوماتيرياليا] 20- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| معامل يونغ (GPa) | قطر نانوبيلار (نيو مكسيكو) | نانوبيلار الملعب (nm) | المسافة إلى مركز (nm) | الارتفاع نانوبيلار (نيو مكسيكو) | نانوبيلار تيبس (N/m) | |
| مسطحة | 2.43±0.19 | - | - | - | - | - |
| GP 120/200 | 1.74±0.11 | 120-200 | 320-240 | 440 | 276.9±21.9 | 9.35 |
| سباق الجائزة الكبرى 200/280 | 2.01±0.05 | 200-280 | 240-160 | 440 | 268.1±25.9 | 55.78 |
| سباق الجائزة الكبرى 280/360 | 2.1±0.13 | 280-360 | 160-80 | 440 | 293.6±23.6 | 134.15 |
الجدول 1. خصائص الملفقة نانوبيلارس. كمية البيانات التي تظهر معامل يونغ والقطر، الملعب، والمسافة من مركز إلى مركز، والارتفاع وتصلب نانوبيلارس ملفقة. تم تعديل هذا الجدول من [Acta بيوماتيرياليا] 20.
الشكل 4 . وصف هيكفكس. (أ) جدول يبين الرسم التخطيطي هيكفكس المستمدة من الدم المحيطي الكبار. (ب) مرحلة تباين الصورة من مستعمرة هيكفك، المستمدة من الدم المحيطي الكبار في يوم 14. (ج) صور إيمونوفلوريسسينت تظهر CD144 (الأخضر)، فوف (أحمر)، ونواة الخلية ملطخة DAPI (أزرق). تم تعديل هذا الرقم من [Acta بيوماتيرياليا] 20- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . هيكفكس مثقف على لوحات مسطحة والتدرج نانوباتيرن لمدة يومين. (أ) ممثل وزارة شؤون المرأة صورة هيكفكس مثقف على لوحات مسطحة، GP 120/200، و "سباق الجائزة الكبرى" 200/280، و "سباق الجائزة الكبرى" 280/360. (ب وج) بيانات القياس الكمي للمساحة والمحيط هيكفكس (n = 50). * ف <.05 مقارنة بالشقة. (د) "ممثل وزارة شؤون المرأة" الصور من حافة الرائدة في مجال هيكفكس على لوحات مسطحة والتدرج نانوباتيرن. بيانات القياس الكمي (ه) عدد من فيلوبوديا كل واحد هيكفك (n = 20). * ف <.05 مقارنة بالشقة. ((و)) صورة الممثل تيم هيكفك مثقف مسطحة ولوحات نانوباتيرن التدرج. تشير الأسهم البيضاء إلى نقاط التفاعل بين سطح هيكفكس والركيزة. تم تعديل هذا الرقم من [Acta بيوماتيرياليا] 20- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية رقم 1. زاوية الاتصال المياه AAO البكر وهي تعامل AAO. قياسات زاوية الاتصال عرض خصائص عمود المصباح هي تجميعها ذاتي أحادي الطبقة (أ) قبل، و (ب) بعد العلاج. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية الرقم 2- الصور SEM لوحات نانوباتيرن التدرج ملفقة مع نفس AAO العفن. مجموعات المقارنة SEM الصورة للتحقق من متانة AAO العفن. (أ) أنتجت لوحة نانوباتيرن التدرج مع تقدم طازجة العفن. (ب) إنتاج لوحة نانوباتيرن التدرج مع العفن AAO بعد ولﻷخذ 15 مرة. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية الرقم 3. تأثير البروتين طلاء. لوحات الصور SEM من هيكفكس التي تم مثقف في نانوباتيرن التدرج GP 120/200 أو GP 200/280 GP 280/360 بدون (أ) أو (ب) مع طلاء البروتين. تم تعديل هذا الرقم من [Acta بيوماتيرياليا] 20 اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصنيع AAO غالباً ما يعاني من عيوب مثل الشقوق، والأشكال غير النظامية من المسام، وحرق. والسبب الرئيسي لهذه العيوب يسمى تفصيل كهربائياً، التي تتأثر بشدة بطبيعة الركازات المعدنية يجري أكسيد والمقاومة ل الكهرباء21. نظراً للمقاومة للكهرباء تختلف تبعاً لدرجة الحرارة، القضاء على الحرارة باستمرار من أقطاب هو النقطة الحرجة للحفاظ على درجة الحرارة الموقعية للكهرباء أنها مستقرة في مثل هذا شرط ويؤنود عالية الجهد. في هذا البروتوكول، ونحن ملفقة قوالب AAO عن طريق تعديل ماسودا في خطوتين أنوديزيشن22،23. استبدال ما يقرب من نصف الكهرباء بالكحول الميثيل ليس فقط يمنع الكهرباء من التجمد في درجات الحرارة المنخفضة ولكن أيضا يحرم مسرى الحرارة بالتبخر في الجزء السفلي من مسام24. السبب في استخدام محرض علوية والمكره بدلاً من محرض مغناطيسي أيضا التأكد من التحكم في درجة الحرارة. محرض المغناطيسي نموذجي بوجود احتمال كبير للضياع سبب اختلالها عرضي شريط المغناطيسي أثناء عملية طويلة الأجل. هذه المشكلة الحث على تعميم الكهرباء، رفع درجة الحرارة، وتؤدي إلى حرق غير لائق.
لكي تدرج حجم العفن AAO، نحن تدريجيا مغمورة AAO في حامض الفوسفوريك النقش الحل. يتم توسيع المسام ما يتناسب مع الوقت AAO يبقى في حل النقش، كما هو مبين في الشكل 1. تحت هذا الشرط، متوسط معدل اتساع المسام 0.67 نيوتن متر/دقيقة التلاعب بالسرعة والوقت غمر ستتغير منحدر قطر AAO المسام التدرج وأقصى حجم. قطر المسام ممكن الحد الأقصى هو 400 نانومتر. عندما يتجاوز قطر المسام 400 نانومتر، يصبح الجدار التباعد بين المسام رقيقة لذا فإنه لا يمكن أن تتسامح مع الضغط خلال الحرارية ولﻷخذ العملية.
أحادي الطبقة تجميعها ذاتيا هي المعروف ليتمكن من إضافة خاصية مسعور ل سطح المادة25. يجعل هذا الجزيء هي رابطة تساهمية قوية مع مجموعات الهيدروكسيل على سطح AAO عرضته العلاج البيرانا26. ولذلك، كما هو مبين في التكميلية الرقم 1، ويمكن أن تتشكل من أحادي الطبقة صلبة الذاتي تجميعها عند عدد كبير من مجموعات الهيدروكسيل موجودة على سطح الركازة. للحصول على الجودة المثلى مع أحادي الطبقة تجميعها ذاتيا هي، فإننا نقترح إجراء رد الفعل في أجواء بدء. عندما تتعرض هي للرطوبة، رد فعل جانب مع المياه يشكل dimers وارتب ليغومرات حتى الجزيئات سيلاني، ويقلل من الجودة الشاملة لأحادي الطبقة تجميعها ذاتيا.
عند استخدام القالب AAO مع حجم تدرج في نانويمبرينتينج الحرارية، وتم الحصول على لوحات ثقافة الخلية مع رج نانوبيلارس الشكل 2 و الشكل 3. الأسلوب نانويمبرينتينج الحرارية له مزية في ذلك يمكن أن تنتج كمية كبيرة من لوحات نانوباتيرن متطابقة باستخدام أحد AAO الرئيسية العفن. ويبين الشكل 2 التكميلي أنه ليس هناك فرق في نوعية نانوباتيرن المنتجة، حتى بعد خمسة عشر عمليات الطباعة، نانوباتيرن العفن AAO الجديدة التي تنتجها بالمقارنة. سبب اختيار البوليستيرين كمادة لنقل نانوباتيرن هو أن البوليستيرين درجة حرارة التحول الزجاجي مناسبة (100 درجة مئوية) للطباعة الحرارية، وأنه يستخدم على نطاق واسع في أطباق الثقافة الخلية التجارية نظراً لما خصائص شفافة وغير سام.
ومن الصعب اختﻻق النانو مع ارتفاع نسبة العرض إلى الارتفاع باستخدام أسلوب نانويمبرينتينج الحرارية. لأنه، عندما الظروف العملية، مثل زيادة الضغط والوقت، يصبح ضارب العفن إلى البوليمر الركازة، مما يجعل من الصعب فصل العفن من الركازة. ولذلك، أنها صعبة للغاية لإنتاج نانوباتيرنس وجود نسبة العرض إلى الارتفاع من 1:3 أو أكثر باستخدام تقنية نانويمبرينتينج لدينا. لكن وفقا للصور تيم لاحظنا الرقم 5، وجدنا حقيقة مثيرة لاهتمام أن غشاء الخلايا في نانوباتيرنس لم يكن على اتصال بالجزء السفلي من نانوباتيرن. وبعبارة أخرى، قد نشأت جميع المحفزات المادية التي يمكن التعامل معها استجابة للخلايا من الأجزاء العليا من نانوباتيرن. ولذلك، في هذه الدراسة، لم يكن لدينا للنظر في نسبة العرض إلى الارتفاع في دراسة استجابات الخلية نانوباتيرن. كما هو موضح في تكميلية الشكل 3، قد حل طلاء البروتين 0.1% أي تأثير على مرفق هيكفكس على السطوح نانوبيلار. وعلاوة على ذلك، انخفضت هذه المحفزات نانوسكاليد من لوحات نانوباتيرن التدرج خلية المساحة والمحيط هيكفكس وثمرة فيلوبوديال زيادة الرقم 5.
وباختصار، قمنا بإنشاء لوحات نانوباتيرن التدرج عن طريق التلاعب في استجابة من هيكفكس في المختبر. أن تعرف بالضبط ما هو حجم النانو الخلايا تتأثر إلى حد كبير، مطلوب عمل في مستقبل لتصميم نانوبيلار الحجم الخاصة بالخلية عن طريق ضبط منحدر القطر حجم التدرج والحد الأدنى-الحد الأقصى من نانوبيلارس. ونحن نتوقع هذا نانوباتيرن التدرج لتكون أداة رائعة للشاشة التفاعل بين الخلايا والنانو، فضلا عن توفير منافذ الخلية المتقدمة التي النانو يمكن بحرية ضبطها في الحجم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) الممولة من وزارة التربية والتعليم، والعلوم والتكنولوجيا (MEST) [جبهة الخلاص الوطني-2015R1D1A1A01060397] والحيوية وتطوير التكنولوجيا الطبية برنامج تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل [جبهة الخلاص الوطني-2017M3A9C6029563] جبهة الخلاص الوطني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J.
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
