एक उपंयास संतृप्ति Mutagenesis दृष्टिकोण: आरएनए में नियामक प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के एकल चरण लक्षण वर्णन Phosphorothioates का उपयोग
Summary
प्रोटीन कि विशिष्ट आरएनए अनुक्रम बांध जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इन बाध्यकारी साइटों की विस्तृत लक्षण वर्णन जीन विनियमन की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, आरएनए में प्रोटीन-बाइंडिंग साइटों की संतृप्ति mutagenesis के लिए एक एकल कदम दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है । यह दृष्टिकोण सभी प्रोटीन-आरएनए में बाध्यकारी साइटों के लिए प्रासंगिक है ।
Abstract
जीन विनियमन विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । कई डीएनए और आरएनए-बंधन प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए उच्च विशिष्टता के साथ अपने लक्ष्य दृश्यों बांध । ये विनियामक प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति को या तो डीएनए (प्रतिलेखन) के स्तर पर या आरएनए के स्तर (प्री-mRNA ब्याह, polyadenylation, mRNA ट्रांसपोर्ट, क्षय और अनुवाद) पर नियंत्रण करते हैं । विनियामक अनुक्रम की पहचान को समझने में मदद करता है न केवल कैसे एक जीन चालू या बंद है, लेकिन यह भी जो नीचे की ओर जीन एक विशेष नियामक प्रोटीन द्वारा विनियमित रहे हैं । यहां, हम एक एक कदम दृष्टिकोण है कि आरएनए में एक प्रोटीन बंधन साइट के संतृप्ति mutagenesis की अनुमति देता है का वर्णन । यह डोपिंग के साथ डीएनए टेम्पलेट शामिल है गैर-जंगली-प्रकार न्यूक्लियोटाइड के भीतर बाइंडिंग साइट, प्रत्येक phosphorothioate न्यूक्लियोटाइड के साथ अलग RNAs के संश्लेषण, और प्रोटीन के साथ बाध्य अंश निम्नलिखित मशीन के अलगाव. गैर से हस्तक्षेप-जंगली-प्रकार न्यूक्लियोटाइड प्रोटीन से बाध्य अंश से उनके तरजीही अपवर्जन में परिणाम । यह phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis या PTM) युक्त phosphodiester बांड के आयोडीन के साथ चयनात्मक रासायनिक दरार निम्नलिखित जेल ट्रो द्वारा निगरानी की जाती है. इस एकल कदम संतृप्ति mutagenesis दृष्टिकोण आरएनए में किसी भी प्रोटीन बंधन साइट के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू है ।
Introduction
जीन विनियमन जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । जीन प्रतिलेखन के स्तर पर विनियमित किया जा सकता है, पूर्व mRNA ब्याह, 3 ‘ अंत गठन, आरएनए निर्यात, अनुवाद, mRNA स्थानीयकरण, क्षय, पद-अनुवाद संशोधन/दोनों डीएनए-और आरएनए- बंधन प्रोटीन जीन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं विनियमन. जबकि आणविक आनुवंशिक विश्लेषण कई नियामक प्रोटीन की पहचान की है, उनमें से केवल एक छोटे सबसेट पूरी तरह से अपने सेलुलर कार्यों या vivo मेंबाध्यकारी साइटों के लिए विशेषता है । वंशावली अनुक्रम विश्लेषण और mutagenesis डीएनए या आरएनए-प्रोटीन बातचीत की विशेषता के लिए पूरक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।
आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन विकास प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैं, जिनमें यौन विभेद शामिल है । Drosophila प्रोटीन सेक्स घातक (SXL) या मास्टर सेक्स स्विच प्रोटीन पुरुषों में अनुपस्थित है, लेकिन महिलाओं में मौजूद है । यह uridine-रिच दृश्यों या न्यूक्लियोटाइड-बहाव पूर्व mRNA लक्ष्य (ट्रांसफार्मर, सेक्स घातक, और पुरुष विशिष्ट lethal2) में विशिष्ट ब्याह साइटों से सटे इलाकों पहचानता है दैहिक कोशिकाओं में1,2 ,3,4. इसके अलावा, यह uridine के लिए बाध्यकारी द्वारा polyadenylation साइट स्विचन-अमीर polyadenylation बढ़ाने के अनुक्रम को विनियमित (ई (नि.)) प्रलेख5,6। SXL की संभावना महिला germline में अतिरिक्त लक्ष्य है कि1,7,8,9,10,11की पहचान की जा रह नियंत्रित करता है, 12 , 13.
आमतौर पर, एक बाध्यकारी साइट के लक्षण वर्णन mutagenesis, उदाहरण के लिए, हटाने या एकल या एकाधिक न्यूक्लियोटाइड के प्रतिस्थापन द्वारा शामिल है । प्रत्येक उत्परिवर्ती बंधन साइट, जंगली प्रकार आरएनए अनुक्रम के सापेक्ष, तो ब्याज की प्रोटीन के लिए अपने बाध्यकारी संबध (Kd या संतुलन पृथक्करण स्थिरांक) निर्धारित करने के लिए प्रोटीन सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है; Kd प्रोटीन एकाग्रता के लिए ५०% आरएनए बाइंडिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । विस्तृत mutagenesis की इस श्रम-गहन प्रक्रिया में कई म्यूटेंट का उत्पादन और विश्लेषण शामिल है — बाइंडिंग साइट में प्रत्येक स्थान के लिए तीन गैर-जंगली प्रकार न्यूक्लियोटाइड । इस प्रकार, वहां तेज, सरल, और शाही सेना में प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की सस्ती संतृप्ति mutagenesis के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए एक की जरूरत है ।
यहां, हम एक एक कदम दृष्टिकोण है कि आरएनए में एक प्रोटीन बंधन साइट के संतृप्ति mutagenesis की अनुमति देता है का वर्णन । यह डोपिंग के साथ डीएनए टेम्पलेट शामिल है गैर-जंगली-प्रकार न्यूक्लियोटाइड के भीतर बाइंडिंग साइट, प्रत्येक phosphorothioate न्यूक्लियोटाइड के साथ अलग RNAs के संश्लेषण, और प्रोटीन के साथ बाध्य अंश निम्नलिखित मशीन के अलगाव. गैर से हस्तक्षेप-जंगली-प्रकार न्यूक्लियोटाइड प्रोटीन से बाध्य अंश से उनके तरजीही अपवर्जन में परिणाम । यह phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis या PTM) युक्त phosphodiester बांड के आयोडीन के साथ चयनात्मक रासायनिक दरार निम्नलिखित जेल ट्रो द्वारा निगरानी की जाती है. इस एकल कदम संतृप्ति mutagenesis दृष्टिकोण आरएनए में किसी भी प्रोटीन बंधन साइट के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenesis लंबे समय के लिए प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की विशेषताएं किया गया है । सबसे पहले, म्यूटेंट की एक श्रृंखला का निर्माण किया जा सकता है और व्यक्तिगत बाध्यकारी परख में परीक्षण के लिए बाध्यकारी संबंध पर उ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक धंयवाद पिछले वित्त पोषण के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों और धंयवाद माइकल आर ग्रीन synthesizing oligonucleotides के लिए ।
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
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