Summary
يصف لنا استخدام زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسكت) لتقييم إمكانات خبيثة من الخلايا المكونة للدم وراثيا. هسكت مفيد لتقييم الخلايا المكونة للدم الخبيثة المختلفة في فيفو ، فضلا عن توليد مجموعة كبيرة من الفئران مع المتلازمات ميلوديسبلاستيك (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين) أو سرطان الدم تقييم العلاجات رواية.
Abstract
ميلوديسبلاستيك المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين) هي مجموعة متنوعة من اضطرابات الخلايا الجذعية المكونة للدم التي يتم تعريفها بواسطة هيماتوبويسيس غير فعالة، سيتوبينياس الدم المحيطي، والانزياح، وميل للتحول إلى سرطان الدم الحاد. NUP98-HOXD13 (NHD13) الفئران المعدلة وراثيا الخص MDS البشرية من حيث سيتوبينياس الدم المحيطي والانزياح والتحول إلى اللوكيميا الحادة. أظهرنا سابقا أن حركة الديمقراطيين الاشتراكيين يمكن نقلها من ماوس المهندسة وراثيا بحركة الديمقراطيين الاشتراكيين إلى المستلمين البرية من نوع بزرع خلايا نخاع العظام المنبسطة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين (بمنك). نفهم بوضوح أكثر خلية حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في الأصل، قمنا بتطوير النهج زرع محددة، إيمونوفينوتيبيكالي تعريف المجموعات الفرعية المكونة للدم. في هذه المقالة، نحن تصف عملية عزل وزرع مجموعات سكانية محددة الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف. وبعد زرع الأعضاء، يصف لنا نهج لتقييم كفاءة الزرع واستمرار وجود خلايا حركة الديمقراطيين الاشتراكيين المانحين.
Introduction
ميلوديسبلاستيك المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين) تمثل مجموعة متنوعة من اضطرابات الدم الاستنساخ تميزت هيماتوبويسيس غير فعالة، وأدلة مورفولوجك من خلل التنسج، وميل للتحول إلى سرطان الدم النقوي الحاد (AML)1،2 ،،من34. هيماتوبويسيس غير فعالة يعترف اعتقال نضج في نخاع العظام، والنتائج في سيتوبينياس الدم المحيطي على الرغم من نخاع العظم هايبرسيلولار1،3. قدرت حالات الإصابة بحركة الديمقراطيين الاشتراكيين طرق مختلفة ك 2-12 حالة لكل 000 100 شخص سنوياً في الولايات المتحدة، وحدوث حركة الديمقراطيين الاشتراكيين يزيد مع التقدم في العمر، مما يجعل هذا شرطا هاما لفهم نظراً لشيخوخة السكان في الولايات المتحدة3، 5. على الرغم من أن معظم الحالات من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين لا مسببات واضحة، وبعض الحالات من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين يعتقد أن يكون بسبب التعرض لعوامل سمية جينية معروفة، بما في ذلك المذيبات مثل البنزين، والسرطان العلاج الكيميائي6.
حركة الديمقراطيين الاشتراكيين المرضى عادة اكتسبت الطفرات في خلايا حركة الديمقراطيين الاشتراكيين7. على الرغم من النادر نسبيا، وقد اكتسبت عددا من المرضى حركة الديمقراطيين الاشتراكيين المولدة الصبغية المتوازنة التي تشمل الجينات مثل NUP98، EVI1، RUNX1 و MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). لدينا مختبر مصلحة طويلة الأمد في كروموسوم المولدة، التي تنطوي على الجينات NUP988. الفئران المعدلة وراثيا أن صريح التحوير NUP98-HOXD13 (NHD13) وينظم المروج Vav1 ومحسن عناصر عرض كافة الميزات الرئيسية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين، بما في ذلك سيتوبينياس الدم المحيطي، وأدلة مورفولوجك الانزياح، والتحول إلى مكافحة غسل الأموال9 .
على الرغم من أن حركة الديمقراطيين الاشتراكيين قد تم الاعتراف بما يزيد على 60 سنة10، وتعتبر أن اضطراب خلايا الجذعية الاستنساخ، الجهود الرامية إلى انجرافت الخلايا البشرية حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في الفئران العوز كانت ناجحة إلى حد كبير، لأن خلايا حركة الديمقراطيين الاشتراكيين انجرافت سيئة11، 12،،من1314 والفئران لا تتطور الأمراض السريرية. في محاولة لتحديد الخلايا المكونة للدم التي يمكن أن تنقل حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، تحولت إلى نموذج NHD13، وأظهرت أننا يمكن أن انجرافت حركة الديمقراطيين الاشتراكيين ككيان مرض التي أظهرت كافة الميزات الأساسية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين البشرية، بما في ذلك سيتوبينياس الدم المحيطي، الانزياح، و التحول إلى مكافحة غسل الأموال15. وفي هذا التقرير، نقدم التفاصيل التقنية لهذه التجارب، فضلا عن نهج لزيادة يجزئ الجذعية المكونة للدم والخلايا السليفة (هسبك)، في محاولة لتحديد الخلايا الشروع في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الحيوان الإجراءات الموضحة في هذه المقالة قد أقرها المعهد الوطني للسرطان في بيثيسدا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، وتتوافق مع السياسات الواردة ضمن "السياسة خدمة الصحة العامة" في رعاية إنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية، قانون الرفق بالحيوان، ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1-إعداد الخلية
- نخاع العظام الحصاد الأنوية الخلية (بمنك)
- استخدام المواد المعقمة فقط. تعقيم أدوات قابلة لإعادة الاستخدام باستخدام اﻷوتوكﻻف بخار. شراء الإبر والمحاقن، والبلاستيك وير في حاويات معقمة تستخدم مرة واحدة. أداء جميع التلاعبات الحيوان وخلية في "الثاني الفئة"، نوع A2 مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- إعداد بمنكس في مل 14 جولة الأنبوبة السفلي التي تحتوي على 3 مل HF2 (هانك لموازنة الحل الملح وتستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين).
- Euthanize C57Bl6 المانحة الفئران (إيجابية بالنسبة CD45 اليل CD45.2)، السن عادة من 2-6 أشهر، باستخدام دائرة2 CO.
- تعقيم الذبيحة الماوس بالرش الإيثانول 70% على الجسم بأكمله مع زجاجة رذاذ. قشر الجلد من الساقين، ومن الحوض وصولاً إلى الكاحل.
- إزالة فيمورى وتايبي من الذبيحة باستخدام مقص معقم (مستقيم، شارب/شارب، و 11.5 سم) والملقط (جرايفى، مسنن، عرض تلميح 0.8 ملم). تقليم عضلات المرفق واضح.
- قص نهايات الدانية والبعيدة من الساق مع المقص. عقد الساق مع الملقط، إدراج 27-قياس 3 مل حقنه تحتوي على 2.5 مل HF2 في تجويف نخاع الدانية في نهاية القاصي من الساق (الكاحل). مسح خلايا النخاع العظمى من الساق باستخدام ضغط لطيف في مل 14 جولة الأنبوبة السفلي.
- كرر الساق الأخرى.
- قص نهايات عظم الفخذ الدانية والبعيدة مع المقص. مسح تجويف نخاع عظم الفخذ بإدخال إبرة قياس 20 المرفقة إلى 3 مل حقنه تحتوي على 2.5 مل HF2 في النهاية البعيدة تجويف نخاع عظم الفخذ وتطبيق ضغط لطيف للمحاقن.
- كرر لعظم الفخذ الأخرى، جمع جميع نخاع العظام من كلا تايبي وفيمورى في مل 14 نفس الجولة أسفل الأنبوبة.
- تفريق كتلة نخاع من يسفط صعودا وهبوطاً عدة مرات مع نفس الإبرة 20-قياس المرفقة للمحاقن مل 3.
- تلطيخ جسم من بمنك
- الكونت بمنك. إضافة 20 ميليلتر من حل حامض الخليك 3% إلى 20 ميليلتر من تعليق بمنك التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.1.8. بعد ذلك، عد استخدام هيموسيتوميتير ومجهر مقلوب.
- بيليه بمنك بالطرد المركزي لطيف في 450 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه مع HF2 استخدام ميليلتر 90 الواحدة 107 خلايا وإضافة 10 ميليلتر من بيوتينيلاتيد المضادة نسب جسم كوكتيل إلى تعليق خلية.
- وبعد حضانة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، غسل الخلايا الملون مع 3 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
- ريسوسبيند بمنك مع 100 ميليلتر من HF2 الواحدة 107 الخلايا. إضافة 2 ميليلتر من اللوفيكوسيانين (APC) مترافق البيوتين المضادة الأجسام المضادة إلى تعليق خلية، تليها الحضانة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- أشطف بمنك الملون مع 3 مل من برنامج تلفزيوني وريسوسبيند بمنك مع HF2 تكملة مع 0.2 ميكروغرام/مل من يوديد propidium (PI) للتدفق الخلوي الخلية الفرز.
- التدفق الخلوي الخلية الفرز من بمنك
- معايرة التدفق الخلوي الخلايا فارز. تحسين جميع أنابيب ضوئي (بمتس) ومبعثر والفلورية المعلمات باستخدام خلايا أونستينيد ويقع ضمن نطاق كل كاشف الخطي.
- إعداد أونستينيد، ملطخة بي، والمسمى APC النسب خلايا كوكتيل بالتوازي من الخطوة 1، 2. تحليل لتعويض الطيفية.
- تميز الخلايا يبنوا طريق النابضة متتابعة ح منتدى التعاون الأمني مقابل SSC-ح، 640-التعاون بين بلدان الجنوب-أ مقابل 640-التعاون بين بلدان الجنوب-ح و 640-التعاون بين بلدان الجنوب-S مقابل 640-التعاون بين بلدان الجنوب-دبليو
- استبعاد الخلايا غلق باستخدام PI متحمس في 561 نانومتر والانبعاثات التي يتم جمعها مع مرشح تمرير نطاق 614/20. تثير النسب APC تسمية الخلايا في 640 نانومتر وجمع الانبعاثات مع مرشح تمرير نطاق 671/30.
- تسجيل قيم الأسفار كارتفاع الجهد وجمع الأحداث 100,000 على الأقل في قائمة ملفات البيانات وضع تصور السكان يجب أن يتم فرزه.
- حساب التعويض الطيفية بعد الحصول على ثلاث عينات من الخلايا 10,000 لما يلي: غير مسمى الخلايا و PI المسماة الخلايا كوكتيل النسب المضادة الأجسام المضادة مترافق مع APC المسماة الخلايا.
- تعيين المناطق الثلاث لفرز النسب السلبية (LN)، النسب الإيجابية (ليرة لبنانية) مع شدة الأسفار خافت (LP1)، والسكان ليرة لبنانية مع الأسفار مشرق (LP2) في أنابيب 5 مل تحتوي على 0.5 مل من 10% FBS وسائل الإعلام.
- فرز الخلايا باستخدام قطره واحدة المغلف وتنقية وضع الإيقاف قبل الاكتمال.
- إجراء تحليل نوع وظيفة مع خلايا مجموع 1,000 على كل عينة تم فرزها التأكد من النقاء والسلامة لفرز الخلايا.
- جمع الخلايا تم فرزها باستخدام الطرد المركزي في 450 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه الخلية مع 0.5 مل HF2.
- تأكيد الخلية فرز رقم هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق. ضبط عدد الخلايا مع HF2 لزرع الأعضاء.
ملاحظة: طيف واسع من السكان بمنك يمكن أن تكون معزولة لزرع الأعضاء باستخدام مجموعات إضافية من الأجسام المضادة مترافق fluorochrome في خطوة 1.2.2 أعلاه.
2-إعداد الفئران المتلقي وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسكت)
- إعداد المتلقين زرع
- الحفاظ على الطب البيطري وتربية رعاية كونجينيك الفئران المستفيدة (B6-LY5.1/Cr، CD45.1) في منشأة محددة ممرض حيوانية (منتدى جنوب المحيط الهادئ) مجاناً.
- لتطهير الاتقائية لمسار الجهاز الهضمي، توفير المياه المعقمة التي تحتوي على 100 مغ/لتر من مادة سيبروفلوكساسين للمستلمين لمدة 7 أيام قبل التشعيع الجرعة المميتة (9 غراي)، وصيانة لمدة 14 يوما بعد التشعيع.
- توفير تشعيع جرعة مميتة (9 غراي) من مصدر خدمات العملاء على النحو التالي. استخدام عامل تشغيل خدمات العملاء المدربين ومصدق. تعيين الصك المصدر Cs لتسليم تشعيع جاما الجسم الكلي كجي في الدقيقة 70. ضع 10 الفئران في حامل خصيصا وإدراج الحامل في قاعة إيرادياتور. تسليم 9 تشعيع الجسم الكلي غراي في 13 دقيقة وتعود الفئران إلى اقفاصها.
- زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم
- مزيج نوع البرية (WT) بمنك من ماوس مستلم كونجينيك (B6-LY5.1/Cr، CD45.1) بجرعة خلية من خلايا 2 × 105 كل الماوس مع 2 إلى 5 × 104 خلايا اختبار المنقي بمنك أعد مع التدفق الخلوي الفرز كما هو موضح في 1-3 أعلاه. مزيج من الخلايا في نفس المحاقن.
ملاحظة: بمنك WT توفر لها تأثير إشعاع تدخر للماوس المتلقية والسماح لبقاء الماوس المستلم إذا كان اختبار الخلايا لا تدعم هيماتوبويسيس. بمنك WT المستخدمة في هذا النوع من تجربة التعبير عن اليل CD45.1، وهكذا يمكن أن تميز من اختبار الخلايا باستخدام الأجسام المضادة التي تميز بين CD45.1 و CD45.2. الخلايا WT BM يشار إلى "مساعد الخلايا" أو "تجنيب الإشعاع الخلايا" أو "الخلايا المنافس". - ضبط حجم الخليط خلية إلى 200 ميليلتر كل مستلم يستخدم HF2 العقيمة لتسهيل الحقن.
- زرع الخلائط خلية إلى الفئران المستفيدة دكت المشع عبر الذيل عن طريق الحقن الوريدي حقن الوريد باستخدام المحاقن 1 مل وابرة قياس 28، ضمن ح 24 التشعيع. ضع ذيل الماوس تحت مصباح حرارة، الحرارة يؤدي إلى تمدد الوريد الذيل.
ملاحظة: Euthanize جميع الفئران المستفيدة في نهاية الدراسة وتقييم تطور المرض من نيكروبسي، وعلم الأنسجة، والتدفق الخلوي.
- مزيج نوع البرية (WT) بمنك من ماوس مستلم كونجينيك (B6-LY5.1/Cr، CD45.1) بجرعة خلية من خلايا 2 × 105 كل الماوس مع 2 إلى 5 × 104 خلايا اختبار المنقي بمنك أعد مع التدفق الخلوي الفرز كما هو موضح في 1-3 أعلاه. مزيج من الخلايا في نفس المحاقن.
3-انجرافتمينت التحليل استخدام "التدفق الخلوي"
- تقييم engraftment الخلية المانحة، جمع الدم المحيطي (PB) من الفئران المستفيدة في الأسبوع السادس والأسبوع الثاني عشر والأسبوع السادس عشر بعد زرع الأعضاء.
- الحارة المستلمين الموجودين في القفص مع مصباح الحرارة لحوالي 1 دقيقة ووضع الماوس في ريسترينير.
- قطع الوريد الذيل مع مشرط (بليد 10، التعامل مع مشرط #3) وجمع 100 ميليلتر من الجريدة الرسمية كل مستلم يستخدم أنبوب ميكروكابيلاري المحتوية على يدتا تخثر الدم.
- تقسيم الجريدة الرسمية التي تم جمعها إلى مختبرين تساوي اثنين بوضع 50 ميليلتر في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة. استخدام أحد قاسمة للألى تعداد الدم الكامل (CBC) (أداء لب الأنسجة NCI) واستخدام قاسمة الثانية لتلطيخ جسم التدفق الخلوي.
- للكشف عن انجرافتمينت المانحة بالتدفق الخلوي، خلايا الدم الحمراء (RBC) عن طريق إضافة 1 مل من المخزن المؤقت تحلل ربك ناقص التوتر (8.29 غرام/لتر من NH4Cl، 1 غرام/لتر من كهكو3، 0.037 غ/لتر من Na2يدتا، الرقم الهيدروجيني 7.2) إلى 50 ميليلتر من الجريدة الرسمية التي تم جمعها. دوامة العينة لخلط واحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي PB ليسيد في 4,600 س ز 1.5 دقيقة نضح المادة طافية بعناية وتجاهل.
- جزئيا عرقلة بيليه الخلية بلطف التنصت أو "التحريك" الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة مل 1.3 من برنامج تلفزيوني في بيليه الموجود في أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في س 4,600 ز للحد الأدنى 1.5 بعناية أسبيراتي وتجاهل المادة طافية.
- تعطيل بيليه الخلية عن طريق التنصت أو التحريك، وإضافة 200 ميليلتر من HF2 تستكمل بمصل فأر 5% إلى بيليه الخلية.
- إضافة CD45.2 مكافحة جسم (1 ميليلتر) مترافق مع اللوفيكوسيانين (APC) إلى تعليق خلية. تبني في 4 درجات مئوية على الأقل 30 دقيقة، وإيجاز دوامة الخليط.
- بعد تلطيخ، تغسل الخلايا مرتين كما هو موضح أعلاه، وريسوسبيند مع 400 ميليلتر من HF2 تكملة مع 1 ميكروغرام/مل من PI.
- الكشف عن انجرافتمينت سيتوميتير تدفق 4-لون باستخدام. الحصول على معلومات إضافية حول أنواع الخلايا في الدم المحيطي بإضافة أجسام مضادة إضافية للكشف عن أنواع الخلايا المحددة، مثل الخلايا الليمفاوية B أو T.
- تسجيل بيانات engraftment التسلسلي باستخدام ورقة انتشار للسماح لمزيد من التحليل للبيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن تظهر الأرقام التمثيلية لنتائج تجارب عدة. ويبين الشكل 1 الخلوي تدفق ممثل فرز التجربة. خلال التمايز المكونة للدم العادي، الخلايا أصبحت ملتزمة بنسب المكونة للدم محددة، أنهم الحصول على النسب وتحديد علامات خلية السطحية وتفقد القدرة على التجديد الذاتي. ولذلك، في البرية من نوع الفئران، تنحصر الخلايا الجذعية الذاتي تجديد بمنك النسب السلبية. في هذه التجربة، ونحن فرز بمنك من نخاع العظم NHD13 في النسب النسب السلبية، وانخفاض إيجابية، وارتفاع نسب إيجابية الخلايا. هذه فرز ثم تم زرع الخلايا إلى المستلمين بالوزن لتحديد القدرات الذاتي تجديد.
ويبين الشكل 2 النتائج من تجربة منفصلة، في النسب التي الخلايا السلبية أو تم زرع خلايا لم يتم فرزها من المانحين NHD13 مع حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في دكت المشع WT المستلمين. وأعرب الخلايا المانحة NHD13 علامة سطح الخلية CD45.2، بينما الخلايا منافس WT (راجع المقطع 2.2.1 أعلاه) أعرب عن علامة سطح الخلية CD45.1. ويبين الشكل 3 تحليل engraftment المسلسل لم يتم فرزها NHD13 بمنك، أو بمنك NHD13 النسب السلبية. بعد أسبوعين تقريبا من 16، أووتكومبيتي الخلايا NHD13 الخلايا WT، كما يتضح من زيادة نسبة CD45.2 + الخلايا في الدم المحيطي. ويبين الشكل 4 مثالاً للتحول ليوكيميك من ماوس زرع الخلايا NHD13 حركة الديمقراطيين الاشتراكيين.
رقم 1: التدفق الخلوي فرز استراتيجية بمنك ملطخة بجسم النسب كوكتيل. يمثل كل مربع مستطيل على الأرض دوت السكان الخلية فرز هسكت لتقييم وظيفة الخلية. R4, النسب السلبية؛ R5، انخفاض نسب إيجابية؛ R6، إيجابية النسب العالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ملامح الممثل نظام مراقبة الأصول الميدانية للانزيم انجرافتمينت استخدام جسم CD45.2 مكافحة محددة المانحة. تم زرع المستلم بمنك مع بمنك NHD13 (CD45.2 +) 1 × 106 والمستلم لنبم مع 5 × 104 NHD13 النسب السلبية BM الخلايا (CD45.2 +). في كل حالة من الحالات، استخدمت 2 × 105 WT بمنك (CD45.1 +) كخلايا المنافس. الأرقام في مربعات العلوي والسفلي تمثل CD45.2 الإيجابية (مشتقة من المانحين NHD13) و CD45.2 السلبية (المستمدة من الخلايا منافس WT)، على التوالي، في ما بعد زرع 6 في الأسبوع والأسبوع 24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: حركية Engraftment المستلمين الفردية بعد زرع الأعضاء- يظهر كل سطر في الرسم البياني فحوصات انجرافتمينت المسلسل الماوس المستلمين الفردية. تم زرع المستفيدين بمنك مع 1 × 106 خلايا من بمنك كله NHD13، وتم زرع المستفيدين لنبم مع 5 × 104 من NHD13 النسب السلبية BM بعد الفرز. ويشير NHD إلى الجهات المانحة NHD13. بي أم، بمنك الفئران المستفيدة؛ لنبم، النسب السلبية BM المتلقية؛ ببمك، خلايا الدم الطرفية مونونوكليتيد. وفي جميع الحالات، أووتكومبيتي الخلايا المانحة NHD13 تدريجيا الخلايا WT. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تلطيخ أيار-Grünwald Giemsa (مج) من نخاع العظم (بي أم) من المتلقي حركة الديمقراطيين الاشتراكيين التي أحرزت تقدما في مجال مكافحة غسل الأموال- لاحظ وجود العديد من الانفجارات وأشكال غير ناضجة. تشير الأسهم إلى الانفجارات، ورؤوس أسهم تشير إلى أشكال غير ناضجة. 400 الأصلي X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن حركة الديمقراطيين الاشتراكيين اضطراب الاستنساخ خلايا الجذعية المكونة للدم، حركة الديمقراطيين الاشتراكيين "وقف"، أو خلايا المبادر، لا بعد تتسم. أظهرنا سابقا أن حركة الديمقراطيين الاشتراكيين يمكن أن تكون الأولى لوزن الفئران باستخدام نخاع العظام من الفئران NHD13 هسكت، تتسم بفقر الدم الكبير الكريات والكريات، نقص العَدلات وأدلة مورفولوجك من خلل التنسج15. وبالإضافة إلى ذلك، حددت فحوصات تعمير تنافسية ميزة نمو الخلايا من نخاع العظم NHD13 حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. أخذت معا، هذه النتائج يعني وجود حركة الديمقراطيين الاشتراكيين الجذعية أو الخلايا المبادر. تجارب إضافية الآن في التقدم، وتهدف إلى صقل في إيمونوفينوتيبيك الخصائص لبدء حركة الديمقراطيين الاشتراكيين الخلية15 استخدام أكثر تعريف السلف وتنبع علامات خلية (CD150، CD48، ج-كيت والهيئة-1)16 جنبا إلى جنب مع النسب علامة تلطيخ الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول.
تحديد حركة الديمقراطيين الاشتراكيين الشروع في الخلايا باستخدام الفئران NHD13 ينطوي التدفق واسع النطاق الخلوي إجراء الفرز. أماكن التلاعب السابقين فيفو بمنكس الابتدائي الإجهاد في الخلايا، ويحتمل أن تكون أسفرت عن موت الخلايا أو فقدان الوظيفية. ولذلك، ينبغي بذل الجهود لتقليل الوقت السابقين فيفو التلاعب بما في ذلك الوقت من التدفق الخلوي الفرز. صانع ونموذج التدفق الخلوي الصكوك وديناميات تدفق من المتغيرات الإضافية التي قد تؤثر على بقاء الخلية بعد الفرز. يتطلب الإجراء هسكت ضخ الخلايا عن طريق الأوعية الدموية. وبالرغم من أن حقن الوريد الذيل قد يكون أسلوباً أكثر تحديا من حقن الرجعية-المداري، في تجربتنا، حقن الوريد الذيل يمكن أن يؤديها أسرع من حقن الرجعية-المدارية كما الفئران المستفيدة هي عدم تخديره من أجل هذا السياق ذيل الحقن. الحد حجم الحقن (الحد الأقصى 150 ميليلتر) مسألة أخرى في17من حقن الرجعية-المداري، أعلى تركيز خلية قد يؤدي إلى خسارة إضافية للخلايا أثناء إعداد الخلية، مثل قص الخلايا على جدار المحاقن و الإبر.
على الرغم من أن تركز هذه التجارب على نموذج NHD13 لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين، يمكن استخدام النهج الفرز وزرع هسكت الموصوفة هنا لأي ماوس المهندسة وراثيا. بالإضافة إلى تحديد خصائص ذاتية تجديد الخلايا المكونة للدم، يمكن استخدام هذا النهج زرع الأعضاء لأغراض أخرى. على سبيل المثال، إذا كان أحد يرغب في الحصول على مجموعة كبيرة من الفئران بنخاع العظام حركة الديمقراطيين الاشتراكيين لتقييم فعالية العلاج مع جزيء صغير، يمكن إنشاء مجموعة كبيرة (30 + الفئران) بزرع الفئران WT مع "حركة الديمقراطيين الاشتراكيين BM. بدلاً من ذلك"، يمكن عكس الاستراتيجية هسكت. في محاولة لعلاج فئران من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، يمكن زرعها الفئران NHD13 مع حركة الديمقراطيين الاشتراكيين مع WT BM، ويمكن رصد نجاح عملية الزرع بتقييم نسبة الخلايا المكونة للدم التي تعبر عن CD45.1 (الذي يصادف WT BM) بدلاً من CD45.2 (الذي يمثل حركة الديمقراطيين الاشتراكيين BM) 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء الكشف عنها.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها برنامج البحوث الداخلية للمعهد الوطني للسرطان، "المعاهد الوطنية للصحة" (منح أرقام ضياء SC 010378 و 010983 قبل الميلاد).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
References
- Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
- Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
- Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
- Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
- Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
- Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
- Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
- Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
- Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
- Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
- Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
- Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
- Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
- Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219 (2017).
