Summary
我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々 な悪性造血細胞の評価に役立ちます。
Abstract
骨髄異形成症候群 (MDS) は、造血の効果が、末梢血血球減少によって、異形成、急性白血病への変換のための傾向によって定義される造血幹細胞障害の多様なグループです。NUP98 HOXD13 (NHD13) トランスジェニック マウス末梢血血球減少によって、異形成と急性白血病への変換の観点から人間の MDS を要約するでしょう。我々 は以前、MDS 骨髄核細胞 (BMNC) を移植による野生型の受信者に mds 遺伝子組み換えマウスから MDS が転送することを示した。起源の MDS のセルを明確に理解、特定を移植する方法を開発した、immunophenotypically に造血のサブセットが定義されています。この記事で私たちは移植造血幹・前駆細胞の特定の人口の分離とのプロセスを説明します。次の移植は、移植の効率とドナー MDS 細胞の持続性を評価する方法をについて説明します。
Introduction
骨髄異形成症候群 (MDS) は、造血の効果が、異形成の形態学上の証拠と急性骨髄性白血病 (AML)1,2 への変換のための傾向によって特徴付けられるクローン血液疾患の多様なセットを表す ,3,4。無効造血骨髄で成熟逮捕と hypercellular 骨髄1,3にもかかわらず末梢血血球減少によっての結果として認識されます。MDS の発症率は、米国で毎年 10万人あたり 2-12 ケースとしていろいろと推定されている、MDS の発症率は年齢とともに増加この与えられた米国の人口3、老化を理解する重要な条件を作る 5。MDS のほとんどの場合に、明確な病因がない、MDS のいくつかのケースはがん化学療法6ベンゼンなどの溶剤を含む知られている遺伝毒性要因への曝露に起因すると考えられています。
MDS 患者は通常データシート セル7の変異を取得しています。比較的稀に、MDS 患者の数は、NUP98、EVI1、RUNX1、MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) などの遺伝子を含むバランスのとれた染色体転座を取得しています。私たちの研究室は8NUP98 遺伝子を含む染色体転座の長年の興味。トランスジェニック マウスを表す Vav1 プロモーターによって調整される NUP98 HOXD13 (NHD13) 遺伝子とエンハンサー要素は MDS、末梢血血球減少によって、異形成や急性骨髄性白血病9 への変換の形態学上の証拠などの主要な機能のすべてを表示.
MDS 60 年以上10で認識されているクローン幹細胞障害と見なされます、細胞免疫不全マウスで MDS を接がに取り組み成功していない主、データシート セル接が悪い11、ので 12,13,14マウス臨床病気を開発しません。どの造血細胞は MDS を送信ことができますを識別するために、私たちが NHD13 モデルになってし、末梢血血球減少によってを含む人間の MDS の基本的な機能のすべてを示した病気の実体として MDS を接が可能性が我々 を示した異形成とアジア ・ マイル リミテッド15に変換します。このレポートでは、MDS を開始するセルを識別するためにさらに造血幹・前駆細胞 (HSPC) を分別する方法と同様に、これらの実験の技術的な詳細を紹介します。
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Protocol
この資料に記載されている動物の手続きベセスダ動物ケアおよび使用委員会で国立がん研究所によって承認され、思いやりのあるケアと実験動物の使用の公衆衛生サービス ポリシーに含まれるポリシーに準拠、動物福祉法とケアと実験動物の使用のためのガイド。
1. セル準備
- 収穫骨髄有核細胞 (BMNC)
- 滅菌材料のみを使用します。スチーム オートクレーブを使用して再利用可能な器具を滅菌します。単回使用の滅菌容器にプラスチック容器、注射器、針を購入します。クラス II、タイプ A2 生物学的安全キャビネットのすべての動物とセルの操作を実行します。
- HF2 の 3 mL を含む下部チューブ ラウンド 14 mL で BMNCs を準備 (ハンクのバランス 2% 牛胎児血清を添加した食塩)。
- C57Bl6 ドナー マウス (陽性 CD45 遺伝子 CD45.2)、年齢 2-6 ヶ月通常 CO2チャンバーを用いたを安楽死させます。
- マウス死体を滅菌するには、スプレー ボトルで体全体を 70% エタノールを噴霧します。足首まで骨盤から足から皮膚の皮をむきます。
- 滅菌はさみ (ストレート、シャープ ユニット/シャープ、11.5 cm) および鉗子 (グレーフェ、鋸歯状にされた、0.8 mm の先端幅) を使用して枝肉から大腿骨および脛骨を削除します。接続されている筋肉を明らかにトリミングします。
- 脛骨の近位および遠位端をハサミでカットします。脛骨を鉗子で保持、脛骨 (足首) の遠位端脛骨骨髄腔に HF2 の 2.5 mL を含む 27 ゲージ 3 mL シリンジを挿入します。底部チューブ ラウンド 14 mL に穏やかな圧力を使用して脛骨から骨髄細胞をフラッシュします。
- 他の脛骨に繰り返します。
- 大腿骨の近位および遠位端をハサミでカットします。3 mL シリンジ大腿骨骨髄腔の遠位端に HF2 の 2.5 mL を含むと、注射器に穏やかな圧力を適用するフラッシュ 20 g 針を挿入することによって大腿骨髄腔に取り付けられました。
- 両方の脛骨からすべての骨髄を収集、他の大腿骨に繰り返し、同じ 14 mL で大腿骨の丸い底部チューブ。
- 3 mL の注射器に接続されている同じ 20 g 針、上下に数回を吸引によって骨髄の質量を分散させます。
- BMNC の抗体の汚損
- カウント BMNC。1.1.8 の手順で生成された BMNC 懸濁液の 20 μ L に 3% 酢酸溶液 20 μ L を追加します。その後、診断および倒立顕微鏡を使用してカウントします。
- 4 ° C で 5 分間 450 x g で穏やかなの遠心分離によって、BMNC をペレットします。10 の7セルごと 90 μ L を使用する HF2 とペレットを再懸濁します、細胞懸濁液にビオチン化抗リネージュ抗体カクテルの 10 μ L を追加します。
- 4 ° C で 20 分間のインキュベート後 3 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のステンド グラスの細胞を洗います。
- HF2 の 10 の7セルごとの 100 μ L で BMNC を再懸濁します。2 μ L アロフィコシアニン (APC) の共役反ビオチン抗体を 20 分のための 4 ° C で培養後、細胞懸濁液を追加します。
- 3 ml の PBS のステンド グラスの BMNC をすすいで流れ cytometry 細胞選別の propidium ヨウ化 (PI) の 0.2 μ G/ml を添加した HF2 と BMNC を再懸濁します。
- BMNC のフローサイトメトリー細胞選別フローします。
- 流れ cytometry セルソーターを調整します。光電子増倍管 (光電子増倍管)、散布図、無染色の細胞を用いた蛍光パラメーターを最適化し、各検出器の線形の範囲内で設定します。
- 無染色、PI 染色を準備し、APC 標識リネージュ ステップ 1.2 から並列でカクテルの細胞。スペクトル補償を分析します。
- FSC H対SSC H、H--SSC 640 640 SSC A対と対640 SSC S 640-SSC-W. のシーケンシャル ゲートでダブレット細胞を判別します。
- 561 nm で 614/20 帯域通過フィルターで収集された排出興奮して PI を使用して淘汰のセルを除外します。リネージュ APC 671/30 帯域通過フィルター付け 640 nm と収集の発光で細胞を刺激します。
- 電圧の高さと蛍光値を記録し、ソートする人口を視覚化するリスト モード データ ファイルに少なくとも 100,000 のイベントを収集します。
- 次の 10,000 のセルの 3 つのサンプルを取得した後のスペクトルの補正を計算する: 細胞、細胞、PI と APC 標識細胞と共役反リネージュ抗体カクテルをラベルなし。
- 10 %fbs メディアの 0.5 mL を含む 5 mL チューブに明るい蛍光 (LP2) リネージュ負 (LN) dim 蛍光強度 (LP1) と LP 人口リネージュ正 (LP) を並べ替えるには 3 つの領域を設定します。
- 1 つのドロップを使用して並べ替えセルを包むし、飛行中止モードを浄化します。
- 並べ替えられた細胞の純度を確認する各並べ替えられたサンプルにセルの総数が 1,000 記事並べ替え解析を実行します。
- 4 ° C で 5 分間 450 × g で遠心分離によって細胞を収集し、HF2 の 0.5 ml 細胞ペレットを再懸濁します。
- 並べ替えられたセル番号で検定、トリパン ブルーを確認します。HF2 の移植細胞数を調整します。
注: BMNC の人口の広いスペクトルは移植手順上記 1.2.2 で蛍光色素標識された抗体の組み合わせを追加を使用して分離できます。
2. 受信者マウス作製と造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植)
- 移植の準備
- 獣医と飼育コンジェニック受信者マウス (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) 特定病原体無料 (SPF) の動物実験施設でケアを維持します。
- 胃腸トラックの除染を予防、致命的な線量 (9 Gy) 照射前 7 日間、受信者にシプロフロキサシン 100 mg/L を含む滅菌水を供給、照射 14 日間保持します。
- とおり致命的な線量 (9 Gy) 照射 Cs のソースからを提供します。訓練を受けた、認定 Cs 演算子を使用します。70 cgy-ルンビア/分全身の γ 線照射を提供する Cs 信号発生器を設定します。特注のホルダーに 10 匹のマウスを置き、照射室にホルダーを挿入します。13 分 9 Gy 全身照射を提供し、マウスをケージに戻ります。
- 造血幹細胞移植
- 上記に記載されている 1.3 として流れ cytometry 並べ替えと野生型 (WT) マウス 2 を 5 × 10 とあたり 2 × 105セルのセル用量で受信者マウス (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) コンジェニックから BMNC BMNC 準備精製テストの4セルをミックスします。同じ注射器で細胞をミックスします。
注: WT BMNC 受信者のマウスに放射線を温存効果を提供でき、受信者のマウスの生存のためテスト細胞が造血をサポートしていない場合。WT BMNC 使用このタイプの実験のエクスプレス CD45.1 アレルされ、こうして識別 CD45.1 および CD45.2 を区別する抗体を用いて細胞から。WT BM 細胞は、「ヘルパー セル」、「放射線スペア電池」または「競合細胞」と呼ばれます。 - 200 μ L 注入を促進するため滅菌 HF2 を使用して受信者ごとにセルの混合物のボリュームを調整します。
- 1 mL 注射器と照射の 24 時間以内、28 ゲージ針を使用して静脈内尾静脈注射を介して致死的に放射線照射した受信者マウスに細胞の混合物を移植します。熱は尾静脈拡張につながるとは、熱ランプの下でねずみのしっぽを配置します。
注: 研究の終わりにすべての受信者のマウスを安楽死させるし、死体解剖、組織学、およびフローサイトメトリーによって病気の進行を評価します。
- 上記に記載されている 1.3 として流れ cytometry 並べ替えと野生型 (WT) マウス 2 を 5 × 10 とあたり 2 × 105セルのセル用量で受信者マウス (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) コンジェニックから BMNC BMNC 準備精製テストの4セルをミックスします。同じ注射器で細胞をミックスします。
3 フローサイトメトリーを用いた生着アッセイ
- ドナー細胞の生着を評価するには、受信者のマウスから移植後 16 週、12 週目、6 週で末梢血 (PB) を収集します。
- 約 1 分の熱ランプ暖かいケージ内の受信者と、落にマウスを置きます。
- メス (刃 10、#3 メス ハンドル) の尾静脈をカットし、抗凝固剤として EDTA を含むマイクロキャピ ラリー チューブを使用して受信者ごとの PB の 100 μ L を収集します。
- 50 μ L 滅菌遠心チューブ内に配置することによって、収集した PB を 2 つの等しい因数に分割します。自動完全な血球数 (CBC) の 1 つの因数 (NCI 病理コアで実行されます) を使用して抗体の汚損のため 2 番目の因数を使用し、フローサイトメトリーします。
- フローサイトメトリーによるドナーの生着を検出、収集した PB の 50 μ L に 1 mL の低張性赤血球換散バッファー (NH4Cl、KHCO3ナ2EDTA、pH 7.2 0.037 g/L の 1 g/L の 8.29 g/L) を追加することによって赤血球 (RBC) を溶解させます。渦混合し、室温で 10 分間インキュベートするサンプル。
- 1.5 分は慎重に、上清を吸引し、廃棄のための 4,600 x g で分離の PB を遠心分離機します。
- 部分的に軽くタップするか、「弾く」管の底で細胞ペレットを混乱させます。1.3 mL の PBS、ペレットにチューブと 4,600 x g で 1.5 分間遠心に位置して慎重に吸引と破棄上清を追加します。
- タップまたはフリック、細胞ペレットを混乱させるし、細胞ペレットに 5% ラット血清を添加した HF2 を 200 μ l 添加します。
- 細胞懸濁液にアロフィコシアニン (APC) と共役アンチ CD45.2 抗体 (1 μ L) を追加します。少なくとも 30 分と簡単に渦混合物のための 4 ° C で孵化させなさい。
- 汚損の後、上記の 2 倍の細胞を洗浄し、PI の 1 μ G/ml を添加した HF2 の 400 μ L で再懸濁します。
- 4 色流れの cytometer を使用して生着を検出します。B または T のリンパ球などの特定の細胞型を検出する抗体を追加を追加することによって末梢血内のセル型の追加情報を取得します。
- 拡散シートを使用してさらにデータの分析を可能にするためシリアル生着データを記録します。
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Representative Results
いくつかの実験結果の代表的な数値を示します。図 1は、代表的なフローサイトメトリー実験を並べ替えを示しています。正常な造血分化中細胞は特定の造血系統にコミットになる彼ら系列を定義するセル表面のマーカーを取得し、自己複製の可能性を失います。したがって、野生型マウスでは、幹細胞の自己複製はリネージュ負 BMNC に限定されます。この実験で我々 は、正と高血統陽性細胞はリネージュ リネージュ負、低に NHD13 骨髄から BMNC に分類されます。これらの並べ替え済み細胞が、自己再生能力を決定する WT に移植しました。
図 2は、否定的な細胞系列の別の実験からの結果を示しています。 または mds NHD13 ドナーから並べ替えられていない細胞が致死的照射 WT に移植しました。WT 競合細胞 (セクション 2.2.1 上記参照) CD45.1 細胞表面マーカーを表明したに対し、NHD13 ドナー細胞は CD45.2 細胞の表面マーカーを表現しました。図 3は、未整理の NHD13 BMNC または負の系譜 NHD13 BMNC のいずれかのシリアルの生着の分析を示しています。約 16 週間後 CD45.2 + 末梢血細胞の増加割合で示すように、NHD13 細胞は WT 細胞を害さない。図 4は、NHD13 MDS 細胞を移植したマウスから白血病変換の例を示します。
図 1: BMNC の戦略を並べ替えフローサイトメトリーは、カクテル系統抗体で染色します。ドット プロットの各長方形の箱は、造血幹細胞移植細胞の機能を評価するためにソートのセル人口を表します。R4 系統の負R5、低い血統で、肯定的です;R6、高い系統正。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ドナー特定アンチ CD45.2 抗体を用いた生着の試金のための代表的な FACS プロファイル。1 X 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +) BMNC 受信者が移植され、LNBM 5 × 104 NHD13 リネージュ負胆と受信者の細胞 (CD45.2 +)。それぞれのケースでは、2 x 105 WT BMNC (CD45.1 +) は競合細胞として使用されました。(NHD13 ドナー由来) 上限と下限ボックス表す CD45.2 正の数値と負 CD45.2 (WT ライバル細胞由来)、それぞれ、移植後 6 週と 24 週で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 個々 の受信者移植後の生着動態。グラフ上の各行は、個々 の受信者マウスのシリアルの生着の試金を示しています。BMNC 受信者が NHD13 全体 BMNC の 1 X 10 の6セルが移植され、LNBM 受信者 NHD13 リネージュ負 BM の 5 × 104ソート後移植されました。NHD は、NHD13 ドナーを示します。バミューダ諸島、BMNC 受信者マウス;LNBM、リネージュ負の BM の受信者;PBMC、末梢血 mononucleated 細胞。すべてのケースで NHD13 ドナー細胞は徐々 に WT 細胞を引き起こしたりします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: (ウロ) 5 月グリューンヴァルト ギムザ染色骨髄 (BM) 急性骨髄性白血病に進んで MDS 受信者から。多数の爆発と未熟な形態の存在に注意してください。爆発を示す矢印と矢印の未熟な形態を示します。元 400 X。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
MDS はクローン性造血幹細胞の障害であるが、MDS「幹」、または開始セルは特徴付けされていますいません。以前、MDS 骨髄による造血幹細胞移植、大球性貧血、白血球減少、好中球減少、異形成15の形態学上の証拠によって特徴付けられる NHD13 マウスを用いた WT マウスに移植できることを示した。さらに、競争力のある再試金は NHD13 MDS 骨髄由来細胞の成長の優位性を識別しました。一緒に取られて、これらの調査結果は、MDS 幹または開始セルの存在を意味します。追加実験が進行中の今、肺浸潤を目的とした特性データシート開始セル15より定義された幹・前駆細胞のマーカー (CD150、CD48、c キットと Sca 1) を使用して16系統と組み合わせるマーカー染色法はこのプロトコルで記述されています。
MDS を識別する広範な流れ cytometry 並べ替えプロシージャを含む NHD13 マウスを使用してセルを開始します。主 BMNCs の前のヴィヴォ操作は、細胞死や機能の損失に至るおそれ、細胞にストレスを配置します。したがって、流れの cytometry の並べ替えの時間を含む前のヴィヴォ操作の時間を短縮する努力をすべきであります。メーカーと流動流れ cytometry 器具のモデルは、並べ替え後セル実行可能性に影響を与える可能性があります追加の変数です。造血幹細胞移植の手順には、血管を介して細胞の注入が必要です。受信者のマウスがないの尾静脈麻酔としてに、尾静脈注射をレトロ軌道注射よりも急速に実行できる尾静脈注射かもしれないが我々 の経験で、レトロな軌道の注射よりもより挑戦的な技術注射。注入量 (最大 150 μ L) の制限は、細胞濃度が高いセル準備、注射器の壁の細胞のせん断加工などの過程で細胞の損失につながる可能性がありますレトロな軌道注入17の別の問題と針。
これらの実験は、データシートの NHD13 モデルに焦点を当てているがここで説明した造血幹細胞移植並べ替えと移植方法は任意の遺伝子組み換えマウスに使用できます。自己造血細胞の特性を決定する、に加えてこの移植方法は、他の目的に使えます。例えば、小分子による治療の有効性を評価するために MDS 骨髄を持つマウスの大規模コホートを取得する 1 つの欲望する場合、MDS 点また WT マウスの移植によって生成される大規模コホート (30 + マウス)、造血幹細胞移植戦略を取り消すことができます。MDS のマウスを治療しようとして、mds NHD13 マウスは WT BM で移植することができます。 および CD45.2 (MDS BM にあたる) ではなく CD45.1 (WT BM にあたる) を表現する造血細胞の割合を評価することによって移植の成功を監視できます。18。
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Disclosures
何を開示する必要があります。
Acknowledgments
この作品は、国立がん研究所の学内研究プログラムによって支えられた (許可番号 ZIA SC 010378 と BC 010983) 健康の国民の協会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
References
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