Summary
Describimos el uso de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para evaluar el potencial maligno de las células hematopoyéticas genéticamente. TCMH es útil para evaluar varias células hematopoyéticas malignas en vivo así como generar una cohorte grande de ratones con síndromes mielodisplásicos (MDS) o leucemia para evaluar nuevas terapias.
Abstract
Síndromes mielodisplásicos (SMD) son un grupo diverso de trastornos de células madre hematopoyéticas que son definidos por hematopoyesis ineficaz, cytopenias de la sangre periférica, displasia y una propensión para la transformación a leucemia aguda. Ratones transgénicos NUP98-HOXD13 (NHD13) recapitulan MDS humana en términos de cytopenias de la sangre periférica, displasia y transformación a leucemia aguda. Previamente demostramos que MDS se podía transferir de un ratón genéticamente modificado con MDS a los receptores de tipo salvaje mediante el trasplante de células nucleada de la médula MDS (BMNC). Más claramente entender la célula MDS de origen, hemos desarrollado métodos específicos de trasplante, immunophenotypically definido subconjuntos hematopoyéticos. En este artículo, describimos el proceso de aislar y transplante de poblaciones específicas de vástago de hematopoietic y células progenitoras. Después del trasplante, se describen métodos para evaluar la eficacia del trasplante y la persistencia de las células donantes del MDS.
Introduction
Síndromes mielodisplásicos (MDS) representan un conjunto diverso de trastornos de la sangre clonales caracterizados por hematopoyesis ineficaz, evidencia morfológica de la displasia y una propensión para la transformación a leucemia mieloide aguda (AML)1,2 ,3,4. La hematopoyesis ineficaz se reconoce como una detención de la maduración en la médula ósea y los resultados en cytopenias de la sangre periférica a pesar de que la médula ósea hipercelular1,3. La incidencia de la MDS se ha estimado vario como 2-12 casos por 100.000 personas anualmente en los Estados Unidos, y la incidencia de los MDS aumenta con la edad, haciendo de esta una condición importante para entender dado el envejecimiento de población de Estados Unidos3, 5. Aunque la mayoría de los casos de MDS no tiene etiología clara, algunos casos de MDS son probablemente debido a exposición a agentes genotóxicos conocidos, incluyendo solventes como el benceno y cáncer quimioterapia6.
Pacientes de los MDS normalmente han adquirido las mutaciones en las células MDS7. Aunque relativamente poco común, un número de pacientes de los MDS tienen translocaciones cromosómicas equilibradas que involucran genes NUP98 EVI1, RUNX1, y MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Nuestro laboratorio tiene un antiguo interés en translocaciones del cromosoma, que implican el gene NUP98 del8. Ratones transgénicos que expresa un transgen NUP98-HOXD13 (NHD13) regulado por el promotor de Vav1 y elementos potenciador Mostrar todas las características claves de los MDS, incluyendo cytopenias de la sangre periférica, evidencia morfológica de la displasia y transformación a LMA9 .
Aunque MDS ha sido reconocidos por más de 60 años10y se considera ser un desorden clonal de células madre, esfuerzos al engraft células humanas de MDS en ratones inmunodeficientes han sido en gran parte fracasados, porque las células MDS engraft mal11, 12,13,14 y los ratones no desarrollan enfermedad clínica. En un esfuerzo por identificar qué células hematopoyéticas pueden transmitir MDS, se volvió hacia el modelo de NHD13 y demostró que podríamos engraft MDS como una entidad de la enfermedad que mostraba todas las características cardinales de los MDS humana, incluyendo cytopenias de la sangre periférica, displasia, y transformación a LMA15. En este informe, presentamos los detalles técnicos de estos experimentos, así como métodos para fraccionar más tallo hematopoyética y células precursoras (HSPC), en un esfuerzo por identificar las células iniciadoras de MDS.
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Protocol
Los animales procedimientos descritos en este artículo fueron aprobados por el Instituto Nacional del cáncer en el Comité de uso y cuidado de animales de Bethesda y conforme a las políticas dentro de la política de servicio de salud pública en cuidado humano y uso de animales de laboratorio, la Ley de bienestar animal y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. preparación de la célula
- Cosecha de la médula células nucleadas (BMNC)
- Utilizar sólo material estéril. Esterilizar instrumentos reutilizables mediante un autoclave de vapor. Compra de agujas, jeringas y artículos de plástico en recipientes estériles de uso individual. Realizar todas las manipulaciones animal y la célula en una clase II, cabina de seguridad biológica de tipo A2.
- Preparar BMNCs de 14 mL tubo inferior que contiene 3 mL de HF2 (Hank equilibrada solución de sal suplementado con 2% de suero bovino fetal).
- Eutanasia C57Bl6 ratones donantes (positivos para CD45 alelo CD45.2), la edad por lo general 2-6 meses, usando una cámara de CO2 .
- Esterilizar el cadáver del ratón rociando etanol al 70% en todo el cuerpo con una botella de spray. Pelar la piel de las piernas, desde la pelvis hasta el tobillo.
- Retire los fémures y tibias de la canal utilizando tijeras estériles (recto, agudo/sharp, 11,5 cm) y pinzas (Graefe, serrado, ancho de punta de 0,8 mm). Corte claramente los músculos correspondientes.
- Corte los extremos proximales y distales de la tibia con las tijeras. Sostiene la tibia con fórceps, inserte una jeringa de 3 mL de indicador de 27 que contienen 2,5 mL de HF2 en la cavidad de la médula ósea tibial en el extremo distal de la tibia (tobillo). Lavar las células de la médula ósea de la tibia mediante una presión suave en la 14 mL tubo de fondo redondo.
- Repita para la otra tibia.
- Corte los extremos proximales y distales del fémur con tijeras. Ras de la cavidad de la médula ósea de fémur mediante la inserción de una aguja de calibre 20, unida a una jeringa de 3 mL conteniendo 2,5 mL de HF2 en el extremo distal de la cavidad de la médula ósea de fémur y aplicando presión suave en la jeringa.
- Repita para el fémur, que recoge toda la médula ósea de ambas tibias y fémures en la misma 14 mL redondo tubo inferior.
- Dispersar la masa de la médula ósea por aspiración hacia arriba y hacia abajo varias veces con la misma aguja de calibre 20, unida a la jeringa de 3 mL.
- Tinción de anticuerpo de BMNC
- Cuenta BMNC. Añadir 20 μl de una solución de ácido acético 3% a 20 μl de la suspensión BMNC generó en el paso 1.1.8. Entonces, contar con un hemocitómetro y un microscopio invertido.
- El BMNC de pellets por centrifugación suave 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado con HF2 con 90 μl por 107 células y añadir 10 μl de anticuerpo anti-linaje de biotinilado cóctel a la suspensión de células.
- Después de incubar durante 20 min a 4 ° C, se lavan las células teñidas con 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Resuspender el BMNC con 100 μl de HF2 107 células. Añadir 2 μl de allophycocyanin (APC) conjugado anticuerpo anti-biotina a la suspensión de células, seguido por la incubación a 4 ° C por 20 min.
- Enjuague el BMNC manchada con 3 mL de PBS y resuspender BMNC con HF2 suplementado con 0.2 μg/mL de yoduro de propidio (PI) para la clasificación de flujo citometría celular.
- Flow cytometry célula clasificación de BMNC
- Calibrar el clasificador de células de citometría de flujo. Optimizar todos los tubos de fotomultiplicador (PMTs), dispersión y parámetros de fluorescencia utilizando células sin manchas y dentro de la gama lineal de cada detector.
- Preparar sin manchas, teñidos de PI, y APC marcado linaje células cóctel paralelamente en el paso 1.2. Analizar para compensación espectral.
- Discrimina las células doblete por sincronización secuencial de FSC-H vs SSC-H 640-SSC-A vs 640-SSC-H y 640-SSC-S vs 640-SSC-W.
- Excluir las células viables mediante PI excitado en 561 nm y de emisión con un filtro de paso banda 614/20. Excitar el linaje APC etiquetado celdas de 640 nm y recoger la emisión con un filtro de paso banda 671/30.
- Anote los valores de fluorescencia como altura voltaje y recoger por lo menos 100.000 eventos en archivos de datos de modo lista para visualizar las poblaciones a ser ordenados.
- Calcular indemnización espectral después de la adquisición de tres muestras de 10.000 células por lo siguiente: sin etiqueta células, PI etiquetado células y cóctel de linaje el anticuerpo conjugado con APC etiquetado células.
- Establecer tres regiones para ordenar linaje negativo (LN), linaje positivo (LP) con intensidad de fluorescencia tenue (LP1) y la población de LP con fluorescencia brillante (LP2) en tubos de 5 mL con 0,5 mL de 10% FBS medios.
- Las células tipo usando una gota envuelven y purifican el modo de carga abortada.
- Realizar análisis de tipo post con 1.000 células totales en cada muestra seleccionada para confirmar la pureza y viabilidad de las células clasificadas.
- Recoge ordenada de las células por centrifugación a 450 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender el pellet celular con 0,5 mL de HF2.
- Confirman clasificado celular número con hemocitómetro y azul de tripano. Ajustar el número de células con HF2 para el trasplante.
Nota: Un amplio espectro de poblaciones BMNC puede ser aislado para trasplante usando combinaciones adicionales de anticuerpos conjugados con fluorocromo en el paso anterior 1.2.2.
2. receptor ratones preparación y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT)
- Preparación de los receptores de trasplante
- Mantener la veterinaria y cría cuidado congenic ratones receptores (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) en un patógeno específico (SPF) animal servicio de gratuito.
- De descontaminación profiláctica de la vía gastrointestinal, proporcionar agua estéril que contiene 100 mg/L de ciprofloxacina a los destinatarios durante 7 días antes de la irradiación letal dosis (9 Gy) y mantener durante 14 días después de la irradiación.
- Proporcionar una irradiación de dosis letal (9 Gy) de una fuente de Cs como sigue. Usar un operador entrenado, certificado de la Cs. Establecer el instrumento de la fuente de Cs para entregar 70 cGy/min dosis de radiación gamma corporal total. 10 ratones en un soporte diseñado e Inserte el soporte en la cámara del Irradiador. Entregar irradiación de cuerpo total 9 Gy en 13 minutos y volver a los ratones a sus jaulas.
- Trasplante de células madre hematopoyéticas
- Mezcla de tipo salvaje (WT) BMNC de un ratón receptor Congénicos (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) en una dosis de celda de 2 x 105 células por ratón con 2 a 5 x 104 células de la prueba purificada que BMNC preparado con citometría de flujo clasificación como arriba se describe en 1.3. Mezcla de células en la misma jeringa.
Nota: El peso BMNC proporcionan un efecto economizador de radiación al ratón receptor y permiten la supervivencia del receptor ratón si las células de prueba no son compatibles con la hematopoyesis. La WT BMNC utilizado en este tipo de experimento expresa el alelo CD45.1 y así se pueden distinguir de las células de prueba usando los anticuerpos que discriminen entre CD45.1 y CD45.2. Las células del BM de WT se refieren como "linfocitos", "células escasamente la radiación" o "células del competidor". - Ajustar el volumen de la mezcla de células a 200 μL por destinatario utilizando HF2 estéril para facilitar la inyección.
- Trasplante de las mezclas de la célula a la ratones receptores irradiados letalmente via cola intravenoso Inyección en la vena usando una jeringa de 1 mL y aguja de calibre 28, dentro de las 24 horas de irradiación. Colocar la cola de ratón bajo una lámpara de calor, calor conduce a la dilatación de la vena de la cola.
Nota: Eutanasia a todos los ratones receptores al final del estudio y evaluar la progresión de la enfermedad por la necropsia, la histología y la citometría de flujo.
- Mezcla de tipo salvaje (WT) BMNC de un ratón receptor Congénicos (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) en una dosis de celda de 2 x 105 células por ratón con 2 a 5 x 104 células de la prueba purificada que BMNC preparado con citometría de flujo clasificación como arriba se describe en 1.3. Mezcla de células en la misma jeringa.
3. engraftment análisis mediante citometría de flujo
- Para evaluar el engraftment de la célula donante, recoger sangre periférica (PB) de los ratones receptores en semana 6, semana 12 y 16 semanas después del trasplante.
- Caliente a los destinatarios en la jaula con la lámpara de calor durante aproximadamente 1 minuto y coloque un limitador de un ratón.
- Cortar la vena de la cola con un bisturí (hoja 10 mango de bisturí #3) y recoger 100 μl de PB por destinatario utilizando un tubo de microcapillary que contiene EDTA como anticoagulante.
- Dividir el PB recogido en dos alícuotas iguales colocando 50 μL en un tubo de microcentrífuga estéril. Utilizar una alícuota de un automatizado hemograma completo (CBC) (realizado en el centro de la histopatología de NCI) y utilizar la segunda alícuota de anticuerpos y citometría de flujo.
- Para detectar el engraftment de la donante mediante citometría de flujo, lisar los glóbulos rojos (RBC) añadiendo 1 mL de tampón de lisis RBC hipotónica (8,29 g/L de NH4Cl, 1 g/L de KHCO3, 0,037 g/L de Na2EDTA, pH 7,2) a 50 μl de la PB recogido. Vórtice de la muestra, mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Centrifugue el PB sometidas a lisis a 4.600 x g para 1,5 min. cuidadosamente aspirar el sobrenadante y desechar.
- Interrumpir parcialmente el precipitado de células suavemente golpeando ligeramente o "sacudiendo" el fondo del tubo. Agregar 1,3 mL de PBS en el sedimento situado en tubo y centrifugar a 4.600 x g durante 1,5 minutos cuidadosamente aspirar y descartar el sobrenadante.
- Interrumpir el precipitado de células golpeando o sacudiendo y añadir 200 μL de HF2 suplementado con 5% de suero de rata para el precipitado de células.
- Añadir el anticuerpo anti-CD45.2 (1 μl de) conjugado con allophycocyanin (APC) a la suspensión de células. Incubar a 4 ° C durante al menos 30 min y brevemente vórtice la mezcla.
- Después de la tinción, lavan las células dos veces como se describió anteriormente y resuspender con 400 μL de HF2 1 μg/ml de PI.
- Detectar el engraftment usando un citómetro de flujo de 4 colores. Obtener información adicional acerca de tipos de células en la sangre periférica mediante la adición de anticuerpos adicionales para detectar tipos de células específicas, tales como linfocitos B o T.
- Registrar datos de engraftment serie utilizando una hoja de cálculo para permitir el posterior análisis de los datos.
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Representative Results
Nos muestran figuras representativas para obtener los resultados de varios experimentos. La figura 1 muestra una citometría de flujo representativo clasificación experimento. Durante la diferenciación Hematopoyética normal, como las células se ha comprometido a un linaje hematopoyético específico, adquieren marcadores de superficie celular definición de linaje y perder la posibilidad de auto renovación. Por lo tanto, en los ratones de tipo salvaje, auto-renovación de células madre se limita a BMNC linaje negativo. En este experimento, nos ordenan BMNC de NHD13 la médula ósea en células de linaje positivo positivo y alto linaje linaje negativo, bajo. Éstos clasifican las células fueron transplantadas luego en recipientes de peso para determinar la capacidad de auto renovación.
La figura 2 muestra los resultados de un experimento separado, en que linaje células negativas o células de donantes NHD13 con MDS fueron transplantadas en receptores WT letalmente irradiados. Las células de donantes NHD13 expresaron el marcador superficial de la célula CD45.2, mientras que las células de competidor de peso (ver sección 2.2.1 anterior) expresaron el marcador superficial de la célula CD45.1. Figura 3 muestra el análisis serial engraftment de NNI BMNC NHD13 o linaje negativo NHD13 BMNC. Después de aproximadamente 16 semanas, las células NHD13 vierten las células de la WT, como lo demuestra el creciente porcentaje de células CD45.2 + en la sangre periférica. La figura 4 muestra un ejemplo de la transformación leucémica de un ratón transplantado con células NHD13 MDS.
1 Figura: citometría de flujo clasificación estrategia de BMNC teñidas con anticuerpos de linaje cóctel. Cada caja rectangular en la trama de punto representa la población de células ordenada de HSCT evaluar la función de la célula. R4, linaje negativo; R5, linaje bajo positivo; R6, positivo de alto linaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: perfiles representativos FACS para ensayo de engraftment utilizando anticuerpos anti-CD45.2 específicos de donante. Destinatario BMNC fue trasplantado con 1 X 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +) y receptor LNBM con BM negativos de 5 X 104 NHD13 linaje células (CD45.2 +). En cada caso, 2 x 105 WT BMNC (CD45.1 +) fueron utilizados como células del competidor. Números en positivo cajas superior e inferior representan CD45.2 (derivado de NHD13 donantes) y CD45.2 negativa (derivan de células del competidor de peso), respectivamente, en poste-trasplante de 6 semanas y 24 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: cinética del Engraftment de recipientes individuales después del trasplante. Cada línea en el gráfico muestra ensayos de engraftment serial de un ratón receptor individual. Destinatarios BMNC fueron trasplantados con 1 X 106 células de BMNC todo NHD13 y destinatarios LNBM fueron trasplantados con 5 X 104 de NHD13 linaje negativo BM después de clasificar. NHD indica a donante de NHD13. BM, ratones receptores BMNC; LNBM, destinatario de BM negativo de linaje; PBMC, células mononucleated de periféricos de la sangre. En todos los casos, las células de donantes NHD13 vierten poco a poco las células de la WT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: May-Grünwald Giemsa (MGG) tinción de médula ósea (MO) de destinatario MDS que progresó a AML. Tenga en cuenta la presencia de numerosas explosiones y formas inmaduras. Las flechas indican las ráfagas, y puntas de flecha indican formas inmaduras. Original 400 X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque MDS es un trastorno clonal de células madre hematopoyéticas, las MDS "tallo" o células inicia, no se han caracterizado. Previamente demostramos que MDS puede ser transplantables a los ratones WT con la médula ósea de ratones NHD13 de HSCT, caracterizado por anemia macrocítica, leucopenia, neutropenia y evidencia morfológica de displasia15. Además, ensayos de repoblación competitiva identifican una ventaja del crecimiento de las células de la médula NHD13 MDS. Tomados en conjunto, estos resultados implican la existencia de un vástago MDS o iniciación célula. Experimentos adicionales están ahora en curso, destinadas a refinar el immunophenotypic características de un MDS iniciar celular15 usando más definida madre y progenitor marcadores de la célula (CD150, CD48, c-Kit y Sca-1)16 combinado con el linaje marcador de tinción descritas en el presente Protocolo.
Identificación de MDS iniciar células utilizando ratones de NHD13 implica procedimiento clasificación de la citometría de flujo extenso. La manipulación ex vivo de BMNCs primarias pone estrés en las células, potencialmente dando por resultado la muerte celular o pérdida funcional. Por lo tanto, deben hacerse esfuerzos para reducir el tiempo de manipulación ex vivo de incluyendo el tiempo de la clasificación de citometría de flujo. El fabricante y modelo de instrumentos de citometría de flujo y dinámica del flujo son variables adicionales que pueden afectar la viabilidad celular después de su clasificación. El procedimiento HSCT requiere infusión de células a través de un vaso sanguíneo. Aunque la inyección de la vena de la cola puede ser una técnica más difícil que la inyección de retro orbitario, en nuestra experiencia, cola inyección en la vena puede realizarse más rápidamente que la inyección orbital retro como los ratones receptores no están anestesiados por la vena de la cola inyecciones. Limitación de volumen de inyección (máximo 150 μL) es otro tema en inyección retro-orbitales17, como una mayor concentración de células puede conducir a pérdida adicional de células en el curso de preparación de células, como corte de células en la pared de las jeringas y agujas.
Aunque estos experimentos se centran en el modelo NHD13 de MDS, los enfoques de clasificación y trasplante HSCT descritos aquí pueden utilizarse para cualquier ratón genéticamente. Además de determinar las características de las células hematopoyéticas renueva a sí misma, este enfoque de trasplante puede utilizarse para otros fines. Por ejemplo, si se desea obtener una cohorte grande de ratones con MDS la médula ósea para evaluar la eficacia del tratamiento con una molécula pequeña, una cohorte grande (30 + ratones) puede generarse mediante el trasplante de ratones WT con MDS BM como alternativa, la estrategia HSCT puede revertirse. En un intento por curar ratones de MDS, ratones NHD13 con MDS pueden ser transplantados con WT BM, y el éxito del trasplante puede controlarse mediante la evaluación de la proporción de células hematopoyéticas que expresan CD45.1 (que marca WT BM) frente a CD45.2 (que marca MDS BM) 18.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud (números ZIA SC 010378 y BC 010983 la concesión).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
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