Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

כאן נתאר של תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד קרום פלזמה חתימת יעילה באמצעות ניתוחים fluorometric, הדמיה בתאים חיים. Assay הזה יכול לשמש לסינון סמים או היעד גנים המווסתים קרום פלזמה חתימת בתאי יונקים.

Abstract

בסביבתם פיזיולוגיים, תאי יונקים נחשפים לעיתים קרובות מושם מכני וביוכימי שתוצאתה נזק קרום פלזמה. בתגובה נזקים אלה, machineries מולקולרית מורכבים במהירות לאטום מחדש קרום פלזמה שחזור תפקידה מכשול ולשמור על הישרדות cell. למרות 60 שנים של מחקר בתחום זה, אנו עדיין חוסר הבנה מעמיקה של התא חתימת מכונות. עם המטרה של זיהוי מרכיבי התא הזה חתימה מחדש של קרום פלזמה של שליטה או תרופות שיכולות לשפר חתימה, פיתחנו assay תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית המודד חתימת יעילות בתאים בתרבית של קרום פלזמה תרבותי ב- microplates. כמערכת מודל עבור נזק קרום פלזמה, תאים נחשפים את חיידקי להיוות נקבובית רעלן listeriolysin O (מתוק), המהווה גדול 30-50 ננומטר קוטר proteinaceous נקבוביות ב כולסטרול המכילים הקרומים. השימוש של קורא מבוקרי טמפרטורה microplate רב במצב מאפשר מדידות spectrofluorometric מהיר ורגיש בשילוב עם brightfield קרינה פלואורסצנטית הדמיה מיקרוסקופיה של תאים חיים. ניתוח קינטי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הנפלטת fluorochrome מחייב חומצת גרעין impermeant הממברנה ומשקף את מידת ממברנה ופצעו וחתימה ברמת האוכלוסייה התא, המאפשר החישוב של התא חתימת יעילות . קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הדמיה מאפשר ספירת תאים, אשר צורונים אקספרס שימרה פלורסנט של חלבון גרעיני היסטון 2B, בתוך כל טוב של microplate להביא בחשבון וריאציות אפשריות במספר שלהם ומאפשרת בסופו של דבר זיהוי של אוכלוסיות תאים נפרדים. זה וזמינותו תפוקה גבוהה הוא כלי רב עוצמה צפויים להרחיב את ההבנה שלנו של מנגנוני תיקון קרום באמצעות הקרנה עבור גנים המארח או exogenously הוסיף תרכובות את חתימת קרום פלזמה שליטה.

Introduction

בתרבית של תאים כפופים לחץ מכני, osmotic ו ביוכימי, והתוצאה היא האובדן של קרום פלזמה שלמות. ללא חתימה מחדש מהיר ויעיל, תאים פגומים שתכניע במהירות למוות מתוכנת או נמק. מאז שנות השישים, מאמצים כדי להבין את קרום פלזמה חתימת תהליך יש כבר מונעים על-ידי ההשלכות ההרסניות הקשורים בתפקוד שלו. אכן, מחלות כגון חגורת הגפיים-ניוון שרירים, סוכרת או תסמונת Chediak-היגאשי קושרו תיקון קרום פלזמה לקויה עקב מוטציות dysferlin קידוד גנטי, הייצור של מוצרי קצה glycation מתקדם, פגמים lysosomal סחר המתקן CHS1, בהתאמה1,2,3,4,5,6. אולם, נכון להיום, ההבנה שלנו של קרום חתימה הוא עדיין מוגבל7. מחקרים ראשוניים הראו כי קרום חתימה הוא שיזם זרם של חוץ-תאית Ca2 + דרך קרום פלזמה פגום8,9,10. מאז, מספר שאינו-שבחירה Ca2 +-מנגנונים תלויים הוצעו כדי לחתום מחדש תאים. ההשערה תיקון מציעה כי בסמיכות הפצע, שלפוחית תאיים נתיך עם כל קרום פלזמה פגום לפעול כמו תיקון11,12,13,14. מודל נוסף מציעה אקסוציטוזה סידן תלוית הזה של lysosomes לפצע האתר משחרר את האנזים lysosomal חומצה sphingomyelinase, אשר ממירה ספינגומיילין ceramide בעלון החיצוני של קרום פלזמה. השינוי הפתאומי הזה בהרכב השומנים תוצאות מונחה-ceramide אנדוציטוזה מתוך16,15,17באזור הפגוע. לבסוף, המנגנון המוצע השלישית כרוכה תפקיד עבור endosomal המיון מורכבים הנדרשים להעברה (ESCRT) לקדם את היווצרות שלפוחית הפונים כלפי חוץ זה באד של קרום פלזמה18. רק קבוצה מוגבלת של חלבונים זוהה במודלים אלה, מכונות שלהם חייב להיות הובהר עוד יותר.

כאן נתאר וזמינותו של תפוקה גבוהה זה אמצעי קרום פלזמה חתימת יעילות תאים בתרבית של חסיד חשופים לפגיעה מתווכת על-ידי רקומביננטי listeriolysin O (מתוק)19. מתוק להיוות נקבובית רעלן (PFT) מופרש על ידי המחלה תאיים עיצוב גבות ליסטריה monocytogenes20,21,22 , שייך לקבוצת ה-MACPF/CDC (ממברנה התקפה מורכבת, perforin, ו superfamily cytolysin תלויי-כולסטרול). MACPF הם יוצרים נקבובית יונקים החלבונים המעורבים מערכות ההגנה החיסוניות, בעוד CDCs טוקסינים חיידקיים בעיקר המיוצר על ידי פתוגנים גראם חיוביים הגורמות נזק לתאים המארח כדי לקדם אורח חיים החולני שלהם23. CDCs הם מסונתז כמו מונומרים מסיסים במים או הדימרים זה לאגד כולסטרול נוכח קרום פלזמה oligomerize לתוך מתחם prepore subunits עד 50. Prepore מורכב מסדר מחדש ואז להוסיף β-גדילי מעבר ליפידית, ויוצרים נקבובית β-חבית המתפרס על 30-50 ננומטר בקוטר24,25,26,27.  נקבוביות גדולות אלה מאפשרות פלקסים של יונים ורכיבים הסלולר קטן בתוך ומחוץ לתא. למרות זאת, מספר מחקרים הציעו כי נקבוביות בגדלים קטנים יותר הם גם יצרו28,29,30. בין CDCs, מתוק מציג מאפיינים ייחודיים, כולל צבירת בלתי הפיך pH טמפרטורה ותלוי, מה שתורם לביצוע ניתוחים תפוקה גבוהה31,32. ניתן להוסיף מתוק המדיום התרבות התא-4 הלעפה תרוטרפמט, טמפרטורה מתירני כדי שלה מחייב תאים, אך לא את היווצרות הנקבובית מורכבים. חניכה של היווצרות נקבובית ואז ניתן לסנכרן באמצעות העלאת הטמפרטורה הלעפה תרוטרפמט 37, ומאפשר פעפוע יעיל של הרעלן מולקולות במישור של הקרום על טופס oligomers וכן את הבנייה מחדש הסתגלותי מעורב נקבובית הדור. לכן, שלאחר הבורר בטמפרטורה, קינטי של נזק לתאים יהיה תלוי הכמות של רעלן קשור קרום פלזמה. חשוב לציין, מתוק מסיסים (מאוגדים קרום פלזמה) במהירות ובאופן בלתי הפיך אגרגטים כאשר הטמפרטורה מגיעה הלעפה תרוטרפמט 37, אשר מקלה על הצורך לשטוף את הרעלן לא מאוגד מולקולות ומגביל את היקף נזק הממברנה לאורך זמן. לבסוף, מכיוון מתוק נקשר כולסטרול, טפסים נקבוביות ממברנות כולסטרול-עשיר, זה וזמינותו היא לבצע מגוון רחב של תאי יונקים. חשוב לזכור כי מתוק משפיע על התא המארח איתות בעיקר דרך היווצרות נקבובית, עם כמה יוצאים מן הכלל בתא נקבובית שאינו תלוי איזה איתות עלולה להתרחש33,34,35,36 ,-37,-38,-39. לכן, זה לא יכול להיות מהכלל הזה מתוק איתות פעילויות עשויה להשפיע על התהליך של תיקון קרום.

זה וזמינותו ישירות מעריך את היקף התא ופצעו על ידי מדידת שיתוף התא impermeant fluorochrome (למשל, יודיד propidium) פסיבי מזין תאים פצועים, הופך מאוד פלורסנט ברגע זה משייך חומצות גרעין . לפיכך, fluorochrome יכול להישמר במדיום התרבות התא לאורך כל הניסוי, ומאפשר ניתוחים בזמן אמת של התא ופצעו. עוצמת קרינה פלואורסצנטית לצבוע חומצת גרעין מחייב יגדל עם ריכוז הרעלן ו, על ריכוז נתון של הרעלן, תגדל עם הזמן עד כל הנקבוביות נוצרות, התאים הם תוקנו או עד רוויה. זרם של חוץ-תאית Ca2 + דרך ממברנה הנקבוביות הוא אירוע קווה נון עבור חתימה מחדש. לכן, יעילות resealing יכול להיות בעקיפין שמעידים השוואת תא ופצעו במדיום תרבות המכיל Ca2 + (תיקון תנאי מתירניות) כדי ופצעו ב Ca2 +-חינם בינוני (תיקון תנאי מגביל). כיוון עוצמת קרינה פלואורסצנטית לצבוע מחייב חומצת גרעין הוא ביחס ישר לריכוז תא היטב לכל, חשוב לתאי הזרע-ריכוז זהה בבארות כל. חשוב גם לספור תאים כל היטב לפני ואחרי וזמינותו כדי להבטיח כי ניתוק התא אינו מתרחש, צפים, מצטברים תאים ניתן להסתיר את קריאות קרינה פלואורסצנטית אשר עלול לסבך את פרשנות הנתונים. לספור תאים, התאים לבטא היסטון גרעיני מותאם לשפות אחרות 2B-GFP (ויזת עבודה H2B-GFP) שימשו זה וזמינותו. מבוקרי טמפרטורה, מצב מרובה, microplate הקוראים לשלב מהירה, תפוקה גבוהה מדידות (באמצעות תבנית 96 או 384-ובכן לוח) של עוצמות קרינה פלואורסצנטית עם מיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים ב 37 º C. האחרון יכול לשמש כדי למנות את מספר הטלפון הנייד ולצפות היווצרות בסופו של דבר של אוכלוסיות תאים נפרדים.

בסופו של דבר, וזמינותו זה מספק למשתמשים את היכולת להרחיב את הידע שלהם על המורכבות של מנגנוני תיקון קרום על ידי הקרנה של מולקולות מארח או תרכובות exogenously הוסיף כי עשויות לשלוט ממברנה לתקן. הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים ניסיוני כדי למדוד את היעילות resealing של התאים חשופים מתוק ולהעריך את ההשפעות של התרופה נתון או טיפול הסלולר על יעילות חתימה מחדש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

  1. תא יופיצ
    הערה: האדם תאי אפיתל צוואר הרחם, הלה והלה לבטא היסטון 2B-GFP (ויזת עבודה H2B-GFP), שהיו בשימוש פרוטוקול זה, אך assay זו ניתן להתאים בתרבית של תאים אחרים19.
    1. ניתוק תאים חסיד מבקבוק 75 ס מ2 תא תרבות ע י שטיפת התאים עם 2 מ של טריפסין-EDTA 0.25%. החלף את טריפסין בשימוש 2 מ של טריפסין טריים-EDTA 0.25%.
    2. דגירה התאים ב 37 הלעפה תרוטרפמט במשך 5 דקות עד התאים יש מעוגל, מנותק מן הבקבוק.
    3. Resuspend התאים 8 מ של מדיום הגידול (DMEM המכיל 10% לא פעיל חום העובר שור סרום 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין µg/mL 100).
    4. לקבוע את הריכוז התא באמצעות של hemocytometer ו- µL 10 תא השעיה.
    5. לדלל התאים מדיום הגידול כדי ריכוז של 2.5 x5 10 תאים/מ.
    6. יוצקים התליה תא לתוך קערה פיפטה סטרילי ומערבבים ביסודיות את המתלים. באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ.
    7. באמצעות micropipette של 12-רב-ערוצי וטיפים µL 200, להפיץ הלה תאים (2.5 x4 תאים/100 10 µL/טוב) בשלושה עותקים (או ארבע פעמים) בצלחת שטוחה 96-ובכן, ברור התחתון, שחור פוליסטירן שטופלו תרביות רקמה.
      הערה: סידור ציפוי מוצג כדוגמא באיור1.
    8. התרבות התאים במשך 24 שעות ביממה בחממה תרבות תא humidified-37 הלעפה תרוטרפמט ו-5% CO2.
  2. פתרון מניות הכנה
    1. להכנת 1 ליטר של מניה 10 x מאגר מ' (משמש להכנת M1 ו- M2) על-ידי הוספת 95 גר' הנקס מאוזנת תמיסת מלח, 0.476 גר' MgCl2 (5 מ מ), ו- g 23.83 של HEPES (100 מ מ) עד 900 מ"ל של מים. להתאים את ה-pH ל 7.4, להעלות את עוצמת הקול 1 ל' מסנן לחטא.
    2. הכנת 50 מ של 50 x (1.25 מ') מניות של גלוקוז על-ידי הוספת 11.26 גר' D-(+)-גלוקוז לסך של 50 מ ל מים. מסנן לעקר את הפתרון.
    3. להכין 50 מ של 100 x (120 מ"מ) מניות של סידן על-ידי הוספת 0.666 גר' CaCl2 סך של 50 מ ל מים. מסנן לעקר את הפתרון.
    4. הכנת 50 מ של 10 x (50 מ מ) מלאי של-אתילן גליקול-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', חומצה tetraacetic (EGTA) על-ידי הוספת 0.951 גר' EGTA 40 מ ל מים. להגביר את רמת ה-pH 8 באמצעות NaOH כדי להמיס את EGTA, ואז להעלות את עוצמת הקול כדי 50 מ. מסנן לעקר את הפתרון.
    5. לצלחת יחיד 96-ובכן, להכין 50 מ של 1 בינוני (M1, מכיל Ca2 +), 50 מ של 2 בינוני (M2, Ca2 +-ללא תשלום), ו-15 מיליליטר 2 בינוני בתוספת EGTA, בהתאם:
      1. עבור M1, הוסף 5 מ של 10 x מאגר M 0.5 מ של 100 x CaCl2, 1 מ"ל של גלוקוז x 50 43.5 מ ל מים.
      2. עבור M2, הוסף 5 מ של 10 x מאגר מ' ו- 1 מ"ל של גלוקוז 50 x 44 מ ל מים.
      3. M2/EGTA, להוסיף 1.5 מיליליטר 10 x מאגר מ' ו- 1.5 מיליליטר 10 x EGTA 12 מ של מים.
        הערה: כל הפתרונות המכיל propidium יודיד (PI) צריך להיות מוכן ישירות לפני הוספת התאים.
  3. צלחת הקורא/הדמיה Cytometer הגדרות
    הערה: להשתמש בקורא רב במצב צלחת מצויד עם שתי יחידות הזיהוי: של מצלמות-דיגיטליות ו- cytometer של הדמיה. להגביל את החשיפה פלורסצנטיות להימנע photobleaching fluorophores.
    1. לחמם את הקורא צלחת 37 ° C לפני ביצוע וזמינותו.
    2. כוונן את הפרמטרים עבור וזמינותו קינטי בהתאם בתוך מצב הגדרות :
      1. לבחור Monochromator, פל (זריחה), קינטית עבור תצורת אופטי, לקרוא מצבי וקרא סוג, בהתאמה.
      2. תחת הגדרות אורך גל, בחירה של 9 ו 15 ננומטר עירור, פליטה bandpass, בהתאמה. עבור מבחני באמצעות propidium יודיד (PI), מוגדר אורכי הגל עירור, פליטת 617, 535 nm, בהתאמה.
      3. תחת סוג צלחת, בחר ולס 96 התבנית צלחת, צלחת שנקבע מראש תצורה המתאים צלחת התחתון ברור קיר שחור.
      4. תחת אזור לקריאה, לסמן את הבארות ינותחו ברחבי קינטי.
      5. תחת PMT, אופטיקה, מראש את ההבזקים בכל קריאה ל- 6 , סמן את התיבה עבור קריאה מלמטה.
      6. תחת תזמון, להוסיף 30: 00:00 בתיבת זמן לרוץ הכולל עבור assay קינטי 30 דקות ולאחר הכנס 05: 00:00 עבור מרווח זמן.
        הערה: עבור כל פעם הצבע ואת אורך גל אחד, זמן הקריאה של צלחת מלאה 96-ובכן הוא 30 s.
      7. לאשר את ההגדרות שצוינו פרטי הגדרות מימין ובחר אישור. להפעיל לחץ לקריאה ליזום את קינטי.
    3. הגדר את פרמטרי ההדמיה בהתאם בתוך מצב הגדרות:
      1. לבחור Minimax, הדמיה, קצה עבור תצורת אופטי, לקרוא מצבי וקרא סוג, בהתאמה.
      2. תחת אורכי גל, בחר ששודרו אור, ואו שניהם פלורסצנטיות בתיבות המתאימים עירור, פליטה של אורכי הגל של 456/541 nm (GFP), 625/713 nm (PI).
      3. להשתמש באותן האפשרויות עבור סוג הצלחת ואזור לקריאה כפי שהוגדר בשלבים 1.3.2.3 ו- 1.3.2.4.
      4. תחת הגדרת אזור טוב, בחר מספר האתרים בתוך באר לדימות.
        הערה: 12 אתרי יתאימו לתמונת מלא-. טוב.
      5. תחת הגדרות ייבוא תמונה, בחר את פעמים חשיפה של אור מסור, 541 (GFP), 713 (PI). עבור ה-GFP, תמונה כולו טוב עם מועד החשיפה של ms 20/תמונה. עבור ששודרו אור (TL) ו- PI פלורסצנטיות, רוכשים תמונה אחת של מרכז מכל קידוח עם פעמים חשיפה של ms 8 ו- 20, בהתאמה.
      6. לאשר את ההגדרות שצוינו ב- מידע ההגדרות מימין ובחר אישור. הפעם הרכישה עבור הדמיה, כל שטח בכל טוב (12 תמונות טוב) של צלחת 96-ובכן, גל אחד היא מינימלית ~ 15 העיתונות לקריאה ליזום הדמיה.
        הערה: הזמן רכישה של תמונה בודדת/טוב של צלחת 96-ובכן מחייב פלטה/min ~2.5 מאורך גל אחד. שאר הפרמטרים המתוארים לעיל מקבילים לציוד ספציפי במעבדה שלנו. Spectrofluorometric מידות: מנורה פלאש קסנון הצגת 1.0 קבועה עירור אורכי גל nm (250-850 ננומטר) עם bandpass nm 9 או 15 מתכווננת, גלאי צינור האופטיקה עם > 6 יומן טווח דינמי, פליטה nm 15 או 25 מתכוונן bandpass. הדמיה cytometer: מקור אור תאורה מסוגל אור לבן, 460 nm ו אורכי גל עירור nm 625 עם bandpass nm 20, מסננים פליטה מרוכז בכל 541 nm (108 bandpass ננומטר) ו- 713 nm (123 nm bandpass), בהתאמה, ולא מטרה X 4 מצמידים 1.25 12 סיביות תשלום מצמידים מכשיר מגה-פיקסל.

2. assay

הערה: בזמן וזמינותו, התאים להיות 70-90% confluent. במהלך השלבים לשטוף, המדיום צריך להיות יוסר, חלה על הקיר בצד של הבאר (לא ישירות מעל תאי). לשמור על הטמפרטורה של מתוק ב- < 4 הלעפה תרוטרפמט כדי למנוע צבירת שלה עד שלב 3.1.5.

  1. להכין מלאי של 30 מיקרומטר PI ב M1 וחיממתי מלאי של 30 מיקרומטר PI ב- M2 מראש ב- 37 הלעפה תרוטרפמט.
  2. לשטוף בעדינות את התאים בצלחת 1 באמצעות micropipette 12-רב-ערוצי וטיפים µL 200, כדלקמן:
    1. תנאים תיקון-מתירני, הסר את מדיום הגידול ואת שטיפת שהתאים פעמיים עם µL 200/M1 טוב להתחמם מראש ב- 37 הלעפה תרוטרפמט. החלף את המדיום 100 µL/טוב של M1 חמה המכילה 30 מיקרומטר PI.
    2. בשביל לתקן תנאים מגבילים, להסיר את מדיום הגידול ולשטוף את התאים פעם אחת עם M2 µL/טוב חם 200 המכילים 5 מ"מ EGTA כדי chelate Ca2 +, ולאחריה שטיפה אחת עם µL 200/M2 היטב. החלף את המדיום עם 100 M2 µL/טוב חמה המכילה 30 מיקרומטר PI.
    3. לאחר מדיום הגידול שטף והחלפתם בינוני המכיל propidium יודיד, להעביר ישירות לשלב 2.1.3.
  3. תמונה צלחת 1 תחת אור המשודרת GFP, PI כמפורט תחת 1.3.3 (קינטיק מראש). שלב זה לוקח 15-20 דקות.
  4. במהלך תקופת 15 דקות בשלב 2.1.3, להכין צלחת 2 באמצעות micropipette 12-רב-ערוצי וטיפים µL 200 כדלקמן:
    1. מקום 96-ובכן עגול microplate פוליפרופילן התחתון על קרח. להגדיר את הצלחת באמצעות עיצוב ניסיוני המתאים צלחת 1 (איור 1).
    2. תנאים תיקון-מתירני, להוסיף 100 µL/טוב של M1 כקרח המכיל 60 מיקרומטר PI, ואחריו התוספת של 100 µL/טוב של M1 כקרח המכיל 4 x מתוק או לא עבור הפקד.
    3. עבור תנאים מגבילים-תיקון, להוסיף 100 µL/טוב של M2 כקרח המכיל 60 מיקרומטר PI, ואחריו התוספת של 100 µL/טוב של M2 כקרח המכיל 4 x מתוק או לא עבור הפקד.
  5. לאחר הדמיה צלחת 1 (שלב 2.1.3), מיד למקם אותו על קרח, באמצעות נייר אלומיניום כדי להפריד את הצלחת קשר ישיר עם קרח. אפשר צלחת 1 כדי להתקרר למשך 5 דקות.
  6. באמצעות micropipette של 12-רב-ערוצי וטיפים µL 200, להעביר 100 µL מכל קידוח לתוך צלחת 2 (שלב 2.1.4) לבארות המתאימים בצלחת 1. לפיזור כראוי את הרעלן בתקשורת של צלחת 1, הוספת בעצות שלהלן מניסקוס, להוציא בעדינות את אמצעי אחסון ללא היכרות עם בועות.
    הערה: לא פיפטה למעלה ולמטה, כמו זה בשוגג עלול לנתק את התאים.
  7. להשאיר את הצלחת. בשביל 1 דקות נוספות לאפשר את הרעלן לאגד התאים ולהעביר מיד לצלחת 1 לקורא צלחת עבור וזמינותו קינטי באמצעות מצב מצלמות-דיגיטליות (שלב 1.3.2).
  8. בסוף וזמינותו קינטי, מיד תמונה צלחת 1 (פוסט-קינטי) באמצעות שלב 1.3.3.

3. ניתוח: תא ספירה

  1. לקבוע את ספירת בהתבסס על גרעיני ידי קרינה פלואורסצנטית באמצעות התוכנה ספירה תא microplate.
    1. בתוך הגדרות, בחר שאריץ ניתוחולאחר תחת המקטע קטגוריה בתוך הגדרות ניתוח תמונה בחר דיסקרטי אובייקט ניתוח שימוש 541 הגל עבור מציאת חפצים.
    2. בתוך האפשרות למצוא חפצים, באמצעות את לצייר על תמונות למצוא שיטה, בחר הגרעינים תחת הכרטיסייה הגדרות ולחץ על ' החל'.
    3. הקש OK ו קריאה ליזום את התא כולל אלגוריתם.
  2. לחלופין, אם אין כלי כזה זמין, השתמש ניתוח תמונה של תוכנה כגון ImageJ לספור תאים.
    1. ב- ImageJ, פתח את קובץ התמונה כמו ערימה.
    2. להמיר את המחסנית 8-bit סולם גוני אפור תמונות על ידי לחיצה על תמונה בשורת התפריטים, לרחף מעל סוג, ובחר 8 סיביות.
    3. להחסיר את הרקע: לחצו על תמונה בשורת התפריטים, רחף מעל התאםובחר בהירות/חדות. התאם את הערך המינימלי כדי להסיר את רעשי הרקע ולבחור החל.
    4. סף ליצירת תמונות בינאריות: לחצו על תמונה בשורת התפריטים, רחף מעל התאם, ובחר את הסף. בחר רקע כהה, התאימו את ערכי סף מינימום ומקסימום, ולחץ על החל.
    5. במקרה של חופפים גרעינים, כלי קו פרשת המים יכול לשמש קטע רב-קוטבי. לחץ על תהליך בתפריט, לרחף מעל בינארי , בחר קו פרשת המים.
      הערה: זה יפריד באופן אוטומטי גרעינים מחוברים.
    6. לנתח את התמונות רעולי פנים על-ידי החלת קריטריונים מוגדרים על-ידי המשתמש (גודל, מעגליות) כדי לחדד את הזיהוי של גרעינים או לא לכלול שאריות תאים.
      1. לחץ על נתח התפריט ולאחר מכן ניתוח חלקיקים. להגדיר את הגודל הרצוי (פיקסל ^ 2) וכן מעגליות (הערך 1 הוא מעגל מושלם) טווחים זה מספיקים לכלול תאים בודדים/גרעינים.
      2. בתיבה הנפתחת הצג, בחר את הפיכת האפשרות הרצויה, הסימון סכםולאחר לחץ על אישור כדי לקבל ספירת.

4. ניתוח: עקומות קינטי

  1. להעביר את המידע קינטי בתוכנת reader צלחת תוכנה נתונים אנליטיים.
  2. עבור כל תנאי הניסוי, ממוצע עוצמות קרינה פלואורסצנטית משכפל על כל timepoint, יחד עם סטיית תקן המתאים ו שגיאת התקן של הממוצע עבור כל תנאי הניסוי.
  3. עבור כל תנאי הניסוי, לעקוב אחר עקומת קינטי המתאימים: עוצמת PI (ציר y) נגד הזמן (ציר x).
  4. כדי לחשב את היעילות resealing של מצב נתון טיפול, לחשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) של + מתוק ב- M1 (AUC(M1)) ו + מתוק ב- M2 (AUC(M2)). השתמש הגישה הציעו להלן כדי להעריך את היעילות (E) של חתימה:
    Equation
  5. לבצע השוואה בין טיפול בקרה ובדיקה על-ידי קביעת יחס יעילות (REff) המצוין להלן:
    Equation 2
    REFF = 1, בדיקת הטיפול אינו משפיע על תיקון
    REFF < 1, מבחן טיפול מעכב תיקון
    REFF > 1, בדיקת הטיפול משפר את תיקון
  6. לחשב את השטח מתחת לעקומה באמצעות המשוואה הבאה:
    Equation 3, איפה k המספר הכולל של מעקב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תא סופר דיוק: הלה תאים משמשים לעתים קרובות כקו בתרבית של תאים דגם לחקור מנגנוני תיקון קרום. בעת הערכת תיקון קרום ברמת האוכלוסייה תא, חשוב לתאי צלחת-ריכוז זהה בבארות כל לפרשנויות הנתונים המתאימים. זה חשוב גם לוודא ביצוע וזמינותו מספרי הטלפון הנייד שלהם שוות ערך מעבר בארות. הלה תאים המבטאים צורונים 2B היסטון דבוקה GFP (ויזת עבודה H2B-GFP) הוכנסו זה וזמינותו למנות באופן אוטומטי את התאים המבוסס על הגילוי של פלורסנט בגרעין. להקים את הדיוק ספירת תאים, כפולה דילולים טורי של הלה ויזת עבודה H2B-GFP תאים מצופים triplicate בצלחת 96-ובכן, בתרבית במשך 4 שעות. כמות זמן זו מספיקה עבור התא מצורף ומספק מוגבלת חלוקת התא. וולס מלא היו עם תמונה בתאורה המשודרת (TL), תאורות פלורסצנטיות GFP וספירות תא היו העריך בהתבסס על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP באמצעות צלחת קורא ניתוח תוכנה (איור 2A ו- 2B). ספירות תא הממוצע ± סטיית תקן סומן נגד תא זריעה ריכוזים, קו של מיטבית הצביע על יחס 1.08:1 של ספירת התאים לתא זריעה, הממחיש את הדיוק של הספירה (איור 2C). על ידי הדמיה כל הבארות לפני וזמינותו קינטי, זה יכול להיות הבטיחו מספרי הטלפון הנייד עקביים בין כל בארות. כמו כן, על-ידי הדמיה בארות לאחר וזמינותו קינטי, אחד יכול להקים אם חשיפה הרעלן נגרמה ניתוק התא.

ביטוי של GFP לא מפריע propidium יודיד (PI) עוצמת מדידות (IPI): כדי להבטיח כי האגודה גרעיני ויזת עבודה H2B-GFP אינה מפריעה PI התאגדות או פאי פלורסצנטיות עוצמת המדידה (IPI), אניPI נמשל בתאים הלה, הלה ויזת עבודה H2B-GFP שנחשפו, או לא, 1 ננומטר מתוק (איור 3). בהיעדרו של PI, הייתה רמה נמוכה באופן דומה של רקע זריחה הלה, הלה ויזת עבודה H2B-GFP, המציין כי GFP אינם מדממים דרך מסננים פליטת קרינה פלואורסצנטית PI. בנוכחות PI, אך היעדר מתוק, היה דומה הבזליים PI פלורסצנטיות פליטה הלה והן הלה ויזת עבודה H2B-GFP זה לא השתנה במשך הזמן. זה אישר כי הביטוי של GFP אינה משפיעה על מדידת קרינה פלואורסצנטית PI, ציין כי PI אינו לחדור תאים שאינם פגומים מעל מסגרת הזמן של הניסוי. תוספת של מתוק הביאה לגידול PI זריחה עם הזמן זה היה דומה הלה והן הלה ויזת עבודה H2B-GFP. עלייה זו נובעת תא ופצעו מאת מתוק בשילוב עם PI שיוך חומצות גרעין. יחד, תוצאות אלו לקבוע כי הביטוי של היסטון-2B-GFP אינה משפיעה על התאגדות PI או מדידת קרינה פלואורסצנטית שלה.

קרינה פלואורסצנטית PI אינה מפריעה מבוסס-GFP תא ספירת: קישור הדדי, שזה חשוב לוודא כי PI התאגדות הגרעין בתאים פצועים אינם מתערבים תא מבוסס-GFP לספור. קרינה פלואורסצנטית נציג תמונות של הלה הלה ויזת עבודה H2B-GFP נחשפים 1 ננומטר מתוק בנוכחות PI מראים כי הצטברות מסומן של PI בתאים הפצועים קינטיקה פוסט, כמו הצפוי (איור 4A). הדמיה התגלה גם כי PI יכול לדמם דרך זיהוי קרינה פלואורסצנטית GFP (איור 4A , טבלה 1). כבל מוצלב פלורסצנטיות שהעריכו בצורה הטובה ביותר על תמונות פוסט-קינטי של תאים הלה לא מבטא GFP, אך עדיין מוצגים גרעינים פלואורסצנטי ירוק (איור 4A). כבל מוצלב יכול גם להיות שמעידים המדידה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית GFP (IGFP) בתאי הלה ויזת עבודה H2B-GFP, אשר גדל באופן משמעותי פוסט-קינטי בהשוואה מראש קינטי (איור 4B). חשוב, PI פלורסצנטיות מוצלב לא משפיעה תא סופר כי תהליך פילוח מעורב שהספירה של גרעין האטום מושפע עלייה GFP קרינה פלואורסצנטית (איור 4C).

מדידת קרום פלזמה חתימת יעילות: בחלק זה, אנו מציגים המתודולוגיה בסיסי המשמש כדי למדוד את היעילות של קרום חתימה. על ראיה התהליך של קרום חתימה, הלה ויזת עבודה H2B-GFP תאים נחשפו, או לא, ל-1 nM מתוק, נוכחות (M1) או היעדרות (M2) של Ca חוץ-תאית2 + (איור 5). כצפוי, בהיעדר מתוק,פאי נשארתי הקבוע M1 ו- M2. תוספת של מתוק ב Ca2 +-המכיל בינונית הביא עלייה מתמדת בעוצמת פלורסצנטיות PI (IPI), ואילו בהיעדרו של Ca חוץ-תאית2 +, הייתה עלייה תלולה ב PI פלורסצנטיות, המשקף היעדר חתימת ממברנה. כדי להעריך את היעילות resealing, אשר מוגדרת כגודל הקיבולת של תאים כדי לתקן ב M1 ביחס M2 (שלב 1.5.4.1), האזור שמתחת עקומות M1 ו- M2 (AUC) היו נחושים ואת היעילות של תיקון (E) חושבה להיות 0.287.

אלטרנטיבה PI: פאי ubiquitously שימש כסמן קרום פלזמה נזק. עם זאת, ישנם אחרים חומצות גרעין איגוד המשתמשות צבעים מתאימים גם זה וזמינותו. לדוגמה, איגוד חומצת גרעין impermeant carbocyanine ממברנה לצבוע (CNABD) המוצגים של ספקטרום פליטה להגיע לתוך אדום רחוק ויש של ירידה לפרטים גבוה עבור DNA נטושים כפול. PI מאגד לעומת40,של ה-DNA ו- RNA-41. בניגוד PI, עירור של ספקטרום הפליטה של CNABD אינם חופפים עם אלה של GFP המאפשר כדאי ספקטרלי רזולוציה בין fluorochromes שני. בנוסף, CNABD בשימוש פרוטוקול זה יש מקדם הכחדה כמעט כפול של PI, מה שאומר כי עבור אורכי הגל שלהם המתאימים עירור, צבע זה הוא יותר מסוגל לספוג אנרגיה מאשר PI וכתוצאה מכך פליטת קרינה פלואורסצנטית חזק יותר. ניתוח כמותי זריחה של תמונות CNABD ו- GFP הראה כי זה צבע תערוכות טווח דינמי גדול פלורסצנטיות, אינו פולט באופן משמעותי על אורכי הגל של קרינה פלואורסצנטית GFP, אינו משפיע על ספירת התאים (איור 6A-D). אכן, הלה ויזת עבודה H2B-GFP תאים מודגרות בתקשורת M1 או M2 המכיל CNABD, נפגע על ידי 1 ננומטר מתוק הציג 4 - ו 5.5 פי עלייה אניCNABD ביחס הפקדים שאינו פגום, בהתאמה (איור 7 א). לשם השוואה, התאים חשופים 1 ננומטר מתוק בנוכחות PI הציג 2.5 - ו 3 פי עלייה בעוצמת פלורסצנטיות PI ב M1 ו- M2, בהתאמה (איור 5). כמו PI, המוצגים CNABD הגדלת עוצמת קרינה פלואורסצנטית עם הגדלת ריכוז מתוק ב- M1 (איור 7 א), יעילות תיקון שהתקבל היה מחושב כפי שמתואר בשלב 1.5.4.1 (איור 7 ב). . מדווחים כי התא חתימת יעילות ירידות כמו מגביר ריכוז מתוק. תופעה זו משקפת את העובדה כי תאים להקטין את יכולת לחתום מחדש כאשר נגרמים נזקים מוגזמת.

הערכת איכות וזמינותו תיקון קרום: היבט חשוב של כל assay הוא החוסן שלה או היכולת לזהות ולפתור את ההבדלים בין הפקדים שליליים או חיוביים. האות וריאציה בין הפקדים חיוביים ושליליים עליך להציג מספקת טווח דינמי, הפארמצבטית. ב- assay תיקון קרום זה, הפקדים חיוביים ושליליים הם תאים נחשפים מתוק מתירני-תיקון (M1), תנאים מגבילים-תיקון (M2), בהתאמה. שתי הגישות נלקחו כדי להעריך את היציבות של זה וזמינותו לניתוח תפוקה גבוהה. ראשית, הגורם Z, או הקרנת החלון מקדם, קובע אם נתונה של תנאים מספק גדול מספיק טווח דינמי, תוך כדי להתווכח על השתנות אות. Z-גורמים בטווחים 0 < ≤ Z של 0.5 עד 0.5 < Z ≤ 1 שיתאימו assay מקובל ולא טוב מאוד, בהתאמה42,43. הגבלה של שימוש הגורם Z להערכת איכות היא שנבדקו תנאי מוצג בדרך כלל מתון יותר ערכים לעומת הפקדים חיוביים ושליליים קיצוניים. לכן, כמו הגישה השניה, אנחנו מחושבים ההבדל רשע בקפדנות מתוקנן (SSMD, β), אשר יכול לזהות הבדלים בין התנאים ניסיוני כי אחרת להיות מסווג בתור תוצאה שלילית בהתבסס על Z מוסמך-גורם44 ,45. ערכים SSMD ניתן לסווג כוח השפעה החל אין השפעה (β = 0) כדי חזק מאוד (β ≥ 5). באמצעות הנתונים איור 7 א וחאן אל השוואה של M1 לעומת התנאים M2, חשיפה nM ו 0.5 0.25 מתוק המיוצר ערכי Z-פקטור של 0.3100813 0.137313 ו β = 6.0672 ו- 4.803308, בהתאמה, המציינת כי חלון של ריכוזים מתוק מתאים במקרים בהם נדרשת וזמינותו. כמו ריכוז מתוק הוא גדל מעבר 1 ננומטר, הפער ב- ICNABD קינטי עקומות בין תנאי M1 ו- M2 סוגר וכתוצאה מכך ערכי Z-factor ו- SSMD מופחת באופן דרסטי, (איור 7 ב). כזה ריכוזים גבוהים של מתוק יתאימו לתנאים בו הפוטנציאל לתיקון היא גברה על ידי נזק, ובכך מבטל את השימוש וזמינותו בזיהוי הגורמים המעורבים תיקון קרום. זה מודגם עוד יותר על ידי הירידה תיקון יעילות (E) כמו מגביר ריכוז מתוק (איור 7 ב). כל הנתונים (Z-factor, SSMD ו- E) נוצרו עם משכפל ביולוגית 3 ומשוכפלת 3 טכני לכל תנאי ניסיוני עבור אימות וזמינותו. יחד, נתונים אלה מראים כי assay הזה יש החוסן הצפוי עבור assay תפוקה גבוהה עם ריכוזים מתוק נחות 1 ננומטר עבור תאים הלה.

הוכחה של עיקרון: ברגע היציבות של וזמינותו הוקמה, אנחנו ביצע ניסויים נוספים, כהוכחה של עיקרון כי assay הזה יש את הרגישות ואת הרזולוציה לזיהוי פגם תהליך התיקון. בנוסף, אנו נחשב כי מבחני תפוקה גבוהה משמשים כמו תהליך מיון לזיהוי "להיטים" בתוך במסכים גדולים, אשר עשוי לכלול פחות מ- 3 ביולוגי משכפל. לכן, זה רלוונטי כי הנבחנים מספק את הכוח זיהוי כדי לזהות "להיטים" בתוך וזמינותו יחיד. לכן, תחת מסך תפוקה גבוהה, ניתן לכוונן את הפריסה assay כדי להכיל 4 טכני משכפל להגברת עוצמה סטטיסטית בניסוי יחיד. תאים מצופים ב ארבע פעמים, היו מראש שטופלו h 1 לפני וזמינותו עם desipramine, מעכב תרופתי של sphingomyelinase חומצה החלבון lysosomal (ASM) אשר משחקת תפקיד קרום פלזמה תיקון15,17 ,46. חשוב לציין, טיפול עם desipramine לא השפיעה תא ספירת ברחבי וזמינותו, המאפשר השוואה המתאים בין תאים שטופלו desipramine ו שאינם מטופלים (איור 8A). עיכוב של ASM בתאים שטופלו desipramine גרם פגם בקרום חתימת יעילות בתגובה לחשיפה מתוק, כפי שהודגמה בעזרת הירידה E ו- REff (איור 8 ב' וג' 8). באמצעות מודל מעורב אפקטים, השוואה של desipramine שטופלו לתאים שאינם מטופלים נחשפים nM ו 0.5 0.25 מתוק ב M1 הראה p-ערכי 0.0010 ועונה 1 פרק 10-10, בהתאמה. יחד, הנתונים מצביעים על כי nM ו 0.5 0.25 מתוק ריכוזים המתאים כדי לזהות פגמים תיקון באווירה ניסיונית תפוקה גבוהה, עם ניתוחים סטטיסטיים אפשריים של ניסוי יחיד פעם משכפל טכני הוגדלה עד ארבע . שימו לב כי הגישה הסטטיסטית של המודל אפקטים מעורבים בין ארבע פעמים חשבון וריאציות אפשריות על פני משכפל ביולוגי מרובים. יש ממצאים משמעותיים באמצעות שכפול ביולוגי אחד צריך לאמת בהגדרות ניסיוניים נוספים.

Figure 1
איור 1: תכנון ניסויים. תזרים מתארת בעיצוב צלחת נציג נקבעה כדי לבחון את ההשפעה של תנאי המבחן שבע לעומת תאים שאינם מטופלים שליטה. פקדים נוספים צריך להיכלל אם זה מתאים, למשל סמים מכוניות יכולות. התאים הם מצופה (לוח 1) 24 שעות לפני הניסוי. ביום של הניסוי, תאים בצלחת 1 נשטפים בינונית M1 או M2 להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס, הצלחת היא הדמיה (TL, GFP ו- PI קרינה פלואורסצנטית) מראש קינטי. במהלך 15 דקות של ריאגנטים הדמיה, מתווספות על הקרח צלחת 2. לאחר דימות, צלחת 1 מושם באופן מיידי על קרח למשך 5 דקות ולאחר μL 100/טוב מועברים באמצעות גלופה 2 ללוח 1. בצלחת 1 ימוקם לקורא את הצלחת להפעיל וזמינותו קינטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואחריו הדמיה (זריחה TL GFP, PI). הנתונים מנותחים ואז לספור תאים, להעריך את יעילות תיקון בכל תנאי הניסוי. בערכות נתונים גדולות, ניתוח יכול להיות אוטומטי. כמו כן, ניתן להגדיל את המספר של משכפל טכני 4 במסכים תפוקה גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סופר דיוק התא. הלה תאים ביטוי מתויג GFP היסטון 2B היו נזרע ב triplicates בריכוזים המצוין. תאים (א) היו עם תמונה ב 37 ° C תחת אור המשודרת (TL) ושימש GFP קרינה פלואורסצנטית (12 תמונות טוב), אלגוריתם זיהוי תאים על גרעינים בודדים (בסגול). סרגל קנה מידה = 1 מ מ. (B) הגדלה גבוהה יותר של TL, GFP תא זיהוי (סגול) תמונות (מוגדלת 2 X). סרגל קנה מידה = 100 μm. (ג) התמונה ניתוח תוכנה שימש כדי לספור את מספר התאים לבין התא ספירות שורטטו נגד הראשונית התא ריכוז זריעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Propidium יודיד פלורסצנטיות מדידה אינה מושפעת ביטוי 2B-GFP-היסטון. הבעת 2B-GFP-היסטון ותאים שאינם לבטא הלה נחשפו, או לא, 1 ננומטר מתוק נוכחות (קווים מלאים) או היעדר 30 μM PI ב Ca2 +(קווים מקווקווים)-המכיל בינוני (M1). וזמינותו קינטית נמדדת עוצמות קרינה פלואורסצנטית PI spectrofluorometry כל 5 דקות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. הנתונים הם ממוצע PI פלורסצנטיות עוצמת (IPI) המתבטא פלורסצנטיות יחסית יחידות (RFU) ± SEM (n = 3 ניסויים עצמאית, שכל אחד מהם שבוצעו ב- triplicates). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תא ספירה אינה מושפעת על-ידי קרינה פלואורסצנטית PI. (א) נציג קדם פוסט-קינטי ותמונות (TL, PI ו- GFP) של תאים חשוף, או לא, 1 ננומטר מתוק ב- M1. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) קרינה פלואורסצנטית כמותית מיקרוסקופיה ניתוח (אניGFP± SEM) חשף GFP מוגברת פלורסצנטיות מדידה עקב התאגדות גרעיני PI על התא ופצעו מאת מתוק (פוסט-קינטי). ספירה מבוססת-GFP תא (ג) לא הושפע העלייה בעוצמת GFP. ספירת התאים לכל טוב בא לידי ביטוי כמו הממוצע ± ב- SEM (ב B ו- c: שחור ברים = נתונים קינטי מראש; הסורגים האדומים = נתונים פוסט-קינטי; n = 3 ניסויים עצמאית, אחד הופיעה triplicates; -t-test דו-זנבית של סטודנט שימש לניתוח כמותי קרינה פלואורסצנטית ספירות בעוצמה ותא מתמונות הנרכש, * * p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: מדידת קרום פלזמה חתימת יעילות. היסטון 2B-GFP לביטוי הלה תאים נחשפו, או לא, 1 ננומטר מתוק ב Ca2 +-המכיל (M1) או2 +Ca-בינוני (M2) חינם המכילה 30 μM PI. נתונים קינטי לייצג עוצמת קרינה פלואורסצנטית PI (IPI) זריחה יחסית יחידות (RFU) ± SEM, נמדד במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. n = 3 ניסויים עצמאית, שכל אחד מהם שבוצעו ב- triplicates. יעילות resealing נמדדה כפי שמצוין בשלב פרוטוקול 1.5.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: חומצות גרעין Carbocyanine מחייב צבע כמו צבען חלופי כדי להעריך ממברנה חתימה. הלה ויזת עבודה H2B-GFP תאים נחשפו, או לא, 0.5 ננומטר מתוק למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות μM 1 CNABD ב Ca2 +-המכיל (M1) או2 +Ca-בינוני (M2) ללא תשלום. (א) תמונות של הלה ויזת עבודה H2B-GFP תאים נרכשו מראש, שלאחר קינטי ב M1 המכיל לצבוע. סרגל קנה מידה = 100 μm. (B ו- C) CNABD משולב ו- GFP פלורסצנטיות עוצמות נמדדו באמצעות את cytometer הדמיה והביע ביחידות יחסית פלורסצנטיות ± (RFU) ב- SEM. תמונות פלורסצנטיות GFP (ד) עובדו לבצע ספירה הלה ויזת עבודה H2B-GFP תאים (שחור ברים = סרגלי נתונים מראש קינטי, אדום = נתונים פוסט-קינטי, n = 3 ניסויים עצמאית, שכל אחד מהם שבוצעו ב- triplicates). -T-test דו-זנבית של סטודנט שימש כדי לנתח את עוצמת קרינה פלואורסצנטית כמותיים וסופרת התא תמונות שנרכשו, * * p < 0.01, * * * p < 0.001) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: השפעת ריכוז מתוק על חתימת יעילות, Z-factor ו- SSMD. (א) הלה ויזת עבודה H2B-GFP תאי הדגירה ב M1 או M2 המכיל 1 μM CNABD היו נחשפים הגדלת ריכוזים של מתוק, נתון וזמינותו קינטי למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. הנתונים מבוטאים כמו עוצמת CNABD (ICNABD) בזריחה היחסי ± יחידות (RFU) ב- SEM (B) הגורם Z ואת ההבדל רשע סטנדרטית לחלוטין (SSMD) חושבו כמו הערכה איכות עבור החוסן של תיקון קרום assay, שימוש השטח מתחת לעקומה (AUC) מדד של44,4543,42,עקומות קינטי. היעילות resealing חושבו כמתואר בסעיפים פרוטוקול ותוצאות (n = 3 ניסויים עצמאית, שכל אחד מהם שבוצעו ב- triplicates). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: חשיפה תא desipramine גורם פגמים חתימה מחדש. הלה ויזת עבודה H2B-GFP תאים (מצופה ב ארבע פעמים) מראש שטופלו 30 μM desipramine (או לא) עבור h 1 ב 37 ° C ואז חשף את 0.25 או 0.5 ננומטר מתוק בנוכחות μM 1 CNABD ב Ca2 +-המכיל (M1) או2 +Ca-בינוני (M2) חינם. התאים היו עם תמונה (קדם ו פוסט-קינטי) ונחשפו וזמינותו קינטי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות (A) התאים היו לספור; הנתונים מבוטאים כפי תא הממוצע ספירות ± ב- SEM (B) CNABD קרינה פלואורסצנטית בעוצמה (ICNABD) מתבטאת פלורסצנטיות יחסי היעילות ב- SEM (C) Resealing ± יחידות (RFU) חושבו על הנוכחות ואת היעדר desipramine. מודל מעורב אפקטים שימש על ערכי העוצמה טרנספורמציה-יומן בהנחה של יירוט אקראי עבור כל שכפול טכני. כדי ללכוד שני משמרת ולשנות צורה של עקומות קינטי, ההשפעה העיקרית של תנאי הטיפול ועל ההשפעה האינטראקציה בין תנאי הטיפול לזמן נבדקו במשותף מובהקות סטטיסטית. -T-test דו-זנבית של סטודנט שימש כדי לנתח תא ספירת מתמונות הנרכש. ערך p מחושב באמצעות מודל מעורב אפקטים. (4 טכני משכפל, ניסוי אחד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הדמיה Cytometer פליטה ערוץ מפרטים
Fluorophore Fluorophore ex / em (אן אם) הערוץ הירוק (ex / em ± bandpass, nm) הערוץ האדום (ex / em ± bandpass, nm)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

טבלה 1: פסגות עירור, פליטת ה-GFP, PI, CNABD ואת ירוק אדום ערוץ bandpasses עירור, פליטה עבור cytometer הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Assay זו מודדת את היעילות של קרום חתימת ברמת האוכלוסייה תא עם קיבולת תפוקה גבוהה. זה יכול לשמש עבור מרכיבי התא או ספריות סמים העלולה להשפיע על קרום תיקון מסך. וזמינותו שתואר פעם תבנית צלחת 96-ובכן, אבל זה ניתן להתאים 384-ובכן לוחות עבור תפוקה גבוהה יותר. היתרון הזה וזמינותו הוא היכולת שלו לקבל מדידות קרינה פלואורסצנטית של תאים חסיד חי בזמן אמת ללא צורך מוגזם תא עיבוד כגון ניתוק התא, קיבוע או קרינה פלואורסצנטית תיוג קיבוע שאחרי. קוראי צלחת כינוייהם, כגון שימוש ב פרוטוקול זה, יש רגישות מספיק מדידות spectrofluorometric מהירה במרווחי זמן, המתחילים 30 s לצלחת 96-ובכן. רכישת תמונות פלורסצנטיות מספק מידע נוסף כולל ספירת תאים, שינויים בסופו של דבר מורפולוגיה תאים, וכן זיהוי פוטנציאל של אוכלוסיות תאים נפרדים. וזמינותו הנוכחי אינו קובע את קינטיקה של קרום פלזמה חתימת ברמה תא בודד, אך מזהה ניסיוני תנאים (תרכובות תרופתי או מרכיבי התא) יכול להשפיע, באופן חיובי או שלילי, התהליך של ממברנה חתימת ברמת האוכלוסייה התא.

מספר גישות אחרות פותחו כדי להעריך את הקרום חתימת מנגנונים. לדוגמה, הפרעה מכנית על ידי ניקוב microneedle, שחיקה חרוז אבלציה לייזר שימשו המודל נזק מכני הממברנה. המדד של ופצעו או תקן כרוך פלורסצנטיות מיקרוסקופ או לזרום cytometry לכימות הכניסה של הגששים פלורסנט (FM 1-43, יודיד propidium, dextrans fluorescein מצומדת) או מעקב חלבון פלואורסצנטי כימרות47 ,48,49,50. כל הגישות הללו יש יתרונות משלה; עם זאת, הם אינם נוטה תפוקה גבוהה ההקרנה בתאים חיים כפי שהוצג בזה וזמינותו.

נוכח וזמינותו אופטימלי כדי לנתח את היעילות resealing של תאים ונפגע על ידי החלבון להיוות נקבובית מתוק, איזה נקבוביות גדולות של טפסים כי היתר הכניסה Ca2 + המאסיבית כפי ע י יתבקע מכני של קרום פלזמה. למרות רעלים להיוות נקבובית מייצג צורה אחת של קרום פלזמה נזק, תיקון של נקבוביות גדולות הרעלן פצעים מכני הוצעו כדי לשתף Ca נפוצות2 +-מסלולים תלויה17,51. חשוב לציין כי האינטראקציה מתוק עם קרום התא רכיבים כגון כולסטרול עשוי להשפיע על איתות התא ובכך עשויים להשפיע ממברנה חתימת מנגנונים בהשוואה פצעים מכני. הידע שלנו על תיקון קרום עדיין מוגבל, נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע אם חתימה מחדש של פצעים מכני נבדלים חתימה מחדש בעקבות היווצרות של הרעלן נקבוביות. ישנם מספר יתרונות השימוש מתוק. ראשית, ניתן לסנכרן אתחול של נזק הממברנה על ידי העלאת הטמפרטורה בין 4 ל- 37 מעלות צלזיוס. שנית, הצורה מסיסים של מתוק (מאוגדים קרום התא) בלתי הפיך אגרגטים ב- pH נייטרלי ו- 37 מעלות צלזיוס, ובכך להגביל אפקטי ציטוטוקסיות, abrogating את הצורך לשטוף את התאים. לבסוף, מידת הנזק יכול להיות מותאם על ידי שינוי הריכוז של הרעלן. עם זאת, מגבלה של assay הזה הוא בבורר טמפרטורה בין 37 ל- 4 מעלות C, אשר עשוי להשפיע על מנגנון תיקון כגון תחבורה vesicular, אנדוציטוזה נזילות ממברנה, בין תהליכים אחרים, אשר מושפעים טמפרטורה52, 53,54. חשוב לוודא כי כל מעכב תרופתי הכלולים וזמינותו אינו מפריע להיווצרות נקבוביות מתוק על-ידי ביצוע וזמינותו של המוליזה של הנוכחות (לעומת. היעדרויות) של סמים55. בשל ההבדלים אצווה פוטנציאליים בפעילות מתוק, חשוב להכין מלאי של מתוק גדול מספיק עבור כל המסך תפוקה גבוהה55.

כללנו השימוש של התאים לבטא את כמירה GFP-היסטון-2B גרעיני מותאם לשפות אחרות כאמצעי לספור תאים לפני ואחרי תיקון קרום וזמינותו באמצעות הדמיה מיקרוסקופיים ואחריו אוטומטית וניתוח תמונות. חשוב, שוות ערך התא סופרת על פני תנאי וכן התא משתנה נחשב בעבר, לאחר וזמינותו קינטי מכריעים כמו פאי או בעוצמות קרינה פלואורסצנטית CNABD יכול בקלות להיות מנורמל. אכן, הבדל ספירת תאים תגרום הבדלים במידת הנזק על ידי ריכוז נתון של מתוק, אשר אפשר לתקנו עבור באמצעות קרינה פלואורסצנטית נורמליזציה בשל הבדלים בחתימת יעילות (איור 7). הראינו כי היסטון-2B-GFP הביטוי אינו מפריע פליטה התאגדות או קרינה פלואורסצנטית PI או CNABD. לעומת זאת, התאגדות PI או CNABD אינה משפיעה ספירה תא מבוסס-GFP. אם שילובים אחרים של fluorophores כדי לשמש, זה יהיה צורך בהערכת פוטנציאל ספקטרלי חפיפה בין fluorochromes, כפי בוצעה בעבודה זו. למרות PI נעשה שימוש נרחב כדי למדוד נזק הממברנה, אנו מראים כי CNABD הוא תחליף מצויין זה מוצגים תשואה גבוהה יותר קרינה פלואורסצנטית קוונטית, וכתוצאה מכך טווח דינמי גדול יותר מתאים אפיון חתימת יעילות.

Z-factor ו- SSMD אישר כי זו assay יש החוסן הדרושים לביצוע ניתוחים תפוקה גבוהה. חישוב יעילות resealing הוא כלי חיוני ואמין כדי לזהות להיטים פוטנציאלים. בנוסף, המודל אפקטים מעורבים יכול לשמש ככלי סטטיסטי כדי להעריך את הלהיטים בתוך וזמינותו יחיד. מערך הניסוי חייב לכלול מינימום של משכפל טכני שלושה אם המסך יכול לחזור מספר פעמים. Quadruplicates אמור לשמש אם כלים סטטיסטיים, כגון המודל אפקטים מעורבת, תיכלל ניסוי יחיד, בין אם זה יחזרו ובין אם לאו. עם זאת מומלץ לבצע המסך מספר פעמים, כדי לאמת את התוצאות על-ידי ביצוע ניסויים משלימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו להכיר ד ר ג'סי Kwiek (אוניברסיטת אוהיו) באדיבות הרשות לשימוש שלו פלטפורמה רב במצב זיהוי עבור ניסויים מוקדמים. מחקר דיווחו במאמר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר RO1AI107250 כדי Seveau סטפני. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 143 קרום פלזמה חתימה מחדש ממברנה תיקון ניוון שרירים יודיד propidium חומצת גרעין carbocyanine מחייב צבע הרעלן להיוות נקבובית listeriolysin O
תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter