Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Her beskriver vi en høy gjennomstrømming fluorescens-baserte analysen som måler plasma membranen resealing effektivitet gjennom fluorometric og tenkelig analyser i levende celler. Denne analysen kan brukes for screening narkotika eller målet gener som regulerer plasma membranen resealing i pattedyrceller.

Abstract

I fysiologiske miljøet, er pattedyrceller ofte utsatt for mekaniske og biokjemiske påkjenninger som resultere i plasma membranen skader. Svar på disse skadene forsegle komplekse molekylær machineries raskt plasma membranen for å gjenopprette sin barriere funksjon og beholde celle overlevelse. Til tross for 60 år med forskning i dette feltet mangler vi fortsatt en grundig forståelse av cellen resealing maskiner. Med mål om å identifisere cellulære komponenter som kontroll plasma membranen resealing eller stoffer som kan forbedre resealing, har vi utviklet en fluorescens-baserte høy gjennomstrømming analysen som måler plasma membranen resealing effektivitet i pattedyrceller kultivert i microplates. Som et modellsystem for plasma membranen skade, celler blir utsatt for den bakterielle pore-forming gift listeriolysin O (LLO), som danner store 30-50 nm diameter proteinaceous porene i kolesterol inneholder membraner. Bruk av en temperaturkontrollert Multi-mode microplate leser gir raskere og følsom spectrofluorometric mål i kombinasjon med brightfield og fluorescens mikroskopi avbilding av levende celler. Kinetisk analyse fluorescens intensitet slippes ut av en membran impermeant nukleinsyre bindende fluorochrome reflekterer graden av membran såret og resealing på befolkningsnivå celle, slik at beregningen av cellen resealing effektivitet . Fluorescens mikroskopi bildebehandling åpner for opplisting av celler som constitutively uttrykke et fluorescerende chimera av kjernefysiske protein histone 2B, i hver brønn av microplate å ta hensyn til mulige variasjoner i antall og tillater eventuell Identifikasjon av ulike celle populasjoner. Denne høy gjennomstrømming analysen er et kraftig verktøy vil utvide vår forståelse av membran reparasjonsmekanismene via screening for verten gener eller exogenously legges forbindelser som kontroll plasma membranen resealing.

Introduction

Pattedyrceller er underlagt mekanisk osmotisk og biokjemiske stress, noe som resulterer i tap av plasma membranen integritet. Uten rask og effektiv resealing, vil skadede celler raskt bukke til programmert eller nekrose død. Siden 1960, har innsats for å forstå plasma membranen resealing prosessen vært motivert av den ødeleggende konsekvenser forbundet med sin dysfunksjoner. Faktisk har sykdommer som lem-belte muskeldystrofi, diabetes og Chediak-Higashi syndrom vært knyttet til mangelfull plasma membranen reparasjon mutasjoner i genet koding dysferlin, produksjon av avanserte glycation end produkter og feil i lysosomale menneskehandel regulator CHS1, henholdsvis1,2,3,4,5,6. Men hittil, vår forståelse av membran er resealing fortsatt begrenset7. Første studier har vist at membran resealing startes av tilstrømningen av ekstracellulære Ca2 + gjennom skadet plasma membranen8,9,10. Siden da har flere ikke-gjensidig utelukkende Ca2 +-avhengige mekanismer har vært foreslått å reseal celler. Oppdateringen hypotesen foreslår at i nærhet til såret, intracellulær blemmer sikring med hverandre og skadet plasma membranen som en oppdatering11,12,13,14. En andre modellen foreslår at kalsium-avhengige exocytosis lysosomer på såret området utgivelser lysosomale enzym syre sphingomyelinase, som konverterer sphingomyelin til ceramide i ytre heftet av plasma membranen. Denne plutselige endringen i lipid komposisjon resulterer i ceramide-drevet endocytose skadet område15,16,17. Til slutt, den tredje foreslåtte mekanismen innebærer en rolle for endosomal sorteringen komplekse kreves for transport (ESCRT) å fremme dannelsen av utover mot blemmer som bud av plasma membranen18. Bare et begrenset antall proteiner ble identifisert i disse modellene, og deres maskiner må bli ytterligere belyst.

Her beskriver vi en høy gjennomstrømming analysen som måler plasma membranen resealing effektivitet i tilhenger pattedyrceller utsatt for skade formidlet av rekombinant listeriolysin O (LLO)19. LLO er en pore-forming gift (PFT) utskilles av facultative intracellulær patogen Listeria monocytogenes20,21,22 og tilhører MACPF/CDC (membran komplekset, perforin, og kolesterol-avhengige cytolysin) gruppe. MACPF er pattedyr pore-forming proteiner involvert i immunforsvar, mens CDCs er bakteriell giftstoffer hovedsakelig produsert av Gram-positive patogener som skader vertsceller å fremme deres patogene livsstil23. CDCs er synthesized som vannløselige monomerer eller dimers som binder til kolesterol presentere i plasma membranen og oligomerize til et prepore kompleks av opptil 50 underenheter. Prepore komplekse ordner deretter sette β-tråder over lipid bilayer, danner en β fat pore over 30-50 nm i diameter24,25,26,27.  Disse store porer tillater flukser ioner og små cellulære komponenter av cellen; men har noen studier foreslått at porene i mindre størrelser er også dannet28,29,30. Blant CDCs viser LLO unike egenskaper inkludert irreversibel pH - og temperaturen-avhengige aggregering, som bidrar til høy gjennomstrømming analyser31,32. LLO kan legges til celle kultur medium på 4 grader, en temperatur ettergivende til sin binding til celler, men ikke til dannelsen av pore komplekse. Initiering av pore formasjon kan deretter synkroniseres ved å heve temperaturen å 37 grader, slik at for effektiv spredningen av gift molekyler i flyet av membranen til skjemaet oligomers og conformational remodeling involvert i pore generasjon. Derfor avhenger etter bryteren i temperatur, kinetisk celle skade av mengden giftstoffer bundet til plasma membranen. Viktigere, løselig LLO (ikke bundet til plasma membranen) raskt og irreversibelt samler når temperaturen når 37 grader, noe som reduserer behovet for å vaske bort ubundet gift molekyler og begrenser omfanget av membran skader over tid. Til slutt, fordi LLO binder til kolesterol og danner porene i kolesterol-rik membraner, denne analysen er mottakelig for en rekke pattedyrceller. Det er viktig å huske at LLO påvirker verten celle signalisering hovedsakelig via pore formasjon, med noen få unntak i hvilken pore-uavhengig celle signalisering oppstå33,34,35,36 ,37,38,39. Derfor kan det ikke være utelukket at LLO signalering aktiviteter kan påvirker membranen reparasjon.

Denne analysen vurderer direkte omfanget av cellen såret ved å måle inkorporering av en celle impermeant fluorochrome (f.eks, propidium iodide) som passivt går inn sårede celler og blir svært fluorescerende når det knytter nukleinsyrer . Derfor kan fluorochrome vedlikeholdes i celle kultur medium hele eksperimentet slik at sanntid analyser av cellen såret. Fluorescens intensiteten av nukleinsyre bindende fargestoff vil øke med konsentrasjonen av gift, og for en gitt konsentrasjon av gift, vil øke over tid til alle porene er dannet, og cellene er fullt reparert eller metning er nådd. Tilstrømningen av ekstracellulære Ca2 + gjennom membranen porene er et sine qua non begivenhet for resealing. Derfor resealing effektiviteten kan bevitnes indirekte ved å sammenligne celle såret i kultur medium inneholder Ca2 + (reparasjon ettergivende tilstand) til såret i en Ca2 +-fri medium (reparasjon restriktive tilstand). Fordi fluorescens intensiteten av nukleinsyre bindende fargestoff er direkte proporsjonal med cellen konsentrasjonen i hver brønn, er det viktig å frø celler på samme konsentrasjonen i alle brønnene. Det er også viktig å nummerere celler i hver brønn før og etter analysen slik at celle avdeling ikke oppstår, som flytende, aggregert celler kan skjule fluorescens målinger som kan komplisere data tolkning. Hvis du vil nummerere celler, ble celler som uttrykker kjernefysiske lokalisert histone 2B-GFP (H2B-GFP) brukt i denne analysen. Temperatur-kontrollert, multi-modus, microplate lesere kombinerer rask, høy gjennomstrømming målinger (med en 96 eller 384-vel plate format) av fluorescens intensiteter med mikroskopi avbilding av levende celler på 37 ° C. Sistnevnte kan brukes til å nummerere celle nummer og observere endelige dannelsen av ulike celle populasjoner.

Til slutt denne analysen gir brukere muligheten til å utvide sin kunnskap om kompleksiteten i membranen reparasjonsmekanismene av screening for verten molekyler eller exogenously lagt forbindelser som kan styre membran reparere. Det følgende beskriver eksperimentelle trinnene for å måle resealing effektiviteten av celler som er utsatt for LLO og evaluere effekten av et gitt stoff eller cellular behandling på resealing effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse

  1. Cellen Plating
    Merk: Human cervical epitelceller, jakten og HeLa uttrykke Histone 2B-GFP (H2B-GFP), ble brukt i denne protokollen, men denne analysen kan tilpasses til andre pattedyrceller19.
    1. Koble tilhenger celler fra en 75 cm2 celle kultur kolbe ved å vaske cellene med 2 mL Trypsin-EDTA 0,25%. Erstatte den brukte trypsin med 2 mL frisk trypsin-EDTA 0,25%.
    2. Inkuber cellene på 37 grader i 5 min til cellene har avrundede og løsrevet fra flasken.
    3. Resuspend cellene i 8 mL oppblomstringen medium (DMEM inneholder 10% inaktivert fosterets bovin serum, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin).
    4. Bestemme cellen konsentrasjonen med en hemocytometer og 10 µL av cellen suspensjon.
    5. Fortynne cellene i vekstmediet til en konsentrasjon av 2.5 x 105 celler/mL.
    6. Hell celle suspensjon i et sterilt pipette basseng og grundig blande suspensjon bruker en 10 mL serologisk pipette.
    7. Bruker 12-kanals brønnene og 200 µL tips, distribuere HeLa celler (2,5 x 104 celler/100 µL/vel) i tre eksemplarer (eller quadruplicate) i en 96-brønns flat, klart bunnen, svart polystyren vev kultur-behandlet plate.
      Merk: En plating ordning er presentert som et eksempel i figur 1.
    8. Kultur celler for 24 timer i en fuktet celle kultur inkubator på 37 grader og 5% CO2.
  2. Lagerløsning forberedelse
    1. Forberede 1 L en 10 x lager av buffer M (brukes til å klargjøre M1 og M2) ved å legge til 95 g Hanks balansert saltløsning, 0.476 g MgCl2 (5 mM), og 23.83 g HEPES (100 mM) til 900 mL vann. Justere pH 7,4 og senke volumet til 1 L. Filter sterilisere.
    2. Forberede 50 mL av en 50 x (1,25 M) lager av glukose ved å legge 11.26 g D-(+)-glukose totalt 50 mL vann. Filteret sterilisere løsningen.
    3. Forberede 50 mL av en 100 x (120 mM) lager av kalsium ved å legge 0.666 g CaCl2 totalt 50 mL vann. Filteret sterilisere løsningen.
    4. Forberede 50 mL av en 10 x (50 mM) lager av etylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N, N N', N', tetraacetic syre (EGTA) ved å legge 0.951 g EGTA 40 mL vann. Øke pH 8 med NaOH for å oppløse EGTA og deretter senke volumet til 50 ml passer. Filteret sterilisere løsningen.
    5. For en enkelt 96-brønns plate, forberede 50 mL av Medium 1 (M1, inneholder Ca2 +), 50 mL av Medium 2 (M2, Ca2 +-gratis), og 15 mL Medium 2 supplert med EGTA, tilsvarende:
      1. For M1, legge til 5 mL 10 x Buffer M, 0,5 mL av 100 x CaCl2og 1 mL av 50 x glukose 43.5 mL vann.
      2. For M2, legge til 5 mL 10 x Buffer M og 1 mL av 50 x glukose 44 mL vann.
      3. M2/EGTA, legge til 1,5 mL 10 x Buffer M og 1,5 mL 10 x EGTA til 12 mL vann.
        Merk: Alle løsninger som inneholder propidium iodide (PI) bør være forberedt direkte før du legger til cellene.
  3. Plate leser tenkelig Cytometer innstillinger
    Merk: Bruk en multi-Mode plate leser utstyrt med to detection enheter: en spectrofluorometer og en tenkelig cytometer. Begrense fluorescens eksponering for å unngå photobleaching av fluorophores.
    1. Forvarm plate leseren 37 ° C før analysen.
    2. Angi parametere for kinetic analysen tilsvarende i innstillingsmodus :
      1. Velg monokromator, FL (fluorescens)og kinetisk for optiske konfigurasjon, lese moduser og lese type, henholdsvis.
      2. Velge en 9 og 15 nm eksitasjon og utslipp Båndpassdesign, Bølgelengde innstillinger. Analyser satt bruker propidium iodide (PI), eksitasjon og utslipp bølgelengdene til 535 og 617 nm, henholdsvis.
      3. Velg 96 brønner for plate formatet og en pre-set plate konfigurasjon tilsvarer en svart vegg klart bunnplaten under Skivetype.
      4. Under Lese områdemarkere brønnene som skal analyseres gjennom den kinetiske.
      5. Under avdrag og optikk, forhåndsinnstilt blinker per lesing 6 og Merk av for lese fra nederst.
      6. Under Timing, sett 00:30:00 i boksen Kjør totaltiden for en 30 min kinetic analysen, og sett inn 00:05:00 for intervallet.
        Merk: For hver gang poeng og en bølgelengde, lesetiden av en full 96-brønns plate er 30 s.
      7. Kontroller de angitte innstillingene i Innstillingsinformasjon til høyre og velg OK. Trykk Read å starte den kinetiske kjøre.
    3. Angi parametrene tenkelig tilsvarende i innstillingsmodus:
      1. Velg Minimax, Imagingog endepunkt for optiske konfigurasjon, lese moduser og lese type, henholdsvis.
      2. Under bølgelengder, Merk overføres lys, og én eller begge fluorescens tilsvarer eksitasjon og utslipp bølgelengder av 456/541 nm (GFP) og 625/713 nm (PI).
      3. Bruke samme alternativer for Skivetype og Lese område som definert i trinn 1.3.2.3 og 1.3.2.4.
      4. Vel området innstillingenVelg antall områder i et godt til å avbildes.
        Merk: 12 steder tilsvarer et full-godt bilde.
      5. Under Oppkjøpet innstillinger, velge eksponering for overføres lett, 541 (GFP) og 713 (PI). For GFP, bilde hele med en eksponeringstid på 20 ms/bilde. For sendt lys (TL) og PI fluorescens, skaffe et enkelt bilde i midten av hver brønn med eksponeringstider på 8 og 20 ms, henholdsvis.
      6. Kontroller de angitte innstillingene i Innstillinger informasjon til høyre og velg OK. Anskaffet for imaging hele overflaten av hver brønn (12 bilder/vel) av en 96-brønns plate og en bølgelengde er ~ 15 min. Trykk lese å starte bildebehandling.
        Merk: Anskaffet et enkelt bilde/godt av en 96-brønns plate krever ~2.5 min/plate for en bølgelengde. Parameterne som beskrives ovenfor tilsvarer spesifikke utstyret i vårt laboratorium. Spectrofluorometric mål: en xenon flash lampe viser 1.0 nm tilvekst eksitasjon bølgelengder (250-850 nm) med en justerbar 9 eller 15 nm Båndpassdesign, en photomultiplier tube detektor med en > 6 logge dynamisk område og en justerbar 15-25 nm utslipp Båndpassdesign. Imaging cytometer: en belysning lyskilde dugelig av hvitt lys, 460 nm og 625 nm eksitasjon bølgelengder med en 20 nm Båndpassdesign, utslipp filtre sentrert på 541 nm (108 nm Båndpassdesign) og 713 nm (123 nm Båndpassdesign), henholdsvis, og et 4 X mål til en 1,25 12-bit kostnad - sammen enhet-megapikselkameraet.

2. analysen

Merk: På tidspunktet for analysen, cellene må ligge 70-90% confluent. Under vask trinnene, bør medium være fjernet fra og brukt til sideveggen av brønnen (ikke direkte over cellene). Opprettholde temperaturen i LLO på < 4 grader å hindre sin samling til trinn 3.1.5.

  1. Forberede et lager av 30 µM PI i M1 og et lager av 30 µM PI i M2 pre varmet på 37 grader.
  2. Forsiktig vaske cellene i platen 1 med 12-kanals brønnene og 200 µL tips, som følger:
    1. For reparasjon-ettergivende forhold, fjerne oppblomstringen medium og vask cellene to ganger med 200 µL/vel M1 pre varmet på 37 grader. Erstatt medium med 100 µL/godt av varm M1 inneholder 30 µM PI.
    2. For reparere restriktive, fjerne vekstmediet og vask cellene gang med 200 µL/godt varm M2 som inneholder 5 mM EGTA til chelate Ca2 +, etterfulgt av en vask med 200 µL/godt M2. Erstatt medium med 100 µL/godt varm M2 med 30 µM PI.
    3. Når vekstmediet har blitt vasket og erstattet med medium som inneholder propidium iodide, flytte direkte til trinn 2.1.3.
  3. Bildet plate 1 under lyset, GFP og PI som beskrevet under 1.3.3 (pre kinetic). Dette trinnet tar 15-20 min.
  4. I 15 min perioden i trinn 2.1.3, forberede plate 2 med 12-kanals brønnene og 200 µL tips som følger:
    1. Plass en 96-brønns runde bunnen polypropylen microplate på isen. Konfigurere platen med en eksperimentell design tilsvarer plate 1 (figur 1).
    2. Reparasjon-ettergivende forhold, legge 100 µL/godt av iskalde M1 inneholder 60 µM PI, etterfulgt av tillegg av 100 µL/godt av iskalde M1 inneholder 4 x LLO eller ikke for kontrollen.
    3. Reparasjon-restriktive, legge 100 µL/vel iskald m2 med 60 µM PI, etterfulgt av tillegg av 100 µL/vel iskald m2 med 4 x LLO eller ikke for kontrollen.
  5. Etter imaging plate plasser 1 (trinn 2.1.3), det straks på is, bruke aluminiumsfolie skille platen fra direkte kontakt med is. Tillate plate 1 å avkjøles i 5 min.
  6. Bruker 12-kanals brønnene og 200 µL tips, overføre 100 µL fra hver brønn inn plate 2 (trinn 2.1.4) tilsvarende fordelt i plate 1. Riktig distribuere giften i media plate 1, sett tipsene nedenfor meniscus og forsiktig ut volumet uten introdusere bobler.
    Merk: Ikke Pipetter opp og ned, som dette utilsiktet løsne cellene.
  7. La platen i en ekstra 1 minutt å tillate giften binde til cellene og øyeblikkelig overføre plate 1 plate leseren for kinetic analysen ved hjelp av spectrofluorometer modus (trinn 1.3.2).
  8. På slutten av kinetic analysen, umiddelbart plate 1 (etter kinetic) bruke trinn 1.3.3.

3. analyse: Cellen opplisting

  1. Bestemme celletall basert på kjernefysisk fluorescens ved hjelp av microplate celle opplisting programvare.
    1. Velg re-analyse Innstillinger, og velg Diskret objektet analyse bruker 541 som bølgelengde for å finne objekter under delen kategori Bildeinnstillinger .
    2. Alternativet Finn objekter, bruker det trekke på bilder å finne metode, velg kjerner under kategorien Innstillinger og trykk Bruk.
    3. Trykk på OK og lese å starte cellen teller algoritme.
  2. Alternativt hvis ingen slike verktøy tilgjengelig, bruke en image analyseprogramvare som ImageJ nummerere celler.
    1. Åpne bildefilen som en bunke i ImageJ.
    2. Konvertere stakken til 8-biters gråskala bilder ved å klikke bildet i menylinjen, hover over Type, og velg 8-biters.
    3. Trekke fra bakgrunnen: Klikk på bilde i menylinjen, hold over justere, og velg Lysstyrke/kontrast. Justere minimumsverdien for å fjerne bakgrunnsstøy og velger.
    4. Terskel for å skape binære bilder: Klikk på bilde i menylinjen stikker justere, og velg terskel. Velg mørk bakgrunn, justere minimum og maksimum terskelverdier, og klikk Bruk.
    5. Ved overlappende kjerner, kan et vannskille verktøyet brukes til segmentet kjerner. Klikk prosessen i hover over binær -menyen og velg vannskille.
      Merk: Dette vil automatisk skille tilkoblede kjerner.
    6. Analysere de maskerte bildene ved å bruke bruker-spesifiserte kriterier (størrelse og sirkularitet) for å avgrense identifikasjon av kjerner og ekskludere celle rusk.
      1. Klikk på analyser i menyen og deretter analyser partikler. Angi ønsket størrelse (piksel ^ 2) og sirkularitet (verdien 1 er en perfekt sirkel) områder som er tilstrekkelig til å inkludere individuelle celler/kjerner.
      2. I Vis dropdown-boksen velger du alternativene for ønsket, sjekk Oppsummerog klikk OK for å få celletall.

4. analyse: Kinetic kurver

  1. Overføre kinetic data fra platen reader-programmet til en analytisk programvare.
  2. For hver eksperimentelle tilstand, gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av replikat på hver timepoint, sammen med tilhørende standardavvik og standard feil av gjsnitt for hver eksperimentelle betingelse.
  3. For hver eksperimentelle tilstand, spore tilsvarende kinetic kurven: PI intensitet (y-aksen) versus tid (x-aksen).
  4. For å beregne resealing effektiviteten av en gitt behandling tilstand, beregne området under kurven (AUC) av den + LLO i M1 (AUC(M1)) og + LLO i M2 (AUC(M2)). Bruke tilnærming foreslått under å vurdere effektiviteten (E) av resealing:
    Equation
  5. Utfør en sammenligning mellom kontrollen og test behandling ved å bestemme effektiv ratio (REff) angitt nedenfor:
    Equation 2
    REFF = 1, test behandling har ingen virkning på reparasjon
    REFF < 1, test behandling hemmer reparasjon
    REFF > 1, test behandling forbedrer reparasjon
  6. Beregne areal under kurven ved hjelp av følgende ligning:
    Equation 3, der n er antall oppfølging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellen teller nøyaktighet: HeLa celler brukes ofte som en modell pattedyr cellen linje for å utforske membran reparasjonsmekanismene. Når vurdere membran reparasjon på befolkningsnivå cellen, er det viktig å plate celler på samme konsentrasjonen i alle brønner for riktig data tolkning. Det er også viktig å kontrollere på tidspunktet for analysen at cellen tallene er tilsvarende over brønner. HeLa celler som uttrykker constitutively histone 2B del GFP (H2B-GFP) ble introdusert i denne analysen til å automatisk nummerere cellene basert på deteksjon av deres fluorescerende kjerner. For å etablere nøyaktigheten i cellen opplisting, var todelt føljetong fortynninger av HeLa H2B-GFP celler belagt i tre eksemplarer i en 96-brønns plate og kultivert 4 h. Denne tidsperioden er tilstrekkelig for cellen vedlegg og gir begrenset celledeling. Full brønner ble fotografert under lyset (TL) og GFP fluorescens illuminations og celletall ble vurdert basert på GFP fluorescens bruker plate leser analyseprogramvare (figur 2A og 2B). Gjennomsnittlig celle teller ± standardavviket var plottet mot celle seeding konsentrasjoner, og en linje for beste tilpasning markert 1.08:1 forholdet celletall til celle seeding, demonstrere nøyaktigheten av telling (figur 2C). Av imaging alle brønnene før en kinetisk analyse, kan det sikres at cellen tallene er konsekvent blant alle brønnene. Også av imaging brønner etter kinetic analysen, kan en opprette hvis eksponering for giften forårsaket celle avdeling.

Uttrykk for GFP forstyrrer ikke propidium iodide (PI) intensitet målinger (IPI): slik at H2B-GFP nuclear association ikke forstyrrer PI innlemmelse eller et PI fluorescens intensitet (IPI), jegPI var forhold i HeLa og HeLa H2B-GFP celler som ble utsatt, eller ikke, 1 nM LLO (Figur 3). I fravær av PI var det tilsvarende lave bakgrunn fluorescens HeLa og HeLa H2B-GFP, som angir at GFP ikke svetter gjennom PI fluorescens utslipp filtre. I nærvær av PI, men fraværet av LLO var det en lignende basale PI fluorescens utslipp i både HeLa og HeLa H2B-GFP som ikke endre over tid. Dette bekreftet at uttrykk for GFP ikke påvirker måling av PI fluorescens indikerte at PI ikke trenge ikke skadet celler over tid rammen av eksperimentet. Tillegg av LLO resulterte i en økning i PI fluorescens over tid som var både HeLa og HeLa H2B-GFP. Denne økningen skyldes celle såret av LLO kombinert med PI foreningen med nucleic syrer. Sammen etablere disse resultatene at uttrykket av histone-2B-GFP ikke påvirker PI innlemmelse eller måling av sin fluorescens.

PI fluorescens påvirker ikke GFP-baserte celle teller: gjensidige, var det viktig å kontrollere at PI kjernefysiske innlemmelse i såret celler ikke påvirke GFP-baserte celle teller. Representant fluorescens bilder av HeLa og HeLa H2B-GFP utsatt for 1 nM LLO i nærvær av PI viste at det var en markert akkumulering av PI i såret celler innlegget kinetics, som forventet (figur 4A). Bildebehandling avslørte også at PI kan blø gjennom GFP fluorescens gjenkjenning (figur 4A og tabell 1). Denne fluorescens crossover var best verdsatt på post kinetic bildene HeLa celler som uttrykker ikke GFP, men fortsatt vises grønne fluorescerende kjerner (figur 4A). Dette krysskabel kan også være dokumentert ved måling av GFP fluorescens intensitet (IGFP) i HeLa H2B-GFP celler, som betydelig økte etter kinetic sammenliknet med pre kinetic (figur 4B). Viktigere, påvirker PI fluorescens crossover ikke cellen teller fordi segmentering prosessen involvert i opptellingen av kjerner er upåvirket av en økning i GFP fluorescens (figur 4C).

Måle plasma membran resealing effektivitet: I denne delen presenterer vi grunnleggende metodene som brukes til å måle effektiviteten av membran resealing. For å bevis prosessen med membran resealing, HeLa H2B-GFP celler ble utsatt, eller ikke, til 1 nM LLO i tilstedeværelse (M1) eller fravær (M2) av ekstracellulære Ca2 + (figur 5). Som forventet, i fravær av LLO, forble jegPI konstant i M1 og M2. Tillegg av LLO i Ca2 +-som inneholder mediet resulterte i en jevn økning i PI fluorescens intensitet (IPI), mens i fravær av ekstracellulære Ca2 +, var det en betydelig brattere økning i PI fluorescens, reflekterer den fravær av membran resealing. Å vurdere resealing effektiviteten, som er definert som antall celler å reparere i M1 i forhold til M2 (trinn 1.5.4.1), området under M1 og M2 kurver (AUC) var bestemt og effektiviteten av reparasjon (E) beregnet til 0.287.

Et alternativ til PI: PI overalt er brukt som en markør for plasma membranen skade. Det finnes imidlertid andre nukleinsyre bindende fargestoffer som er også egnet for denne analysen. For eksempel en membran impermeant carbocyanine nukleinsyre binding farge (CNABD) viser en utslipp spektrum nå i langt rødt og har en høy spesifisitet for double-strandet DNA. PI binder derimot både DNA og RNA40,41. I motsetning til PI overlapper eksitasjon og utslipp spektra av CNABD ikke med de GFP gir bedre spectral oppløsning mellom de to fluorochromes. Videre har CNABD brukes i denne protokollen en utryddelse koeffisienten nesten dobbelt som av PI, som betyr at for deres respektive eksitasjon bølgelengder, dette fargestoffet er mer i stand til å absorbere energi enn PI som resulterer i en sterkere fluorescens utslipp. Kvantitativ fluorescens analyse av CNABD og GFP bilder viste at dette fargestoffet viser et stort fluorescens dynamisk område, sender ikke betydelig på bølgelengder av GFP fluorescens, og påvirker ikke celletall (figur 6AD). Faktisk HeLa H2B-GFP celler ruges i M1 eller M2 mediet som inneholder CNABD og skadet av 1 nM LLO viser en 4 - og 5.5 ganger økning i jegCNABD i forhold til ikke-skadet kontrollene, henholdsvis (figur 7A). Til sammenligning celler utsatt for 1 nM LLO i nærvær av PI utstilt en 2,5 og 3 ganger økning i PI fluorescens intensitet i M1 og M2, henholdsvis (figur 5). Liker PI, CNABD utstillinger øker fluorescens intensitet med økende LLO konsentrasjon i M1 (figur 7A), og den resulterende reparasjon effektiviteten ble beregnet som beskrevet i trinn 1.5.4.1 (figur 7B). Vi rapporterer at cellen resealing effektivitet avtar som LLO konsentrasjonen øker. Dette fenomenet gjenspeiler det faktum at celler reduserer deres evne til å forsegle når overdreven skader forårsaket.

Kvalitetsvurdering av membran reparasjon analysen: en viktig del av enhver analysen er dens robustness eller evne til å oppdage og løse forskjeller mellom negative og positive kontrollene. Signalet variasjon mellom positive og negative kontroller må vise tilstrekkelig dynamisk område og reproduserbarhet. I denne membranen reparasjon analysen er positive og negative kontrollene celler utsatt for LLO i reparasjon tillatelse (M1) og reparasjon-(M2) restriktive, henholdsvis. To tilnærminger ble tatt å vurdere robustheten av denne analysen for høy gjennomstrømming analyse. Først den Z-faktoren eller screening vinduet koeffisienten, bestemmer om et gitt sett med vilkår gir et stort nok dynamisk område, mens regnskap for signalet variasjon. Z-faktorer innenfor 0 < Z ≤ 0,5 og 0,5 < Z ≤ 1 tilsvarer en akseptabel og meget god analyse,42,43henholdsvis. En begrensning for å bruke den Z-faktoren for kvalitetsvurdering er at testet forholdene vanligvis ha mer moderat verdier sammenlignet med ekstrem positive og negative kontrollene. Derfor, som en annen tilnærming, beregnet vi strengt standardisert bety forskjellen (SSMD, β), som kan identifisere forskjellene mellom eksperimentelle forhold som ellers ville bli kategorisert som et negativt resultat basert på en kvalifisert Z-faktor44 ,45. SSMD verdier kan kategoriseres i effekt styrke fra ingen effekt (β = 0) til ekstremt sterk (β ≥ 5). Bruker data fra figur 7A og AUC for sammenligning av M1 mot M2 forhold, eksponering for 0,25 og 0,5 nM LLO produsert Z-faktor-verdiene 0.3100813 og 0.137313 og β = 6.0672 og 4.803308, henholdsvis indikerer at et vindu for LLO egnet for analysen. Som konsentrasjonen av LLO økes utover 1 nM, gapet i jegCNABD kinetic kurver mellom M1 og M2 lukker resulterer i drastisk redusert Z-faktor og SSMD verdier (figur 7B). Slike høye konsentrasjoner av LLO tilsvarer der reparasjon potensial blir skade og dermed benekter bruk av analysen identifisere faktorer involvert i membranen reparasjon. Dette er ytterligere illustrert av nedgangen i reparasjon effektivitet (E) som LLO konsentrasjonen øker (figur 7B). Alle data (Z-faktor, SSMD og E) ble generert med 3 biologiske gjentak og 3 teknisk replikerer per eksperimentelle betingelse for analysen validering. Sammen disse dataene viser at denne analysen har forventet robusthet for en høy gjennomstrømming analysen med LLO konsentrasjoner underlegne 1 nM for HeLa celler.

Bevis på prinsippet: Når robust analysen ble etablert, vi utført flere eksperimenter som et bevis på prinsippet at denne analysen har følsomhet og oppløsning til å identifisere en feil i reparasjonsprosessen. Også vurdert vi at høy gjennomstrømming analyser brukes som en screening-prosess for å identifisere "treff" i store skjermer, noe som kan innebære mindre enn 3 biologiske replikerer. Dermed er det relevant at eksperimentell design gir gjenkjenning makt til å identifisere "treff" innenfor en singel-analysen. Derfor under en høy gjennomstrømming skjerm, kan oppsettet analysen justeres for å imøtekomme 4 teknisk gjentak å øke statistisk styrke i et enkelt eksperiment. Celler var belagt i quadruplicate og var pre-behandlet 1t før analysen med desipramine, en farmakologisk inhibitor av lysosomale protein syre sphingomyelinase (ASM) som spiller en rolle i plasma membranen reparasjon15,17 ,46. Viktigere, påvirke behandling med desipramine ikke celletall hele analysen, slik at passende sammenligning mellom desipramine-behandlet og ikke-behandlet celler (figur 8A). Hemming av ASM i desipramine-behandlet celler resulterte i feil membran resealing effektivitet ved eksponering til LLO, som illustrert ved nedgangen i E og REff (figur 8B og 8 C). Bruker en blandet effekter modell, behandlet en sammenligning av desipramine-til ikke-behandlet celler utsatt for 0,25 og 0,5 nM LLO i M1 viste p-verdier av 0.0010 og 1 x 10-10, henholdsvis. Sammen indikerer data at 0,25 og 0,5 nM LLO aktuelle konsentrasjoner å identifisere feil i reparasjon i høy gjennomstrømming eksperimentelle omgivelser, med mulig statistiske analyser av ett enkelt eksperiment når de tekniske gjentak er økt til fire . Merk at statistisk tilnærming av blandet effekter modell mellom quadruplicate ikke vil høyde for mulige variasjoner over flere biologiske replikerer. Noen betydelig funn med en biologisk replikere må bekreftes i eksperimentell tilleggsinnstillinger.

Figure 1
Figur 1: eksperimentell design. Flyt diagrammet viser en representant plate design konfigurert til å teste effekten av syv testforhold i forhold til kontrollen ikke behandlet celler. Flere kontroller skal inkluderes hvis aktuelt, som for eksempel narkotika biler. Celler er belagt (plate 1) 24 timer før eksperimentet. På dagen for eksperimentet, celler i plate 1 er vasket med M1 eller M2 medium pre varmet på 37 ° C, og platen er fotografert (TL, GFP og PI fluorescens) pre kinetic. Under 15 min bildebehandling, reagenser er lagt på is til plate 2. Etter bildebehandling, plate 1 plassert straks på is 5 min og 100 μL/godt overføres fra plate 2 til plate 1. Plate 1 plasseres i plate leseren kjøre kinetic analysen på 37 ° C i 30 min, etterfulgt av imaging (TL, GFP og PI fluorescens). Dataene blir deretter analysert for å telle celler og vurdere reparasjon effektivitet i alle eksperimentelle forhold. I store datasett, kan analyse automatiseres. Også kan antall tekniske gjentak økes til 4 i høy gjennomstrømming skjermer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: cellen teller nøyaktighet. HeLa celler uttrykke GFP-merket Histone 2B var frø inne triplicates i de angitte konsentrasjonene. (A) celler ble fotografert på 37 ° C lyset (TL) og GFP fluorescens (12 bilder/vel) og en celle-algoritme ble brukt til å avgrense personlige kjerner (i lilla). Skala bar = 1 mm. (B) høyere forstørrelsen av TL, GFP og celle gjenkjenning (lilla) bilder (zoomet 2 X). Skala bar = 100 μm. (C) Image analyseprogramvare ble brukt til å telle antall celler og cellen teller var plottet mot første celle seeding konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Propidium iodide fluorescens måling påvirkes ikke av Histone 2B-GFP uttrykk. Histone 2B-GFP uttrykke og ikke uttrykke HeLa celler ble utsatt, eller ikke, til 1 nM LLO i tilstedeværelse (heltrukket linje) eller fravær (stiplede linjer) på 30 μM PI i Ca2 +-inneholder medium (M1). Kinetisk analysen målt PI fluorescens intensiteter av spectrofluorometry hver 5 min i 30 min på 37 ° C. Data er gjennomsnittlig PI fluorescens intensiteten (IPI) uttrykt i relativ fluorescens enheter (RFU) ± SEM (n = 3 uavhengige eksperimenter, hvert utføres i triplicates). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: cellen opplisting er upåvirket av PI fluorescens. (A) representant pre og post kinetisk bildene (TL, PI og GFP) celler utsatt eller ikke, til 1 nM LLO i M1. Skala bar = 100 μm. (B) kvantitative fluorescens mikroskopi analyse (jegGFP± SEM) viste økt GFP fluorescens målingen på grunn av PI kjernefysiske innlemmelse på cellen såret av LLO (etter kinetic). (C) GFP-baserte celle opplistingen var upåvirket av økningen i GFP intensitet. Celletall per brønn ble uttrykt i gjennomsnittlig ± SEM. (i B og C: svart barer = pre kinetic data; røde stolper = post kinetic data; n = 3 uavhengige eksperimenter, hvert utført i triplicates; en tosidige Student t-test ble brukt til å analysere kvantitative fluorescens intensiteten og celle teller fra ervervet bilder, ** p < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: måle plasma membran resealing effektivitet. Histone 2B-GFP uttrykke HeLa celler ble utsatt, eller ikke, til 1 nM LLO i Ca2 +-inneholder (M1) eller Ca2 +-fri (M2) medium som inneholder 30 μM PI. Kinetisk dataene representerer PI fluorescens intensitet (IPI) i relativ fluorescens enheter (RFU) ± SEM, målt i 30 min på 37 ° C. n = 3 uavhengige eksperimenter, hvert utføres i triplicates. Resealing effektiviteten ble målt som angitt i protokollen trinn 1.5.4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Carbocyanine nukleinsyre bindende fargestoff som en alternativ fargestoff å vurdere membran resealing. HeLa H2B-GFP celler ble utsatt, eller ikke, til 0,5 nM LLO i 30 min på 37 ° C i nærvær av 1 μM CNABD i Ca2 +-inneholder (M1) eller Ca2 +-fri (M2) medium. (A) bilder av HeLa H2B-GFP celler ble kjøpt pre og post kinetisk i M1 med fargestoff. Skala bar = 100 μm. (B og C) integrert CNABD og GFP fluorescens intensiteter ble målt ved hjelp av tenkelig cytometer og uttrykt i relativ fluorescens enheter (RFU) ± SEM. (D) GFP fluorescens bilder ble behandlet for å nummerere HeLa H2B-GFP celler (svart barer = pre kinetic datastolpe, rød = post kinetic data, n = 3 uavhengige eksperimenter, hvert utføres i triplicates). En tosidige Student t-test ble brukt til å analysere kvantitative fluorescens intensitet og celle teller fra ervervet bilder, ** p < 0,01, *** p < 0,001) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: effekten av LLO konsentrasjon på resealing effektivitet og Z-faktor SSMD. (A) HeLa H2B-GFP celler ruges i M1 eller M2 med 1 μM CNABD ble utsatt for økende konsentrasjoner av LLO og utsatt for kinetic analysen i 30 min på 37 ° C. Dataene er uttrykt som CNABD intensitet (ICNABD) i relativ fluorescens enheter (RFU) ± SEM. (B) Z-faktoren og strengt standardisert bety forskjellen (SSMD) ble beregnet som en kvalitetsvurdering for robusthet av membran reparasjon analysen, bruker området under kurven (AUC) som en beregning for kinetic kurver42,43,44,45. Resealing effektiviteten ble beregnet som beskrevet i delene protokollen og resultater (n = 3 uavhengige eksperimenter, hvert utføres i triplicates). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: cellen eksponering desipramine forårsaker feil i resealing. HeLa H2B-GFP celler (belagt i quadruplicate) var pre-behandlet med 30 μM desipramine (eller ikke) 1t på 37 ° C og deretter utsatt 0,25 eller 0,5 nM LLO i nærvær av 1 μM CNABD i Ca2 +-inneholder (M1) eller Ca2 +-fri (M2) medium. Cellene ble fotografert (pre og post kinetic) og utsatt for kinetic analysen på 37 ° C for 30 min. (A) celler ble nummerert; dataene er uttrykt som gjennomsnittlig celle teller ± SEM. (B) CNABD fluorescens intensitet (ICNABD) er uttrykt i relativ fluorescens enheter (RFU) ± SEM. (C) Resealing effektivitet ble beregnet i tilstedeværelse og fravær av desipramine. En blandet effekter modell ble brukt på Logg-forvandlet intensitetsverdiene forutsatt en tilfeldig skjæringspunkt for hver teknisk replikere. Å fange både et skifte og endre i form av kinetic kurver, testet av behandling tilstand og samhandling effekten mellom behandling tilstand og fellesskap for statistisk betydning. En tosidige Student t-test ble brukt til å analysere celletall fra ervervet bilder. P-verdien ble beregnet med blandet effekter modell. (4 teknisk replikerer, et eksperiment). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Imaging Cytometer utslipp kanal spesifikasjoner
Fluorophore Fluorophore ex / em (nm) Grønne kanalen (ex / em ± Båndpassdesign, nm) Røde kanalen (ex / em ± Båndpassdesign, nm)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tabell 1: GFP og PI CNABD eksitasjon og utslipp topper og de grønne og røde kanalen eksitasjon og utslipp bandpasses for bildebehandling cytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne analysen måler effektiviteten av membran resealing på befolkningsnivå cellen med høy gjennomstrømming kapasitet. Den kan brukes til skjermen for cellulære komponenter eller narkotika biblioteker som kan påvirke membran reparasjon. Beskrevet analysen brukt en 96-brønns plate format, men det kan tilpasses til 384-vel plater for høyere gjennomstrømming. En fordel med denne analysen er dens evne til å få fluorescens målinger av tilhenger levende celler i sanntid uten overdreven cellen behandling som cellen avdeling, fiksering eller fluorescens merking etter fiksering. Multimode plate lesere, som den som brukes i denne protokollen, har tilstrekkelig følsomhet for rask spectrofluorometric målinger i tidsintervaller som er så lite som 30 s for en 96-brønns plate. Oppkjøpet av fluorescens bilder gir tilleggsinformasjon, inkludert celle opplisting, eventuelle endringer i celle morfologi og potensielle identifikasjon av ulike celle populasjoner. Nåværende analysen etablerer ikke the kinetics av plasma membranen resealing på enkeltcelle nivå, men identifiserer eksperimentelle forhold (farmakologiske forbindelser eller cellulære komponenter) som kan påvirke, positivt eller negativt, prosessen med membran resealing på befolkningsnivå cellen.

Flere andre eksperimentelle tilnærminger har blitt utviklet for å vurdere membranen resealing mekanismer. For eksempel mekanisk avbrudd ved microneedle punktering, perle slitasje og laser ablasjon har blitt brukt til å modellere mekanisk membran skade. Måling av såret/reparasjon involvert fluorescens mikroskopi eller flow cytometri kvantifisere oppføringen av fluorescerende sonder (FM 1-43, propidium iodide, fluorescein-konjugerte dextrans) eller sporing fluorescerende protein chimeras47 ,48,49,50. Hver av disse metodene har sine egne fordeler; men er de ikke mottakelig for høy gjennomstrømming screening i levende celler som presenteres i denne analysen.

Nåværende analysen var optimalisert for å analysere resealing effektivitet celler såret av pore-forming protein LLO, som former store porer som tillater Ca2 + tilstrømningen som provosert av mekanisk brudd i plasma membranen. Selv om pore-forming miljøgifter representerer en form for plasma membranen skade, reparasjon av store gift porene og mekanisk sår ble foreslått å dele felles Ca2 +-avhengige baner17,51. Det er viktig å merke seg at LLO samspillet med celle membran komponenter som kolesterol kan påvirke celle signalisering og dermed kan påvirke membran resealing mekanismer sammenlignet med mekanisk sår. Vår kunnskap om membran reparasjon er fortsatt begrenset videre studier er nødvendig for å etablere hvis resealing av mekanisk sår avviker fra resealing etter dannelsen av gift porene. Det er flere fordeler med å bruke LLO. Først kan oppstart av membran skade synkroniseres ved å heve temperaturen fra 4 til 37 ° C. Andre, løselig form av LLO (ikke bundet til cellemembranen) irreversibelt samler på nøytral pH og 37 ° C, dermed begrense cytotoksiske effekter og lertid måtte vaske cellene. Til slutt, graden av skade kan justeres ved å variere konsentrasjonen av giften. En begrensning av denne analysen er imidlertid temperaturbryteren mellom 37 og 4 ° C, som kan påvirke reparasjon mekanismen som vesicula transport, endocytose og membran flytende, blant andre prosesser, som er påvirket av temperatur52, 53,54. Det er viktig å kontrollere at alle farmakologiske hemmer inkludert i analysen ikke forstyrrer dannelsen av LLO porene ved å utføre en hemolyse analysen i nærvær (i motsetning til fravær) av narkotika55. Fordi potensielle satsvise forskjellene i LLO aktivitet er det viktig å forberede et lager av LLO som er stor nok for en høy gjennomstrømming skjermen55.

Vi inkludert bruk av celler som uttrykker kjernefysiske lokalisert Histone-2B-GFP chimera å nummerere celler før og etter membran reparasjon analysen via mikroskopiske imaging etterfulgt av automatisert bildeanalyser. Viktigere, tilsvarende cellen teller over betingelser og uforanderlige celle teller før og etter kinetic analysen er avgjørende når PI eller CNABD fluorescens intensiteter kan lett normaliseres. Faktisk vil en aldersforskjell celletall resultere i forskjeller i graden av skade av en gitt konsentrasjon av LLO, som ikke kan korrigeres for via fluorescens normalisering på grunn av variasjoner i resealing effektivitet (figur 7). Vi viste at Histone-2B-GFP uttrykk ikke forstyrrer PI eller CNABD innlemmelse eller fluorescens utslipp. PI eller CNABD innlemmelse påvirker derimot ikke GFP-baserte celle opplisting. Hvis andre kombinasjoner av fluorophores brukes, vil det være nødvendig å vurdere potensielle spectral overlapping mellom fluorochromes, som ble utført i dette arbeidet. Selv om PI er mye brukt til å måle membran skade, viser vi at CNABD er en utmerket erstatning som viser høyere fluorescens quantum avkastning, noe som resulterer i et større dynamisk område egnet for å karakterisere resealing effektivitet.

Z-faktor og SSMD bekreftet at denne analysen har robusthet nødvendig å utføre høy gjennomstrømming analyser. Beregningen av resealing effektiviteten er en kritisk og pålitelig verktøy for å identifisere mulige treff. I tillegg kan blandet effekter modell brukes som et statistiske verktøy for å evaluere treff i en singel-analysen. Eksperimentell planen må inneholde minst tre tekniske gjentak hvis skjermen kan gjentas flere ganger. Quadruplicates bør brukes hvis statistiske verktøy, som blandet effekter modell, er i et enkelt eksperiment, hvorvidt det skal gjentas. Det anbefales imidlertid å utføre skjermen flere ganger og validere resultatene ved utføring av supplerende eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner Dr. Jesse Kwiek (Ohio State University) for vennlig tillater oss å bruke hans Multi-mode oppdagelsen plattform for noen foreløpige eksperimenter. Forskning i denne artikkelen ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer i National Institutes of Health prisen nummer RO1AI107250 til Stephanie Seveau. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 143 Plasma membran resealing membran reparasjon muskeldystrofi propidium iodide carbocyanine nukleinsyre bindende fargestoff pore-forming gift listeriolysin O
Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter