Summary
ここで細胞の蛍光イメージング解析による効率を再封止膜を測定する高スループット蛍光を用いた測定について述べる。この試金は、薬や哺乳類細胞における原形質膜を再シールするターゲット遺伝子をスクリーニングするために使用できます。
Abstract
彼らの生理学的環境で哺乳類細胞はしばしば細胞膜損傷力学的および生化学的ストレスにさらされます。これらの損害に対し、複雑な分子機械は急速にそのバリア機能を回復し、細胞の生存を維持する細胞膜を再シールします。にもかかわらず、この分野の研究の 60 年間、我々 はまだ機械を再シールする細胞の完全に理解を欠いています。細胞成分の同定の目的とその制御膜を再シールまたは、再シールを改善できる薬開発した哺乳類細胞における効率を再封止膜を測定する蛍光ベースの高スループット試金マイクロ プレートで培養しました。細菌の孔形成毒素リステリオリジン O (LLO) は、大規模な 30-50 nm 径のタンパク質はコレステロールを含むの細孔を形成するのにさらされている細胞膜損傷のためのモデル システムとして膜。温度制御マルチモード マイクロ プレート リーダーは、明視野観察と細胞の蛍光顕微鏡との組み合わせで迅速・高感度カルバゾール測定に使用します。膜非透過性核酸結合の螢光によって放射される蛍光強度の速度論的解析および効率を再シールするセルの計算を可能にするセルの人口レベルで再封止膜の範囲を反映します。.蛍光顕微鏡イメージング恒常蛍光核蛋白質ヒストン 2 の b の数の潜在的な変化を考慮するマイクロ プレートの各ウェルに、キメラを表現でき、最終的な細胞の列挙が可能します。異なる細胞集団の同定。この高スループット試金は、宿主遺伝子のスクリーニングを介して膜修復メカニズムの私達の理解を拡大するまたは追加外因の強力なツールは、その制御膜を再シール化合物です。
Introduction
哺乳類細胞膜の完全性の損失で、その結果機械、浸透、および生化学的ストレス予告があります。迅速かつ効率的な再封止、なし損傷した細胞プログラムまたは壊死死にすぐに屈する。プロセスを再封止膜を理解する努力は、1960 年代以降、その機能障害に関連付けられている壊滅的な結果によってが動機になっています。確かに、ベイジュ症候群、糖尿病、肢帯型筋ジストロフィーなどの病気は、突然変異遺伝子符号化ジスフェリン、高度の glycation の最終製品の生産や欠陥による欠損細胞膜修復にリンクされています。ライソゾーム人身売買レギュレータ CHS1、それぞれ1,2,3,4,5,6。しかし、まで、膜の私達の理解を再シールはまだ限られた7です。初期の研究は、細胞外 Ca2 +膜破損した8,9,10までの流入によって膜を再シールを開始することを示しています。その後、いくつか非相互に排他的な Ca2 +の細胞を再シールするのに依存のメカニズムが提案されています。パッチの仮説は、傷口に近接、細胞内小胞がお互いとパッチ11,12,13,14として破損した細胞膜融合を提案します。2 番目のモデルは、カルシウム依存性の開口放出を提案する傷をリソソームのサイト リリース ライソゾーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼは、スフィンゴミエリンをセラミド細胞膜の外側のリーフレットに変換します。脂質組成の変化は、損傷領域15,16,17のセラミド駆動エンドサイトーシスの結果します。最後に、3 つめの提案されたメカニズムには、エンドソーム並べ替えを複雑なトランスポート (ESCRT) 膜18から発芽する外向きの小胞の形成を促進するために必要な役割が含まれます。蛋白質の限定セットのみがこれらのモデルで識別され、その機械をさらに解明する必要があります。
ここ付着性哺乳類細胞における効率を再封止膜が損傷を受けた措置を介する遺伝子組換えリステリオリジン O (LLO)19高スループット試金を記述します。LLO リステリア菌20,21,22通性細胞内病原体によって分泌される孔形成毒素 (PFT) を MACPF/CDC に属する (膜の攻撃の複合体、パーフォリンとコレステロール依存性 cytolysin) スーパーファミリー。MACPF は、哺乳類の気孔形成グラム陽性の病原体の病原性ライフ スタイル23を促進するために宿主細胞に損傷を与えるプロデュース CDCs 主に細菌毒素に対し免疫防御に関与するタンパク質。CDCs は水溶性モノマーとして合成される化や細胞膜に存在コレステロールに結合する二量体まで 50 サブユニットの孔形成前の複合体に oligomerize複雑な prepore は、直径24,25,,262730-50 nm にわたる β バレル型細孔を形成脂質全体の β ストランドを挿入するのには、再配置します。 これらの大きな毛穴がセルのうちイオンと小型携帯電話部品のフラックスを許可します。しかし、いくつかの研究は、小さいサイズの細孔が形成された28,29,30も提案しています。CDCs、間 LLO ハイスループット解析31,32を助長している不可逆的な pH と温度依存性の集計を含む固有のプロパティが表示されます。LLO は 4 ° C、孔複合体の形成ではなく、細胞への結合に許容温度で細胞培養液に追加できます。ポア形成の開始は、細孔生成に関与するフォーム オリゴマーに膜面での毒素分子の効率的な拡散と構造改造を許可する、37 ° C に温度を上げることによって、同期できます。したがって、細胞の損傷の運動、温度スイッチ、次は、細胞膜にバインド毒素の量に依存します。重要なは、水溶性 LLO (細胞膜にはバインドされていない) 迅速かつ不可逆的集約温度 37 ° C、非連結の毒素分子を離れて洗浄する必要性を軽減し、時間をかけて膜損傷の程度を制限に達したとき。最後に、LLO コレステロール バインド コレステロール豊富な膜で毛穴を形作るため、この試金は哺乳類細胞の広い範囲に従う。おいて LLO ホスト細胞の気孔の形成を介して主にシグナル伝達に影響を与えることが重要です間隙に依存しないセルのいくつかの例外を持つシグナルが発生する33,34,35,36 ,37,38,39。したがって、ことはできませんその LLO 活動は細胞膜修復のプロセスに影響を及ぼす信号を除外します。
この試金は直接セル、セル非透過性螢光色素 (例えば、ヨウ化 propidium) 受動的負傷者の細胞に入ると核酸に関連付けられると、高輝度になります定款を測定することにより負傷の程度を評価します。.したがって、螢光色素は細胞を傷つけるのリアルタイム解析をできるように、実験を通して細胞培養培地で維持できます。核酸結合色素の蛍光強度は毒素の濃度が増えるし、毒素の濃度が増加時間をかけてすべての細孔が形成され、細胞は完全に修復されか、飽和に達するまで。細胞外 Ca2 +膜の気孔を通して流入は、再封止かやりイベントです。したがって、resealing の効率が直接判明しない細胞 Ca2 +で負傷する Ca2 + (修理寛容な条件) を含む培地の負傷を比較して-無料媒体 (修理制限条件)。核酸結合色素の蛍光強度は直接各ウェルの細胞濃度に比例しているので、すべての井戸で同じ濃度でシード セルに重要です。また、細胞の剥離が発生しないこと、フローティングとして集計されるセルは、データの解釈を複雑にするかもしれない蛍光測定値を隠すことができるように試験の前後に、各ウェルの細胞を列挙することが重要です。細胞を列挙するには、ローカライズされた核ヒストン 2B GFP (H2B GFP) を発現する細胞は、この試金で使用されました。温度制御、マルチモード マイクロ プレート リーダー迅速、高スループット計測計測を組み合わせる (96 または 384 ウェル プレート フォーマットを使用して) 蛍光強度の 37 ° c. で生きている細胞の顕微鏡イメージングの後者は細胞数を列挙し、異なる細胞集団の最終的な形成を観察に使用できます。
最終的には、この試金はホスト分子のスクリーニングによって膜修復機構の複雑さの彼らの知識を拡大する機能をユーザーに提供または外追加化合物膜を制御する修理します。次のプロトコル LLO 細胞の resealing の効率を測定する実験の手順を説明し、ある薬剤または再シール効率で細胞治療の効果を評価します。
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Protocol
1. 準備
- 電池めっき
注: ひと子宮頸の上皮細胞、hela 細胞、hela 細胞のヒストン 2B GFP (H2B GFP) を表現するがこのプロトコルで使用されていたが、この試金は他の哺乳類細胞19に合わせることができます。- 0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL で細胞を洗浄することにより付着性のセル 75 cm2細胞培養用フラスコからをデタッチします。新鮮なトリプシン-EDTA 0.25 %2 mL に使用されるトリプシンを置き換えます。
- セルが丸みを帯びた、フラスコから切り離されるまでは、5 分の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
- 8 mL の培 (10% 熱不活化牛胎児血清、100 U/mL ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストレプトマイシンを含む DMEM) に細胞を再懸濁します。
- 診断および細胞懸濁液の 10 μ L を使用してセルの濃度を決定します。
- 2.55セル/mL の 10 倍濃度の培地に細胞を希釈します。
- 滅菌ピペット盆地に細胞懸濁液を注ぐし、10 mL の血清ピペットを使用して懸濁液を徹底的にミックスします。
- 12 マルチ チャンネル ピペットと 200 μ L のヒントを使用すると、96 ウェル フラット、明確な底、黒ポリスチレン培養処理板で 3 通 (または 4 連) の HeLa 細胞 (104セル/100 μ L/ウェル x 2.5) を配布します。
注: めっきの配置は、図 1の例として提示されます。 - 37 ° C、5% CO2で加湿細胞文化のインキュベーターで 24 時間培養します。
- 貯蔵液の準備
- ハンクス平衡塩類溶液, MgCl2 (5 mM) の 0.476 g 95 g を追加することによってバッファー M (M1 と M2 を準備するために使用) の 10 x の在庫の 1 L の準備と水 900 mL に HEPES (100 mM) の 23.83 g。PH 7.4 に調整し、1 l. フィルター滅菌にボリュームを上げます。
- 11.26 g d-(+) を追加することによってグルコース (1.25 M) 在庫 x 50 の 50 mL を準備-血糖値が 50 mL の水の合計。フィルター滅菌ソリューションです。
- 0.666 CaCl2 g を 50 mL の水の合計に追加することによってカルシウムの (120 mM) 在庫 × 100 の 50 mL を準備します。フィルター滅菌ソリューションです。
- エチレング リコール-bis(2-aminoethylether)-N, N, N の在庫を (50 mM) x 10 の 50 mL を準備 '、N'、グリコールエーテルジアミン四酢酸の 0.951 g を水 40 mL に追加することによって四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)。8、グリコールエーテルジアミン四酢酸を分解する NaOH を使用して pH を増加し、50 mL にボリュームを上げます。フィルター滅菌ソリューションです。
- 単一の 96 ウェル プレート、中 1 の 50 mL を準備 (M1、含んでいる Ca2 +)、中 2 の 50 mL (M2、Ca2 +-無料)、それに応じて、グリコールエーテルジアミン四酢酸を添加した培地 2 の 15 ml:
- M1 の 43.5 mL の水に 5 mL のバッファー M、100 x CaCl2, 0.5 mL と 50 x グルコースの 1 mL x 10 を追加します。
- M2、44 mL の水に 5 mL バッファー M x 10 と 50 倍のブドウ糖の 1 mL を追加します。
- M2/グリコールエーテルジアミン四酢酸、追加 10 バッファー M x と 10 の 1.5 mL の 1.5 mL 12 mL の水を x EGTA。
注: propidium ヨウ化 (PI) を含むすべてのソリューションは、直接のセルを追加する前に準備されるべき。
- プレート リーダー/イメージングの Cytometer 設定
メモ: 検出の 2 台搭載マルチモード プレート リーダーを使用して: 蛍光とイメージングの cytometer。退色、蛍光物質を避けるために蛍光露出を制限します。- 事前分析を実行する前に 37 ° c プレート リーダーを暖かきます。
- したがって運動の試金のためのパラメーターを設定設定モード内。
- 光学構成の単色光分光器、 FL (蛍光)、および運動をします、読み取りモード、およびそれぞれの種類を読みます。
- 波長の設定] の下で、9 と 15 nm 励起と放射バンドパスをそれぞれ選択します。試金による (PI)、535 と 617 nm それぞれ励起と放射の波長を設定します。
- [板タイプ] プレート形式と黒壁明確な底板に対応する事前設定板構成の96 ウェルを選択します。
- 読み取りエリアの下には、運動を通して分析する井戸を強調表示します。
- [光電子増倍管、光学、プリセット6の読み取りあたり点滅し下から読み取りのチェック ボックスをオン。
- 「タイミング、 00:30:00 30 分運動の試金ための実行時間の合計ボックスでし間隔の00:05:00を挿入します。
注: たびに、ポイントし、1 つの波長完全 96 ウェル プレートの読書時間は 30 秒。 - 右側に設定情報で指定した設定を確認し、 [ok]を選択します。運動を開始するプレス読み取りを実行します。
- 撮像パラメーターを適宜設定設定モード内。
- 光学構成のMinimax、イメージング、およびエンドポイントを選択、読み取りモード、およびそれぞれの種類を読みます。
- 波長、下ボックスをオン透過光を、いずれかまたは両方、蛍光 456/541 の励起・発光波長に対応する nm (GFP) と 625/713 nm (PI)。
- 1.3.2.3 と 1.3.2.4 の手順で定義されているプレート型読み取りエリアの同じオプションを使用します。
- 圏域の設定も、[イメージを作成するも内のサイトの数を選択します。
注: 12 のサイトは、完全によく画像に対応します。 - [画像集録設定、透過光、541 (GFP) と 713 (PI) の露光時間を選択します。GFP の 20 ms/画像の露光時間でも全体をイメージします。送信される光 (TL) と PI 蛍光 8 ~ 20 ms の露光時間で各ウェルの中心の単一のイメージをそれぞれ取得します。
- 右側の設定情報で指定した設定を確認し、 [ok]を選択します。96 ウェル プレートの各ウェル (12 画像/井戸) の表面全体を撮像と一つの波長の同期捕捉時間は 〜 15 分押して読み取りイメージングを開始します。
注: 96 ウェル プレートの単一のイメージ/井戸の取得時間は 1 つの波長の ~2.5 分/プレートを必要があります。上記のパラメーターは、当研究室では、特定の機器に対応します。カルバゾール測定: 1.0 nm 増分励起波長 (250 850 nm) 調整可能な 9 や 15 nm のバンドパスを表示するキセノン フラッシュ ランプ、光電子増倍管検出器 > 6 ログ ダイナミック レンジと調節可能な 15 または 25 nm の発光帯域通過。イメージングの cytometer: 白色光、460 のことができる、照明光源 nm と 20 nm のバンドパス、541 を中心とした排ガス浄化で 625 nm 励起波長 nm (108 nm バンドパス) と 713 nm (123 nm バンドパス)、それぞれ、4 X 目的が 1.25 に結合し、メガピクセルカメラ 12 ビット電荷結合素子。
2. アッセイ
注: 試金の時に、細胞は 70-90% の合流をする必要があります。洗浄手順の間に媒体をから削除され、よく (直接ではなく上記のセル) の側壁に適用する必要があります。3.1.5 のステップまでその凝集を予防する < 4 ° C で LLO の温度を維持します。
- 30 μ M PI M1 の在庫を準備し、M2 の 30 μ M PI の在庫で 37 ° C に加温します。
- プレート 12 マルチ チャンネル ピペットと 200 μ L ヒントを次のように使用して 1 のセルは水洗いしています。
- 修理許容条件の 37 ° C に加温 200 μ L/ウェル M1 で 2 回細胞成長培地と洗浄を削除します。培地を 100 μ L/ウェル暖かい M1 の 30 μ M PI を含むに置き換えます。
- 制限条件を修復、成長培地を取り除き、5 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸キレート Ca2 +、200 μ L/ウェル M2 と 1 洗浄の順を含む 200 μ L/ウェル暖かい M2 と一度セルを洗浄します。100 μ L/ウェル暖かい M2 30 μ M PI を含む媒体を交換してください。
- 成長媒体の洗浄および propidium ヨウ化物を含有する培地に置き換え後は、直接 2.1.3 をステップに移動します。
- 画像板 1 透過光、GFP と PI の下 1.3.3 (事前運動) の下のとおりです。この手順は、15-20 分かかります。
- 2.1.3 の手順で 15 分間プレート 12 マルチ チャンネル ピペットと 200 μ L ヒントを次のように使用して 2 の準備します。
- 氷の上の 96 ウェル丸底ポリプロピレン マイクロ プレートを配置します。1 (図 1) をプレートに対応する、実験的なデザインを使用してプレートを構成します。
- 修理許容条件追加 100 μ L/ウェル冷たい M1 の 60 μ M 100 の添加に続いて、PI を含む μ L/ウェル冷たい M1 の 4 LLO x かコントロールが含まれています。
- 修理制限条件追加 100 μ L/ウェル冷たい M2 の 60 μ M 100 の添加に続いて、PI を含む冷たい m 2 含む 4 LLO x またはコントロールのための μ L/ウェル。
- イメージング プレート 1 (2.1.3 ステップ)、すぐに後氷との直接接触からプレートを分離するアルミ箔を使って氷の上に配置します。プレート 1 5 分間クールダウンを許可します。
- 12 マルチ チャンネル ピペットと 200 μ L のヒントを使用して、対応する井戸に板 1、2 (ステップ 2.1.4) プレートに各ウェルから 100 μ L を転送します。プレート 1 のメディアで毒素を正しく配布するには、メニスカスの下のヒントを挿入し、軽く気泡を導入することがなく、ボリュームを取り出します。
注: はない上下、ピペットのセルを切断可能性があります誤ってこれとして。 - セルにバインドし、すぐに板 1 を蛍光モード (ステップ 1.3.2) を使用して、測定用のプレート リーダーに転送する毒素を許可するようにさらに 1 分間プレートを残します。
- 運動アッセイの終わりには、1.3.3 をステップすぐにプレート 1 (運動後) を用いた画像。
3. 解析: セル列挙
- 核蛍光マイクロ プレート セル列挙ソフトウェアを使用してに基づく細胞数を決定します。
- 設定内で再分析を選択し、画像分析の設定の [カテゴリ] セクションの下で控えめなオブジェクト解析波長として541を使用してオブジェクトを検索するを選択します。
- 画像上に描画を方法を見つけることを使用してオブジェクトを検索し、オプションで [設定] タブで、核を選択し、適用を押します。
- [Ok] 、読み取りカウント アルゴリズムはセルを起動するを押します。
- また、このようなツールがない場合は、細胞を列挙する ImageJ など画像解析ソフトを使用します。
- ImageJ でスタックとして画像ファイルを開きます。
- メニュー バーでは、種類覆いかぶさるのイメージをクリックしてスタックを 8 ビットのグレースケール画像に変換し、 8 ビットを選択します。
- 背景を減算: メニュー バーのクリック画像調整、ホバーし、明るさ・ コントラストを選択します。バック グラウンド ノイズを削除し、選択適用する最小値を調整します。
- バイナリ画像を作成するしきい値: メニュー バーのクリック画像調整、ホバーし、しきい値を選択します。暗い背景、最小値と最大しきい値を調整し、適用をクリックします。
- 核をオーバラップ セグメント核へ流域のツールを使用できます。メニュー上でバイナリのプロセスをクリックし、流域を選択します。
注: これは自動的に接続された核が分離されます。 - (サイズと真円度) 核の同定を絞り込むし、細胞の残骸を除外するユーザー指定の基準を適用することによってマスクされたイメージを分析します。
- メニューとし、分析粒子分析をクリックします。目的のサイズを設定 (ピクセル ^2)、(1 の値は完全な円) 真円度の範囲を個々 の細胞核を含めるだけで十分です。
- 表示」ドロップ ダウン ボックスで必要なオプションを選択し、集計の方法、 OKセル数を得ることをクリックします。
4. 解析: 運動曲線
- プレート リーダー ソフトウェアから速度論的データを分析データ ソフトウェアに転送します。
- 各条件では, 対応する標準偏差と実験条件ごとに平均の標準誤差、各 timepoint で複製の蛍光強度の平均値します。
- 実験条件ごとに対応する運動曲線をトレース: PI 強度 (y 軸) と時間 (x 軸) です。
- 与えられた治療条件の resealing の効率を計算するには、(AUC) 曲線の下の領域を計算の + M1 の LLO (AUC(M1)) と + M2 の LLO (AUC(M2))。再シールの効率 (E) を評価するために以下に示す方法を使用します。
- 以下に示す効率比 (REff) を決定することによりコントロールとテスト治療の比較を実行します。
REFF = 1、テスト治療は修復に影響を与えません
REFF < 1、テスト治療の修復を阻害します。
REFF > 1、テスト治療改善修理 - 次の方程式を使用して曲線の下の領域を計算します。
、k はフォロー アップの合計数。
、k はフォロー アップの合計数。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
細胞数測定精度: HeLa 細胞は膜修復機構を探索、モデル哺乳類セルラインとして頻繁に。セルの人口レベルの細胞膜修復を評価し、適切なデータ解釈のすべての井戸で同じ濃度で細胞をプレートすることが重要です。また、井戸の間で、細胞数が同等である試金の時に確認することが重要です。恒常ヒストン 2B (H2B GFP) GFP の融合を表現する HeLa 細胞は、自動的にその蛍光核の検出に基づく細胞を列挙するこのアッセイで導入されました。セル列挙体の精度を確立するには、二重のシリアル希薄 H2B GFP HeLa 細胞の 96 ウェル プレートで帳票と 4 時間培養メッキだった。この時間の長さは細胞接着のための十分な限られた細胞分裂を提供しています。透過光 (TL) の下で完全な井戸をイメージしましたし、GFP 蛍光イルミネーションと細胞数は GFP 蛍光プレート リーダーの解析ソフトウェア (図 2 aおよび2 b) を使ってに基づいて評価しました。細胞播種濃度に対してプロットした平均セル数 ± 標準偏差とベスト フィットのラインに播種、(図 2) の計数の正確性を示す細胞に細胞数の 1.08:1 比が示されています。すべて運動アッセイの前に井戸のイメージング、細胞数がすべての井戸の中で一貫していることを確保できます。また、運動アッセイ後井戸の画像、によって 1 つはかどうか、毒素への暴露が原因で細胞の剥離を確立できます。
GFP の発現が (IPI) propidium ヨウ化 (PI) の強度の測定と干渉しない: H2B GFP 原子力協会が PI 定款又は PI 蛍光強度測定 (IPI) 私はPIと干渉しないように有意にさらされた hela 細胞と HeLa H2B GFP の細胞にまたはない、1 nM LLO (図 3)。PI の不在、hela 細胞、HeLa H2B-GFP PI 蛍光発光フィルターを通して GFP を取除かないことを示す背景の蛍光性の同様に低レベルがあった。PI、しかし LLO の不在、存在下で hela 細胞と時間で変化しない HeLa H2B GFP の両方で似たような基底 PI 蛍光性の放出があった。これは GFP の発現が PI 蛍光の測定に影響を与えないことを確認、PI が実験の期間を非ダメージを受けた細胞を浸透していないことを示した。LLO 添加 hela 細胞、HeLa H2B GFP に類似していた時間をかけて PI 蛍光の増加をもたらした。この増加は、核酸と PI の関連付けと組み合わせると LLO によって負傷した細胞によるものです。一緒に、これらの結果を確立 PI 定款又はその蛍光の測定、ヒストン 2B GFP の発現が影響しません。
PI 蛍光が GFP 基づかせていた細胞数と干渉しない: 相互、PI 傷ついた細胞核定款が GFP 基づかせていた細胞数と干渉しないことを確認することが重要だった。Hela 細胞、HeLa H2B GFP の代表的な蛍光画像公開 1 nM LLO PI の存在下で期待される (図 4 a) としてのポスト動態の PI の傷ついた細胞の蓄積があったことを示しました。イメージングでは、PI が GFP 蛍光検出 (図 4 aおよび表 1) が写りも明らかにしました。この蛍光クロス オーバー最高 GFP を発現していないが、まだ緑蛍光核 (図 4 a) を表示する HeLa 細胞の運動後の画像で高く評価されました。このクロス オーバーは、大幅増加運動後に事前運動 (図 4 b) と比較して HeLa H2B GFP の細胞で、(I はGFP) GFP の蛍光強度の測定によって証明される可能性があります。重要なは、セルカウント核の列挙に関与するセグメンテーションのプロセスは GFP 蛍光 (図 4) の増加によって影響を受けるために、PI 蛍光クロス オーバーは影響しません。
測定効率を再封止膜: このセクションで膜を再シールの効率を測定するために使用する基本的な方法論を提案します。膜を再シールのプロセスを証拠に H2B GFP HeLa 細胞にさらされた、かどうか、1 nM LLO (M1) 有無 (M2) の細胞外 Ca2 + (図 5)。LLO の不在で期待どおりに私はPIは M1 と M2 で一定。Ca2 +添加 LLO-PI 蛍光強度 (IPI) 着実に増加の結果媒体を含んでいる細胞外 Ca2 +の不在では、PI 蛍光の著しく急増加を反映して、膜を再シールの不在。M1 M2 を基準に修復する細胞の能力として定義されている resealing の効率を評価する (ステップ 1.5.4.1) (AUC) M1 と M2 の曲線下の領域を求めたし、する 0.287 修理 (E) の効率を求めた。
PI に代わる: PI は普遍的膜損傷のマーカーとして使用されています。ただし、この試金のために適している他の核酸結合色素があります。たとえば、膜非透過性 carbocyanine 核酸結合色素 (CNABD) 展示遠赤に達する発光スペクトルと高い特異性は、二本鎖 DNA。PI はその一方で、DNA と RNA の両方の40,41をバインドします。PI とは異なり励起と CNABD の発光スペクトルと重複しない 2 つの蛍光色素間よりよいスペクトル分解能を可能にする GFP の。さらに、このプロトコルで使用される CNABD は、消散係数倍 pi の意味、各励起波長この染料は、PI よりエネルギーを吸収することができるより強力な蛍光性の放出の結果します。この染料が大規模な蛍光のダイナミック レンジを示すことを示した CNABD と GFP の画像の定量解析は GFP 蛍光の波長で大幅に排出しないし、細胞数 (図 6A-D) には影響しません。確かに、H2B GFP HeLa 細胞 CNABD M1 または M2 培地で培養し、1 被災 nM LLO 展示 4 5.5 倍の増加私CNABD非破損しているコントロールを基準としてそれぞれ (図 7 a)。比較については、セル 1 に公開 nM LLO PI の存在下ではそれぞれ M1 と M2 の PI 蛍光強度の 2.5-3 倍の増加を展示 (図 5)。PI のように M1 の LLO 濃度を増加させると蛍光強度の増加 CNABD 展示 (図 7 a) 1.5.4.1 (図 7 b) の手順の説明に従って結果の修理効率を求めた。今回はその LLO 濃度増加と効率低下を再シールするセルを報告します。この現象は、細胞が過剰な損害を発生させたときに再シールするための能力を減少させるという事実を反映しています。
膜修復アッセイの品質評価: 任意のアッセイの重要な側面は、その堅牢性や検出および正と負のコントロール間の相違点を解決する機能します。正と負のコントロールとの間の信号の変化には、十分なダイナミック レンジと再現性を表示しなければなりません。この膜修復アッセイの正と負のコントロール、それぞれ修理寛容 (M1) と修理厳しい (M2) 条件、LLO にさらされているセルです。2 つのアプローチは、この試金高スループット分析のためのロバスト性を評価するために撮影されました。Z 係数やウィンドウ係数をスクリーニングを特定の条件セットを大提供して かどうかを決定するまず、信号の変動を考慮して十分なダイナミック レンジ。Z 係数 0 の範囲内で < Z ≤ 0.5、0.5 < Z ≤ 1 が受け入れられ、非常に良いアッセイ、それぞれ42,43に対応します。品質評価のための Z 係数を使用しての制限は、テスト条件は通常極端な正と負のコントロールと比較してより適当な値を示すことです。したがって、2 番目の方法として我々 は修飾 Z 係数44 に基づいて否定的な結果として分類されるそれ以外の場合の実験条件の違いを識別することができます厳密に標準化された平均差 (SSMD、β) を計算 ,45。SSMD 値は効果なしに至る効果の強さに分類できる (β = 0) に非常に厳密な (β ≥ 5)。M2 条件と M1 の比較のため図 7Aと AUC からのデータを使用して、0.25、0.5 nm LLO 露出生産 Z 係数 β と 0.137313、0.3100813 = 6.0672 と 4.803308、それぞれ、LLO 濃度のウィンドウであることを示すアッセイに最適です。1 を超えて LLO の濃度が増加すると nM、ギャップCNABDで M1 と M2 の条件間の運動曲線を閉じます Z 係数 SSMD の大幅に削減値 (図 7 b) の結果します。LLO のような高濃度は修復可能性が損傷が増加し、従って細胞膜修復に関与する要因を識別するに測定の使用を否定条件に対応します。これをさらに修復効率 (E) LLO 濃度増加 (図 7 b) の減少によって示します。3 生物的複製と (Z 係数、SSMD、および E) のすべてのデータが生成されたし、3 技術が分析検証の実験条件ごとにレプリケートします。一緒に、これらのデータは、この試金が LLO 濃度 1 に劣る高スループット試金のための予想の堅牢性を持っていることを示して HeLa 細胞の nM。
原則の証拠: アッセイの堅牢性が確立されると、我々 はこの試金は感度と分解能の修復プロセスの欠陥を識別するために、原則の証拠として追加実験を行った。また、我々 は生物 3 未満を伴うことがあります大画面内「ヒット」を識別するためにスクリーニング プロセスを複製するように高スループット試金が使用されていると見なされます。したがって、それは適切な実験的なデザインでは単一のアッセイ内の「ヒット」を識別する検出力を提供しています。したがって、単一の実験の統計的検出力を高めるため 4 技術的複製に対応するため、高速画面の下アッセイのレイアウトを調整できます。セル 4 連でメッキされた、デシプラミン、細胞膜修復15,17 の役割を担うリソソーム タンパク質酸性スフィンゴミエリナーゼ (ASM) の薬理学的阻害抗体の前に前処理の 1 h をしました。、46。重要なは、デシプラミンと治療は、アッセイは、デシプラミン処理し、無処理細胞 (図 8 a) の適切な比較を可能にする全体の細胞数に影響しませんでした。デシプラミン処理細胞で ASM の阻害は、E と REff (図 8 bと8 C) の減少によって示されているように、LLO への露出に効率を再封止膜の欠陥で起因しました。混合効果モデルを使っての比較デシプラミン処理を 0.25、0.5 nM の M1 の LLO 0.0010 と 1 x 10-10の p 値を示した非投与細胞。一緒に、データは 0.25、0.5 nM LLO ハイスループット実験的設定の修復の欠陥を識別するために適切な濃度、一度単一の実験の可能な統計解析と技術の複製 4 つに増加していることを示す.注 4 連間の混合効果モデルの統計的アプローチは複数の生物間で潜在的な変動を考慮されないことをレプリケートします。1 つの生物の複製を使用して任意の重要な調査結果は、追加の実験設定で検証すべき。
図 1: 実験的なデザイン。フロー図は、代表的なプレート デザイン コントロール非処理細胞と比較すると 7 つのテスト条件の効果をテストするように構成を示しています。例薬車に関しては、適切な場合、追加のコントロールが含まれます。細胞 (1) 24 時間実験前のプレートします。37 ° C に加温 M1 または M2 の中で実験の日、板 1 のセルの洗浄は、プレートがイメージ (TL、GFP および PI 蛍光) 事前運動。イメージング、試薬の 15 分間は、プレート 2 に氷に追加されます。イメージング後、プレート 1 はすぐに 5 分間氷上に置いた、100 μ L/ウェル プレート プレートに 1 2 から転送されます。1 プレートは、プレート リーダー (TL、GFP、および PI 蛍光) をイメージングに続いて、30 分の 37 ° C で速度論的分析を実行するに配置されます。データは、セルをカウントし、すべての実験条件で修理効率を評価する分析しています。大量データの分析を自動化できます。また、高スループットの画面で 4 技術的複製の数を増やせます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 測定精度のセル。指定された濃度でトリプリケートで GFP タグ ヒストン 2B を発現 HeLa 細胞を播種されました。(A) 細胞を透過光 (TL) 下 37 ° C でイメージしましたし、GFP 蛍光 (12 画像/ウェル) とセル検出アルゴリズム (紫) で個々 の核の線引きに使用されました。スケール バー = 1 ミリメートル。 (B) 細胞検出 (パープル) 像 (拡大 2 X)、GFP、TL の高倍率。スケールバー = 100 μ m。(C) 画像解析ソフトウェアを用いてカウントを初期に対してプロットしたセルのセル数をカウントするセル播種濃度です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Propidium ヨウ化蛍光測定、ヒストン 2B GFP 発現の影響を受けません。ヒストン 2B GFP 表現と非発現 HeLa 細胞にさらされた、かどうか、1 nM LLO (実線) の存在または不在 (破線) Ca2 +で 30 μ m PI-媒体 (M1) を含んでいます。運動アッセイは、37 ° C で 30 分の 5 分ごとの蛍光分析法による PI 蛍光強度を測定データは、平均 PI 蛍光強度 (IPI) 相対的な蛍光ユニット (RFU) ± SEM で表現 (n = 3 の独立した実験、トリプリケートでそれぞれ行われます)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: セル列挙は PI 蛍光による影響を受けません。(A) 代表的な前と後の運動イメージ (TL、PI および GFP) 細胞、またはない、1 nM M1 の LLO。スケールバー = 100 μ m。(B) 定量的蛍光顕微鏡による解析 (私はGFP± SEM) セルが LLO (運動後) で負傷した時に PI 核定款による増加 GFP 蛍光測定を明らかにしました。(C) GFP 基づかせていた細胞列挙された GFP 強度の増加によって影響を受ける。ウェルあたりの細胞数は平均 ± SEM. として表現された (で B と C の黒バー事前運動データを = 赤いバー後反応速度データを =; n = 3 の独立実験トリプリケートでそれぞれ実行; 2 尾スチューデントの t 検定を用いて定量分析取得した画像から強度と細胞数 * * p < 0.01)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 効率を再封止膜を測定します。ヒストン 2B GFP 発現 HeLa 細胞にさらされた、かどうか、1 nM LLO で Ca2 +-(M1) を含むまたは Ca2 +-30 μ M PI を含む無血清培地 (M2)。速度論的データは相対的な蛍光ユニット (RFU) ± 37 ° C で 30 分間測定、SEM で PI 蛍光強度 (IPI) を表すn = 3 の独立した実験、トリプリケートでそれぞれ行われます。プロトコル手順 1.5.4 で示されているように、resealing の効率を測定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: Carbocyanine 核酸膜を再シールを査定する代替色素として染料をバインドします。H2B GFP HeLa 細胞にさらされた、かどうか、0.5 nM LLO 1 μ M CNABD の Ca2 +の存在下で 37 ° C で 30 分間-(M1) を含むまたは Ca2 +-(M2) の自由な媒体。(A) 画像の hela 細胞 H2B GFP の細胞が前と後の M1 のキネティックに買収された染料を含みます。スケールバー = 100 μ m。(BとC) 統合 CNABD と GFP の蛍光強度を用いてイメージングの cytometer と (RFU) ± SEM. 相対蛍光単位で表される (D) GFP 蛍光画像は HeLa H2B GFP を列挙する処理されました。セル (黒いバーが事前運動データ、赤いバーを = 後運動データ、n = = 3 独立実験、トリプリケートでそれぞれ行われます)。2 尾スチューデントの t 検定を用いて定量的蛍光強度分析し、セルの数を取得した画像から * * p < 0.01 * * * p < 0.001)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: LLO に及ぼす濃度効率、Z 係数と SSMD を再シールします。(A) HeLa H2B-GFP M1 または M2 含む 1 μ CNABD 培養細胞 LLO 濃度の増加にさらされる, 37 ° C で 30 分間運動アッセイを受けるデータが表現する相対的な蛍光ユニット (RFU) ± SEM. Z 係数 (B) CNABD 強度 (ICNABD)、厳密に標準化された平均値の差 (SSMD) は細胞膜修復の堅牢性の品質評価として計算された、試金、運動曲線42,43,44,45指標として (AUC) 曲線下面積を使用します。プロトコルと結果のセクションで説明するよう resealing の効率を算出した (n = 3 の独立した実験、トリプリケートでそれぞれ行われます)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: セル暴露デシプラミンを再シールの欠陥が発生します。H2B GFP HeLa 細胞 (4 連でメッキ) 処理を行った 30 μ M デシプラミン (またはない) 37 ° C で 1 時間後、1 μ M CNABD の Ca2 +の存在下で 0.25、0.5 nM LLO に公開 -(M1) を含むまたは Ca2 +-(M2) の自由な媒体。セルは、(前と後の運動) をイメージしました運動アッセイ 37 ° C で 30 分 (A) 細胞が列挙された; を受けると相対的な蛍光の有無で算出した単位 (RFU) ± SEM. (C) Resealing 効率の平均セル数 ± SEM. (B) CNABD 蛍光強度 (ICNABD) を表したデータを表現する、デシプラミン。混合効果モデルは、各技術の複製のランダムなインターセプトを想定して強度の対数変換値に使用されました。両方シフトをキャプチャし、運動曲線の形状の変化、処理条件の主な効果と熱処理条件と時間の間の相互作用効果共同で統計的な有意性テストされました。2 尾スチューデントの t 検定は取得した画像からの細胞数を分析に使用されました。P 値は混合効果モデルを使用して計算されます。(4 技術的複製、1 つの実験)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| イメージングの Cytometer 放出チャネル仕様 | |||
| 蛍光体 | Ex Fluorophore/em (nm) | 緑のチャネル (ex/em ± バンドパス、ニュー メキシコ) | 赤のチャネル (ex/em ± バンドパス、ニュー メキシコ) |
| GFP | 488/510 | 460/541 ± 20/108 | 625/713 ± 20/123 |
| PI | 533/617 | ||
| CNABD | 642/661 | ||
表 1: CNABD、PI、GFP 励起と放射ピークと緑と赤はチャネル イメージングの cytometer の励起と放射バンドパスです。
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Discussion
この試金は高スループット容量を持つセルの人口レベルで再封止膜の効率を測定します。使用できる細胞成分や細胞膜修復に影響を与える薬物ライブラリの画面に。説明アッセイは 96-well 版のフォーマットを使用、高いスループット 384 ウェル プレートに合わせることができます。このアッセイの利点は、過剰な細胞など細胞の剥離、固定、または蛍光標識後固定処理を必要とせずリアルタイムで付着性細胞の蛍光測定が得られることです。マルチモード プレート リーダー、このプロトコルで使用されるなど 30 ほどの間隔で急速なカルバゾール測定のため十分な感度がある秒 96 ウェル プレートで。蛍光画像の取得は、セルの列挙、最終的な変化を細胞の形態との異なる細胞集団の潜在的な同定などの追加情報を提供します。現在のアッセイの単一セルのレベルで再封止膜動態を確立しないが実験条件 (薬理学的化合物または細胞コンポーネント) に影響する、肯定的または否定的に、プロセスを識別します。セルの人口レベルで膜を再シールします。
いくつかの他の実験的アプローチは、メカニズムを再封止膜を評価するために開発されています。たとえば、マイクロニードル穿刺、ビーズ磨耗、レーザーアブレーションによる機械的破壊は機械的膜損傷をモデルに使用されています。蛍光プローブ (FM 1-43、propidium ヨウ化、フルオレセイン共役 dextrans) のエントリの定量化や蛍光タンパク質キメラ47 の追跡によって蛍光顕微鏡または流れの cytometry が負傷/修理の測定に関与しています。、48,49,50。これらのアプローチのそれぞれが独自の利点;しかし、彼らはこの試金に提示されている細胞内高速スクリーニングに適してではありません。
現在のアッセイに細胞の原形質膜の機械的の破裂によって引き起こされた大規模な Ca2 +流入を許可するフォームの大きな孔孔形成タンパク質 LLO、負傷者の resealing の効率性を分析する最適化されました。大きい毒素毛穴修復細胞膜損傷の 1 つのフォームを表し、一般的な Ca2 +を共有する機械傷を提案した孔形成毒素が-依存性経路17,51。コレステロール細胞シグナル伝達に影響を与えることができるそれにより機械傷と比較した場合のメカニズムを再封止膜に影響を及ぼすかもしれないと細胞膜成分とその LLO の相互作用に注意することが重要です。細胞膜修復に関する知識はまだ限られているとさらなる研究が毒素の気孔の形成を再シール機械傷の再シールと異なる場合を確立する必要。LLO を使用していくつかの利点があります。4 から 37 ° C への温度を上げることによってまず、膜の損傷の発生を同期できます。第二に、LLO (細胞膜にはバインドされていない) の溶ける形態不可逆的集約中性 pH で 37 ° C、従って細胞毒性を制限して、細胞を洗浄する必要性を abrogating します。最後に、被害の程度は、毒素の濃度を変化させることにより調整できます。しかし、この試金の制限は 37 ~ 4 ° C、小胞輸送、エンドサイトーシス、膜流動性は、温度52によって影響を受けている、他のプロセス間など修復機構に影響を与えるかもしれない温度スイッチ 53,54。アッセイに含まれる任意の薬理学的阻害剤が薬55(不在) 対存在で溶血アッセイを行うことでの LLO 気孔の形成と干渉しないことを確認することが重要です。潜在的なバッチの違いにより LLO 活動、高スループット画面全体55に対して十分な大きさは、LLO の在庫を準備することが重要です。
我々 には前に、と後に顕微鏡画像を用いて膜修復アッセイ自動画像解析後に細胞を列挙する手段としてローカライズされた核ヒストン 2B GFP キメラを発現する細胞の使用が含まれています。重要なは、対応するセルが条件カウントと不変のセルの前にカウントし、運動アッセイが PI として重要なまたは CNABD 蛍光強度が簡単にことはできません後に正規化します。確かに、細胞数の違いは、蛍光正規化効率 (図 7) を再シールの違いによる訂正できません、LLO の与えられた濃度による被害の程度の差になります。ヒストン 2B GFP 発現が PI または CNABD 定款又は蛍光発光と干渉しない示した。逆に、PI または CNABD の定款では、GFP 基づかせていた細胞列挙は影響しません。Fluorophores の他の組み合わせを使用する場合は、この作業で行われたように、螢、重なりの潜在的なスペクトルを評価するために必要になるでしょう。PI は、膜の損傷の測定に広く使用されていますが CNABD が効率を再シール特性を適切なダイナミック レンジが広く、高い蛍光量子収率を示す優れた代替であることを示します。
Z 係数と SSMD は、この試金が高スループット分析の実行に必要な堅牢性を持っていることを確認しました。Resealing 効率の計算は、潜在的な衝突を識別するために重要な信頼性の高いツールです。さらに、混合効果モデルは、単一のアッセイ内ヒットを評価する統計的ツールとして使用できます。画面は数回繰り返すことができる場合、実験計画は 3 つの技術的な複製の最小値を含める必要があります。混合効果モデルなどの統計ツール単一の実験に含まれるそれが繰り返されるかどうか場合、quadruplicates を使用する必要があります。しかしお勧めです画面を数回実行して相補的な実験を行い、結果を検証します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は、私たちはいくつかの予備的な実験のため彼のマルチモード検出プラットフォームを使用する許可していただいた博士ジェシー Kwiek (オハイオ州立大学) を認めます。この記事で報告された研究は、国立研究所のアレルギーとステファニー Seveau を受賞番号 RO1AI107250 の下で健康の国民の協会の感染症によって支持されました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | i3x | |
| MiniMax 300 Imaging cytometer | Molecular Devices | 5024062 | |
| TO-PRO-3 | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| HeLa | ATCC | CCL2 | |
| HeLa H2B-GFP | Millipore | SCC117 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate | Corning | 3603 | |
| Hanks' balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| EGTA | ISC BioExpress | 0732-100G | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-(+)-Glucose, HybriMax | Sigma-Aldrich | G5146-1KG |
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