Summary
여기서, 우리는 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석을 사용하여 혈관 네트워크 형성에 루타 graveolens의 물 추출물의 효과를 평가한다.
Abstract
혈관 신생은 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내고 몇몇 신호 전광 통로를 관련시키는 내피 세포 증식, 분화 및 이동과 같은 다른 프로세스를 포함하는 현상입니다. 여기에서 우리는 관 형성 분석이 혈관 신생에 천연물의 충격을 평가하고 관련시킨 분자 기계장치를 조사하기 위하여 간단한 시험관 내 방법이다는 것을 보여줍니다. 특히, 루타 자갈렌즈(RGWE)의 물 추출물이 존재할 때, 내피 세포는 더 이상 세포 세포를 형성할 수 없으며 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) 튜브 형성에 대한 RGWE 효과가 폐지되는 데에는 MEK의 구성 활성화.
Introduction
혈관 신생은 기존의 혈관에서 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내고 배아 발생 및 기관 성장 도중 생기는 생리적인 프로세스입니다. 성인기에서 혈관 신생은 사이클링 난소, 임신 중 태반, 상처 치유 및 수리 중에만 활성화됩니다. 혈관 신생은 내피 세포가 증식, 분화 및 이동하는 능력에 따라 달라지며 그대로 혈관네트워크를 형성합니다 1. 그러나 염증성, 대사 성 및 류마티스 질환과 같은 여러 장애에서 혈관 신생 과정이 변경되고 혈관 신생이 과도해집니다. 더욱이, 통제되지 않는 혈관신생 프로세스는 또한 종양진행 및 전이를 자극합니다 1. 이러한 이유로, 지난 10년간, 연구연구는 암, 안구, 관절 또는 피부 질환에서 과도한 혈관신생의 억제를 목표로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 초점을 맞추고있다2,3.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 현재 항혈관신생 요법 4의 주요표적을 나타내며, 과도한 혈관신생을 방지하기 위해 여러 개의 항-VEGF 단일클론 항체가 개발 및 합성되고 있다. 그러나, 이러한 합성 약물은 심각한 부작용을 보이고 불리한 비용대 이익 비율을 가지고 5,6. 따라서, 보완하고 현재 사용되는 약물과 결합하는 최소한의 부작용으로 과도한 혈관 신생을 제한하는 새로운 치료 전략을 찾는 것이 필수적이다. 이러한 새로운 약물은 높은 화학적 다양성과 생화학적 특이성을 특징으로하는 천연 제품 중에서 찾을 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 시험관에서 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브를 형성하는 HUVECs의 능력에 RGWE의영향을 평가하는 간단한 방법을 제안한다 5. 실제로, RGWE는 루틴이 주요성분인가운데 플라보노이드 및 폴리페놀과 같은 이차 대사산물의 혼합물이다. 그들 중 많은 사람들이 이미 항 염증 및 혈관 보호 제 7,8,9,10,11로테스트되었습니다. 더욱이, 우리는 최근에 RGWE, 그러나 루틴이 아니라, 겔화된 지하 매트릭스에 관을 형성하는 HUVEC 능력을 억제할 수 있고 이 현상이 MEK-ERK 통로에 의해 중재된다는 것을, RGWE를 잠재적인 치료 도구로 나타낼 수 있다는 것을 증명했습니다 과도 한 새로운 혈관 형성을 방지5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RGWE 준비
- 식물학자의 감독 하에 봄/여름 철에 식물에서 R. graveolens 잎을 수집합니다.
참고: 이 경우, 잎은 나폴리 식물원에서 약용 식물의 실험 섹션에서 수집되었다, 이탈리아5. 식물은 자발적이고 다년생이며 지중해 지역에 존재합니다(그림1). - 잎 250g의 무게와 가위로 잘게 자릅니다.
- 원추형 플라스크에 잎을 넣고 다진 잎 250g에 증류수 1L를 넣고 110 °C에서 60 분 동안 끓이십시오.
- 3mm 깔때기 필터 용지를 사용하여 끓인 잎을 물 추출물을 나타내는 액체 상에서 분리합니다.
- 0.22 μm 필터를 통해 액체 상을 걸쳐 비커에 수집합니다. 비커를 파라필름으로 덮고 추출물을 밤새 -80°C에서 동결시되.
- 파라 필름에 바늘로 10 - 15 구멍을 만들고 동독에서 추출물을 동독화하십시오. 분말을 얻기 위해 며칠이 걸릴 수 있습니다.
- 얻어진 분말을 계량하고, 알리쿼트으로 나누고, 필요할 때까지 4°C에 보관하십시오. 1 년 동안 보관 할 수 있습니다.
- 실험에 필요한 경우, 50 mg/mL의 표준 농도로 증류수로 분말을 희석, 재고 용액을 준비합니다. 작은 볼륨 (예를 들어, 1 mL) aliquots로 분리합니다. 이 제제는 사용될 때까지 -20°C에서 보관될 수 있지만 분자의 산화로 인해 며칠 이상 4°C에서 보관할 수 없다. 동결 및 해동을 피하십시오.
2. 세포 배양
- 내피 세포 성장 배지에서 HUVECs를 육성: 내피 기저 배지 1 μg/mL 하이드로 코르티손 과 1 ng/mL 표피 성장 인자, 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신을 37°C에서 5% CO2의 분위기에서 보충하였다.
- 때 80% 결합, 의 비율로 세포를 분할 1:3 모든 통로. 성장 인자에 대한 반응에서 명백한 차이를 보이지 않는 2 ~ 5 개의 대구에서 세포를 사용하십시오. 여섯 번째 통로 후, 세포는 노화가되고 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브를 형성하지 않습니다.
3. 감염
- HUVECs가 70 % 수렴되면 원하는 유전자로 트랜스 펙트하십시오.
- 100 mm 플레이트의 경우, 관심 있는 유전자를 포함하는 1 μg의 pCDNA3 벡터와 1 μg의 빈 pCDNA3 벡터를 사용한다(이 경우, 구성적으로 활성 MEK[caMEK])).
- 3 μL의 리포펙타민 2,000의 DNA의 복합체, 감소된 혈청 배지로 희석 (재료표참조) 최종 부피 200 μL. 세포에서 배지를 제거하고 신선한 완전한 배지의 1 mL로 대체; 그런 다음 셀에 트랜스펙팅 솔루션을 추가합니다. 37 °C에서 인큐베이터에서 세포를 배양하고 5% CO2로 배양합니다. 또한 제조 업체의 지침에 따라 lipofectamine 2,000에서 다른 다른 형질 감염 에이전트를 사용할 수 있습니다.
- 완전한 신선한 배지 의 7 mL를 첨가 3 시간 후, 다음 애혈술을 진행하기 전에 24 - 48 시간 동안 37 °C에서 세포를 추가로 배양한다. 형질전환 다음날, 매질을 신선한 완전한 매체로 교체하십시오.
4. 튜브 형성 분석
- 겔화 된 지하실을 준비하기 전에 96 웰 플레이트 및 피펫 팁을 4 °C에서 1 시간 동안 냉각시.
- 지하 준비의 순간에, 얼음 (0 °C)에 접시를 넣고 거품의 형성을 피하면서 각 우물에 차가운 매트릭스 의 50 μL을 추가합니다. 매트릭스가 실온에서 고체가 되기 때문에 매트릭스 함유 바이알은 절차 중에 얼음위에 보관되어야 합니다.
- 플레이트를 37°C에서 5% CO2로 30분 이상 동안 인큐베이터에 넣고 지하가 중합되도록 한다.
- 그 동안, 세포를 수확. HUVECs를 0.25% 트립신/0.53 mM EDTA 용액의 1 mL로 세척; 그런 다음 트립신-EDTA 용액 2 mL를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 이어서, 세포가 현탁되는 배지를 수집하고 3분 동안 264 x g에서 원심분리에 의해 분리된 세포를 수확한다.
- 세포를 계산하기 위해, 0.2 mL의 세포 현탁액을 PBS의 0.5 mL및 0.3 mL의 0.4% 트라이판 블루 용액에 추가한다. 실온에서 5 분 후, 뷔르커 챔버에서 세포를 계산합니다.
- 2 x 104 세포 / 50 μL의 농도로 완전한 배지로 세포를 다시 일시 중단하십시오.
- 셀 수에주의하십시오. 너무 많거나 너무 적은 세포는 겔화 된 지하실에 올바른 방법으로 튜브를 형성하지 않을 수 있습니다.
- RGWE (0.01, 0.1 및 1 mg /mL)의 증가 복용량을 준비하고 배양 배지 또는 루틴 (12, 120 및 300 μg / mL)에서 재고 용액을 희석하고 최종 부피 50 μL / well에 추가하고 50 μL / well의 세포 현탁액을 추가하십시오. 각 웰의 최종 부피는 100 μL이 될 것입니다. 각 실험 조건에 대해 4~6개의 우물을 준비합니다. 대조군으로서, 배양 배지내의 증류수(vehicle)를 1:50의 비율로 희석시켰다.
- 6~ 24시간 범위의 시간 동안 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
- 10배의 배율로 위상 대비 현미경을 사용하여 시딩 후 6~24시간 범위 내에서 세포를 관찰합니다. HUVECs는 6 시간 이내에 튜브와 같은 구조를 형성 할 수 있지만 12 - 18 시간 후에 더 나은 결과를 관찰 할 수 있습니다.
- 영상 획득 후, 세포는 지하 매트릭스로부터 분리될 수 있고 세포 수에 대한 치료의 효과를 평가하기 위해 카운트될 수 있다. 각 우물에 대해 배지를 제거하고 24 U/mL의 농도로 디스파스를 추가하고 플레이트를 37 °C에서 1 시간 동안 넣습니다. 이어서, 각각의 우물로부터, 세포가 부유되는 배지를 수집하고 3 분 동안 264 x g에서 원심분리에 의해 분리 된 세포를 수확. PBS의 0.2 mL에서 다시 중단. 세포를 계산하려면 0.2 mL의 세포 현탁액을 PBS의 0.5 mL에 추가하고 0.3 mL의 0.4% 트라이판 블루 용액을 추가합니다. 실온에서 5 분 후, 뷔르커 챔버의 세포를 계산합니다.
- 튜브 형성 분석의 결과를 정량화하기 위해, 적어도 3개의 튜브가 결합되는 분기 점의 수를 카운트할 수 있다. 적절한 이미지 소프트웨어를 사용하여, 각 현미경의 각 필드에 대해 분기 점의 수를 계산하고 각 실험 조건에 대한 평균 ± 표준 오차(SE)를 계산한다. 두 꼬리 t-검정을 사용하여 통계적 유의를 평가합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
혈관 신생에 대한 RGWE의 영향을 평가하기 위해 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석기를 실시했습니다. 그것에 경작될 때, HUVECs는 길쭉하게 보이고 세포 세포 네트워크를 형성하기 위하여 서로 연결되는 세포에서유래하는 관 같이 구조물을 형성합니다 (그림 2). 도3에서는 RGWE로 처리된 HUVECs의 분기 수가 대조군 조건에 비해 현저히 낮았다는 것을 보여줍니다. 특히, 0.1 mg/mL 및 1 mg/mL RGWE의 존재, 지점의 수는 제어 조건에 비해 각각 40% 및 60%로 낮습니다. 루틴이 RGWE 5의 주요 성분으로표시되었기 때문에 HUVEC 튜브 형성 분석에 미치는 영향을 분석했습니다. 도4에 도시된 바와 같이, 루틴만으로는 HUVECs의 세포 세포 네트워크 형성 능력에 영향을 미치지 못한다. 그 때, 우리는 관 형성의 RGWE 유도한 억제의 밑에 분자 기계장치를 조사하기 위하여 관 대형 분석기를 이용했습니다. MEK/ERK 세포내 신호 통로는 혈관신생 공정에서 중추적인 역할을 합니다. caMEK에 의해 형질감염된 HUVECs는 RGWE로 처리되었고 겔화 된 지하 매트릭스에서 경배되었다. 그림5에 나타난 바와 같이, caMEK 형질감염 된 내피 세포에서 RGWE는 더 이상 튜브 형성을 억제하지 않으며, 모의 형질 감염된 세포는 제어로 사용되며 겔화 된 지하 매트릭스에서 세포 세포 네트워크를 형성하고 RGWE에 반응하여 이를 나타냅니다. 혈관 신생에 있는 RGWE의 효력이 MEK-ERK 통로에 의해 중재된다는 것을.
그림 1: 루타 자갈렌즈. 루타 자갈렌즈 관목. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: HUVECs는 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 와 같은 구조를 형성합니다. 폴리스티렌 접시 (왼쪽)와 겔화 된 지하실 매트릭스 (오른쪽)에서 배양 된 HUVECs의 대표적인 현미경 사진. 배율 막대 = 10 μm.
그림 3: RGWE는 HUVECs에서 튜브 형성을 억제합니다. (A) RGWE (0, 0.01, 0.1 및 1.0 mg /mL)로 처리 된 겔화 된 지하 매트릭스상에서 배양 된 HUVECs의 고전력 현미경 사진. 스케일 바는 10 μm.(B) RGWE (0.01, 0.1, 및 1.0 mg/mL)가 있는 경우 HUVEC 분기점(진한 회색)의 백분율로, 처리되지 않은 세포(0 mg/mL)와 HUVECs에서 처리된 트라이판 블루 배제 시험(라이트 그레이)에 비해 0.01 mg/mL , 0.1, 및 1 mg/mL) 또는 하지 (0 mg/mL) RGWE에 대 한 24 h. *p & 0.01 대 제어 조건 (0 mg/mL). 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ±SE로 표현된다. 통계적 유의는 2꼬리 t-검정에 의해 수득되었다.
그림 4: 루틴은 HUVEC 튜브 형성에 영향을 미치지 않습니다. (A) HUVECs의 고출력 현미경 사진은 겔화 된 지하 매트릭스에 시드하고 처리 (12, 120 및 300 μg / mL) 또는 하지 (0 μg / mL) 24 시간 동안 루틴으로. 스케일 바는 10 μm.(B) 루틴(12, 120 및 300 μ/mL)의 투여량이 증가하는 경우 HUVEC 분기점(진한 회색)의 백분율로, HUVECs 처리된 HUVECs에서 의 대조군 조건(0 μg/mL)과 트라이판 블루 배제 시험(라이트 그레이)에 비해 , 120, 300 μ/mL) 또는 24 시간 동안 루틴이있는 (0 μg / mL) 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ±SE로 표현된다. 통계적 유의는 2꼬리 t-검정에 의해 수득되었다.
그림 5: MEK 통로는 HUVEC 관 형성에 RGWE 효과를 중재합니다. (A) 빈 벡터 (모의 형질전환) 또는 caMEK로 트랜스된 HUVECs의 고전력 현미경 사진, 겔화 된 지하 매트릭스에 시드하고 RGWE (0, 0.01, 0.1 및 1 mg / mL)의 증가 된 용량으로 처리. 스케일 바는 10 μm.(B) HUVECs 모의 형질감염(진한 회색)과 CAMEK(라이트 그레이)로 형질전환된 HUVECs의 분기점 수의 백분율이며, 대조군대비 RGWE(0.01, 0.1, 1 mg/mL)의 증가된 투여량으로 처리되었다. 조건 (0 mg / mL). *p < 0.01 대 제어 조건; § p< 0.05 대 세포는 빈 벡터로 형질전환되고 동일한 양의 RGWE로 처리하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ±SE로 표현된다. 통계적 유의는 2꼬리 t-검정에 의해 수득되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
천연 화합물은 높은 화학적 다양성 및 생화학적 특이성을 특징으로 하며 잠재적으로 치료 분자의 공급원을 나타낸다. 여기서, 우리는 식물 R. graveolens에서 물 추출물을 얻는 방법을 보여주고 혈관 형성 분석법을 수행하기 쉽고 신뢰할 수 있으며 혈관 신생에 대한 RGWE의 효과를 조사하는 데 유용한 정량적 방법으로 제안합니다. 완전한 물 추출물을 얻으려면 R. graveolens 잎을 1 시간 동안 끓이는 것이 중요합니다. 1시간 미만의 비등은 모든 분자의 추출을 허용하지 않았고, 추출물은 예상되는 생물학적 효과를 발휘할 수 없었다.
관 대형 분석실험은 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내는 몇몇 단계를 기초로 하는 분자 기계장치를 공부하기 위하여 시험관 내 시험을 나타냅니다. 이 분석은 연구원이 관련시킨 단백질 및 신호 폭포뿐만 아니라 혈관 신생을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 것을 허용합니다. 더욱이, 이 분석실험은 연구원이 혈관 대형에 있는 모든 중요한 기계장치, 내피 세포 증식, 유착, 이동 및 protease 활동, 영향을 미칠 수 있는 물질을 시험하는 것을 허용합니다. 이러한 종류의 테스트만사용하여, 우리는 RGWE, 그러나 그것의 주요 분대 루틴이, 세포 생존에 영향을 미치지 않고 튜브 같이 구조물을 형성하는 HUVECs의 기능을 감소시킬 수 있고 이 효력이 MEK-ERK 통로 활성화에 달려 있다는 것을 보여줍니다. 그러나 올바른 수의 셀로 테스트를 수행하는 것이 중요합니다. 사실, 너무 적거나 너무 많은 세포는 관의 올바른 형성을 허용할 수 없었습니다. 이러한 이유로 올바른 수의 셀을 찾기 위해 예비 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. 더욱이, 세포 대패의 수는 세포 수만큼이나 중요하며, 정확한 튜브 형성 분석방법을 얻기 위해, 세포는 2회~5회 통과되어야 한다. 6항 후에, 우측 관 대형을 손상시킬 수 있는 노화 메커니즘이 발생한다.
튜브 형성 분석실험은 매우 재현 가능한 분석이며, 튜브 형성8,9,10의3차원 연구를 위한 금본위제는 아니더라도 내피세포의 생리학에 빛을 발산한다. 11. 3차원 콜라겐 및 피브린 모델은 혈관 관 발생, 발아 및 내피 세포-내피 세포-pericyte 상호작용의 조사에 더 나은 것으로 입증되었습니다. 그러나, 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석실험에 비해, 이러한 테스트는 더 많은 시간과 돈을 소모11,첫 번째는 생체 내 연구에 더 초점을 맞춘 에 대한 기초가 될 수있는 예비 결과를 얻기 위해 좋은 테스트가 될 수 있음을 시사. 마지막으로, 튜브 형성 분석은 24 시간에서 수행 될 수 있으며, 변형되지 않은 HUVECs는 6 시간12,13내에서 튜브 와 같은 구조를 형성 할 수 있기 때문에.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 마리아 테레사 이방인과 AIRC 펀드 IG18999 마우리치오 비풀코에 루카 콜루치 - 다마토와 발레 프로그램 기금에 폰디 디 아테네에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
