Summary
Aqui, nós avaliamos os efeitos do extrato da água de Ruta graveolens na formação da rede do vaso usando um ensaio da formação do tubo em uma matriz gelada do porão.
Abstract
A angiogênese é um fenômeno que inclui diferentes processos, como proliferação de células endoteliais, diferenciação e migração, que levam à formação de novos vasos sanguíneos e envolvem várias vias de transdução de sinal. Aqui nós mostramos que o ensaio da formação do tubo é um método in vitro simples para avaliar o impacto de produtos naturais na angiogênese e para investigar os mecanismos moleculars envolvidos. Em particular, na presença do extrato de água de Ruta graveolens (rgwe), as células endoteliais já não são capazes de formar uma rede celular e que os efeitos rgwe na formação de tubos de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) são abolidos pela ativação constitutiva do MEK.
Introduction
A angiogênese é um processo fisiológico que leva à formação de novos vasos sanguíneos de preexistentes e ocorre durante a embriogênese e o crescimento de órgãos. Na idade adulta, a angiogênese é ativada apenas no ovário cicatricial, na placenta durante a gravidez, e durante a cicatrização e reparo da ferida. A angiogênese depende da capacidade das células endoteliais de proliferarem, diferenciar e migrar para formar uma rede vascular intacta1. No entanto, em vários distúrbios, como doenças inflamatórias, metabólicas e reumáticas, os processos angiogênicos são alterados e a angiogênese torna-se excessiva. Além disso, processos angiogênicos descontrolados também estimulam a progressão tumoral e a metástase1. Por estas razões, na última década, os estudos de pesquisa estão focados no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas voltadas para a inibição da angiogênese excessiva no câncer, ocular, articular ou distúrbios cutâneos2,3.
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) representa o principal alvo das terapias antiangiogênicas atuais4, e vários anticorpos monoclonais anti-VEGF foram desenvolvidos e sintetizados para prevenir a angiogênese excessiva. No entanto, essas drogas sintéticas apresentam efeitos colaterais graves e têm uma relação custo-benefício desfavorável5,6. Portanto, é imperativo encontrar novas estratégias terapêuticas para limitar a angiogênese excessiva com efeitos colaterais mínimos para complementar e combinar com drogas atualmente usadas. Estes novos fármacos podem ser encontrados entre os produtos naturais que se caracterizam por uma elevada diversidade química e especificidade bioquímica.
Neste artigo, propomos um método simples para avaliar o impacto do RGWE na capacidade de HUVECs de formar túbulos em uma matriz basal gelada in vitro5. Na verdade, RGWE é uma mistura de metabólitos secundários, como flavonoides e polifenóis, entre os quais a rutina é o principal componente5. Muitos deles já foram testados como agentes anti-inflamatórios e vasoprotetores7,8,9,10,11. Além disso, temos demonstrado recentemente que RGWE, mas não rutina, é capaz de inibir a capacidade HUVEC para formar túbulos em uma matriz de porão gelada e que este fenômeno é mediado pela via MEK-ERK, indicando RGWE como uma ferramenta terapêutica potencial capaz de prevenir a formação excessiva de novos vasos sanguíneos5.
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Protocol
1. preparação RGWE
- Colete as folhas de R. graveolens das plantas durante os meses da mola/verão a supervisão de um botânico.
Nota: Neste caso, as folhas foram coletadas na seção experimental de plantas medicinais no jardim botânico de Nápoles, Itália5. A planta é espontânea, perene, e está presente nas regiões mediterrânicas (Figura 1). - Pesar 250 g de folhas e pique-os finamente com tesouras.
- Coloque as folhas em um balão cônico e adicione 1 L de água destilada a 250 g de folhas picadas e leve-a a ferver a 110 ° c por 60 min. Cubra o balão com folha de alumínio para evitar a evaporação excessiva.
- Use papel de filtro de funil de 3 mm para separar as folhas cozidas da fase líquida que representa o extrato de água.
- Filtre a fase líquida através de um filtro de 0,22 μm, recolhendo-o num copo. Cubra o copo com parafilm e congele o extrato em-80 ° c durante a noite.
- Faça 10-15 furos com uma agulha no parafilm e liofililize o extrato em um lyophilizer. Note que pode demorar um par de dias para obter o pó.
- Pesar o pó obtido, dividi-lo em alíquotas, e armazená-lo a 4 ° c até que seja necessário. É possível armazená-lo por um ano.
- Quando necessário para os experimentos, prepare uma solução de estoque, diluindo o pó com água destilada para uma concentração padrão de 50 mg/mL. Separe-o em pequenos volumes (por exemplo, 1 mL) de alíquotas. Esta preparação pode ser armazenada a-20 ° c até ser utilizada, mas não pode ser armazenada a 4 ° c por mais de um par de dias devido às oxidações das moléculas. Evite congelar e degelo.
2. cultura de células
- Cultivar HUVECs em meio de crescimento de células endoteliais: meio basal endotelial suplementado com 1 μg/mL de hidrocortisona e 1 ng/mL de fator de crescimento epidérmico, 10% FBS e penicilina/estreptomicina a 37 ° c em uma atmosfera de 5% CO2.
- Quando 80% confluentes, dividir as células na proporção de 1:3 cada passagem. Use células de duas a cinco passagens, que não mostram diferenças aparentes em resposta a fatores de crescimento. Após a sexta passagem, as células tornam-se senescentes e não formam tubos na matriz gelada do porão.
3. transfecção
- Quando os HUVECs são 70% confluentes, transfecção-los com o gene desejado.
- Para uma placa de 100 mm, use 1 μg de vetor pCDNA3 vazio como controle e 1 μg de vetor pCDNA3 contendo o gene de interesse (MEK constitutivamente ativo [caMEK], neste caso).
- Complexo 1 μg de DNA com 3 μL de lipofectamina 2.000, diluído com meio sérico reduzido (ver tabela de materiais) para o volume final de 200 μl. Retire o meio das células e substitua-o por 1 ml de meio completo fresco; em seguida, adicione a solução de transfecting às células. Incubar as células na incubadora a 37 ° c, com 5% CO2. Também é possível utilizar outros agentes de transfecção diferentes da lipofectamina 2.000, seguindo as instruções do fabricante.
- Adicionar 7 mL de meio fresco completo 3 h após a transfecção e, em seguida, incubar ainda mais as células a 37 ° c por 24-48 h antes de prosseguir com os próximos ensaios. No dia após o transfection, substitua o meio com o meio completo fresco.
4. ensaio de formação de tubos
- Fixe uma placa 96-well e pontas da pipeta em 4 ° c para 1 h antes de preparar o porão gelificada.
- No momento da preparação do porão, coloque a placa no gelo (0 ° c) e adicione 50 μL de matriz fria em cada poço, evitando a formação de bolhas. Observe que o frasco contendo matriz deve ser mantido no gelo durante o procedimento, uma vez que a matriz se torna sólida à temperatura ambiente.
- Põr a placa na incubadora em 37 ° c com 5% CO2 para pelo menos 30 minutos para permitir que o porão polimerize.
- Enquanto isso, colha as celas. Lave os HUVECs com 1 mL de uma solução de EDTA 0,25% tripsina/0,53 mM; em seguida, adicione 2 mL da solução de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° c durante 5 min. Observe as células um microscópio invertido para verificar se a camada celular está completamente dispersa. Em seguida, recolher o meio em que as células são suspensas e colher as células destacadas por centrifugação em 264 x g por 3 min. ressuscitem-los em 1 ml de fosfato-tampão salina (PBS).
- Para contar as células, adicione 0,2 ml da suspensão da célula a 0,5 ml de PBS e 0,3 ml de solução de azul de Tripan 0,4%. Após 5 minutos à temperatura ambiente, conte as células em uma câmara de Bürker.
- Ressuscite as células em meio completo na concentração de 2 x 104 células/50 μL. semente eles para o porão gelificada na concentração de 2 x 104 células por poço e deixá-los resolver sobre ele.
- Preste atenção ao número de células. Demasiados ou demasiado poucas pilhas não podem formar tubos na maneira direita no porão gelificada.
- Prepare doses crescentes de RGWE (0, 1, 0,1 e 1 mg/mL), diluindo a solução de ações em meio de cultura ou Rutina (12, 120 e 300 μg/mL), tudo no volume final de 50 μL/bem, e adicioná-los a 50 μL/poço de suspensão celular. O volume final em cada poço será de 100 μL. Prepare quatro a seis poços para cada condição experimental. Como controle, diluir a água destilada (veículo) no meio de cultura em uma proporção de 1:50.
- Incubar as células na incubadora a 37 ° c e 5% CO2 por um tempo variando de 6 a 24 h.
- Observe as células dentro de um intervalo de tempo que abrange de 6 a 24 h após a semeadura, usando um microscópio de contraste de fase em uma ampliação de 10X. HUVECs são capazes de formar tubo-como estruturas dentro de 6 h, mas é possível observar melhores resultados após 12-18 h. fotografar as estruturas de tubo-like em cada poço e imagem uma média de três a cinco campos aleatórios em cada poço.
- Após a aquisição da imagem, as células podem ser separadas da matriz basal e contabilizadas para avaliar o efeito do tratamento no número de células. Para cada poço, retire o meio, adicione Dispase a uma concentração de 24 U/mL, e coloque a placa a 37 ° c por 1 h. Então, de cada poço, recolher o meio em que as células são suspensas e colher as células destacadas por centrifugação em 264 x g por 3 min. ressuscitem-los em 0,2 ml de PBS. Para contar as células, adicione 0,2 ml de suspensão celular a 0,5 ml de PBS e 0,3 ml de solução de azul de Tripan 0,4%. Após 5 minutos à temperatura ambiente, conte as células na câmara de Bürker.
- Para quantificar os resultados do ensaio de formação de tubos, é possível contar o número de pontos de ramificação nos quais pelo menos três tubos se juntam. Usando o software de imagem apropriado, conte para cada campo em cada micrografo o número de pontos de ramificação e calcule a média ± o erro padrão (SE) para cada condição experimental. Use um teste tde duas caudas para avaliar a significância estatística.
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Representative Results
Para avaliar a influência de RGWE na angiogênese, realizou-se um ensaio de formação de tubos em uma matriz de porão gelada. Quando cultivada nele, HUVECs formam estruturas semelhantes a tubos que se originam de células que aparecem alongadas e que se conectam entre si para formar uma rede celular (Figura 2). Na Figura 3, mostramos que o número de filiais em HUVECs tratados com rgwe foi significativamente menor em relação às condições de controle. Notavelmente, na presença de 0,1 mg/mL e 1 mg/mL de RGWE, o número de ramos é menor em 40% e 60%, respectivamente, em comparação com a condição de controle. Desde que o Rutina foi indicado como o componente principal de RGWE5, nós analisamos seu efeito no ensaio da tubo-formação de HUVEC. Como mostrado na Figura 4, a rutina sozinha não é capaz de afetar a capacidade do HUVECs de formar uma rede celular. Em seguida, utilizou-se o ensaio de formação de tubos para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à inibição induzida por RGWE da formação de tubos. A via de sinalização intracelular MEK/ERK exerce um papel crucial nos processos angiogênicos. HUVECs transfected por camek foi tratado com o rgwe e cultivado na matriz gelificada do porão. Como mostrado na Figura 5, nas células endoteliais de camek-transfected, o rgwe não inibe mais a formação de tubos, enquanto as células transfectadas, usadas como controle, ainda formam uma rede celular na matriz basal gelada e respondem a rgwe, indicando, assim, que o efeito do RGWE na angiogênese é mediado pela via MEK-ERK.
Figura 1: Ruta graveolens. Um arbusto da Ruta graveolens . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: HUVECs formam estruturas tipo tubo em uma matriz de porão gelada. Fotografias representativas microscópicas de HUVECs cultivadas em prato de poliestireno (à esquerda) e em matriz de porão gelada (direita). Barra de escala = 10 μm.
Figura 3: RGWE inibe a formação de tubos em HUVECs. (A) fotografias microscópicas de alta potência de HUVECs cultivadas em uma matriz de porão gelada tratada com rgwe (0, 0, 1, 0,1 e 1,0 mg/ml). A barra de escala é de 10 μm. (B) a percentagem do ponto de ramificação HUVEC (cinza escuro) na presença de rgwe (0, 1, 0,1 e 1,0 mg/ml) em comparação com células não tratadas (0 mg/ml) e o teste de exclusão azul de Tripan (cinza claro) em HUVECs tratados (0, 1 , 0,1 e 1 mg/mL) ou não (0 mg/mL) com RGWE durante 24 h. *p < 0, 1 vs. a condição de controlo (0 mg/ml). Os resultados são expressos em média ± a SE de três experimentos independentes. A significância estatística foi obtida por um teste tde duas caudas.
Figura 4: a rutina não afeta a formação do tubo HUVEC. (A) fotografias microscópicas de alta potência de HUVECs semeadas em uma matriz de porão gelada e tratadas (12, 120 e 300 μg/ml) ou não (0 μg/ml) com Rutina por 24 h. A barra de escala é de 10 μm. (B) a percentagem do ponto de ramificação HUVEC (cinza escuro) na presença de doses crescentes de Rutina (12, 120 e 300 μ/ml) em comparação com as condições de controle (0 μg/ml) e o teste de exclusão azul de Tripan (cinza claro) em HUVECs tratados (12 , 120 e 300 μ/mL) ou não (0 μg/mL) com Rutina durante 24 h. Os resultados são expressos em média ± a SE de três experimentos independentes. A significância estatística foi obtida por um teste tde duas caudas.
Figura 5: a via MEK Medeia efeitos rgwe na formação do tubo HUVEC. (A) fotografias microscópicas de alta potência de HUVECs transfected com vetor vazio (transfection simulado) ou com camek, semeadas na matriz gelada do porão e tratadas com doses crescentes de rgwe (0, 0, 1, 0,1, e 1 mg/ml). A barra de escala é de 10 μm. (B) a percentagem do número de pontos de ramificação em HUVECs mock-transfected (cinza escuro) e em HUVECs transfected com camek (cinza claro) e tratados com doses crescentes de rgwe (0, 1, 0,1, e 1 mg/ml) comparado ao controle condições (0 mg/mL). *p < 0, 1 contra a condição de controle; § p < 0, 5 vs. células transfectadas com o vetor vazio e tratadas com a mesma quantidade de rgwe. Os resultados são expressos em média ± a SE de três experimentos independentes. A significância estatística foi obtida por um teste tde duas caudas.
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Discussion
Os compostos naturais são caracterizados por uma elevada diversidade química e especificidade bioquímica e representam uma fonte de moléculas potencialmente terapêuticas. Aqui, mostramos como obter o extrato de água da planta R. graveolens e propor o ensaio de formação de tubos como um método fácil de executar, confiável e quantitativo, útil para investigar os efeitos do rgwe na angiogênese. É importante ferver as folhas do R. graveolens para 1 h para ser certo obter o extrato completo da água. Ferver por menos de 1 h não permitiu a extração de todas as moléculas, e o extrato não poderia exercer o efeito biológico esperado.
O ensaio de formação de tubos representa um teste in vitro para estudar os mecanismos moleculares subjacentes às várias etapas que levam à formação de novos vasos sanguíneos. Este ensaio permite que os pesquisadores identifiquem compostos capazes de modular a angiogênese, bem como as proteínas e as cascatas de sinalização envolvidas. Além disso, este ensaio permite que os pesquisadores testem substâncias que podem influenciar, ao mesmo tempo, proliferação de células endoteliais, adesão, migração e atividade de protease, todos os mecanismos importantes na formação de vasos sanguíneos. Usando somente este tipo do teste, nós mostramos que RGWE, mas não seu rutin principal do componente, é capaz de reduzir a habilidade de HUVECs de dar forma a estruturas tubo-como sem afetar a viabilidade da pilha e que este efeito depende da ativação do caminho de MEK-ERK. No entanto, é importante realizar o teste com o número certo de células. Na verdade, poucas ou muitas células não podiam permitir a formação correcta dos tubos. Por esta razão, é aconselhável realizar um teste preliminar para encontrar o número correto de células. Além disso, o número de passagens da pilha é tão importante quanto o número de pilha desde que, para obter o ensaio correto da formação do tubo, as pilhas têm que ser é duas vezes a cinco vezes. Após a passagem 6, ocorrem mecanismos de senescência que podem prejudicar a formação do tubo direito.
O ensaio de formação do tubo é um ensaio muito reprodutível, e lança luz sobre a fisiologia das células endoteliais, mesmo que não seja o padrão-ouro para o estudo tridimensional da formação de tubos8,9,10, o 11. Os modelos tridimensionais do colagénio e da fibrina foram demonstrados para ser melhores para investigações da tubulogenesis vascular, sprouting, e da interação endothelial do pilha-pericyte. Entretanto, comparado ao ensaio da formação do tubo na matriz gelada do porão, estes testes são mais tempo-e dinheiro-consumindo11, sugerindo que o primeiro poderia ser um bom teste para obter os resultados preliminares que podem ser a base para uns estudos mais focados in vivo. Finalmente, o ensaio de formação do tubo pode ser realizado em 24 h, uma vez que os HUVECs não transformados são capazes de formar estruturas semelhantes a tubos dentro de 6 h12,13.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por Fondi di Ateneo para Luca Colucci-d ' Amato e VALERE programa fundos para Maria Teresa Gentile e AIRC fundo IG18999 para Maurizio Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
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