Summary
Her evaluerer vi virkningene av vann ekstrakt av Ruta graveolens på fartøyet nettverk formasjon ved hjelp av et rør formasjon analysen på en gelled kjeller matrise.
Abstract
Angiogenese er et fenomen som inkluderer ulike prosesser, slik som endothelial celle spredning, differensiering, og migrasjon, som fører til dannelsen av nye blodårer og involvere flere signal Transduction trasé. Her viser vi at rør formasjon analysen er en enkel in vitro -metode for å evaluere virkningen av naturlige produkter på angiogenese og undersøke de molekylære mekanismene som er involvert. Spesielt i nærvær av vann ekstrakt av Ruta graveolens (RGWE), endothelial celler er ikke lenger i stand til å danne en celle-cellenettverk og at RGWE effekter på menneskelig navle vene endothelial celle (HUVEC) tube formasjon er avskaffet av konstituerende aktivering av MEK.
Introduction
Angiogenese er en fysiologisk prosess som fører til dannelsen av nye blodårer fra eksisterende og oppstår under embryogenesis og orgel vekst. I voksen alder, angiogenese aktiveres bare i sykling eggstokken, i morkaken under svangerskapet, og under såret healing og reparasjon. Angiogenese avhenger av evnen til endothelial celler til å spre, differensiere, og migrere til å danne en intakt vaskulær nettverk1. Imidlertid, inne adskillige uroer, som opphissende, metabolic, og revmatiske sykdommen, angiogenic prosesser er forandret og angiogenese blir overdreven. Dessuten, ukontrollert angiogenic prosesser stimulerer også tumorprogresjon og metastasering1. Av disse grunner, i det siste tiåret, Forskningsstudier er fokusert på utvikling av nye terapeutiske strategier rettet mot hemming av overdreven angiogenese i kreft, øye, joint, eller hud lidelser2,3.
Vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) representerer Hovedmålet for dagens antiangiogen behandling4, og flere anti-VEGF monoklonale antistoffer har blitt utviklet og syntetisert for å hindre overdreven angiogenese. Men, disse syntetiske stoffene viser alvorlige bivirkninger og har en ugunstig kost-til-fordel ratio5,6. Derfor er det viktig å finne nye terapeutiske strategier for å begrense overdreven angiogenese med minimale bivirkninger å utfylle og kombinere med for tiden brukte legemidler. Disse nye stoffene kan bli funnet blant naturlige produkter som er preget av et høyt kjemisk mangfold og biokjemiske spesifisitet.
I denne artikkelen foreslår vi en enkel metode for å evaluere virkningen av RGWE på evnen til HUVECs å danne tubuli på en gelled kjeller matrise in vitro5. Faktisk er RGWE en blanding av sekundære metabolitter som flavonoider og polyfenoler blant som rutin er den viktigste komponenten5. Mange av dem har allerede blitt testet som anti-inflammatorisk og vasoprotective agenter7,8,9,10,11. Videre har vi nylig demonstrert at RGWE, men ikke rutin, er i stand til å hemme HUVEC evne til å danne tubuli på en gelled kjeller matrise og at dette fenomenet er formidlet av MEK-ERK veien, indikerer RGWE som en potensiell terapeutisk verktøy i stand til å hindre overdreven nye blodkar dannelse5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RGWE forberedelse
- Samle R. graveolens blader fra planter i løpet av våren/sommeren under tilsyn av en botaniker.
Merk: I dette tilfellet ble bladene samlet på eksperimentell § medisinske planter i botanisk hage i Napoli, Italia5. Anlegget er spontan, flerårig, og er til stede i middelhavs regionene (figur 1). - Veie 250 g av løv og fint hogge dem med saks.
- Sett bladene i en konisk kolbe og tilsett 1 L destillert vann til 250 g hakkede blader og bringe det til en byll på 110 ° c for 60 min. dekk flasken med aluminiumsfolie for å unngå overdreven fordampning.
- Bruk 3 mm-trakt filter papir for å skille de kokte bladene fra væskefasen som representerer vann ekstrakt.
- Filtrer væskefasen gjennom et filter på 0,22 μm, og samle den i et beger. Dekk begeret med parafilm og fryse ekstraktet ved-80 ° c over natten.
- Lag 10-15 hull med en nål i parafilm og lyophilize ekstraktet i en lyophilizer. Merk at det kan ta et par dager å få pulveret.
- Veie pulveret innhentet, dele den inn i alikvoter, og lagre den ved 4 ° c til nødvendig. Det er mulig å lagre den for et år.
- Når det er nødvendig for forsøkene, utarbeide en lagerløsning, fortynne pulveret med destillert vann til en standard konsentrasjon av 50 mg/mL. Skill det i små-volum (f. eks 1 mL) alikvoter. Dette preparatet kan oppbevares ved-20 ° c til det brukes, men kan ikke oppbevares ved 4 ° c i mer enn et par dager på grunn av oksideringsmidler av molekylene. Unngå å fryse og tine.
2. Cell kultur
- Dyrke HUVECs i endothelial cellevekst medium: endothelial basal medium supplert med 1 μg/mL Hydrocortisone og 1 ng/mL epidermal vekstfaktor, 10% FBS, og penicillin/Streptomycin ved 37 ° c i en atmosfære av 5% CO2.
- Når 80% confluent, splitte cellene i forholdet 1:3 hver passasje. Bruk celler fra to til fem skriftsteder, som ikke viser åpenbare forskjeller som svar på vekstfaktorer. Etter den sjette passasje, celler blir senescent og ikke danner rør på gelled kjelleren matrise.
3. transfeksjoner
- Når HUVECs er 70% confluent, transfect dem med ønsket genet.
- For en 100 mm plate, bruk 1 μg av Tom pCDNA3 vektor som kontroll og 1 mikrogram pCDNA3 vektor som inneholder genet av interesse (constitutively aktiv MEK [caMEK], i dette tilfellet).
- Kompleks 1 μg av DNA med 3 μL av lipofectamine 2 000, fortynnet med redusert serum medium (se tabell over materialer) til det endelige volumet på 200 ΜL. Fjern mediet fra cellene og erstatt det med 1 ml friskt komplett medium; deretter legger du til den transfecting løsningen i cellene. Ruge cellene i inkubator ved 37 ° c, med 5% CO2. Det er også mulig å bruke andre transfeksjoner midler forskjellig fra lipofectamine 2 000, etter produsentens anvisninger.
- Tilsett 7 mL komplett fersk medium 3 h etter transfeksjoner og deretter videre ruge cellene ved 37 ° c for 24-48 h før du fortsetter med neste analyser. Dagen etter transfeksjoner, erstatte mediet med friskt komplett medium.
4. Tube formasjon analysen
- Avkjøl en 96-brønn tallerken og pipette ved 4 ° c i 1 time før du klargjør gelled kjeller.
- På tidspunktet for kjelleren forberedelse, sette platen på is (0 ° c) og tilsett 50 μL av kulde matrise i hver brønn samtidig unngå dannelse av bobler. Merk at den Matrix-inneholdende hetteglass bør holdes på isen under inngrepet siden matrisen blir solid ved romtemperatur.
- Sett platen i inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 i minst 30 min for å la kjelleren til polymeres.
- I mellomtiden høster cellene. Vask HUVECs med 1 mL av en 0,25% Trypsin/0.53 mM EDTA-løsning; Tilsett deretter 2 mL av Trypsin-EDTA-løsningen og ruge ved 37 ° c i 5 min. Observer cellene under et invertert mikroskop for å verifisere at celle laget er fullstendig spredt. Deretter samler du mediet der cellene er suspendert og høste de frittstående cellene ved sentrifugering ved 264 x g i 3 min. Resuspend dem i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS).
- For å telle cellene, tilsett 0,2 mL av celle fjæringen til 0,5 mL PBS og 0,3 mL 0,4% trypan blå oppløsning. Etter 5 minutter ved romtemperatur, telle cellene i et Bürker kammer.
- Resuspend cellene i komplett medium ved konsentrasjonen av 2 x 104 celler/50 ΜL. Seed dem på gelled kjelleren ved konsentrasjonen av 2 x 104 celler per brønn og la dem bosette seg på den.
- Vær oppmerksom på antall celler. For mange eller for få celler kan ikke danne rør på den rette måten på gelled kjelleren.
- Forbered økende doser av RGWE (0,01, 0,1 og 1 mg/mL), fortynning av lager løsningen i kultur medium eller rutin (12, 120 og 300 μg/mL), alt i det endelige volumet av 50 μL/brønn, og legg dem til 50 μL/brønn av celle fjæring. Det endelige volumet i hver brønn vil være 100 μL. Forbered fire til seks brønner for hver eksperimentelle tilstand. Som en kontroll, fortynne destillert vann (kjøretøy) i kultur medium i forholdet 1:50.
- Ruge cellene i inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for en tid som spenner fra 6 til 24 h.
- Observer cellene innen en tidsperiode strekker seg fra 6 til 24 h etter såing, ved hjelp av en fase-kontrast mikroskop med en forstørrelse på 10X. HUVECs er i stand til å danne rør-lignende strukturer innen 6 h, men det er mulig å observere bedre resultater etter 12-18 h. fotografere rør-lignende strukturer på hver brønn og bilde et gjennomsnitt fra tre til fem tilfeldige felt i hver brønn.
- Etter bildet oppkjøpet, kan cellene bli løsrevet fra kjelleren matrise og telles for å evaluere effekten av behandlingen på antall celler. For hver brønn, Fjern mediet, tilsett dispase ved en konsentrasjon på 24 U/mL, og sett platen ved 37 ° c for 1 time. Deretter, fra hver brønn, samle mediet der cellene er suspendert og høste de frittliggende cellene ved sentrifugering ved 264 x g for 3 min. Resuspend dem i 0,2 ml PBS. For å telle cellene, tilsett 0,2 mL celle fjæring til 0,5 mL PBS og 0,3 mL 0,4% trypan blå oppløsning. Etter 5 min ved romtemperatur, telle cellene i Bürker kammeret.
- For å kvantifisere resultatene av røret formasjon analysen, er det mulig å telle antall gren poeng der minst tre rør delta. Ved hjelp av riktig bildeprogramvare, telle for hvert felt i hver mikroskop antall gren poeng og beregne gjennomsnittlig ± standard feil (SE) for hver eksperimentelle tilstand. Bruk en tosidig t-test for å evaluere statistisk betydning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å evaluere påvirkning av RGWE på angiogenese, gjennomførte vi et rør formasjon analysen på en gelled kjeller matrise. Når dyrket på den, HUVECs form tube-lignende strukturer som kommer fra celler som vises langstrakt og som kobler hverandre for å danne en celle-cellenettverk (figur 2). I Figur 3viser vi at antall grener i HUVECs behandlet med RGWE var signifikant lavere sammenlignet med kontroll forholdene. Spesielt, i nærvær av 0,1 mg/mL og 1 mg/mL RGWE, antall grenene er lavere med 40% og 60%, henholdsvis, sammenlignet med kontroll tilstand. Siden rutin har blitt indikert som den viktigste komponenten i RGWE5, analyserte vi dens effekt på HUVEC tube-formasjonen analysen. Som vist i Figur 4, rutin alene er ikke i stand til å påvirke HUVECs ' evne til å danne et celle-cellenettverk. Deretter brukte vi røret formasjon analysen for å undersøke molekylære mekanismer underliggende RGWE-indusert hemming av rør formasjon. Den MEK/ERK intracellulære signalering veien utøver en sentral rolle i angiogenic prosesser. HUVECs transfekterte av caMEK ble behandlet med RGWE og dyrket på gelled kjeller matrise. Som vist i figur 5, i caMEK-transfekterte endothelial celler, RGWE ikke lenger hemmer rør formasjon, mens mock-transfekterte celler, brukt som kontroll, fortsatt danne en celle-cellenettverk på gelled kjelleren matrise og er RESPONSIVE til RGWE, og dermed indikerer at RGWE effekt i angiogenese er formidlet av MEK-ERK veien.
Figur 1: Ruta graveolens. En Ruta graveolens busk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: HUVECs form tube-lignende strukturer på en gelled kjeller matrise. Representative mikroskopiske fotografier av HUVECs kultivert i polystyren parabol (venstre) og på gelled kjeller matrise (høyre). Scale bar = 10 μm.
Figur 3: RGWE hemmer rør dannelse i HUVECs. (A) High-Power mikroskopiske fotografier av HUVECs kultivert på en gelled kjeller matrise behandlet med RGWE (0, 0,01, 0,1, og 1,0 mg/ml). Skalaen bar er 10 μm. (B) prosentandelen av HUVEC gren punkt (mørk grå) i nærvær av RGWE (0,01, 0,1 og 1,0 mg/ml) sammenlignet med ubehandlede celler (0 mg/ml) og trypan blå eksklusjon test (lys grå) på HUVECs behandlet (0,01 , 0,1 og 1 mg/mL) eller ikke (0 mg/mL) med RGWE for 24 h. *p < 0,01 kontra kontroll tilstanden (0 mg/ml). Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± SE av tre uavhengige eksperimenter. Den statistiske betydningen ble oppnådd ved en tosidig t-test.
Figur 4: rutin påvirker ikke dannelsen av HUVEC-rør. (A) høyeffekts, mikroskopiske fotografier av HUVECs seeded på en gelled kjeller matrise og behandles (12, 120 og 300 μg/ml) eller ikke (0 μg/ml) med rutin for 24 timer. Målestokken er 10 μm. (B) prosentandelen av HUVEC gren punkt (mørk grå) i nærvær av økende doser av rutin (12, 120, og 300 μ/ml) sammenlignet med kontroll forhold (0 μg/ml) og trypan blå ekskluderings test (lys grå) på HUVECs behandlet (12 , 120 og 300 μ/mL) eller ikke (0 μg/mL) med rutin for 24 timer. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± SE av tre uavhengige eksperimenter. Statistisk betydning ble oppnådd ved en tosidig t-test.
Figur 5: MEK Pathway formidler RGWE effekter på HUVEC tube formasjon. (A) High-Power mikroskopiske fotografier av HUVECs transfekterte med Tom vektor (mock transfeksjoner) eller med caMEK, seeded på gelled kjelleren matrise og behandlet med økende DOSER av RGWE (0, 0,01, 0,1, og 1 mg/ml). Skalaen bar er 10 μm. (B) prosentandelen av antall gren poeng i HUVECs mock-transfekterte (mørk grå) og i HUVECs transfekterte med caMEK (lys grå) og behandlet med økende DOSER av RGWE (0,01, 0,1, og 1 mg/ml) sammenlignet med kontroll forhold (0 mg/mL). *p < 0,01 kontra kontroll tilstand; § p < 0,05 vs. Cells transfekterte med den tomme vektoren og behandlet med samme mengde RGWE. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± SE av tre uavhengige eksperimenter. Den statistiske betydningen ble oppnådd ved en tosidig t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Naturlige forbindelser er preget av et høyt kjemisk mangfold og biokjemiske spesifisitet og representerer en kilde til potensielt terapeutiske molekyler. Her viser vi hvordan du skaffer vann ekstrakt fra anlegget R. graveolens og foreslå rør formasjon analysen som en lett-å-utføre, pålitelig og kvantitativ metode nyttig å undersøke RGWE ' s effekter på angiogenese. Det er viktig å koke R. graveolens blader for 1 time for å være sikker på å få den komplette vann ekstrakt. Koking for mindre enn 1 h tillot ikke for utvinning av alle molekylene, og ekstraktet kunne ikke utøve den forventede biologiske effekten.
Tube formasjon analysen representerer en in vitro test for å studere den molekylære mekanismer underliggende flere trinn som fører til dannelsen av nye blodårer. Denne analysen gjør forskerne til å identifisere forbindelser i stand til å modulere angiogenese, samt proteiner og signalering kaskader involvert. Videre gjør denne analysen forskerne å teste stoffer som kan påvirke, på samme tid, endothelial celle spredning, vedheft, migrasjon, og protease aktivitet, alle viktige mekanismer i blod fartøy formasjon. Ved hjelp av bare denne typen test, viser vi at RGWE, men ikke den viktigste komponenten rutin, er i stand til å redusere muligheten for HUVECs å danne rør-lignende strukturer uten å påvirke celle levedyktighet og at denne effekten avhenger av MEK-ERK Pathway aktivisering. Det er imidlertid viktig å utføre testen med riktig antall celler. Faktisk, for få eller for mange celler kunne ikke tillate riktig dannelse av rørene. Av denne grunn er det tilrådelig å utføre en foreløpig test for å finne riktig antall celler. Videre er antall celle passasjer like viktig som celle nummeret siden, for å oppnå riktig rør formasjon analysen, må cellene være passert to ganger til fem ganger. Etter passering 6, senescence mekanismer oppstår som kan svekke høyre tube formasjon.
Røret formasjon analysen er en svært reproduserbar analysen, og det kaster lys over fysiologi av endothelial celler, selv om det ikke er gullstandarden for de tredimensjonale studiet av rør formasjon8,9,10, 11i. Tredimensjonale kollagen og fibrin modeller har vist å være bedre for undersøkelser av vaskulær tubulogenesis, spirende, og endothelial celle-pericyte interaksjon. Men sammenlignet med rør formasjon analysen på gelled kjeller matrise, disse testene er mer tid og penger-forbruker11, noe som tyder på at den første kan være en god test for å få foreløpige resultater som kan være grunnlag for mer fokusert in vivo studier. Endelig rør formasjon analysen kan utføres i 24 h, siden nontransformed HUVECs er i stand til å danne rør-lignende strukturer innen 6 h12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet har vært finansiert av Fondi di Ateneo å Luca Colucci-d'Amato og VALERE program midler til Maria Teresa Gentile og AIRC fondet IG18999 til Maurizio Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
