Summary
Aquí, evaluamos los efectos del extracto de agua de Ruta graveolens en la formación de la red de recipientes mediante el uso de un ensayo de formación de tubos en una matriz de sótano gelizado.
Abstract
La angiogénesis es un fenómeno que incluye diferentes procesos, como la proliferación de células endoteliales, la diferenciación y la migración, que conducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos e implican varias vías de transducción de señales. Aquí mostramos que el ensayo de formación de tubos es un método in vitro simple para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis e investigar los mecanismos moleculares involucrados. En particular, en presencia del extracto de agua de Ruta graveolens (RGWE), las células endoteliales ya no son capaces de formar una red celular y que los efectos RGWE sobre la formación de tubos de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) son abolidos por la formación de tubos de células sociales humanas (HUVEC) activación constitutiva de MEK.
Introduction
La angiogénesis es un proceso fisiológico que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes y se produce durante la embriogénesis y el crecimiento de órganos. En la edad adulta, la angiogénesis se activa sólo en el ovario de ciclismo, en la placenta durante el embarazo y durante la cicatrización y reparación de heridas. La angiogénesis depende de la capacidad de las células endotelialespara proliferar, diferenciar y migrar para formar una red vascular intacta 1. Sin embargo, en varios trastornos, como enfermedades inflamatorias, metabólicas y reumáticas, los procesos angiogénicos se alteran y la angiogénesis se vuelve excesiva. Además, los procesos angiogénicos no controlados también estimulan la progresión tumoral y la metástasis1. Por estas razones, en la última década, los estudios de investigación se centran en el desarrollo de nuevasestrategias terapéuticas dirigidas a la inhibición de la angiogénesis excesiva en trastornos del cáncer, ocular, articular o cutáneo 2,3.
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) representa elobjetivo principal de las terapias antiangiogénicas actuales 4, y se han desarrollado y sintetizado varios anticuerpos monoclonales anti-VEGF para prevenir la angiogénesis excesiva. Sin embargo, estas drogas sintéticas muestran efectos secundarios graves y tienen una relación costo-beneficio desfavorable5,6. Por lo tanto, es imperativo encontrar nuevas estrategias terapéuticas para limitar la angiogénesis excesiva con efectos secundarios mínimos para complementar y combinar con los fármacos utilizados actualmente. Estos nuevos fármacos se pueden encontrar entre los productos naturales que se caracterizan por una alta diversidad química y especificidad bioquímica.
En este artículo, proponemos un método sencillo para evaluar el impacto de la RGWE en la capacidad delos HUVEC para formar túbulos en una matriz de sótano gelificada in vitro 5. De hecho, RGWE es una mezcla de metabolitos secundarios como flavonoides y polifenoles entre los que la rutina es el componente principal5. Muchos de ellos ya han sido probados como agentes antiinflamatorios y vasoprotectores7,8,9,10,11. Además, recientemente hemos demostrado que RGWE, pero no la rutina, es capaz de inhibir la capacidad de HUVEC para formar túbulos en una matriz de sótano gelizada y que este fenómeno está mediado por la vía MEK-ERK, lo que indica RGWE como una herramienta terapéutica potencial capaz de evitar la formación excesiva de nuevos vasos sanguíneos5.
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Protocol
1. Preparación de RGWE
- Recoger las hojas de R. graveolens de las plantas durante los meses de primavera/verano bajo la supervisión de un botánico.
NOTA: En este caso, las hojas fueron recogidas en la Sección Experimental de Plantas Medicinales en el Jardín Botánico de Nápoles, Italia5. La planta es espontánea, perenne y está presente enlas regiones mediterráneas (Figura 1). - Pesar 250 g de hojas y picarlas finamente con tijeras.
- Poner las hojas en un matraz cónico y añadir 1 L de agua destilada a 250 g de hojas picadas y llevarlas a ebullición a 110 oC durante 60 minutos.
- Utilice papel de filtro de embudo de 3 mm para separar las hojas hervidas de la fase líquida que representa el extracto de agua.
- Filtrar la fase líquida a través de un filtro de 0,22 m, recogiendo en un vaso de precipitados. Cubrir el vaso de precipitados con parafilm y congelar el extracto a -80 oC durante la noche.
- Hacer 10 - 15 agujeros con una aguja en la parapelícula y liofilizar el extracto en un liofilizador. Tenga en cuenta que puede tomar un par de días para obtener el polvo.
- Pesar el polvo obtenido, dividirlo en alícuotas, y almacenarlo a 4 oC hasta que sea necesario. Es posible almacenarlo durante un año.
- Cuando sea necesario para los experimentos, preparar una solución en stock, diluyendo el polvo con agua destilada a una concentración estándar de 50 mg/ml. Sepárelo en alícuotas de pequeño volumen (por ejemplo, 1 ml). Esta preparación se puede almacenar a -20 oC hasta su uso, pero no se puede almacenar a 4 oC durante más de un par de días debido a las oxidaciones de las moléculas. Evite la congelación y el deshielo.
2. Cultivo celular
- Cultivar los HUVEC en medio de crecimiento celular endotelial: medio basal endotelial complementado con hidrocortisona de 1 g/ml y factor de crecimiento epidérmico ng/ml, 10% FBS, y penicilina/estreptomicina a 37oC en una atmósfera de 5% CO2.
- Cuando el 80% de confluente, divida las celdas en la proporción de 1:3 cada pasaje. Utilice celdas de dos a cinco pasajes, que no muestren diferencias aparentes en respuesta a los factores de crecimiento. Después del sexto pasaje, las células se vuelven senescentes y no forman tubos en la matriz de sótano gelificada.
3. Transfección
- Cuando los HUVEC son un 70% de confluentes, transfectarlos con el gen deseado.
- Para una placa de 100 mm, utilice 1 g de vector pCDNA3 vacío como control y 1 g de vector pCDNA3 que contenga el gen de interés (mek constitutivamente activo [caMEK], en este caso).
- Complejo de 1 g de ADN con 3 ml de lipofectamina 2.000, diluido con medio sérico reducido (ver Tabla de Materiales)al volumen final de 200 l. Retire el medio de las células y reemplácelo por 1 ml de medio fresco completo; luego, agregue la solución de transfectación a las células. Incubar las células de la incubadora a 37oC, con un 5% de CO2. También es posible utilizar otros agentes de transfección diferentes de lipofectamine 2,000, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Añadir 7 ml de medio fresco completo 3 h después de la transfección y, a continuación, incubar las células a 37oC durante 24 - 48 h antes de proceder con los siguientes ensayos. Al día siguiente de la transfección, sustituya el medio por un medio fresco y completo.
4. Ensayo de formación de tubos
- Enfríe una placa de 96 pocillos y puntas de pipeta a 4oC durante 1 h antes de preparar el sótano gelificado.
- En el momento de la preparación del sótano, poner la placa en hielo (0 oC) y añadir 50 oL de matriz fría en cada pocal evitando la formación de burbujas. Tenga en cuenta que el vial que contiene matriz debe mantenerse en hielo durante el procedimiento, ya que la matriz se vuelve sólida a temperatura ambiente.
- Colocar la placa en la incubadora a 37oC con 5% deCO2 durante al menos 30 min para permitir que el sótano se polimerice.
- Mientras tanto, cosecha las células. Lavar los HUVEC con 1 ml de una solución EDTA de 0,25% trypsin/0.53 mM; luego, añadir 2 ml de la solución de trippsina-EDTA e incubar a 37 oC durante 5 min. Observe las células bajo un microscopio invertido para verificar que la capa celular está completamente dispersa. A continuación, recoger el medio en el que se suspenden las células y cosechar las células separadas por centrifugación a 264 x g durante 3 min. Resuspenderlas en 1 ml de solución salina con fosfato (PBS).
- Para contar las celdas, agregue 0,2 ml de la suspensión celular a 0,5 ml de PBS y 0,3 ml de solución de color azul trypan al 0,4%. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, cuente las células en una cámara de B.rker.
- Resuspenda las células en medio completo a la concentración de 2 x 104 células/50 ol. Siembre en el sótano gelizado a la concentración de 2 x 104 células por pozo y déjelas asentarse en él.
- Preste atención al número de celdas. Demasiadas o muy pocas células pueden no formar tubos de la manera correcta en el sótano gelifilado.
- Preparar las dosis crecientes de RGWE (0,01, 0,1 y 1 mg/ml), diluir la solución de stock en medio de cultivo o rutina (12, 120 y 300 g/ml), todo en el volumen final de 50 l/pozo, y añadirlos a 50 l/pozo de suspensión celular. El volumen final en cada pozo será de 100 l. Prepare de cuatro a seis pozos para cada condición experimental. Como control, diluir el agua destilada (vehículo) en el medio de cultivo en una proporción de 1:50.
- Incubar las células de la incubadora a 37oC y 5% deCO2 durante un tiempo que oscila entre 6 y 24 h.
- Observe las células dentro de un rango de tiempo que se extiende de 6 a 24 h después de la sembración, utilizando un microscopio de contraste de fase con un aumento de 10X. Los HUVEC son capaces de formar estructuras similares a tubos dentro de 6 h, pero es posible observar mejores resultados después de 12 - 18 h. Fotografiar las estructuras similares a tubos en cada pozo e imaginar un promedio de tres a cinco campos aleatorios en cada pozo.
- Después de la adquisición de la imagen, las células se pueden separar de la matriz del sótano y contar para evaluar el efecto del tratamiento en el número de células. Para cada poca, retire el medio, añada la dispensa ción a una concentración de 24 U/ml y coloque la placa a 37oC durante 1 h. Luego, de cada poca, recoger el medio en el que se suspenden las células y cosechar las células separadas por centrifugación a 264 x g durante 3 min. Resuspenderlas en 0,2 ml de PBS. Para contar las celdas, agregue 0,2 ml de suspensión celular a 0,5 ml de PBS y 0,3 ml de solución azul trypan al 0,4%. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, cuente las células en la cámara de B.rker.
- Para cuantificar los resultados del ensayo de formación de tubos, es posible contar el número de puntos de bifurcación en los que se unen al menos tres tubos. Usando el software de imagen apropiado, cuente para cada campo en cada micrográfico el número de puntos de bifurcación y calcule la media del error estándar (SE) para cada condición experimental. Utilice una prueba tde dos colas para evaluar la significancia estadística.
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Representative Results
Para evaluar la influencia de RGWE en la angiogénesis, llevamos a cabo un ensayo de formación de tubos sobre una matriz de sótano gelificada. Cuando se cultivan en él, los HUVEC forman estructuras similares a tubos que se originan a partir de células que aparecen alargadas y que se conectan entre sí para formar una red de células celulares (Figura2). En la Figura3, mostramos que el número de sucursales en LOS HUVEC tratados con RGWE fue significativamente menor en comparación con las condiciones de control. En particular, en presencia de 0,1 mg/ml y 1 mg/ml RGWE, el número de ramas es menor en un 40% y un 60%, respectivamente, en comparación con la condición de control. Dado que la rutina se ha indicadocomo el componente principal de RGWE 5, analizamos su efecto en el ensayo de formación de tubos HUVEC. Como se muestra en la Figura4, la rutina por sí sola no puede afectar la capacidad de los HUVEC para formar una red de células celulares. Luego, utilizamos el ensayo de formación de tubos para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la inhibición inducida por RGWE de la formación de tubos. La vía de señalización intracelular MEK/ERK ejerce un papel fundamental en los procesos angiogénicos. Los HUVECs transpirados por caMEK fueron tratados con RGWE y cultivados en la matriz de sótano gelificada. Como se muestra en la Figura 5, en las células endoteliales transtrofadas por caMEK, RGWE ya no inhibe la formación de tubos, mientras que las células simuladas transtrofadas, utilizadas como control, todavía forman una red de células celulares en la matriz del sótano gelificada y responden a RGWE, lo que indica que que el efecto de la RGWE en la angiogénesis está mediado por la vía MEK-ERK.
Figura 1: Ruta graveolens. Un arbusto de Ruta graveolens. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los HUVEC forman estructuras similares a tubos en una matriz de sótano gelificada. Fotografías microscópicas representativas de HUVECs cultivados en plato de poliestireno (izquierda) y en matriz de sótano gelificada (derecha). Barra de escala a 10 m.
Figura 3: RGWE inhibe la formación de tubos en HUVECs. (A) Fotografías microscópicas de alta potencia de HUVEC cultivados en una matriz de sótano gelificada tratada con RGWE (0, 0.01, 0.1 y 1.0 mg/mL). La barra de escala es de 10 m. (B) El porcentaje del punto de bifurcación HUVEC (gris oscuro) en presencia de RGWE (0,01, 0,1 y 1,0 mg/ml) en comparación con las células no tratadas (0 mg/ml) y la prueba de exclusión azul de tripa (gris claro) en HUVECtratados tratados (0,01 , 0,1 y 1 mg/ml) o no (0 mg/ml) con RGWE durante 24 h. *p < 0,01 frente a la condición de control (0 mg/ml). Los resultados se expresan como la media de la SE de tres experimentos independientes. La significación estadística se obtuvo mediante una prueba tde dos colas.
Figura 4: La rutina no afecta a la formación de tubos HUVEC. (A) Fotografías microscópicas de alta potencia de HUVEC sembradas sobre una matriz de sótano gelificada y tratadas (12, 120 y 300 g/ml) o no (0 g/ml) con rutina durante 24 h. La barra de escala es de 10 m. (B) El porcentaje de punto de bifurcación HUVEC (gris oscuro) en presencia de dosis crecientes de rutina (12, 120 y 300 o/ml) en comparación con las condiciones de control (0 g/ml) y la prueba de exclusión azul de tripa (gris claro) en LOS HUVEC tratados (12) , 120 y 300 o/ml) o no (0 g/ml) con rutina durante 24 h. Los resultados se expresan como la media de la SE de tres experimentos independientes. La significación estadística se obtuvo mediante una prueba tde dos colas.
Figura 5: La vía MEK media los efectos de RGWE en la formación de tubos HUVEC. (A) Fotografías microscópicas de alta potencia de HUVECs transclosificados con vector vacío (transfección simulada) o con caMEK, sin cabeza en la matriz de sótano gelificada y tratadas con dosis crecientes de RGWE (0, 0.01, 0.1 y 1 mg/ml). La barra de escala es de 10 m. (B) El porcentaje del número de puntos de rama en HUVECs se infectan simulados (gris oscuro) y en HUVECs transpirados con caMEK (gris claro) y tratados con dosis crecientes de RGWE (0,01, 0,1 y 1 mg/ml) en comparación con el control de control condiciones (0 mg/ml). *p < 0.01 frente a la condición de control; § p < 0,05 frente a las células transtróctas con el vector vacío y tratadas con la misma cantidad de RGWE. Los resultados se expresan como la media de la SE de tres experimentos independientes. La significación estadística se obtuvo mediante una prueba tde dos colas.
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Discussion
Los compuestos naturales se caracterizan por una alta diversidad química y especificidad bioquímica y representan una fuente de moléculas potencialmente terapéuticas. Aquí, mostramos cómo obtener extracto de agua de la planta R. graveolens y proponemos el ensayo de formación de tubos como un método fácil de realizar, confiable y cuantitativo útil para investigar los efectos de RGWE en la angiogénesis. Es importante hervir las hojas de R. graveolens durante 1 h para asegurarse de obtener el extracto de agua completo. La ebullición durante menos de 1 h no permitió la extracción de todas las moléculas, y el extracto no pudo ejercer el efecto biológico esperado.
El ensayo de formación de tubos representa una prueba in vitro para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a los diversos pasos que conducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos. Este ensayo permite a los investigadores identificar compuestos capaces de modular la angiogénesis, así como las proteínas y las cascadas de señalización implicadas. Además, este ensayo permite a los investigadores probar sustancias que pueden influir, al mismo tiempo, en la proliferación de células endoteliales, la adhesión, la migración y la actividad de la proteasa, todos los mecanismos importantes en la formación de los vasos sanguíneos. Usando sólo este tipo de prueba, demostramos que RGWE, pero no su componente principal rutina, es capaz de reducir la capacidad de los HUVECs para formar estructuras similares a tubos sin afectar la viabilidad celular y que este efecto depende de la activación de la vía MEK-ERK. Sin embargo, es importante realizar la prueba con el número correcto de células. De hecho, muy pocas o demasiadas células no podían permitir la correcta formación de los tubos. Por esta razón, es aconsejable realizar una prueba preliminar para encontrar el número correcto de células. Además, el número de pasajes celulares es tan importante como el número de celda ya que, para obtener el ensayo de formación de tubos correcto, las células tienen que ser pasajeras dos a cinco veces. Después del paso 6, se producen mecanismos de senescencia que pueden afectar la formación del tubo derecho.
El ensayo de formación de tubos es un ensayo muy reproducible, y arroja luz sobre la fisiología de las células endoteliales, aunque no sea el estándar de oro para el estudio tridimensional de la formación de tubos8,9,10, 11. Se ha demostrado que los modelos tridimensionales de colágeno y fibrina son mejores para las investigaciones de la tubulogénesis vascular, la brotación y la interacción endotelial de células-pericita. Sin embargo, en comparación con el ensayo de formación de tubos en la matriz de sótano gelizado, estas pruebas consumen más tiempo y dinero11,lo que sugiere que la primera podría ser una buena prueba para obtener resultados preliminares que pueden ser la base para estudios in vivo más centrados. Por último, el ensayo de formación de tubos se puede llevar a cabo en 24 h, ya que los HUVEC no transformados son capaces de formar estructuras tipo tubo dentro de 6 h12,13.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido financiado por Fondi di Ateneo a los fondos del Programa Luca Colucci-D'Amato y VALERE a Maria Teresa Gentile y al fondo AIRC IG18999 a Maurizio Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
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