Questo protocollo descrive una tecnica per l’immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell’organo.
I linfonodi (LN) sono organi sparsi all’interno del corpo, dove le risposte immunitarie innate possono connettersi con l’immunità adattiva. Infatti, le LN sono strategicamente interposte nel percorso dei vasi linfatici, permettendo il contatto intimo degli antigeni tissutali con tutte le cellule immunitarie residenti nella LN. Pertanto, la comprensione della composizione cellulare, della distribuzione, della posizione e dell’interazione utilizzando l’imaging LN intero ex vivo aggiungerà alla conoscenza di come il corpo coordina le risposte immunitarie locali e sistemiche. Questo protocollo mostra una strategia di imaging ex vivo a seguito di una somministrazione in vivo di anticorpi con etichetta fluorescente che consente una metodologia molto riproducibile e facile da eseguire utilizzando microscopi confocali convenzionali e reagenti di magazzino. Attraverso l’iniezione sottocutanea di anticorpi, è possibile etichettare diverse popolazioni di cellule in LN drenanti senza influenzare le strutture tissutali che possono essere potenzialmente danneggiate da una tecnica di microscopia immunofluorescenza convenzionale.
I linfonodi (LN) sono organi a forma di ovoide ampiamente presenti in tutto il corpo con la funzione cruciale di colmare le risposte immunitarie innate e adattative. Gli LN filtrano la linfa per identificare le particelle estranee e le cellule cancerose per montare una risposta immunitaria contro di loro1. Antigeni che presentano cellule (APC), cellule T e cellule B lavorano insieme per generare anticorpi specifici dell’antigene (immunità umoristica) e linfociti citotossici (immunità cellulare) per eliminare le particelle estranee e le cellule cancerose2. Pertanto, la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie presenti nel sistema linfatico avrà importanti implicazioni per lo sviluppo del vaccino e l’immunoterapia del cancro.
L’avvento di potenti microscopi – tra cui nuovi microscopi confocali e super-risoluzione – ha permesso uno straordinario progresso nella comprensione di come si comportano le diverse popolazioni di cellule immunitarie nel loro ambiente nativo3. È ora possibile immaginare diversi sottotipi di cellule simultanee utilizzando una combinazione di sonde con topi geneticamente modificati che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo di specifici obiettivi4,5. Infatti, tecniche ad alta dimensione, tra cui citometria di massa e analisi del flusso multi-parametrico sono state cruciali per espandere le nostre conoscenze su diverse compartimentazioni e funzionalità delle cellule immunitarie nella salute e nella malattia6, 7. Tuttavia, per preparare campioni per queste tecniche, i tessuti hanno bisogno di digestione e le cellule sono separate dal loro ambiente naturale per essere analizzate nelle sospensioni cellulari. Per superare queste limitazioni e consentire una migliore traduzione in biologia, l’obiettivo del protocollo qui proposto è quello di applicare una metodologia semplice per immagini ex vivo interi linfonodi utilizzando microscopi confocali stock con il vantaggio di una migliore velocità, tessuto conservazione della struttura e vitalità cellulare rispetto alla colorazione dell’immunofluorescenza convenzionale. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di dimostrare che i topi carenti per le cellule T, un sottotipo di linfocito T coinvolto nella difesa precoce dell’ospite contro i patogeni4, hanno follicoli compromessi e zone di cellule T rispetto ai topi di tipo selvatico. Questi risultati ci hanno permesso di seguire uno studio in cui abbiamo dimostrato che le cellule T di z svolgono un ruolo critico nell’omeostasi degli organi linfoidi e nella risposta immunitaria umorale4. Inoltre, questo protocollo fornisce un percorso fisiologico per le sonde e gli anticorpi per raggiungere il linfonodo, in quanto vengono somministrati sottocutaneamente e dissipati attraverso la circolazione linfatica dei tessuti, basandosi su precedenti rapporti che hanno utilizzato nell’etichettatura situ con anticorpi per visualizzare strutture associate a linfatiche8,9, dinamica del centro germinale10,11,12, e bersagli facilmente accessibili al flusso sanguigno13 ,14,15.
La combinazione di imaging con altre tecniche, tra cui la biologia molecolare e l’immunofenofotipizzazione ad alta dimensione ha migliorato la nostra capacità di studiare le cellule immunitarie nel loro contesto nativo. Infatti, mentre altri approcci possono richiedere la digestione dei tessuti e l’isolamento cellulare – che può portare alla perdita di integrità tissutale – l’uso dell’imaging in vivo o ex vivo offre un grande vantaggio nello studio di diversi sottotipi di cellule in modo geografico<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).
BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |