Summary
光谱成像已成为在单个样品中识别和分离多个荧光信号的可靠解决方案，并可轻松区分感兴趣的信号和背景或自荧光。激励扫描高光谱成像通过减少必要的图像采集时间，同时提高信噪比，改进了该技术。
Abstract
几种技术依靠荧光信号的检测来识别或研究现象或阐明功能。在高光谱成像出现之前，这些荧光信号的分离被证明是很繁琐的，在高光谱成像中，荧光源可以彼此分离，也可以与背景信号和自荧光分离（只要了解它们的光谱签名）。然而，传统的发射扫描高光谱成像由于对激发光和发射光进行必要的滤波，其采集时间慢，信噪比低。此前已经表明，激发扫描高光谱成像减少了必要的采集时间，同时提高了采集数据的信号噪声比。该协议使用市售设备，描述了如何组装、校准和使用激发扫描高光谱成像显微镜系统，以分离单个样品中多个荧光源的信号。虽然该技术非常适用于细胞和组织的微小成像，但该技术对于利用荧光的任何类型的实验也很有用，在荧光中，激发波长可能发生变化，包括但不限于：化学成像、环境应用、眼部护理、食品科学、法医学、医学和矿物学。
Introduction
光谱成像可以以各种方式进行，并指几个术语1，2，3，4。一般来说，光谱成像是指在至少两个空间维度和一个光谱维度中获取的数据。多光谱和高光谱成像通常以波长波段数或光谱波段是否连续1来区分。对于此应用，高光谱数据被定义为通过连续波长带获得的光谱数据，其间距小于用于激发的每个带通滤波器的一半最大最大宽度 （FWHM） 的全宽度的一半（即 5 nm具有 14-20 nm 带宽的带通滤波器的中心波长间距）。数据波段的连续性质允许对数据集进行过采样，从而确保在采样光谱域时满足奈奎斯特标准。
高光谱成像是由美国宇航局在1970年代和1980年代与第一颗Landsat卫星5，6联合开发的。从多个连续的光谱波段收集数据，可以生成每个像素的辐射光谱。识别和定义单个组件的辐射光谱，不仅能够通过表面材料的特性光谱进行检测，而且还能够去除中间信号，例如信号因大气条件。1996年，Schrück等人使用五种不同的荧光管及其已知光谱的组合来区分标记的染色体，这一概念在1996年应用于生物系统。光谱卡约打字7.2000年，Tsurui等人对组织样品的荧光成像技术进行了详细阐述，使用7种荧光染料和奇异值分解，实现了每个像素的光谱分离，形成参考光谱的线性组合。库8.与遥感同类产品类似，每个已知荧光光的占位可以从高光谱图像中计算，因为每个荧光的光谱都有先验的信息。
高光谱成像还用于农业9、天文学10、生物医学11、化学成像12、环境应用13、眼保健14、食品科学15、法医科学16，17，医学科学18，矿物学19，和监测20。当前荧光显微镜高光谱成像系统的一个关键限制是，标准高光谱成像技术通过 1） 首先过滤激发光来控制样品激发，然后将窄带中的荧光信号分离出来。2） 进一步过滤发射光，将荧光发射分离成窄带，以后可以数学地分离21。过滤激发照明和发射的荧光可减少可用信号量，从而降低信噪比，并需要较长的采集时间。低信号和较长的采集时间限制了高光谱成像作为诊断工具的适用性。
已经开发出一种成像模式，利用高光谱成像，但增加可用的信号，从而减少必要的采集时间21，22。这种称为激发扫描高光谱成像的新模式通过改变激发波长和收集广泛发射的光范围来获取光谱图像数据。此前已经表明，与发射扫描技术21、22相比，这种技术使信噪比上升一个数量级。信噪比的增加主要是由于检测到的发射光的宽带通（±600 nm），而特异性是通过仅过滤激发光而不是荧光发射来提供的。这使得所有发射的光（每个激发波长）都能到达探测器21。此外，该技术还可用于区分自自荧光与外源标签。此外，由于可检测信号的增加，能够缩短采集时间，从而降低光漂白的危险，并允许以光谱视频成像可接受的采集速率进行光谱扫描。
该协议的目的是作为激发扫描高光谱成像显微镜的数据采集指南。此外，还包括有助于了解光路径和硬件的说明。还介绍了用于激发扫描高光谱成像显微镜的开源软件的实现。最后，提供了有关如何将系统校准到 NIST 可追溯标准、调整软件和硬件设置以获得准确结果以及将检测到的信号解为各个组件的贡献的说明。
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Protocol
1. 设备设置
- 光源：选择具有高功率输出和高准直的宽带光谱光源（这些研究使用了300 W Xe弧灯）。
- 快门（可选）：向光路径添加快门，以减少延时成像的光漂白。
- 可调滤波器系统：采用机械调谐组件和薄膜可调滤波器 （TFTF） 设置，以实现所需的波长可调激励范围（例如，360-485 nm）。
- 显微镜：使用倒置荧光显微镜，包括电动双色滤塔和控制器。
- 荧光滤芯：组装长通荧光滤芯。为获得最佳效果，请选择相同波长的二色镜和长通发射滤波器，以实现激发与发射光的最佳分离（例如 495 nm）。
- 目的：使用适当的异色目标，确保在实验所用波长范围内均匀聚焦（本研究使用了60倍水靶）。
- 自动级（可选）：使用自动级，通过图像拼接快速采样多个视场和/或非常大的视场。使用目标和摄像机校准舞台。
- 摄像机：选择合适的摄像机以实现实验的空间分辨率、灵敏度和噪声要求（该系统使用高灵敏度 sCMOS 摄像机）。
2. 采集软件
- 选择允许独立控制每个硬件组件（如 Micro-Manager）的软件包。
- 创建配置文件：配置文件是一组保存的仪器和说明，Micro-Manager 将加载这些仪器和说明以操作系统的硬件。要创建配置文件，请单击"工具>硬件配置向导"。
- 在步骤 1 中，单击"创建新配置 > 下一步"以继续。请注意，如果用户已有可用配置，则用户可以选择修改或浏览现有配置。
- 在步骤 2 中，浏览"可用设备"列表，查找要通过 Micro 管理器控制的设备，如显微镜、灯、舞台、快门和照相机。高亮显示时，单击"添加..."按钮将设备添加到已安装的设备列表中。这将打开一个新窗口。
- 在"标签"框中指定设备的标签。（例如，sCMOS 摄像机）
- 在"值"下，为每个设备选择相应的 COM 端口。这将导致设备属性列表显示在窗口底部。
- 将设备属性保留为其默认设置。请注意，可以根据需要输入每个设备属性的自定义值。
- 添加每个设备后，单击"下一步"按钮以继续执行下一步。请注意，如果任何设备被遗漏或需要更改，可以稍后修改配置文件，如步骤 2.1.1.1 中所述。
- 在步骤 3 中，使用下拉菜单选择默认相机、快门和对焦阶段。如果需要自动快门，请单击对焦阶段下拉列表下方的复选框。如果 Z 级的焦点方向已知，请从"阶段焦点方向"下的下拉列表中选择它（高级）。否则，将默认值保留为"未知"。
- 在步骤 4 中，双击"延迟 [ms]"标题下的框，以设置与自动设备相关的延迟，例如灯、舞台和快门的延迟为 100 ms，以及机械调谐组件的命令的 250 ms 延迟，以考虑滤波器之间的机械切换时间。
- 在步骤 5 中，为状态设备分配标签。激励扫描显微镜系统的配置使用滤块中的标签来识别每个荧光滤镜立方体（例如，状态 0 对应于亮场成像中使用的空白滤镜立方体）标签Bright;状态 3 对应于标签495 nm和自定义 495 nm 二色滤波器立方体，用于在 495 nm 处分离激发和发射光）。标签还用于机械调谐组件中存储每个激发波长的开关命令（例如，状态 0 对应于机械调谐组件的 340 nm 激励波长调谐命令）。
- 在步骤 6 中，单击"配置文件"框旁边的"浏览"按钮，为配置文件选择保存位置和文件名。单击"完成"以保存配置文件。
- 启动组和预设：Micro-Manager 可以在每个配置文件中存储不同的组，以激活或更改硬件的子集。例如，"系统启动"组和预设组合将存储默认设置，例如摄像机的装箱大小和读出速率。
- 通过在"组"小节中的主窗口中单击+创建组（例如系统）。
- 检查组中的任何用途？需要设置默认值的组内的框（例如，在关联的默认摄像机中分箱）。
- 通过单击"预设"子部分的主窗口中的 "，创建新预设（例如，"启动"）。
- 步骤 2 中选中的每个框将在此处显示为预设选项。选择要为每个选中的框加载的默认值。
- 激发波长的组和预设：Micro-Manager将每个激发波长视为自己的通道，并拥有自己的波长切换命令;因此，每个必须保存为自己的预设。
- 创建一个新组以包含一组所需的激发波长（例如，"495 nm 二色度"）
- 选中"在组中使用？"框，该框名为"与VF-5 设备对应的标签"。
- 创建针对每个激发波长命名的新预设（例如，"340 nm"）。
- 为每个预设分配相应的属性名称和预设值（例如，属性名称："标签";预设值："340 nm"）。
- 多维采集工具：点击多 D Acq。在 Micro-Manager 窗口左上角附近打开一个可自定义的工具，用于单击单个按钮即可捕获每个激发波长的样本图像。有几个自定义选项可以完全按照要求构造采集。
- 时点（本例中未使用）：对于没有延时分量的算例，请保持框未选中。如果需要延时算例，请选中此框。如果选中，请在"数字"框中输入执行其余采集设置的次数。通过在"间隔"框中输入持续时间并选择正确的单位（毫秒、秒或分钟;通常为秒），设置连续获取之间的时间。
- 多个位置（XY;本例中未使用）：对于单个 XY 位置的研究，请保持框未选中。如果需要多个 XY 位置，请选中该框并单击"编辑位置列表"按钮以打开单独的窗口。将舞台移动到每个所需位置，然后单击"标记"按钮以在软件中保存该位置。重复上述步骤，直到标记所有所需的 XY 位置。关闭此窗口以继续。
- Z 堆栈（幻灯片;本示例中未使用）：对于单个 Z 位置的研究，请保持框未选中。如果需要多个 Z 位置，请选中此框。将舞台移到所需的 Z 起始位置，然后单击Z 开始框旁边的"设置"按钮。将舞台移动到所需的结束 Z 位置，然后单击Z 端框旁边的"设置"按钮。在Z 步长框中输入所需的步长大小（以微米表示）。
- 通道：确保选中"通道"框。在这里，通道是给出的单个激发波长的名称。可用的"通道"对应于步骤 2.1.2 和 2.1.3 中描述的"组"。
- 组：单击下拉列表以选择一组可从中选择可用的激发波长（例如，495 nm 二色度）。
- 单击"保持快门打开"框，使快门在每个通道的采集之间保持打开状态。请注意，如果选中此框，则快门仍将在连续的光谱扫描之间关闭，前提是主窗口中也选择了自动快门选项。
- 单击"新建"按钮将频道添加到获取列表中。请注意，"删除"按钮可用于删除不再需要的任何通道，并且"向上"和"向下"可用于对任何选定的通道重新排序。
- 确保在光谱扫描中为每个所需波长选择"使用？"复选框。
- 配置：单击"配置"下的下拉列表，选择所需光谱范围内的第一个波长（例如，340 nm）。
- 曝光：双击"曝光"下的框，输入所选波长所需的曝光时间（例如，100 ms 的"100"）。有关选择适当暴露时间的建议，请参阅第 5 节（"数据采集"）。
- Z 偏移（不适用于光谱扫描）：执行光谱扫描时，将此框留空（在 0 处）。
- Z 堆栈：如果执行 Z 堆栈，请确保在光谱范围内针对每个波长选中此框。
- 跳过 Fr.（不适用于光谱扫描）：执行光谱扫描时，请保持此框空白（在 0 处）。请注意，如果一个或几个激发波长明显比其他激发波长强大，或者如果单个激发波长证明特别具有光毒性，则有选择地跳过帧可能很有用。
- 颜色：执行光谱扫描时，此框留空。请注意，可以为单个波长波段选择颜色以进行数据可视化，但颜色不适合后续光谱解混。
- 重复这些步骤，直到在给定的光谱扫描范围内添加每个所需的激发波长。
- 收购顺序：单击下拉列表以选择执行上述选项的顺序（2.1.4.1-2.1.4.5）。对于光谱扫描，如此处所示的扫描，采集顺序只是通道。 请注意，在多维采集工具 [时间点、多个位置 （XY） 和 Z 堆栈（切片）]中，其他选项显示为选中其他框，并允许先选择位置或时间，然后选择切片或切片通道。
- 自动对焦（本例中未使用）：如果选择了多个位置 （XY），则有几个不同样式的自动对焦可用。单击"选项"按钮，从关闭按钮旁边的下拉列表中选择自动对焦方法。
- 摘要：查看此窗口，查看时间点数、XY 位置、Z 切片、通道、图像总数、总内存、扫描持续时间和采集顺序的摘要，以确保列出的信息与预期的采集设置匹配。
- 保存图像：确保选中此框以保存使用多维采集工具收集的数据。
- 单击 ...目录根旁边的按钮，以选择将保存文件的目录根目录。以描述实验相关详细信息的方式命名目录根（例如，GCaMP 气道平滑肌细胞）。
- 在描述当前图像采集（例如 FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter）的"名称前缀"旁边的框中输入名称。建议创建标识视野和曝光时间的名称前缀，以及其他相关信息，如使用的对象和二色滤波器。请注意，使用这些设置拍摄的第一个映像堆栈将保存为名称前缀后的"^1"。具有相同目录根和名称前缀的任何后续堆栈都将与"\n"一起保存，其中"n"是目录中使用此名称使用该堆栈的次数。
- 单击"单独的图像文件"，以确保保存在每个激发波长生成的图像。
- 另存为：单击多维采集工具右上角附近的"另存为..."按钮，保存这些采集设置，以便日后使用。请注意，目录根前缀和名称前缀也将保存。
- 获取：最后，点击获取！按钮，开始根据上面选择的采集设置获取图像。
- 创建配置文件：配置文件是一组保存的仪器和说明，Micro-Manager 将加载这些仪器和说明以操作系统的硬件。要创建配置文件，请单击"工具>硬件配置向导"。
3. 光谱响应校正（可选）：
- 可以执行光谱输出校正，以校准系统的光谱响应到已知标准，如 NIST 可追溯灯或其他 NIST 可追溯标准或仪器。如果结果与其他光谱成像仪器、光谱仪或不同实验室进行比较，此步骤尤其重要。这个过程已经详细报道之前21，23。
- 使用校准到 NIST 可追踪光源（如 LS-1-CAL-INT、海洋光学）或其他 NIST 可追溯标准的光谱仪来获取样品阶段测量的照明的光谱功率。对光源设置、二色镜和物镜的每个组合执行单独的校正。使用与光谱仪耦合的集成球体，从显微镜物镜中精确测量广角照明。
- 使用集成方法（如梯形规则）将光谱辐射数据集成在照亮的波长上。以中心波长为中心的集成 40 nm 带宽对于大多数在半最大 （FWHM） 时具有 14-20 nm 全宽的标称带宽的滤波器来说就足够了。综合值表示每个激发波长波段的光谱照明强度。
- 将每个波长波段的集成强度绘制为激发中心波长的函数，以便可视化光谱照明强度曲线。
- 确定集成强度最低的波长带。
- 通过将最低集成强度除以每个波长波段的集成强度来生成与波长相关的校正因子，从而标准化光谱照明强度曲线。
4. 样品制备
- 准备"空白"样品（例如，在细胞室中放置玻璃盖玻片并添加 1 mL 的缓冲液）。此缓冲区已描述之前24。
- 准备一个未标记的样品，以确定任何样品的自荧光（例如，在细胞室中放置一个含有未标记气道平滑肌细胞25、26的玻璃盖玻片，并添加1 mL的缓冲液）。
- 为实验中使用的每个荧光标签准备单独的单标记样品，如下所示：
- 添加稀释线粒体标签到缓冲，以达到100 nM浓度。将此缓冲液添加到包含气道平滑肌细胞的盖玻片中。在20-25°C下孵育20分钟。将盖玻片移到细胞室并添加 1 mL 的缓冲液。请注意，线粒体标签的最佳浓度会因制造商、相关颜色和所需特异性等因素而异。
- 将含有气道平滑肌细胞的封面滑片与 GCaMP 探针27转染到细胞室，并添加 1 mL 的缓冲液。
- 准备一个或多个含有所需荧光标签混合物的实验样品。
- 将1 mL的缓冲液（线粒体标签100 nM浓度）加入含有带气道平滑肌细胞的盖玻片中，用GCaMP探针转染，并在20-25°C下孵育20分钟。将盖玻片移到细胞室并添加 1 mL 的缓冲液。
5. 数据采集：
- 检查是否选择了适当的二色分束器（例如 495 nm 二色滤镜立方体）、物位（例如 60x 水镜）和摄像机（sCMOS 摄像机）。
- 在舞台上加载示例。
- 双击曝光 [ms]旁边的框，然后键入"100"，将曝光时间设置为 100 ms。 注意，根据样品的荧光强度，暴露时间可能需要增加或减少。
- 从 Micro-Manager 主窗口的下拉菜单中选择 475 nm，以便进行初始样本查看。请注意，475 nm 可能不是样品查看或确定整个图像堆栈中是否会发生过饱和的最佳波长。
- 单击"实时"以查看示例。
- 单击窗口底部直方图旁边的自动强度查看范围按钮"自动"，将最小值和最大值引入有意义的可视范围。
- 使用显微镜的对焦旋钮聚焦样品。找到样本的边缘以帮助对焦通常很有用。当图像中的边要素看起来锐利时，将聚焦该示例。请注意，在聚焦过程中可能需要多次单击"自动"按钮，以帮助查看荧光图像。此外，如果显微镜处于传输模式，一些用户可能会发现更容易将焦点放在样品上。
- 如果在传输模式下对焦，为了安全，首先确保光谱光源没有将光传输到目镜，然后再调整光路进行传输成像。另请注意，传输焦点和荧光图像之间可能存在小偏差。当达到可接受的对焦时，重新配置光谱荧光成像的光路径。
- 单击多 D Acq。按钮靠近窗口左上角，打开多维采集工具（第 2 节中所述和配置）。
- 通过单击多维采集工具窗口右上角的Load...按钮并导航到激励设置，为光谱采集选择适当的光谱范围（例如，495 nm 二色滤波器的 360-485 nm）以前保存（在步骤 2.1.4.10 中）。有关适当光谱范围的信息，请参阅讨论。
- 获取不包含荧光数据的背景/空白图像，用于背景和噪声减法。这可以使用空白样本（步骤 4.1）或通过导航到实验样本的空白区域来执行。如步骤 5.6 所述，这是最容易实现的，找到样品的边缘，然后定位它，使边缘在视场中居中。
- 确认采集设置且背景区域可见后，单击"获取！"按钮以获取包含背景和噪声的光谱图像堆栈，以便以后用于减法。需要注意的是，样品在远离样品边缘时可能有更强烈的荧光。建议在样本中移动以查找"最亮"的区域，并执行多个测试映像堆栈以确定适当的采集时间并避免过度曝光。
- 在样品中似乎具有强烈荧光的区域上拍摄单个图像堆栈，以确保波长和曝光时间没有组合导致过度曝光。
- 使用 ImageJ 确认没有波长包含过度曝光的像素。
- 在 ImageJ 中，单击"文件 > 导入 > 图像序列"并导航到包含步骤 5.10 中拍摄的光谱图像的文件夹。这将打开一个新窗口。单击"图像数"旁边的框并输入光谱扫描中包含的波长数（例如，26）。将"开始"图像和增量保留为"1"。单击"确定"按钮继续。
- 按键盘上的M以利用 ImageJ 的测量功能。确保Max下列出的数字不是摄像机的上限（例如 65，535）。在光谱扫描中对每个图像重复上述步骤。请注意，相机的检测限制取决于摄像机本身。上限显示在 MicroManager 主窗口中直方图的右上角。或者，可以通过在 ImageJ 中打开图像并导航到图像 > 调整 > 亮度/对比度来确定上限。单击生成的弹出窗口中的"设置"按钮，在"最大值"值旁边的空白处输入过大的值（例如 999，999），然后单击"确定"以继续。新直方图中显示的最大值应为摄像机的上限。
- 如果任何图像包含摄像机的上限检测限制（例如 65，535），请调整光谱扫描的曝光时间，以确保整个光谱范围的最大信号不超过摄像机的动态范围。
- 从未标记的样品获取光谱图像数据，以确定任何自荧光。使用与实验剩余时间相同的波长范围和相机设置（例如，每个波长为 100 ms 的 360-485 nm）获取未标记样品的扫描。
- 从单标记样本获取光谱图像数据，用作光谱控制，以建立光谱库。使用相同的波长范围、曝光时间和相机设置执行每个标签的扫描。请注意，某些样品可能需要较长的采集时间，以便以最小的噪声贡献进行精确的标签频谱检测。
- 对实验样品（例如，使用 GCaMP 探针和线粒体标签的人体气道平滑肌细胞）执行测量。
- 将包含实验样品的幻灯片或盖玻片放在显微镜上。
- 选择具有适当标记组织细胞的视场。
- 如上所述，使用所需的采集设置获取光谱图像数据。
6. 图像分析
- 将图像校正为平面光谱响应。
- 减去第 5.9 节中获得的背景光谱，再乘以第 3.1.5 节中确定的校正系数。这可以通过一个简单的 MATLAB 脚本或 ImageJ 例程来完成。南阿拉巴马大学生物成像资源网站上提供了减法/校正 MATLAB 代码（在本例中使用）。
- 在 MATLAB 中加载减法/修正代码。
- 在"编辑"选项卡中，单击"运行"。这将打开一个包含Bsq 校正按钮的新窗口。单击Bsq 更正按钮可打开另一个窗口，其中包含工作目录、背景文件、更正因子文件和未更正的 tiff 文件夹的选项。
- 使用"浏览"..."工作目录"旁边的按钮，用于选择后续窗口将打开的文件路径。导航到包含保存的背景频谱的文件夹（以 .dat 格式）。
- 使用"浏览"...按钮旁边的后台文件 （.dat）打开步骤 6.1.1.2.1 中选择的目录，然后选择所需的后台文件（以 .dat 格式）。单击"打开"按钮以继续。
- 使用"浏览..."按钮选择校正因子 （.dat）旁边的校正因子。校正因子的目录默认为父 MATLAB 代码的位置。如有必要，导航到包含更正因子文件的子文件夹（以 .dat 格式）。突出显示正确的校正因子文件，然后单击"打开"按钮以继续。
- 使用"未更正的 Tiff文件夹"旁边的"浏览..."按钮打开步骤 6.1.1.2.1 中选择的目录，然后选择该文件夹进行背景减法和图像校正（这通常是立即包含原始内容的 Pos0 文件夹）光谱图像）。单击"打开"按钮以继续。
- 单击"查看光谱校正"按钮。处理完成后，将打开一个窗口，显示消息"Bsq 更正完成"。单击"确定"按钮继续。校正图像存储在一个新的文件夹中，该文件夹以原始原始光谱图像文件夹命名，并存储了一个额外的"已更正"（例如，Pos0_已更正）。
- 减去第 5.9 节中获得的背景光谱，再乘以第 3.1.5 节中确定的校正系数。这可以通过一个简单的 MATLAB 脚本或 ImageJ 例程来完成。南阿拉巴马大学生物成像资源网站上提供了减法/校正 MATLAB 代码（在本例中使用）。
- 生成光谱库。可以使用多个软件包从图像中提取光谱数据，包括 ImageJ。为获得最佳效果，通过确定哪个波长波段具有最强烈的值，并将每个波长波段的测量值除以该最大值，将每个端带标准化为强度最大的波长带。还应注意的是，在自荧光样本中生成的单标签对照组需要额外修改28、29、30、31、32。有关详细信息，请参阅步骤 6.2.4 和讨论。
- 在 ImageJ 中，单击"文件 > 导入 > 图像序列"。这将打开一个新窗口。导航到包含已校正的光谱图像的文件夹。双击文件夹中的任何图像文件可打开新窗口。单击"图像数"旁边的框并输入光谱扫描中包含的波长数（例如，26）。将"开始"图像和增量保留为"1"。单击"确定"按钮继续。
- 在 ImageJ 主窗口中，单击"多边形"选择图标，然后通过单击图像使用鼠标指针在包含荧光数据的区域周围创建多边形。请注意，初始波长中可能几乎没有荧光数据。导航到另一个波长图像和/或使用亮度/对比度工具 （图像 > 调整 > 亮度/对比度 > 自动） 更好地可视化包含感兴趣的荧光数据的区域。
- 绘制多边形后，通过单击"图像 > 堆栈>绘图 Z 轴轮廓"来生成 Z 轴轮廓。这将打开一个新窗口。单击"保存"将光谱数据另存为 .csv 文件。
- 执行减法，以确保具有纯标签、不含自荧光污染的正确光谱库。使用以下方程29从单标签和荧光的混合物中分离纯光谱：
(1)
其中：S纯是标签的纯光谱，S混合是受自荧光污染的样品的测量光谱，S自动FL是测量的自荧光光谱，"a"是标量自荧光光谱的乘数（介于 0 和 1 之间;例如 0.4）和"偏移"是偏移（通常为 0）。改变"a"一词，直到实现自荧光的明显贡献接近零值。有关资料可在数份刊物28、29、30、31、32等刊物中找到。
- 解混合光谱图像数据。解混步骤将为每个荧光标签生成丰度图像，其中丰度是图像中来自相应标签的相对荧光信号量。几个解混算法可用于与ImageJ33，34，35。此外，南阿拉巴马大学生物成像资源网站上还提供了光谱解混 MATLAB 代码（在本例中使用）。光谱解混的更全面的概述是36。
- 在 MATLAB 中加载光谱解混代码。
- 编辑波长.mat 和 Library.mat 文件以对应于实验条件（例如，"波长"为 360-485，增量为 5）。
注：这些波长的相应值应加载到每个荧光标签（和自荧光）的"库"中。Endmember_Name 应按与"库"列值相同的顺序列出标签。请注意，Library.mat 文件应同时包含"库"和"Endmember_Name"变量。 - 在"编辑"选项卡中，单击"运行"。这将打开一个新窗口，允许用户选择一个目录。导航到包含要取消混合的光谱图像的文件夹。选择后，这将打开一个新窗口。
- 在结果的空白中，输入图像名称（例如，带有 GCaMP 和 Mito FOV1 的 HASMC）、波长波段数（例如 26）、时间点数（例如 1）以及是否需要 FRET 测量（例如，n）在各自的空白中。如果为 FRET 选择了"n"，则将两个最终成员空白留空。按"确定"继续，这将打开一个新窗口。
- Naviagate 到包含波长.mat 文件的文件夹。选中后，单击"打开"以继续，这将打开一个新窗口。
- 导航到包含库.mat 文件的文件夹。选中后，单击"打开并继续"，这将将未混合的图像保存在包含光谱图像的目录中的新"未混合"文件夹中。
- 检查未混合的光谱图像的质量。
- 打开每个未混合的图像，以目视检查纯组件的分布。
- 将错误图像的大小与未混合图像的大小进行比较（类似于步骤 5.11，可通过 ImageJ 的度量函数完成）。如果误差图像的幅度与未混合丰度图像的幅度相似，则光谱图像数据中很可能存在光谱图像数据中未由光谱库和线性光谱解混过程准确解释的信号。
- 将错误图像与未混合图像进行比较，以查看是否有未识别的残差结构。
- 打开每个未混合的图像，以目视检查纯组件的分布。
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Representative Results
该协议的几个重要步骤是必要的，以确保收集数据是准确和没有成像和光谱伪影。跳过这些步骤可能会导致数据看起来重要，但无法用任何其他光谱成像系统进行验证或复制，从而有效地否定了使用这些数据得出的任何结论。这些重要步骤中最主要的是适当的光谱输出校正（第 3 节）。校正系数补偿可调谐激发系统光谱输出中的波长相关变化。这是通过缩放具有高功率激发的波长来实现的，这样光学照明功率可与具有低功率激发的波长相媲美，从而达到平坦的光谱激发轮廓。不当校正因子的一个示例是在一个或多个波长上包含非常低的值（例如 <0.001），表明在这些波长上测量的强度值必须大大衰减，以实现平坦的光谱响应。
将系统校准至 NIST 可追溯标准可确保使用激发扫描光谱成像系统收集的数据可与其他系统进行比较，这些系统也校准为 NIST 可追溯标准。因此，必须确保任何校正因子适当地调整收集的数据。校正系数的准确性可以通过使用荧光标准（如 NIST 可追溯荧光）进行验证。图 1说明了一个适当和不适当的校正因子，通过图形和图像数据进行可视化。在这种情况下，与光谱范围的其余部分相比，340 nm 的光谱输出几乎不存在，因此几乎每个波长的光谱值都接近零 （<0.001）。应用于图像堆栈，这会导致大多数像素的大多数图像堆栈值接近零。
如第 5 节所述，激发范围、选定的荧光素和采集设置可能会产生一个或多个激发波长图像带包含过饱和像素的可能性。图 2说明了一个示例，其中曝光时间设置过长，用于多个激发波长，从而导致后续图像包含过饱和像素。这一点需要注意，因为如图所示，单个图像和假色图像在视觉上可能都在可接受的强度范围内。
适当选择背景区域进行减法对于系统之间的数据比较也很重要，因为它在 NIST 可追溯光谱校正之前可移除摄像机噪声或杂散光的元素（图 3）。生成光谱图像堆栈的 RGB 假彩色图像，以便可视化图像中的光谱特征，通常有助于后续的图像处理和数据分析步骤。图 4显示了通过合并三个选定波长波段（370 nm = 蓝色、420 nm = 绿色、470 nm = 红色）生成的 RGB 假色图像。
光谱解混需要了解每个荧光源的光谱轮廓。在激发扫描高光谱成像的情况下，这是通过获取每个荧光（和自荧光）的光谱图像堆栈来完成的。图 5包含在从单标签控件中选择区域以生成光谱库的示例。需要注意的是，每个测量都已归化为其峰值波长。
正确执行时，光谱解混过程允许将光谱图像堆栈分离到每个荧光标签的各自贡献中。图 6显示了一个未混合的光谱图像集示例，其中每个信号都有单独的图像：气道平滑肌细胞自荧光、GCaMP 探头和线粒体标签。还显示了与光谱解混相关的误差，并可以对其进行检查，以将误差的强度级别与未混合信号的强度级别进行比较。计算和解释这个错误已经讨论了之前37。如图6所示，与细胞的核和近核区域存在高误差，表明光谱库中的光谱没有很好地解释这些区域的测量光谱。一个潜在的错误来源可能是，GCaMP和线粒体标签的单标签控制是使用气道平滑肌细胞制备的，这些细胞具有高原生自荧光。因此，GCaMP 和线粒体标签可能不代表纯端成员光谱。此外，自荧光信号可能会以未正确解释的方式影响其他两个标签的库光谱，从而导致拟合比使用很少或没有的细胞系获取标签的精度更低。自荧光。此外，还包括一些示例，说明光谱库的分量太少或太多时，导致光谱图像数据的拟合不足和过度拟合（图6，图7，图8， 图 9和表 1。
如第 6.2 节（特别是步骤 6.2.4）所述，从自荧光标记细胞收集的"纯"光谱可能会污染纯分量的光谱配置文件。因此，应注意将感兴趣的标签的纯光谱与其自荧光宿主分开。图 10显示了与受自荧光（混合）污染的"纯"光谱的解混与步骤 6.2.4 中描述的方法计算的纯光谱之间的差异。差异主要发生在未混合自荧光信号中。如果没有适当的信号分离（例如，从 GCaMP 频谱中减去自荧光污染），自荧光和 GCaMP 库组件将争夺每个像素的相同光谱数据，从而导致特征孔或暗点在自荧光图像中。
图 1：用于将图像校正到平面光谱响应的不当和适当的校正因子的示例应用。（A） 绘制了不适当和适当的校正因素.（B） 使用 （A） 中的不当校正因子生成的 RGB 图像。（C） 以与 （B） 相同的视野生成的 RGB 图像，但使用适当的校正因子除外。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：说明适当采集设置重要性的示例。（A，B）由适当的采集时间（A，100 ms）生成的 RGB 图像与具有饱和采集时间（B，500 ms）的相同视场生成。需要注意的是，当假色时，RGB 图像看起来相同。（C） 选择从 （A） 和 （B） 最密集区域调查强度值的感兴趣区域。（D） 从 100 ms 曝光时间图像（A、黑线）和 500 ms 曝光时间（B、红线）绘制每个波长的强度值。需要注意的是，500 ms 曝光时间的像素强度已达到 370 nm 时探测器动态范围 （65，535 AU） 的极限，直到 525 nm 才会降低，从而产生光谱伪影。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：选择背景减法感兴趣的区域。（A） 原始的波长总和强度图像.（B） 选择的图像区域，以确定以红色显示的背景减法的像素平均背景光谱。（C） 背景减去、校正和求和的强度图像。（D） 校正图像 （C） 的 RGB 着色。生成 RGB 假色图像的过程如图4所示。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4： 生成 RGB 假色图像的过程。（A-C）选择三个波长带均匀地分布在光谱采集范围内，用于假着色（蓝色 = 370 nm，绿色 = 420 nm，红色 = 470 nm）。（D） 通过添加图像立方体中所有波长波段的像素强度生成的总和强度图像。（E-G）面板 （A-C） 中的图像及其各自的假颜色查找表应用。（H） （E-G） 的合并图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5: 用于光谱库生成的单标签控件的区域选择。（A） 气道平滑肌 （ASM） 细胞自荧光的 RGB 假色图像。（B） 以红色表示，为光谱库的自荧光分量选择的 （A） 区域。（C） 带有线粒体标签的 RGB 假彩色 ASM 细胞。（D） 以红色表示，为光谱库的线粒体标签组分选择的 （C） 区域。由于在核附近局部的ASM细胞的自荧光，在远离核的远端选择小区域来识别线粒体标签谱。（E） 使用 GCaMP 探针转染的 RGB 假彩色 ASM 细胞.（F） 为光谱库的 GCaMP 组件选择的 （E） 区域以红色显示。与（D）类似，选择了远离原子核的区域。（G） 从A-F获得的光谱库，在具有最强信号的波长处归一化为统一值。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6: 未混合图像数据的示例，其中可以可视化来自每个库组件的未混合的相对信号贡献。（A-D）GCaMP、线粒体标签、自荧光和误差项的未混合丰度。（E-G）面板 （A-C） 中的图像及其各自的假颜色查找表应用。（H） 复合、合并、假彩色图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7: 从正确定义的光谱库中未混合的相对信号贡献，包括平均强度和总荧光百分比。（A-D）自荧光、GCaMP、线粒体标签和误差项的未混合丰度。需要注意的是，误差项包含不到所测量总荧光信号的 10%。请点击此处查看此图的较大版本。
图 8：来自缺少已知包含在样本中的分量的光谱库（即定义不足的光谱库）的未混合相对信号贡献，包括平均强度和总荧光百分比。（A-C）自动荧光、线粒体标签和误差项的未混合丰度。请注意，与图 7相比，从频谱库中省略了 GCaMP 增加了来自库组件的计算的相对信号贡献以及误差项。请点击此处查看此图的较大版本。
图 9：从包含已知在样品中缺少的附加分量（即超定义光谱库）的光谱库中未混合的相对信号贡献，包括平均强度和总荧光百分比。（A-E）自动荧光、GCaMP、线粒体标签、核标签和误差项的未混合丰度。请注意，与图 7相比，在光谱库中添加核标签减少了自荧光计算的相对信号贡献。此外，误差项的误差率低于正确定义的光谱库指定的百分比误差。这是因为过度定义的库几乎总是允许与正确定义的库更好地拟合实验数据，即使已知样本中不存在的组件的丰度信号是（实际上）过度定义光谱库。请点击此处查看此图的较大版本。
图 10: 在适当的自荧光污染信号减法前后使用库时，未混合图像的比较。（A） 在步骤 6.2.4 中详述的缩放减法之前，从高度自荧光气道平滑肌细胞中的单标签对照派生的原始"纯"光谱。（B-D）使用 （A） 作为库生成的未混合自荧光、GCaMP 和核标签图像。（E） 缩放减法后，从高自荧光气道平滑肌细胞的单标签对照衍生的校正纯光谱。（F-H）使用 （E） 作为库生成的未混合自荧光、GCaMP 和核标签图像。请点击此处查看此图的较大版本。
| 平均强度 （AU） | |||
| 正确安装 | 不合身 | 过度拟合 | |
| 自荧光 | 187 | 299 | 164 |
| GCaMP | 139 | - | 140 |
| 线粒体标签 | 246 | 318 | 248 |
| 核标签 | - | - | 26 |
| RMS 错误 | 53 | 126 | 43 |
| 标准偏差 （AU） | |||
| 正确安装 | 不合身 | 过度拟合 | |
| 自荧光 | 362 | 442 | 315 |
| GCaMP | 168 | 168 | |
| 线粒体标签 | 344 | 388 | 345 |
| 核标签 | - | - | 93 |
| RMS 错误 | 62 | 126 | 44 |
| 最大强度 （AU） | |||
| 正确安装 | 不合身 | 过度拟合 | |
| 自荧光 | 6738 | 7409 | 6738 |
| GCaMP | 1336 | - | 1336 |
| 线粒体标签 | 5098 | 5194 | 5098 |
| 核标签 | - | - | 1257 |
| RMS 错误 | 1050 | 1286 | 910 |
| 占总荧光百分比 | |||
| 正确安装 | 不合身 | 过度拟合 | |
| 自荧光 | 30% | 40% | 26% |
| GCaMP | 22% | 43% | 23% |
| 线粒体标签 | 39% | - | 40% |
| 核标签 | - | - | 4% |
| RMS 错误 | 8% | 17% | 7% |
表 1：比较来自适当光谱库和未定义或过度定义的光谱库的未混合丰度图像的平均值、标准偏差和最大未混合丰度强度值，以及每个光谱库的总荧光百分比未混合丰度图像（每个图像的最小未混合丰度强度始终为零）。数据取自图7、图8和图9。
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Discussion
激发扫描高光谱成像设置的最佳应用始于光路径的构造。特别是，光源、滤光片（可调和二色度）、滤波器切换方法和摄像机的选择决定了可用的光谱范围、可能的扫描速度、探测器灵敏度和空间采样。汞弧灯提供许多激发波长峰值，但不提供平坦的光谱输出，并且需要在输出峰值处显著减小信号，才能将光谱图像数据校正回 NIST 可追溯响应38。替代光源，如Xe弧灯和白光超连续激光器，可以提供更均匀的光谱输出，更适合激发扫描高光谱成像38，39，40。光源、可调谐滤波器和二色滤波器的选择决定了可用的光谱范围。在选择这个范围时，应仔细考虑实验样品所需的光谱信息。
此外，应考虑用于可调谐滤波器的开关机制，以及各种摄像机因素，如量子效率、像素大小和可用帧速率，因为这些因素将影响潜在的采样率41 ，42，43.然而，所有其他因素都是恒定的，与大多数发射扫描光谱成像方法21相比，利用激励扫描方法应能提高灵敏度和更快的成像能力。
如导言所述，此处的高光谱成像是指获取数据的连续和光谱重叠性质。因此，系统的功能需要能够使用小于滤波器 FWHM 一半距离的激发中心波长间距来收集数据。如前所述，精心挑选的薄膜可调滤波器阵列允许以中心波长间隔 5 nm 进行数据采集，该距离足以对 FWHM 为 14-20 nm 的滤波器提供的激励频谱进行过度采样。这种间距在频谱数据收集中具有轻微的冗余，并可能提高解混过程的准确性。先前已讨论考虑光谱范围和准确解混所需的波长通道最少数目。为此，鉴于这些滤波器的带宽，应选择激发范围以比二色波束分离器的截止波长低一些（低5-10nm）的波长结束。这将确保激发照明的整个带宽低于二色波束分离器的截止波长（例如，495 二色滤波器的 360-485 nm），以避免激发发射串扰。
需要软件来独立控制硬件的每个组件，以实现高速光谱成像扫描。该软件应该能够操作快门，选择激发波长，并获取图像在足够高的速度，以满足实验条件（确切的采样率要求将有所不同的实验，但一个示例目标可能是获得四每分钟完成光谱图像堆栈）。更复杂的实验可能使用多个二色镜、目标或 XYZ 位置。有许多软件包可用于数据采集47，48。Micro-Manager 是一款用于显微镜自动化的免费开源软件，提供各种定制选项。此外，Micro-Manager 还包括一个脚本面板，用于在主用户界面中不可用的其他自定义。例如，可以使用自定义脚本在所有激励波长将可调谐滤波器切换器的 250 ms 延迟减少到 10 ms，但滤波器轮旋转到新的可调滤波器的波长转换除外，从而降低了有效的成像大多数波长的波长时间为 240 毫秒。这种定制允许在 4 s 以下采集多达 30 个波长。最后，Micro-Manager 可以与其他环境（如 MATLAB）一起操作，以进一步定制显微镜设备控制。
确定正确的光谱激发范围、采集时间和初始波长，以便进行样品查看和随后的数据采集非常重要。但是，系统各个组件的正常运行可能需要进一步故障排除。光路径的每个分量都有助于获取图像数据。因此，验证光路径内光元件的光谱响应和光传输非常重要，尤其是在尝试优化整体系统响应时。光源通常具有可变强度设置，在灯泡40的寿命期内可能会降低功率。如果样品出现暗淡，原因可能是光源输出减少。根据我们的经验，微管理器中的自动快门功能不会 100% 运行。信号不足可能表示快门已关闭。在 Micro-Manager 的配置文件中保存的初始激励波长可能默认为很少或没有光谱输出的波长，如图1所示的 340 nm 示例。
此外，错误选择高于长通二色分束器截止波长的激发波长的情况并不少见，从而导致额外的串扰和/或激发光被直接分流到摄像机上，这可能可能会损坏摄像机传感器。同样，根据显微镜的配置，调整透射成像的光路可能会导致相机信号丢失。此外，如图2所示，选择初始激发波长和曝光时间进行样品观察可能看起来合适，但实际上会导致其他激发波长的像素过饱和。除非为每个图像检查像素饱和度，否则这一事实不会很明显，因此通常谨慎的做法是在样品中似乎含有最强烈荧光的区域上执行测试图像堆栈。
还值得注意的是，在为背景区域选择的图像中可能存在可变强度。应注意确保这些区域实际上不包含相关的图像数据，因为后续的数据校正步骤将从样本中其他区域获取的图像数据中减去此信号。有时需要使用传输设置和/或大幅延长曝光时间，以检查为测量样品背景而选择的区域是否确实不包含样品。同样，未混合的图像可能在自荧光图像中出现暗点或孔。这可能是由于单标记细胞的"纯"光谱信号的自荧光"污染"造成的库内不当。这是因为从含有自荧光的样品中收集的任何"纯"光谱信号都必然包含一些自荧光光谱本身，即使微量。应注意从单标记对照中减去自荧光信号，以确保适当的光谱库，正如曼斯菲尔德等人多次描述的那样， 31，32
虽然本文未演示，但激发扫描光谱成像系统还可用于多个 XY 位置（或由于图像拼接导致的大视场）在多个焦平面上的延时成像和成像。如果单个实验需要这些选项，则应仔细考虑采集顺序的重要性和光漂白的潜在影响。还值得注意的是，如果实际花费的时间超过估计时间（例如，图像堆栈需要 11 s 获取而不是估计的 10 s），Micro-Manager 将继续获取所选时间点和/或仓位的数量。这种误判会使多个时间点复杂化，并改变计算的时间采样，从而可能扭曲从数据得出的任何结论。
此示例演示了在 145 nm 激发扫描范围内分离三个荧光源的能力。以前使用该系统的实验能够在同一范围内分离多达五个荧光源。此图像采集所需的时间不到 1 分钟，这比大多数发射扫描光谱成像系统要快得多。光路的改进（如高速激发波长调谐）可能会进一步推动这种成像技术达到足以进行视频速率光谱成像的速度。
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Disclosures
莱茨利博士和里奇博士披露了一家初创公司SpectraCyteLLC的财务利益，该公司的成立是为了将光谱成像技术商业化。
Acknowledgments
作者希望感谢NSF 1725937、NIH P01HL066299、NIH R01HL058506、NIH S10OD020149、NIH UL1 TR001417、NIH R01HL137030、AHA 18PRE34060163和亚伯拉罕·米切尔癌症研究基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
| Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
| Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
| Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
| Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
| Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
| Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
| Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
| Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
| Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
| Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
| Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
| Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |
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