Excitation-scanning Hyperspectral Imaging mikroskopi til effektivt at diskriminere fluorescens signaler

Summary

Spectral Imaging er blevet en pålidelig løsning til identifikation og adskillelse af flere fluorescens signaler i en enkelt prøve og kan let skelne signaler af interesse fra baggrund eller autofluorescens. Excitation-scanning hyperspectral Imaging forbedrer denne teknik ved at reducere den nødvendige billed erhvervelse tid samtidig øge signal-til-støj-forholdet.

Abstract

Flere teknikker er afhængige af påvisning af fluorescens signaler for at identificere eller studere fænomener eller for at belyse funktioner. Adskillelse af disse fluorescens signaler blev vist besværligt indtil fremkomsten af hyperspectral Imaging, hvor fluorescens kilder kan adskilles fra hinanden såvel som fra baggrunds signaler og autofluorescens (givet kendskab til deres spektral underskrifter). Men traditionelle, emission-scanning hyperspectral Imaging lider af langsomme anskaffelses tider og lav signal-til-støj nøgletal på grund af den nødvendige filtrering af både excitation og emission lys. Det har tidligere vist sig, at excitation-scanning hyperspectral Imaging reducerer den nødvendige erhvervelse tid samtidig øge signal-til-støj forholdet af erhvervede data. Ved hjælp af kommercielt tilgængeligt udstyr, beskriver denne protokol, hvordan man samler, kalibrerer og bruger et excitation-scanning hyperspectral Imaging mikroskopi system til adskillelse af signaler fra flere fluorescens kilder i en enkelt prøve. Selv om denne teknik er meget anvendelig på mikroskopisk billeddannelse af celler og væv, kan den også være nyttig for enhver form for eksperiment, der udnytter fluorescens, hvor det er muligt at variere excitation bølgelængder, herunder, men ikke begrænset til: kemisk billeddannelse, miljø anvendelser, øjenpleje, levnedsmiddelvidenskab, retsvidenskab, lægevidenskab og mineralogi.

Introduction

Spectral Imaging kan udføres på en række forskellige måder og omtales i flere termer^1,2,3,4. Spektral Imaging refererer generelt til data, som er erhvervet i mindst to rumlige dimensioner og en spektral dimension. Multispektral og hyperspectral billeddannelse udmærker sig oftest ved antallet af bølgelængde bånd, eller om spektral båndene er sammenhængende¹. For denne applikation er hyperspectral data defineret som spektraldata erhvervet med sammenhængende bølgelængde bånd opnået ved mellemrum af Center bølgelængder ikke mindre end halvdelen af fuld bredde på halv maksimum (FWHM) af hver båndpas filter anvendes til excitation (dvs., 5 Nm midterbølge længde afstand for båndpas filtre med 14-20 Nm båndbredder). Den sammenhængende karakter af data båndene giver mulighed for en oversampling af datasæt, at sikre, at Nyquist kriterier er opfyldt, når prøvetagning af spektral domænet.

Hyperspectral Imaging blev udviklet af NASA i 1970 ' erne og 1980 ' erne i forbindelse med den første landsat satellit^5,6. Indsamling af data fra flere sammenhængende spektralbånd tillod generering af et Radiance spektrum af hver pixel. Identificering og definition af Radiance spektret af individuelle komponenter gjorde det muligt ikke kun at detektere overfladematerialer ved deres karakteristiske spektre, men det tillod også fjernelse af mellemliggende signaler, såsom variationer i signalet på grund af atmosfæriske forhold. Begrebet påvisning af materialer ved hjælp af deres karakteristiske spektre blev anvendt på biologiske systemer i 1996, når Schröck et al. brugte kombinationer af fem forskellige fluorophorer og deres kendte spektre til at skelne mærkede kromosomer i en proces, der betegnes spektral karyotyping⁷. Denne teknik blev uddybet i 2000 af Tsurui et al. for fluorescens billeddannelse af vævsprøver, ved hjælp af syv fluorescerende farvestoffer og ental værdi nedbrydning for at opnå spektral adskillelse af hver pixel i lineære kombinationer af spektre i reference bibliotek⁸. Svarende til deres telemåling modparter, kan bidraget fra hver kendt fluoroforet beregnes fra hyperspectral billede, givet a priori oplysninger om spektret af hver fluoroforet.

Hyperspectral Imaging er også blevet anvendt i områderne landbrug⁹, astronomi¹⁰, biomedicin¹¹, kemisk billeddannelse¹², miljø anvendelser¹³, Eye Care¹⁴, levnedsmiddelvidenskab¹⁵, retsvidenskab^16,17, medicinsk videnskab¹⁸, mineralogi¹⁹, og overvågning²⁰. En vigtig begrænsning af nuværende fluorescens mikroskop hyperspectral Imaging systemer er, at standard hyperspectral imaging teknologi isolerer fluorescens signaler i smalle bånd ved 1) første filtrering af excitation lys til kontrolprøve excitation, så 2) yderligere filtrering udledt lys til at adskille fluorescens emission i smalle bånd, der senere kan adskilles matematisk²¹. Filtrering af både excitation-belysningen og den udsendte fluorescens reducerer mængden af tilgængeligt signal, hvilket sænker signal-til-støj-forholdet og nødvendiggør lange anskaffelses tider. Det lave signal og de lange anskaffelses tider begrænser anvendeligheden af hyperspectral Imaging som et diagnostisk værktøj.

En Imaging modalitet er blevet udviklet, der gør brug af hyperspectral Imaging, men øger det tilgængelige signal, og dermed reducere den nødvendige erhvervelse tid^21,22. Denne nye modalitet, kaldet excitation-scanning hyperspectral Imaging, erhverver spektral billeddata ved at variere excitation bølgelængde og indsamle en bred vifte af udsendte lys. Det har tidligere vist sig, at denne teknik giver størrelses stigninger i signal-støj-forhold i forhold til emissions scanningsteknikker^21,22. Stigningen i signal-støj-forhold skyldes i høj grad den brede båndpas (~ 600 nm) af emissions lyset detekteret, mens specificitet er tilvejebragt ved at filtrere kun excitation lys i stedet for fluorescens emission. Dette gør det muligt for alle udsendte lys (for hver excitation bølgelængde) at nå sensoren²¹. Derudover kan denne teknik bruges til at diskriminere autofluorescens fra udefrakommende etiketter. Desuden reducerer evnen til at reducere anskaffelsestid på grund af øget detekterbart signal faren for foto blegning samt tillader spektral scanninger ved en erhvervelse sats, der er acceptabelt for spektral video Imaging.

Målet med denne protokol er at tjene som en dataindsamling guide til excitation-scanning hyperspectral Imaging mikroskopi. Desuden er beskrivelser inkluderet, der hjælper med at forstå den lette vej og hardware. Også beskrevet er gennemførelsen af open source-software til en excitation-scanning hyperspectral Imaging mikroskop. Endelig, beskrivelser er fastsat for, hvordan du kalibrere systemet til en NIST-sporbare standard, justere software og hardwareindstillinger for nøjagtige resultater, og unmix det detekterede signal til bidrag fra individuelle komponenter.

Protocol

1. opsætning af enhed

1. Lyskilde: Vælg en bredbånds-spektral lyskilde med høj effekt og høj kollimation (en 300 W XE Arc-lampe blev brugt til disse studier).
2. Lukker (valgfrit): Tilføj en udløser til den optiske sti for at reducere foto blegning for tidsforskudt billeddannelse.
3. Tunable filter system: indarbejde en mekanisk tuning samling og tynd-film tunable filter (TFTF) indstillet til at aktivere den ønskede bølgelængde-justerbar excitation rækkevidde (f. eks 360-485 nm).
4. Mikroskop: Brug et inverteret fluorescens mikroskop, herunder et motoriseret koldtlysreflektorlamper filter tårn og controller.
   1. Fluorescens filter kube: Saml en lang pass fluorescens filter kube. For at opnå de bedste resultater skal du vælge et koldtlysreflektorlamper-spejl og et lang-pass-emissions filter på samme bølgelængde, så du opnår optimal adskillelse af excitation fra emissionlys (f. eks. 495 nm).
   2. Formål: at anvende et passende apokromatisk mål for at sikre et ensartet fokus på det bølgelængde område, der anvendes til forsøget (der blev anvendt et mål på 60x vand til denne undersøgelse).
   3. Automatiseret stadie (valgfrit): Brug et automatiseret stadie til hurtig prøvetagning af flere synsfelter og/eller meget store felter gennem billed syning. Kalibrer scenen med målet og kameraet.
5. Kamera: Vælg et passende kamera for at opnå den rumlige opløsning, følsomhed og støjkrav i eksperimentet (dette system udnyttede et Højfølsom sCMOS-kamera).

2. erhvervelse software

1. Vælg en softwarepakke, der giver mulighed for uafhængig kontrol af hver hardware komponent, f. eks.
   1. Oprettelse af konfigurationsfilen: konfigurationsfilen er et gemt sæt af instrumenter og instruktioner, som Micro-Manager vil indlæse for at betjene systemets hardware. Hvis du vil oprette en konfigurationsfil, skal du klikke på værktøjer ≫ guiden hardware konfiguration.
      1. I trin 1 skal du klikke på Opret ny konfiguration ≫ næste for at fortsætte. Bemærk, at brugeren kan vælge at ændre eller udforske eksisterende konfiguration , hvis der allerede findes en.
      2. I trin 2 skal du gennemse listen over tilgængelige enheder for at finde de enheder, der skal kontrolleres via Micro-Manager, såsom mikroskopet, lampen, scenen, udløseren og kameraet. Når fremhævet, klik på Tilføj... knappen for at tilføje enheden til listen over installerede enheder. Dette vil åbne et nyt vindue.
         1. Angiv enhedens etiket i boksen etiket . (f. eks. sCMOS-kamera)
         2. Vælg den relevante COM-port for hver enhed under værdi. Dette vil få en liste over enhedens egenskaber til at blive vist i bunden af vinduet.
         3. Lad enhedens egenskaber være på standardindstillingerne. Bemærk, at brugerdefinerede værdier for hver enheds egenskab kan indtastes som ønsket.
         4. Når hver enhed tilføjes, skal du klikke på knappen næste for at fortsætte til næste trin. Bemærk, at hvis nogen enheder er udeladt eller skal ændres, kan konfigurationsfilen ændres senere som beskrevet i trin 2.1.1.1.
      3. I trin 3 skal du bruge rullemenuerne til at vælge standardkameraet, lukkeren og fokus stadiet. Hvis Auto-Shutter ønskes, skal du klikke på afkrydsnings feltet under rullelisten fokus fase. Hvis Z-trins fokus retning er kendt, skal du vælge den på rullelisten under trin fokus retninger (avanceret). Ellers skal du lade standarden være Ukendt.
      4. I trin 4 skal du dobbeltklikke på boksene under overskriften forsinkelse [MS] for at angive forsinkelser, der er knyttet til de automatiserede enheder, såsom forsinkelser på 100 ms for lampen, scenen og lukkeren og en 250 ms-forsinkelse for kommandoer til den mekaniske tuning-enhed for at mekanisk koblings tidspunkt mellem filtrene.
      5. Tildel etiketter til tilstands enhederne i trin 5. Konfigurationen af mikroskop systemet excitation-scanning bruger etiketter i filter blokken til at identificere hver fluorescens filter kube (f. eks. svarer tilstanden 0 til etiketten Bright, den tomme filter kube, der bruges under lysbilleddannelse. tilstand 3 svarer til etiketten 495 nm og Custom 495 nm koldtlysreflektorlamper filter Cube anvendes til at adskille excitation og emission lys ved 495 nm). Etiketter bruges også i den mekaniske tuning samling til at gemme skifte kommandoer for hver excitation bølgelængde (f. eks tilstand 0 svarer til 340 nm excitation bølgelængde tuning kommando for den mekaniske tuning samling).
      6. I trin 6 skal du klikke på knappen Gennemse ud for boksen konfigurationsfil for at vælge en Gem placering og et filnavn til konfigurationsfilen. Klik på Udfør for at gemme konfigurationsfilen.
   2. Start grupper og forudindstillinger: Micro-Manager kan gemme forskellige grupper i hver konfigurationsfil for at aktivere eller ændre et undersæt af hardwaren. For eksempel, en "system Startup" gruppe og Preset kombination vil gemme standardindstillinger såsom Binning størrelse og udlæser satser for kameraet.
      1. Opret en gruppe (f. eks. system) ved at klikke på + i hovedvinduet i under afsnittet gruppe .
      2. Tjek enhver brug i gruppe? bokse inde i gruppen, der kræver en standardværdi, der skal angives (f. eks. Binning i det tilknyttede standard kamera).
      3. Opret en ny forudindstilling (f. eks. "opstart") ved at klikke på + i hovedvinduet i det forudindstillede under afsnit.
      4. Hver boks markeret i trin 2 vises som en forudindstillet indstilling her. Vælg en standardværdi, der skal indlæses for hver markeret boks.
   3. Gruppe og presets for excitation bølgelængder: Micro-Manager behandler hver excitation bølgelængde som sin egen kanal med det sin egen bølgelængde switching kommando; Derfor skal hver gemmes som sin egen forudindstilling.
      1. Opret en ny gruppe til at indeholde et sæt af ønskede excitation bølgelængder (f. eks., "495 nm dichroic")
      2. Tjek brug i gruppe? boks med navnet Label , der svarer til VF-5-enheden.
      3. Opret en ny forudindstilling, der hedder for hver excitation bølgelængde (f. eks., "340 nm").
      4. Tildel til hver forudindstilling det relevante egenskabsnavn og den forudindstillede værdi (f. eks. egenskabsnavn: "label"; forudindstillet værdi: "340 nm").
   4. Multi-dimensionelle erhvervelse værktøj: KlikMulti-D ACQ.nær øverste venstre hjørne af Micro-Manager vinduet for at åbne en tilpasselig værktøj til at bruge til at fange et billede af prøven ved hver excitation bølgelængde med et klik på en enkelt knap. Der er flere tilpasningsmuligheder til at konstruere købet nøjagtigt som ønsket.
      1. Tidspunkter (anvendes ikke i dette eksempel): for undersøgelser uden tidsforskudt komponent skal du lade feltet være umarkeret. Hvis der ønskes timelapse-undersøgelser, skal du markere dette felt. Hvis markeret, skal du angive det antal gange, resten af anskaffelses indstillingerne skal udføres i feltet nummer . Angiv tiden mellem efterfølgende anskaffelser ved at angive varigheden i boksen interval og vælge den korrekte enhed (millisekunder, sekunder eller minutter; normalt sekunder).
      2. Flere positioner (XY; ikke brugt i dette eksempel): ved undersøgelser af en enkelt XY-position skal du lade feltet være umarkeret. Hvis der ønskes flere XY-positioner, skal du markere feltet og klikke på knappen Rediger positions liste for at åbne et separat vindue. Flyt scenen til hver ønsket placering, og klik på knappen Mark for at gemme denne position i softwaren. Gentag, indtil alle ønskede XY-positioner er markeret. Luk dette vindue for at fortsætte.
      3. Z-stakke (slides; anvendes ikke i dette eksempel): for studier af en enkelt Z-position skal du lade feltet være umarkeret. Hvis der ønskes flere Z-positioner, skal du markere afkrydsningsfeltet. Flyt scenen til den ønskede begyndelse Z position og klik på knappen set ved siden af z-start boksen. Flyt scenen til den ønskede slut-Z-position, og klik på knappen Angiv ud for boksen z-end . Indtast den ønskede trin størrelse (i mikron) i feltet Z-Step .
      4. Kanaler: Kontroller, at feltet kanaler er markeret. Her, kanaler er navnene givet til de enkelte excitation bølgelængder. Tilgængelige "kanaler" svarer til de "grupper", der er beskrevet i trin 2.1.2 og 2.1.3.
         1. Gruppe: Klik på rullelisten for at vælge en gruppe, hvorfra du kan vælge tilgængelige excitation bølgelængder (f. eks 495 nm dichroic).
         2. Klik på feltet hold lukker åben for at holde lukkeren åben mellem anskaffelserne for hver kanal. Bemærk, at udløseren stadig vil lukke mellem efterfølgende spektral scanninger, hvis dette felt er markeret, forudsat at indstillingen autoshutter også er valgt i hovedvinduet.
      5. Klik på knappen ny for at føje kanaler til anskaffelses listen. Bemærk, at knappen Fjern kan bruges til at fjerne alle kanaler, der ikke længere ønskes, og at op og ned kan bruges til at omarrangere enhver valgt kanal.
         1. Sørg for, at Brug? afkrydsningsfeltet er markeret for hver ønsket bølgelængde i spektral scanningen.
         2. Konfiguration: Klik på rullelisten under konfiguration , og vælg den første bølgelængde i det ønskede spektralområde (f. eks. 340 nm).
         3. Eksponering: Dobbeltklik på feltet under eksponering , og Indtast den ønskede eksponeringstid for den valgte bølgelængde (f. eks. "100" for 100 ms). Se afsnit 5 ("data indsamling") for at få forslag til at vælge passende eksponeringstider.
         4. Z-forskydning (gælder ikke i en spektral scanning): Lad dette felt være tomt (ved 0), når der udføres en spektral scanning.
         5. Z-stack: Sørg for, at denne boks er markeret for hver bølgelængde i spektral området, hvis der udføres en Z-stak.
         6. Skip fr. (ikke relevant i en spektral scanning): Lad dette felt være tomt (ved 0), når der udføres en spektral scanning. Bemærk, at det kan være nyttigt at selektivt springe rammer i tilfælde af, at en eller få excitation bølgelængder er betydeligt mere magtfulde end andre, eller hvis individuelle excitation bølgelængder viser sig at være særligt fototoksiske.
         7. Farve: Lad dette felt være tomt, når du udfører en spektral scanning. Bemærk, at farverne kan vælges for individuelle bølgelængde bånd til datavisualisering formål, men farve er upassende for efterfølgende spektral unmixing.
         8. Gentag disse trin, indtil hver ønsket excitation bølgelængde inden for det givne spektral scanningsområde er tilføjet.
      6. Anskaffelses ordre: Klik på rullelisten for at vælge, i hvilken rækkefølge ovenstående indstillinger (2.1.4.1-2.1.4.5) skal udføres. For spektral scanninger som den, der er vist her, er overtagelses rækkefølgen simpelthen kanal. Bemærk, at yderligere indstillinger vises som ekstra felter er markeret i det flerdimensionelle anskaffelses værktøj [tidspunkter, flere positioner (XY) og Z-stakke (udsnit)] og giver mulighed for valg af enten position eller tid først, efterfulgt af enten skive eller Kanal.
      7. Autofokus (anvendes ikke i dette eksempel): Hvis flere positioner (XY) er valgt, er flere forskellige stilarter af autofokus tilgængelige. Klik på knappen Indstillinger , og vælg en autofokus metode på rullelisten ved siden af knappen Luk .
      8. Oversigt: Gennemse dette vindue for at se en oversigt over antal tidspunkter, XY-positioner, Z-udsnit, kanaler, samlet antal billeder, samlet hukommelse, scannings varighed og anskaffelses rækkefølge for at sikre, at de anførte oplysninger svarer til de forventede anskaffelses indstillinger.
      9. Gem billeder: Sørg for, at dette felt er markeret for at gemme de indsamlede data ved hjælp af det flerdimensionelle anskaffelses værktøj.
         1. Klik på knappen... knappen ved siden af mappe roden til at vælge en mappe rod, hvor filerne vil blive gemt. Navngiv mappens rod på en måde, der beskriver de relevante oplysninger om eksperimentet (f. eks. glatte muskelceller fra GCaMP).
         2. Angiv et navn i feltet ud for navnepræfiks , der beskriver den aktuelle billed anskaffelse (f. eks. FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Det er tilrådeligt at oprette et navn præfiks, der identificerer synsfeltet og eksponeringstid, samt andre relevante oplysninger, såsom objektet og koldtlysreflektorlamper filter, der anvendes. Bemærk, at den første billedstak, der tages med disse indstillinger, gemmes med "_1" efter navnepræfikset. Enhver efterfølgende stak, der er taget med samme mappens rod og navnepræfiks, vil blive gemt med "_n", hvor "n" er det antal gange, en stak er blevet taget med dette navn i kataloget.
         3. Klik på separate billedfiler for at sikre, at det billede, der genereres ved hver excitation-bølgelængde, gemmes.
      10. Gem som: Klik på knappen Gem som... øverst til højre i multi-dimensionelle anskaffelses værktøj for at gemme disse anskaffelses indstillinger til nem fremtidig brug. Bemærk, at mappen root og Name præfikser vil blive gemt, samt.
      11. Erhverve: Endelig, klik på erhverve! knappen for at begynde at erhverve billeder i henhold til erhvervelse indstillinger valgt ovenfor.

3. korrektion af spektral respons (valgfrit):

1. Spektral udgang korrektion kan udføres for at kalibrere systemets spektral respons til en kendt standard, såsom en NIST-sporbare lampe eller anden NIST-sporbare standard eller instrument. Dette trin er især vigtigt, hvis resultaterne sammenlignes med andre spektral billedbehandlings instrumenter, spektrometre eller mellem forskellige laboratorier. Denne proces er blevet rapporteret i detaljer tidligere^21,23.
   1. Brug et spektrometer, der er kalibreret til en NIST-sporbar lyskilde (såsom LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) eller anden NIST-sporbare standard til at erhverve den spektroradiometriske effekt af belysningen som målt i prøvestadiet. Udfør en separat korrektion for hver kombination af lyskilde indstilling, koldtlysreflektorlamper-spejl og objektiv. Brug en integrerssfære koblet til spektrometer til nøjagtigt at måle vidvinkel belysning fra mikroskopet mål.
   2. Brug en integrationsmetode, såsom trapez reglen, til at integrere spektroradiometriske data over bølgelængder belyst. En 40 nm båndbredde for integration centreret omkring midten bølgelængde er tilstrækkelig for de fleste filtre, der har en nominel båndbredde på mellem 14-20 Nm fuld bredde på halv-maksimum (FWHM). Den integrerede værdi repræsenterer intensiteten af spektral belysningen ved hvert excitation bølgelængde bånd.
   3. Plot den integrerede intensitet af hvert bølgelængde bånd som en funktion af excitation Center bølgelængde for at muliggøre visualisering af spektral belysning intensitet profil.
   4. Bestem bølgelængde båndet med den laveste integrerede intensitet.
   5. Normaliser profilen for spektral belysnings intensitet ved at dividere den laveste integrerede intensitet med den integrerede intensitet af hvert bølgelængde bånd for at generere en bølgelængde afhængig korrektionsfaktor.

4. forberedelse af prøver

1. Forbered en "blindprøve" (f. eks. Anbring en glas dækseddel i celle kammeret, og tilsæt 1 mL buffer). Denne buffer er blevet beskrevet tidligere²⁴.
2. Forbered en ikke-mærket prøve for at bestemme enhver prøve autofluorescens (f. eks. Anbring en glasdækseddel, der indeholder ikke-mærkede luftvejs glatte muskelceller^25,26 i celle kammeret og tilsæt 1 ml buffer).
3. Der fremstilles et separat prøveeksemplar med én etiket for hvert fluorescerende mærke, som anvendes i forsøget:
   1. Tilsæt fortyndet mitokondrie etiket til buffer for at opnå en 100 nM koncentration. Tilføj denne buffer til dækglas, der indeholder luftvejene glatte muskelceller. Inkuber i 20 min ved 20-25 °C. Flyt dæksedlen til celle kammeret, og tilsæt 1 mL buffer. Bemærk, at den optimale koncentration af mitokondrie etiketten vil variere med faktorer som producent, tilhørende farve, og ønskede specificitet.
   2. Flyt en dækseddel, der indeholder luftvejene glatte muskelceller transficeret med gcamp Probe²⁷ til celle kammeret og tilsæt 1 ml buffer.
4. Forbered en eller flere eksperimentelle prøver indeholdende en blanding af de ønskede fluorescerende etiketter.
   1. Der tilsættes 1 mL buffer (100 nM koncentration af mitokondrie etiketten) til en dækseddel, som indeholder glatte muskelceller i luftvejene, som er transficeret med GCaMP-sonden og Inkuber i 20 min ved 20-25 °C. Flyt dæksedlen til celle kammeret, og tilsæt 1 mL buffer.

5. data indsamling:

1. Kontrollér, at den korrekte koldtlysreflektorlamper beamsplitter (f. eks. 495 nm koldtlysreflektorlamper filter Cube), objektiv (f. eks. 60x vandmål) og kamera (scmos-kamera) er valgt.
2. Læg prøven på scenen.
3. Dobbeltklik på feltet ved siden af Exposure [MS] og skriv "100" for at indstille eksponeringstid på 100 ms. Bemærk, at eksponeringstiden muligvis skal øges eller mindskes afhængigt af prøvens fluorescens intensitet.
4. Vælg 475 nm i rullemenuen i hovedvinduet i Micro Manager for at få vist første eksempelvisning. Bemærk, at 475 nm muligvis ikke er den optimale bølgelængde for eksempelvisning eller bestemmelse af, om overmætning vil forekomme i hele billed stakken.
5. Klik på Live for at få vist eksemplet.
   1. Klik på knappen automatisk intensitets visningsområde automatisk ved siden af histogrammet nederst i vinduet for at bringe minimum-og maksimumværdierne ind i meningsfulde visuelle intervaller.
6. Brug mikroskop fokus knapper til at fokusere på prøven. Det er ofte nyttigt at finde kanten af prøven til at hjælpe med at fokusere. Eksemplet vil blive fokuseret, når Edge-funktionerne i billedet ser skarpe ud. Bemærk, at det kan være nødvendigt at klikke på knappen Auto flere gange under fokusering for at hjælpe med at se fluorescens billedet. Desuden kan nogle brugere finde det lettere at fokusere på prøven, hvis mikroskopet er i transmissions tilstand.
   1. Hvis fokus i transmissions modus, for sikkerhed, først sikre, at den spektral lyskilde ikke sender lys til okulerne før justering af lysbanen for transmission Imaging. Bemærk også, at der kan være små afvigelser mellem fokus for transmission og fluorescensbilleder. Når acceptabelt fokus er nået, skal du omkonfigurere lysbanen til spektral fluorescens Imaging.
7. Klik på multi-D ACQ. knap øverst til venstre i vinduet for at åbne det flerdimensionelle anskaffelses værktøj (beskrevet og konfigureret i afsnit 2).
8. Vælg et passende spektral interval for spektral erhvervelse (f. eks. 360-485 nm for 495 nm koldtlysreflektorlamper-filteret) ved at klikke på knappen Indlæs... øverst til højre i vinduet flerdimensionelle anskaffelses værktøj og navigere til indstillingerne for excitation gemt tidligere (i trin 2.1.4.10). Se diskussionen for at få oplysninger om passende spektral intervaller.
9. Erhverve en baggrund/tomt billede, der ikke indeholder fluorescens data til brug for baggrund og støj subtraktion. Dette kan udføres ved hjælp af en tom prøve (trin 4,1) eller ved at navigere til et tomt område af en eksperimentel prøve. Som beskrevet i trin 5,6 opnås dette lettest ved at finde kanten af prøven og derefter placere den, så kanten er centreret inden for synsfeltet.
   1. Når anskaffelses indstillingerne er bekræftet, og et baggrundsområde er synligt, skal du klikke på knappen Hent! for at anskaffe en spektral billedstak, der indeholder baggrund og støj, som kan bruges til subtraktion senere. Det skal bemærkes, at prøver sandsynligvis vil have mere intens fluorescens væk fra kanten af prøven. Det kan være tilrådeligt at flytte om prøven for at finde de "lyseste" regioner og udføre flere test billede stakke til at bestemme passende anskaffelses tider og undgå overeksponering.
10. Tag et enkelt billede stak på et område af prøven, der synes at have intens fluorescens for at sikre, at ingen kombination af bølgelængder og at eksponeringstider resultere i overeksponering.
11. Brug ImageJ til at bekræfte, at ingen bølgelængder indeholder over eksponerede pixels.
    1. Klik på filer ≫ importer ≫ billedsekvens i ImageJ, og Naviger til den mappe, der indeholder de spektral billeder, der er taget i trin 5,10. Dette vil åbne et nyt vindue. Klik på feltet ud for antal billeder , og Indtast det antal bølgelængder, der er inkluderet i spektral scanningen (f. eks. 26). Forlad startbillede og Forøg som "1". Klik på knappen OK for at fortsætte.
    2. Tryk på M på tastaturet for at bruge imagej's måle funktion. Sørg for, at det antal, der er angivet under Maks , ikke er den øvre detektionsgrænse for kameraet (f. eks. 65.535). Gentag dette for hvert billede i spektral scanningen. Bemærk, at detekteringsgrænsen for kameraet afhænger af selve kameraet. Den øvre grænse vises i øverste højre del af histogrammet i hovedvinduet i MicroManager. Alternativt kan den øvre grænse bestemmes ved at åbne et billede i ImageJ og navigere til billedet ≫ justere ≫ lysstyrke/kontrast. Klik på knappen Indstil i det resulterende pop op-vindue, Angiv en alt for stor værdi (f. eks. 999.999) i feltet blank ved siden af den maksimalt viste værdi, og klik på OK for at fortsætte. Den maksimale værdi, der vises i det nye histogram, skal være kameraets øvre detektionsgrænse.
    3. Hvis billeder indeholdt den øvre detektionsgrænse for kameraet (f. eks. 65.535), skal du justere eksponeringstid for spektral scanningen for at sikre, at det maksimale signal i spektral intervallet ikke overskrider kameraets dynamiske område.
12. Hent spektral billeddata fra ikke-mærkede prøver for at bestemme enhver autofluorescens. Hent scanningen for de ikke-mærkede prøver ved hjælp af et identisk bølgelængde område og kameraindstillinger som resten af eksperimentet (f. eks. 360-485 nm ved 100 MS pr. bølgelængde).
13. Få spektral billeddata fra enkelt mærkede prøver, så de kan bruges som spektral kontrol til at opbygge spektral biblioteket. Udfør scanningen for hver etiket ved hjælp af et identisk bølgelængde område, eksponerings tidspunkt og kameraindstillinger. Bemærk, at der kan være behov for en længere erhvervelses tid for nogle prøver for at give mulighed for nøjagtig etiket frekvens registrering med minimal støj tilførsel.
14. Udfør målinger på en eksperimentel prøve (f. eks. glatte muskelceller i humane luftveje med GCaMP-sonde og mitokondriel-etiket).
    1. Placer et dias eller en dækseddel, der indeholder den eksperimentelle prøve på mikroskopet.
    2. Vælg et synsfelt med passende mærkede celler af væv.
    3. Erhverve spektral billeddata ved hjælp af de ønskede anskaffelses indstillinger, som beskrevet ovenfor.

6. billedanalyse

1. Korrekte billeder til et fladt spektral respons.
   1. Trække baggrunds spektret, som er opnået i punkt 5,9, og multiplicere med den justeringskoefficient, som er fastlagt i afsnit 3.1.5. Dette kan gøres med en simpel MATLAB script eller ImageJ rutine. En subtraktion/korrektion MATLAB kode (bruges i dette eksempel) er tilgængelig på University of South Alabama bioimaging Resources hjemmeside.
      1. Indlæs subtraktions-/korrektions koden i MATLAB.
      2. Klik på Kørunder fanen Editor. Dette vil åbne et nyt vindue, der indeholder en bsq korrektion knap. Klik på knappen bsq Correction for at åbne et andet vindue, der indeholder valgmuligheder for arbejdsmappe, baggrundsfil, korrektionsfaktor fil og ikke-korrigeret TIFF-mappe.
         1. Brug Gennemse... knappen ved siden af arbejdsmappe for at vælge den filsti, hvor efterfølgende Vinduer vil åbne. Naviger til den mappe, der indeholder det gemte baggrunds spektrum (i. dat-format).
         2. Brug Gennemse... knap ved siden af baggrund fil (. dat) hen til lukke op den bibliotek valgt i skridt 6.1.1.2.1 og gide den ønsket baggrund fil (i. dat format). Klik på knappen Åbn for at fortsætte.
         3. Brug knappen Gennemse... ved siden af korrektionsfaktoren (. dat) til at vælge en korrektionsfaktor. Mappen for korrektionsfaktoren er som standard placeringen af den overordnede MATLAB-kode. Naviger om nødvendigt til den undermappe, der indeholder korrektionsfaktor filen (i. dat-format). Fremhæv den korrekte korrektionsfaktor fil og klik på knappen Åbn for at fortsætte.
         4. Brug knappen Gennemse... ved siden af ikke-korrigeret TIFF-mappe for at åbne den mappe, der er valgt i trin 6.1.1.2.1, og Vælg mappen til subtraktion i baggrunden og billedkorrektion (dette er normalt den Pos0 mappe, som straks indeholder den rå spektral billeder). Klik på knappen Åbn for at fortsætte.
         5. Klik på knappen Klik for spektral korrektion . Når behandlingen er fuldført, åbnes et vindue med meddelelsen "bsq-korrektion fuldført". Klik på knappen OK for at fortsætte. Korrektions billederne gemmes i en ny mappe, der er knyttet til den originale RAW-spektral billedmappe og en ekstra "_Korrigeret" (f. eks. Pos0_Corrected).
2. Generer spektral biblioteket. Flere softwarepakker kan bruges til at udtrække spektraldata fra billeder, herunder ImageJ. For de bedste resultater, normalisere hvert endmember til bølgelængde bånd af største intensitet ved at bestemme, hvilket bølgelængde bånd har den mest intense værdi og dividere målingen ved hvert bølgelængde bånd med denne maksimale værdi. Det skal også bemærkes, at enkelt-label kontrol genereret inden for auto-luorescent prøver vil have brug for yderligere modifikationer^{28,29,30,31,32}. Se trin 6.2.4 og diskussion for detaljer.
   1. Klik på filer ≫ importer ≫ billedsekvensi ImageJ. Dette vil åbne et nyt vindue. Naviger til den mappe, der indeholder de korrigerede spektral billeder. Dobbeltklik på en billedfil i mappen for at åbne et nyt vindue. Klik på feltet ud for antal billeder , og Indtast det antal bølgelængder, der er inkluderet i spektral scanningen (f. eks. 26). Forlad startbillede og Forøg som "1". Klik på knappen OK for at fortsætte.
   2. Klik på ikonet polygon valg i ImageJ-hovedvinduet, og brug derefter musemarkøren ved at klikke på billedet for at oprette en polygon omkring et område, der indeholder fluorescens data. Bemærk, at der kan være lidt at ingen fluorescens data i den indledende bølgelængde. Naviger til et andet bølgelængde billede og/eller brug værktøjet lysstyrke/kontrast (billede ≫ justere ≫ lysstyrke/kontrast ≫ Auto) for bedre at visualisere regioner, der indeholder fluorescens data af interesse.
   3. Med polygonen tegnet, generer Z-aksen profil ved at klikke på billede ≫ stakke ≫ plot Z-akse profil. Dette vil åbne et nyt vindue. Klik på Gem for at gemme spektral dataene som en. csv-fil.
   4. Udfør en subtraktion for at sikre et korrekt spektral bibliotek med rene etiketter uden autofluorescens kontaminering. Brug følgende ligning²⁹ til at isolere et rent spektrum fra blandingen af en enkelt etiket og fluorescens:
      1
      Hvor: s_Pure er det rene spektrum af etiketten, s_blandet er det målte spektrum af prøven forurenet med Autofluorescens, s _autofl er det målte autofluorescens spektrum, "a" er en skalar multiplikator af autofluorescens spektrum (mellem 0 og 1, f. eks. 0,4), og "offset" er en forskydning (normalt 0). Varier "a"-termen, indtil der opnås en værdi nær nul for det tilsyneladende bidrag fra autofokus. Yderligere oplysninger findes i flere publikationer^{28,29,30,31,32}.
3. Unmix de spektral billeddata. Udblande trinnet vil generere et overflod billede for hver fluorescerende etiket, hvor overflod er mængden af relative fluorescens signal i billedet fra den respektive etiket. Flere unmixing algoritmer er tilgængelige til brug med ImageJ^33,34,35. Derudover er en spektral unmixing MATLAB kode (anvendes i dette eksempel) tilgængelig på University of South Alabama bioimaging Resources hjemmeside. En mere omfattende oversigt over spektral unmixing er tilgængelig³⁶.
   1. Indlæs den spektral unmixing-kode i MATLAB.
   2. Rediger bølgelængde. mat-og Library. mat-filerne, så de svarer til forsøgsbetingelserne (f. eks. "bølgelængde" som 360-485 i trin på fem).
      Bemærk: de tilsvarende værdier for disse bølgelængder skal indlæses i "bibliotek" for hver fluorescerende etiket (og autofluorescens). Endmember_Name bør liste etiketterne i samme rækkefølge som kolonneværdierne for "bibliotek". Bemærk, at filen Library. mat skal indeholde både "Library"-og "Endmember_Name"-variabler.
   3. Klik på Kørunder fanen Editor. Dette vil åbne et nyt vindue giver brugeren mulighed for at vælge en mappe. Naviger til den mappe, der indeholder de spektral billeder, der skal være ublandede. Når først udsøgt, indeværende vil lukke op en ny rude.
   4. I de resulterende emner skal du indtaste billedets navn (f. eks. HASMC med GCaMP og Mito FOV1), antal bølgelængde bånd (f. eks. 26), antal tidspunkter (f. eks. 1) og om der ønskes en FRET-måling (f. eks. n) i deres respektive emner. Hvis n er valgt for FRET, skal du lade begge Medlemsemner være tomme. Tryk på OK for at fortsætte, hvilket vil åbne et nyt vindue.
   5. Naviagate til den mappe, der indeholder bølgelængde. mat-filen. Når det er valgt, skal du klikke på Åbn for at fortsætte, hvilket åbner et nyt vindue.
   6. Naviger til den mappe, der indeholder filen Library. mat. Når du er valgt, skal du klikke på Åbn for at fortsætte, hvilket vil gemme de ublandede billeder i en ny "ublandet" mappe inde i kataloget, der indeholder spektral billederne.
4. Undersøg de ublandede spektral billeder for kvalitet.
   1. Åbn hvert ublandet billede for visuelt at inspicere distributionen af rene komponenter.
      1. Sammenlign størrelsen af fejl billedet med de ublandede billeder (svarende til trin 5,11, dette kan gøres gennem Imagej's foranstaltning funktion). Hvis størrelsen af fejl billedet er ens i størrelsesorden til de ublandede overflod billeder, er det sandsynligt, at der er signaler i spektral billeddata, der ikke er præcist tegnede sig for spektral biblioteket og den lineære spektral unmixing proces.
      2. Sammenlign fejl billedet med de ublandede billeder for at se, om der er uidentificerede rest strukturer.

Representative Results

Flere vigtige skridt fra denne protokol er nødvendige for at sikre indsamlingen af data, der er både nøjagtige og blottet for billeddannelse og spektral artefakter. Hvis du springer disse trin over, kan det resultere i data, der ser betydningsfulde ud, men som ikke kan verificeres eller gengives med andre spektral billedbehandlingssystemer, hvilket effektivt ophæver eventuelle konklusioner, der er foretaget med de pågældende data. Chief blandt disse vigtige trin er korrekt spektral output korrektion (afsnit 3). Korrektionsfaktoren kompenserer for bølgelængde afhængige variationer i den spektral udgang af det tunbare excitation system. Dette opnås ved at skalere bølgelængder med høj effekt excitation, således at den optiske belysningsstyrke kan sammenlignes med bølgelængder med en lav effekt excitation, opnåelse af en flad spektral excitation profil. Et eksempel på en uhensigtsmæssig korrektionsfaktor er en, der indeholder meget lave værdier (f. eks. < 0,001) ved en eller flere bølgelængder, hvilket indikerer, at intensitetsværdierne målt ved disse bølgelængder skal dæmpes kraftigt for at opnå et fladt spektral respons.

Kalibrering af systemet til en NIST-sporbare standard sikrer, at data indsamlet med excitation-scanning spektral Imaging System er sammenlignelige med andre systemer også kalibreret til NIST-sporbare standarder. Derfor er det bydende nødvendigt at sikre, at enhver korrektionsfaktor justerer de indsamlede data på behørig vis. Nøjagtighed af en korrektionsfaktor kan verificeres ved brug af en fluorescens standard, såsom NIST-sporbar fluorescein. Figur 1 illustrerer en passende og uhensigtsmæssig korrektionsfaktor, visualiseret gennem grafiske og billeddata. I dette tilfælde var spektral udgangen ved 340 nm næsten ikke-eksisterende sammenlignet med resten af spektral området, hvilket resulterede i en næsten nul (< 0,001) værdi for stort set alle bølgelængde. Anvendes på billed stakken, resulterer dette i værdier, der er nær nul, gennem det meste af billed stakken for de fleste pixel.

Som anført i afsnit 5, kan excitation Range, udvalgte fluorophores, og erhvervelse indstillinger skabe det potentiale, at en eller mange excitation bølgelængde billed bånd indeholder overmættede pixels. Figur 2 illustrerer et eksempel, hvor eksponeringstid blev sat for længe for flere af excitation bølgelængder, forårsager de efterfølgende billeder til at indeholde overmættede pixels. Dette er vigtigt at bemærke, fordi, som figuren viser, både de enkelte billeder og de falsk farvede billeder kan visuelt synes at være inden for acceptable intensitets intervaller.

Passende udvælgelse af en baggrund region for subtraktion er også vigtigt for data sammenligning mellem systemer, da det fjerner elementer af kameraets støj eller Stray lys forud for NIST-sporbare spektral korrektion (figur 3). Det er ofte nyttigt for efterfølgende billedbehandling og dataanalyse trin til at generere et RGB-falsk farvet billede af spektral billed stakken for at visualisere spektral funktioner i billedet. Figur 4 viser et RGB-falsk farvet billede genereret ved at fusionere tre valgte bølgelængde bånd (370 nm = blå, 420 nm = grøn, 470 nm = rød).

Spektral udblanding kræver viden om spektral profilen for hver enkelt fluorescens kilde. I tilfælde af excitation-scanning hyperspectral Imaging, dette gøres ved at erhverve spektral billede stakke for hver fluoroforet (og autofluorescens). Figur 5 er inkluderet som et eksempel for at vælge regioner fra enkelt-label kontrol for at generere et spektral bibliotek. Det skal bemærkes, at hver måling er blevet normaliseret til sin peak bølgelængde.

Når spektral udblandings processen udføres korrekt, giver den mulighed for adskillelse af en spektral billedstak i de respektive bidrag fra hvert fluorescens mærke. Figur 6 viser et eksempel ublandet spektral billedsæt, med individuelle billeder for hvert af følgende signaler: luftvejs glat muskel celle autofluorescens, en gcamp sonde, og en mitokondriel etiket. Fejlen i forbindelse med spektral unmixing vises også og kan undersøges for at sammenligne intensitetsniveauerne af fejlen med de ublandede signaler. Beregning og fortolkning af denne fejl er blevet diskuteret tidligere³⁷. Som vist i figur 6er der stor fejl forbundet med cellernes nukleare og perinukleare områder, hvilket indikerer, at de målte spektre i disse regioner ikke er godt tegnede af spektrene i spektral biblioteket. En potentiel kilde til fejl kan være, at den enkelt-label kontrol for GCaMP og mitokondrie etiketten blev udarbejdet ved hjælp af luftvejene glatte muskelceller, som har en høj indfødte Auto luorescens. Derfor kan GCaMP og mitokondrie etiketten ikke repræsentere ren endmember Spectra. Desuden kan autofluorescens signalet påvirke Biblioteks spektre for de to andre etiketter på en måde, der ikke var korrekt tegnede sig for, hvilket resulterede i en mindre nøjagtig montering, end hvis etiketterne var blevet erhvervet ved hjælp af en cellelinje med lidt eller ingen Auto. Derudover er eksempler inkluderet, når der er for få eller for mange komponenter i et spektral bibliotek, hvilket resulterer i under montering og over montering af spektral billeddata (figur 6, figur 7, figur 8, Figur 9og tabel 1).

Som nævnt i afsnit 6,2 og specifikt trin 6.2.4, vil "rene" spektre indsamlet fra mærkede celler, der også er auto-luorescent, sandsynligvis forurene spektral profilen for den rene komponent. Som sådan bør der udvises forsigtighed for at adskille de rene spektre af etiketterne af interesse fra deres autofluorescerende værter. Figur 10 viser forskellen i blanding med "rene" spektre, der er forurenet med autofluorescens (blandet) versus ren spektre beregnet efter den metode, som er beskrevet i trin 6.2.4. Forskellen opstår hovedsageligt i at udblande autofluorescens signalet. Uden korrekt signal adskillelse (f. eks. subtraktion af autofluorescens kontaminering fra GCaMP-spektret) konkurrerer autofluorescens og GCaMP-Biblioteks komponenterne om de samme spektraldata i hver pixel, hvilket resulterer i karakteristiske huller eller mørke pletter i autofluorescens billede.

Figur 1 : Eksempler på anvendelser af uhensigtsmæssige og passende korrektionsfaktorer, der bruges til at korrigere billeder til et fladt spektral respons. A) afbildede uhensigtsmæssige og passende korrektionsfaktorer. (B) et RGB-billede genereret med brug af den uhensigtsmæssige korrektionsfaktor i (A). (C) et RGB-billede genereret med samme synsfelt som (B), undtagen ved brug af en passende korrektionsfaktor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Eksempler, der illustrerer vigtigheden af relevante anskaffelses indstillinger. (A, B) RGB-billeder genereret af en passende erhvervelses tidspunkt (A, 100 ms) vs. det samme synsfelt med en mæthed erhvervelse tid (B, 500 MS). Det skal bemærkes, at RGB-billeder vises identiske, når falsk-farvet. C) den interesseregion, der er udvalgt til at måle intensitetsværdier fra de mest intense regioner i litra a) og B). (D) afbildede intensitetsværdier pr. bølgelængde fra 100 MS eksponerings tidsbillede (A, Black Line) og 500 MS eksponeringstid (B, rød linje). Det skal bemærkes, at pixel intensiteter for 500 MS eksponeringstid har nået grænsen for det dynamiske område af detektoren (65.535 AU) ved 370 nm og ikke falder til 525 nm, hvilket resulterer i spektral artefakt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Udvælgelse af en region af interesse for subtraktion i baggrunden. (A) et rå, bølgelængde-opsummeret intensitet billede. (B) regioner i det billede, der er valgt til at bestemme det pixel-gennemsnitligt baggrunds spektrum for baggrunds subtraktion vist med rødt. (C) baggrund-trukket, korrigeret, og opsummeret intensitet billede. D) en RGB-farvning af det korrigerede billede (C). Processen med at generere et RGB-falsk farvet billede vises i figur 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Proces til generering af et RGB-falsk farvet billede. (A-C) Tre bølgelængde bånd jævnt fordelt over spektral erhvervelse område blev valgt til falsk-farve (blå = 370 nm, grøn = 420 nm, rød = 470 nm). (D) det opsummerede intensitets billede genereret ved at tilføje pixel intensiteter fra alle bølgelængde bånd i billed kuben. (E-G) Billederne i paneler (A-C) med deres respektive falsk-farve look-up tabeller anvendes. H) det resulterende fusionerede billede af (E-G). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Region udvælgelse af enkelt-label kontrol til spektral bibliotek generation. (A) RGB falsk-farvet billede af luftvejene glatte muskler (ASM) celle autofluorescens. (B) vist med rødt, områder af (A) valgt for autofluorescens komponenten i spektral biblioteket. (C) RGB-falsk farvede ASM-celler mærket med mitokondrie etiketten. D) vist i rødt, regioner af C) valgt for den mitokondirale etiket komponent i spektral biblioteket. På grund af den autofluorescens af ASM celler lokaliseret nær kernen, blev små regioner udvalgt langt fra kerner til at identificere mitokondrie label spektrum. (E) RGB-falsk-farvede ASM-celler, som er transficeret med gcamp-sonden. F) de områder af (E), der er udvalgt til gcamp-komponenten i spektral biblioteket, vises med rødt. Svarende til (D), regioner væk fra kerner blev valgt. (G) spektral biblioteket opnået fra A-F, normaliseret til en værdi af enhed ved bølgelængden med det stærkeste signal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figur 6 : Eksempel på ublandede billeddata, hvor ublandede relative signal bidrag fra hver Biblioteks komponent kan visualiseres. (A-D) Den ublandede overflod af GCaMP, mitokondrie etiket, autofluorescens og fejl term. (E-G) Billederne i paneler (A-C) med deres respektive falsk-farve look-up tabeller anvendes. (H) det sammensatte, fusionerede, falsk farvede billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figur 7 : Ublandede relative signal bidrag, herunder gennemsnitlig intensitet og procent af total fluorescens, fra et korrekt defineret spektral bibliotek. (A-D) Den ublandede overflod til autofluorescens, GCaMP, mitokondrie label og fejl udtryk. Det skal bemærkes, at fejl udtrykket omfatter mindre end 10% af det samlede fluorescens signal målt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figur 8 : Ublandede relative signal bidrag, herunder gennemsnitlig intensitet og procent af total fluorescens, fra et spektral bibliotek mangler en komponent, der vides at være inkluderet i prøven (dvs. et under defineret spektral bibliotek). (A-C) Den ublandede overflod af autofluorescens, mitokondrie etiket, og fejl udtryk. Bemærk, at udeladelsen af gcamp fra spektral Library har øget de beregnede relative signal bidrag fra Biblioteks komponenterne samt fejl termen, sammenlignet med figur 7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9 : Ublandede relative signal bidrag, herunder gennemsnitlig intensitet og procent af total fluorescens, fra et spektral bibliotek, der indeholder en yderligere komponent, som vides at mangle i prøven (dvs. et over defineret spektral bibliotek). (A-E) Den ublandede overflod af autofluorescens, GCaMP, mitokondrie label, nuklear label, og fejl udtryk. Bemærk, at tilføjelsen af et nukleart mærke til spektral biblioteket har mindsket de beregnede relative signal bidrag fra autofluorescens, sammenlignet med figur 7. Desuden er fejl perioden faldet til under den procentvise fejl, der er angivet af det korrekt definerede spektral bibliotek. Dette skyldes, at et over defineret bibliotek næsten altid vil give en bedre pasform til de eksperimentelle data end en korrekt defineret bibliotek, selvom overflod signaler for komponenter vides at være fraværende fra stikprøven er (i virkeligheden) artefakter for at over definere spektral bibliotek. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10 : Sammenligning af ublandede billeder, når du bruger et bibliotek før og efter korrekt autofluorescens forurenings signal subtraktion. (A) den oprindelige "rene" spektre afledt af enkelt-label kontrol i meget Auto-luorescent luftvejene glatte muskelceller før den skalerede subtraktion beskrevet i trin 6.2.4. (B-D) De ublandede autofluorescens, GCaMP og nukleare label billeder genereret ved hjælp af (A) som biblioteket. E) den korrigerede rene spektre afledt af enkelt-label kontrol i meget Auto-luorescent luftveje glatte muskelceller efter skaleret subtraktion. (F-H) De ublandede autofluorescens, GCaMP og nukleare label billeder genereret ved hjælp af (E) som biblioteket. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Gennemsnitlig intensitet (AU)
	Korrekt montering	Underfitting	Over montering
Auto	187	299	164
GCaMP	139	-	140
Mitokondrie label	246	318	248
Nukleart mærke	-	-	26
RMS-fejl	53	126	43
Standard afvigelse (AU)
	Korrekt montering	Underfitting	Over montering
Auto	362	442	315
GCaMP	168		168
Mitokondrie label	344	388	345
Nukleart mærke	-	-	93
RMS-fejl	62	126	44
Maksimal intensitet (AU)
	Korrekt montering	Underfitting	Over montering
Auto	6738	7409	6738
GCaMP	1336	-	1336
Mitokondrie label	5098	5194	5098
Nukleart mærke	-	-	1257
RMS-fejl	1050	1286	910
% af total fluorescens
	Korrekt montering	Underfitting	Over montering
Auto	30	40%	26
GCaMP	22	43%	23
Mitokondrie label	39%	-	40%
Nukleart mærke	-	-	4
RMS-fejl	8	17	7

Tabel 1: En tabel, der sammenligner den gennemsnitlige, standardafvigelsen og de maksimale værdier for ublandet overflod intensitet pr. ublandet overflod fra et korrekt spektral bibliotek og fra under definerede eller over definerede spektral biblioteker samt procentdelen af den totale fluorescens pr. ublandet forekomst billede (den mindste ublandede overflod intensitet for hvert billede var altid nul). Data, der er hentet fra figur 7, figur 8og figur 9.

Discussion

Den optimale anvendelse af en excitation-scanning hyperspectral Imaging set-up begynder med opførelsen af lysbanen. Især valg af lyskilde, filtre (tunable og dichroic), filter switching metode og kamera bestemme det tilgængelige spektralområde, eventuel scanningshastighed, detektorfølsomhed, og rumlig prøvetagning. Mercury Arc lamper tilbyder mange excitation bølgelængde toppe, men ikke giver en flad spektral udgang og vil kræve betydelige signal reduktion på output toppe at korrigere spektral billeddata tilbage til en NIST-sporbare svar³⁸. Alternative lyskilder, såsom XE Arc lamper og hvidt lys supercontinuum lasere, kan give en mere ensartet spektral output, der er bedre egnet til excitation-scanning hyperspectral Imaging^38,39,40. Valg af lyskilde, justerbare filtre og koldtlysreflektorlamper-filtre bestemmer det tilgængelige spektralområde. Dette interval bør vælges med omhyggelig overvejelse for den ønskede spektral information af den eksperimentelle prøve.

Derudover bør der tages hensyn til den koblingsmekanisme, der anvendes til de tunbare filtre, samt forskellige kamera faktorer som kvante effektivitet, pixelstørrelse og tilgængelige billedhastigheder, da disse faktorer vil påvirke potentielle stikprøve procenter^{41 ,42,43}. Men alle andre faktorer er konstante, udnyttelse af excitation-scanning tilgang bør give øget følsomhed og evnen til hurtigere billeddannelse, sammenlignet med de fleste emission-scanning spektral Imaging tilgange²¹.

Som bemærket i indledningen, hyperspectral Imaging her refererer til den sammenhængende og spektralt overlappende karakter af de erhvervede data. Som sådan, funktionerne i systemet skal være i stand til at indsamle data ved hjælp af afstand af excitation Center bølgelængder mindre end halvdelen af afstanden af FWHM af filtrene. Som rapporteret tidligere, en nøje udvalgt vifte af tynde-film tunable filtre tillader data erhvervelse med Center bølgelængder fordelt 5 Nm fra hinanden, en afstand tilstrækkelig til at over prøve excitation spektrum givet filtre med FWHM af mellem 14-20 Nm. En sådan afstand giver let redundans i spektraldata indsamling med sandsynligvis øger nøjagtigheden af udblande processen. Overvejelse af både spektral intervaller og det nødvendige mindste antal bølgelængde kanaler for nøjagtig udblanding er blevet diskuteret tidligere^44,45,46. Til dette formål, i betragtning af båndbredden af disse filtre, excitation område bør vælges til at ende ved en bølgelængde, der er noget lavere (5-10 nm lavere) end cut-off bølgelængde af koldtlysreflektorlamper beamsplitter. Dette vil sikre, at hele båndbredden af excitation belysning er under cutoff bølgelængde af koldtlysreflektorlamper beamsplitter (f. eks 360-485 nm for 495 koldtlysreflektorlamper filter) for at undgå excitation-emission krydstale.

Software til uafhængigt at styre hver komponent i hardwaren for at opnå højhastigheds-spektral scanning er påkrævet. Softwaren bør være i stand til at betjene udløseren, vælge excitation bølgelængder, og erhverve billeder ved tilstrækkelig høje hastigheder til at opfylde eksperimentelle betingelser (nøjagtige sample rate krav vil variere eksperiment, men et eksempel mål kan være at erhverve fire komplette spektral billedstakke pr. minut). Mere komplekse eksperimenter kan gøre brug af flere koldtlysreflektorlamper spejle, mål, eller XYZ steder. Der er en række softwarepakker til rådighed for dataindsamling^47,48. Micro-Manager er en gratis open source-software til mikroskop automatisering, der tilbyder en bred vifte af tilpasningsmuligheder. Desuden indeholder Micro-Manager et script panel for yderligere tilpasning, der ikke er tilgængelig i den primære brugergrænseflade. For eksempel er det muligt at bruge en brugerdefineret script til at reducere 250 ms forsinkelse af den justerbare filter Switcher til 10 MS på alle excitation bølgelængder undtagen bølgelængde overgange, hvor filteret hjulet roterer til en ny tunable filter, reducere den effektive billeddannelse tid med 240 MS per bølgelængde for de fleste bølgelængder. Denne tilpasning har tilladt erhvervelse af op til 30 bølgelængder i under 4 s. Endelig kan Micro-Manager betjenes sammen med andre miljøer, såsom MATLAB, for yderligere at tilpasse mikroskopet enhedskontrol.

Bestemmelse af den korrekte spektral excitation område, erhvervelse tid, og indledende bølgelængde for Prøvevisning og efterfølgende dataindsamling er meget vigtigt. Ukorrekt betjening af systemets enkelte komponenter kan dog kræve yderligere fejlfinding. Hver komponent i den optiske sti bidrager til de erhvervede billeddata. Derfor er det vigtigt at verificere spektral respons og optisk transmission af optiske komponenter i lysbanen, især hvis de forsøger at optimere den samlede system respons. Lyskilder har ofte variable intensitets indstillinger og kan have nedsat effekt i løbet af lampens levetid⁴⁰. Hvis en prøve vises nedtonet, kan årsagen være reduceret output fra lyskilden. Den autoshutter funktion i Micro-Manager, i vores erfaring, ikke opererer 100% af tiden. Manglende signal kan indikere en lukket udløser. Den indledende excitation bølgelængde gemt i Micro-Manager's konfigurationsfil kan standard til en bølgelængde med ringe eller ingen spektral udgang, såsom 340 nm eksempel vist i figur 1.

Desuden, det er ikke ualmindeligt at fejlagtigt vælge en excitation bølgelængde, der er over cutoff bølgelængde af lang-pass koldtlysreflektorlamper beamsplitter, hvilket resulterer i yderligere Cross-Talk og/eller excitation lys bliver rangeret direkte til kameraet, som kan muligvis beskadige kamerasensoren. På samme måde kan justering af lysbanen til overførsel af transmission resultere i tab af signal til kameraet, afhængigt af konfigurationen af mikroskopet. Som anført i figur 2kan valg af indledende excitation bølgelængde og eksponeringstid for Prøvevisning forekomme passende, men faktisk resultere i overmættede pixels ved andre excitation bølgelængder. Denne kendsgerning vil ikke være synlig, medmindre pixel mætning er kontrolleret for hvert billede, så det er ofte klogt at udføre en test billede stak på et område af prøven, der synes at indeholde den mest intense fluorescens.

Det er også værd at bemærke, at variable intensiteter kan være til stede i billeder valgt til baggrundsområder. Der bør udvises forsigtighed for at sikre, at disse regioner ikke rent faktisk indeholder relevante billeddata, da efterfølgende data korrektions trin derefter trækker dette signal fra de billeddata, der er erhvervet i andre regioner i stikprøven. Det er nogle gange nødvendigt at bruge transmissions indstillingerne og/eller drastisk øge eksponeringstiden for at kontrollere, at den region, der er valgt til måling af stikprøve baggrunden, ikke indeholder nogen stikprøve. På samme måde kan ublandede billeder forekomme med mørke pletter eller huller i autofluorescens billede. Dette kan skyldes et forkert bibliotek forårsaget af autofluorescens "kontaminering" af de "rene" spektral signaler fra enkelt-mærkede celler. Dette skyldes, at enhver "ren" spektral signal indsamlet fra en prøve, der indeholder autofokus vil uvægerligt indeholde nogle af autofluorescens Spectra selv, selv om i spormængder. Der skal udvises forsigtighed for at trække Autofilter-signaler fra de enkelt mærkede betjeningselementer for at sikre et korrekt spektral bibliotek, som beskrevet flere gange af Mansfield et al.^{28,29,30, 31,32}

Selvom det ikke er påvist i denne artikel, kan excitation-scanning spektral Imaging system også bruges til tidsforskudt billeddannelse og billeddannelse over flere XY steder (eller et stort synsfelt på grund af billed syning) i flere brændfly. Hvis disse muligheder ønskes for et enkelt eksperiment, bør man nøje overveje betydningen af overtagelses rækkefølgen og de potentielle virkninger af fotoblegning. Det er også værd at bemærke, at hvis den faktiske tid, der er taget overstiger den anslåede tid (f. eks. en billedstak tager 11 s at erhverve snarere end anslået 10 s), Micro-Manager vil fortsætte med at erhverve det valgte antal tidspunkter og/eller positioner. Denne fejlberegning kan sammensættes med flere tidspunkter og ændre beregnet tidsmæssig prøvetagning, potentielt skævvridning eventuelle konklusioner fra dataene.

Dette eksempel demonstrerer evnen til at adskille tre kilder til fluorescens inden for et 145 nm excitation scanningsområde. Tidligere eksperimenter med dette system har været i stand til at adskille op til fem fluorescens kilder inden for samme område. Den tid, der kræves til dette billede erhvervelse er mindre end 1 min, hvilket er betydeligt hurtigere end de fleste emission-scanning spektral Imaging systemer. Forbedringer i lysbanen, såsom højere hastighed excitation bølgelængde tuning, kan yderligere fremme denne imaging teknologi til hastigheder, der er tilstrækkelige til video-rate spektral Imaging.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output