Excitatie-Scanning hyperspectrale beeld microscopie om fluorescentie signalen efficiënt te discrimineren

Summary

Spectrale beeldvorming is uitgegroeid tot een betrouwbare oplossing voor de identificatie en scheiding van meerdere fluorescentie signalen in een enkel monster en kan gemakkelijk signalen van belang onderscheiden van achtergrond of auto fluorescentie. Excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming verbetert deze techniek door de benodigde beeldverzamelings tijd te verlagen en tegelijkertijd de signaal-ruis verhouding te verhogen.

Abstract

Verschillende technieken zijn gebaseerd op de detectie van fluorescentie signalen om verschijnselen te identificeren of te bestuderen of om functies te verheldoen. De scheiding van deze fluorescentie signalen bleek omslachtig te zijn tot de opkomst van Hyperspectrale beeldvorming, waarbij fluorescentie bronnen van elkaar kunnen worden gescheiden, evenals van achtergrond signalen en auto fluorescentie (gezien de kennis van hun spectrale handtekeningen). Traditionele Hyperspectrale beeldvorming met emissie Scanning lijdt echter aan trage acquisitie tijden en lage signaal-ruis verhoudingen vanwege de noodzakelijke filtering van zowel excitatie-als emissie licht. Eerder is aangetoond dat excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming de benodigde acquisitie tijd vermindert en tegelijkertijd de signaal-ruis verhouding van de verkregen gegevens verhoogt. Met behulp van commercieel verkrijgbare apparatuur, dit protocol beschrijft hoe te monteren, kalibreren, en het gebruik van een excitatie-Scanning hyperspectrale Imaging microscopie systeem voor scheiding van signalen van verschillende fluorescentie bronnen in een enkel monster. Hoewel deze techniek zeer toepasselijk is voor microscopische beeldvorming van cellen en weefsels, kan deze methode ook nuttig zijn voor elk type experiment waarbij fluorescentie wordt toegepast waarbij het mogelijk is om golflengten van excitatie te variëren, inclusief maar niet beperkt tot: chemische beeldvorming, milieutoepassingen, oogzorg, voedsel wetenschap, forensische wetenschappen, medische wetenschap en mineralogie.

Introduction

Spectrale beeldvorming kan op verschillende manieren worden uitgevoerd en wordt aangeduid met verschillende termen^1,2,3,4. In het algemeen verwijst spectrale imaging naar gegevens die zijn verkregen in ten minste twee ruimtelijke dimensies en één spectrale dimensie. Multispectrale en Hyperspectrale beeldvorming worden meestal gekenmerkt door het aantal golflengte banden of de spectrumbanden aaneengesloten¹. Voor deze toepassing worden hyperspectrale gegevens gedefinieerd als spectrale gegevens die zijn verkregen met aaneengesloten golflengte banden bereikt door afstand van de middelste golflengten, niet minder dan de helft van de volledige breedte bij halve maximum (FWHM) van elk band pass filter dat wordt gebruikt voor excitatie (d.w.z. 5 nm Midden golflengte afstand voor band pass filters met 14-20 nm bandbreedtes). De aaneengesloten aard van de gegevens banden maakt een oversampling van de gegevensset mogelijk, zodat Nyquist-criteria worden nageleefd bij het samplen van het spectrale domein.

Hyperspectrale beeldvorming werd ontwikkeld door NASA in de jaren zeventig en tachtig in combinatie met de eerste Landsat satelliet^5,6. Het verzamelen van gegevens uit verschillende aaneengesloten spectrale banden zorgde voor het opwekken van een stralend spectrum van elke pixel. Het identificeren en definiëren van het stralings spectrum van afzonderlijke componenten maakte het mogelijk om niet alleen oppervlakte materialen te detecteren door hun karakteristieke spectra, maar het ook toegestaan om tussenliggende signalen te verwijderen, zoals variaties in het signaal als gevolg van atmosferische omstandigheden. Het concept van het opsporen van materialen met behulp van hun karakteristieke Spectra werd toegepast op biologische systemen in 1996 toen Schröck et al. gebruikte combinaties van vijf verschillende fluor Foren en hun bekende Spectra om gelabelde chromosomen te onderscheiden in een proces dat spectrale karyotypering⁷. Deze techniek werd uitgewerkt in 2000 door Tsurui et al. voor fluorescentie beeldvorming van weefselmonsters, met behulp van zeven fluorescerende kleurstoffen en enkelvoudige waarde ontleding om de spectrale separatie van elke pixel te bereiken in lineaire combinaties van spectra in de referentie bibliotheek⁸. Vergelijkbaar met hun externe sensing tegenhangers, kan de bijdrage van elke bekende de worden berekend uit het hyperspectrale beeld, gegeven a priori informatie over het spectrum van elke de.

Hyperspectrale beeldvorming is ook gebruikt op het gebied van landbouw⁹, astronomie¹⁰, biogeneeskunde¹¹, chemische beeldvorming¹², milieu-toepassingen¹³, Eye Care¹⁴, Food Science¹⁵, Forensische Wetenschappen^16,17, medische wetenschap¹⁸, mineralogie¹⁹, en surveillance²⁰. Een belangrijke beperking van de huidige fluorescentiemicroscoop hyperspectrale beeldvormingssystemen is dat de standaard hyperspectrale beeldvormingstechnologie fluorescentie signalen in smalle banden isoleert met 1) en eerst het excitatie lampje filtert om de monster excitatie te regelen, 2) verdere filtering uitgezonden licht om de fluorescentie-emissie te scheiden in smalle banden die later wiskundig gescheiden kunnen worden²¹. Het filteren van zowel de excitatie verlichting als de uitgezonden fluorescentie vermindert de hoeveelheid beschikbaar signaal, die de signaal-ruis verhouding verlaagt en lange aanschaf tijden vereist. Het lage signaal en de lange acquisitie tijden beperken de toepasbaarheid van Hyperspectrale beeldvorming als diagnostisch hulpmiddel.

Er is een beeldvormings modaliteit ontwikkeld die gebruik maakt van Hyperspectrale beeldvorming, maar het beschikbare signaal verhoogt, waardoor de benodigde acquisitie tijd^21,22wordt verminderd. Deze nieuwe modaliteit, genaamd excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming, verwerft spectrale beeldgegevens door de excitatie golflengte te variëren en een breed scala aan uitgezonden licht te verzamelen. Er is al eerder aangetoond dat deze techniek leidt tot een verhoging van de signaal-ruis verhouding in vergelijking met de technieken voor emissie Scanning^21,22. De toename van de signaal-ruis verhouding is grotendeels te wijten aan de brede band pass (~ 600 nm) van het geconstateerde emissie licht, terwijl specificiteit wordt geboden door alleen het excitatie lampje te filteren in plaats van de fluorescentie-emissie. Dit maakt het mogelijk alle uitgezonden licht (voor elke excitatie golflengte) om de detector te bereiken²¹. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om autofluorescentie van exogene etiketten te discrimineren. Bovendien vermindert de mogelijkheid om de acquisitie tijd te verkorten door een verhoogd detecteerbaar signaal het gevaar van fotobleaching en maakt het mogelijk spectrale scans tegen een acquisitie ratio die acceptabel is voor spectrale videobeelden.

Het doel van dit protocol is om te dienen als een gids voor het verzamelen van gegevens voor excitatie-Scanning hyperspectrale beeldvormings microscopie. Bovendien zijn beschrijvingen opgenomen die helpen om het lichtpad en de hardware te begrijpen. Ook beschreven is de implementatie van open-source software voor een excitatie-Scanning hyperspectrale beeld Microscoop. Ten slotte worden beschrijvingen gegeven voor het kalibreren van het systeem naar een NIST-traceerbare standaard, het aanpassen van software-en hardware-instellingen voor nauwkeurige resultaten en het opheffen van het gedetecteerde signaal in bijdragen van afzonderlijke componenten.

Protocol

1. apparaat instellen

1. Lichtbron: Selecteer een breedbandspectrale lichtbron met hoog uitgangsvermogen en hoge collimator (een 300 W XE Arc lamp werd gebruikt voor deze studies).
2. Sluiter (optioneel): Voeg een sluiter toe aan het optische pad om photobleaching voor timelapse-beeldvorming te verminderen.
3. Afstembare filtersysteem: Neem een mechanische tuning-assemblage en dun-film instelbare filter (TFTF) ingesteld om het gewenste golflengte instelbare excitatie bereik (bijv. 360-485 nm) mogelijk te maken.
4. Microscoop: gebruik een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde dichroïde filter Turret en controller.
   1. Fluorescentie filter kubus: Monteer een long-pass fluorescentie filter kubus. Voor de beste resultaten kiest u een dichroïde spiegel en een lange-pass-emissie filter op dezelfde golflengte om een optimale scheiding van excitatie door emissie licht te bereiken (bijv. 495 Nm).
   2. Doelstelling: gebruik een geschikte apochromatische doelstelling om te zorgen voor een uniforme focus op het golflengtebereik dat wordt gebruikt voor het experiment (een 60x water doelstelling werd gebruikt voor deze studie).
   3. Geautomatiseerd podium (optioneel): gebruik een geautomatiseerde fase voor het snel bemonsteren van meerdere velden van weergave en/of zeer grote velden door middel van beeld stiksels. Kalibreer het podium met de doelstelling en de camera.
5. Camera: Selecteer een geschikte camera om de ruimtelijke resolutie, gevoeligheid en ruis vereisten van het experiment te bereiken (dit systeem gebruikt een zeer gevoelige sCMOS-camera).

2. acquisitie software

1. Kies een softwarepakket dat onafhankelijke controle van elk hardwareonderdeel toestaat, zoals Micro-Manager.
   1. Het configuratiebestand maken: het configuratiebestand is een opgeslagen set van instrumenten en instructies die micro-manager zal laden om de hardware van het systeem te bedienen. Als u een configuratiebestand wilt maken, klikt u op extra ≫ wizard hardwareconfiguratie.
      1. Klik in stap 1 op nieuwe configuratie maken ≫ naast doorgaan. Houd er rekening mee dat de gebruiker kan kiezen voor het wijzigen of verkennen van bestaande configuratie als er al een beschikbaar is.
      2. Blader in stap 2 door de lijst met beschikbare apparaten om de apparaten te vinden die via Micro-Manager kunnen worden besturen, zoals de Microscoop, de lamp, het podium, de sluiter en de camera. Wanneer gemarkeerd, klikt u op de toevoegen... om het toestel toe te voegen aan de lijst met geïnstalleerde apparaten. Hiermee wordt een nieuw venster geopend.
         1. Wijs het label van het apparaat aan in het vak Label . (bijv. sCMOS-camera)
         2. Selecteer onder waardede juiste COM-poort voor elk apparaat. Hierdoor wordt een lijst met apparaateigenschappen onder in het venster weergegeven.
         3. Laat de apparaateigenschappen op de standaardinstellingen staan. Houd er rekening mee dat aangepaste waarden voor elke apparaateigenwoning naar wens kunnen worden ingevoerd.
         4. Wanneer elk apparaat wordt toegevoegd, klikt u op de knop volgende om door te gaan naar de volgende stap. Houd er rekening mee dat als er apparaten worden achtergelaten of moeten worden gewijzigd, het configuratiebestand later kan worden gewijzigd, zoals beschreven in stap 2.1.1.1.
      3. Gebruik in stap 3 de vervolgkeuzemenu's om de standaard camera, sluitertijd en scherpstel fase te selecteren. Als auto-sluiter gewenst is, klikt u op het selectie vakje onder de vervolgkeuzelijst focus fase. Als de focus richting van de Z-fase bekend is, selecteert u deze in de vervolgkeuzelijst onder stage focus Directions (Geavanceerd). Anders laat u de standaardwaarde als onbekend.
      4. Dubbelklik in stap 4 op de vakken onder de kop vertraging [MS] voor het instellen van vertragingen die zijn gekoppeld aan de geautomatiseerde apparaten, zoals vertragingen van 100 MS voor de lamp, het podium en de sluiter, en een 250 MS vertraging voor opdrachten voor de mechanische tuning-assemblage om rekening te mechanische schakeltijd tussen de filters.
      5. In stap 5, labels toewijzen voor de status apparaten. De configuratie voor het excitatie-scanning-microscoop systeem gebruikt labels in het filter blok om elke fluorescentie filter kubus te identificeren (bijv. staat 0 komt overeen met het label Bright, de lege filter kubus die wordt gebruikt tijdens heldere veld beeldvorming; staat 3 komt overeen met het label 495 Nm en aangepaste 495 Nm dichroïde filter kubus gebruikt voor het scheiden van excitatie en emissie licht bij 495 Nm). Labels worden ook gebruikt in de mechanische tuning assemblage voor het opslaan van de schakelcommando's voor elke excitatie golflengte (bv, staat 0 komt overeen met de 340 nm excitatie golflengte tuning commando voor de mechanische tuning Assembly).
      6. Klik in stap 6 op de knop Bladeren naast het vak configuratiebestand om een opslaglocatie en bestandsnaam voor het configuratiebestand te kiezen. Klik op Voltooien om het configuratiebestand op te slaan.
   2. Opstartgroepen en voorinstellingen: Micro-Manager kan verschillende groepen in elk configuratiebestand opslaan om een subset van de hardware te activeren of te wijzigen. Een groep ' systeem opstarten ' en een vooraf ingestelde combinatie slaan bijvoorbeeld standaardinstellingen op zoals de binning-grootte en de uitleessnelheid voor de camera.
      1. Maak een groep (bijv. systeem) door te klikken op + in het hoofdvenster in de groep Subsectie.
      2. Het gebruik in groep controleren? vakken binnen de groep waarvoor een standaardwaarde moet worden ingesteld (bijvoorbeeld binning in de gekoppelde standaard camera).
      3. Maak een nieuwe voorinstelling (bijvoorbeeld "Startup") door te klikken op + in het hoofdvenster in de voor instelling Subsectie.
      4. Elk vakje dat in stap 2 is aangevinkt, wordt hier weergegeven als een vooraf ingestelde optie. Kies een standaardwaarde die voor elk geselecteerd vak moet worden geladen.
   3. Groep en presets voor excitatie golflengten: Micro-Manager behandelt elke excitatie golflengte als zijn eigen kanaal met zijn eigen golflengte schakelcommando; elk moet daarom worden opgeslagen als een eigen voorinstelling.
      1. Maak een nieuwe groep om een set gewenste excitatie golflengten te bevatten (bijv., "495 Nm dichroïde")
      2. Vink het vakje aan voor gebruik in groep? met de naam Label dat overeenkomt met het VF-5-apparaat.
      3. Maak een nieuwe voorinstelling met de naam voor elke excitatie golflengte (bijvoorbeeld "340 nm").
      4. Wijs aan elke voorinstelling de juiste eigenschapsnaam en vooraf ingestelde waarde toe (bijvoorbeeld de eigenschapsnaam: "label"; vooraf ingestelde waarde: "340 nm").
   4. Multi-dimensionale acquisitie tool: Klik opMulti-D Acq.linksboven in het Micro-Manager-venster om een aanpasbaar hulpmiddel te openen voor het vastleggen van een afbeelding van het monster bij elke excitatie golflengte met één druk op de knop. Er zijn verschillende aanpassingsopties om de acquisitie exact zoals gewenst te construeren.
      1. Tijdpunten (niet gebruikt in dit voorbeeld): laat het vakje uitgeschakeld voor studies zonder time-lapse-component. Als timelapse-onderzoeken gewenst zijn, vink dan dit vakje aan. Als dit selectievakje is ingeschakeld, voert u het aantal keren in dat de rest van de verwervings instellingen in het vak Numeriek moet worden uitgevoerd. Stel de tijd tussen opeenvolgende verwervingen in door de duur in te voeren in het vak interval en kies de juiste eenheid (milliseconden, seconden of minuten; meestal seconden).
      2. Meerdere posities (XY; in dit voorbeeld niet gebruikt): voor studies met een enkelvoudige XY-positie laat u het vakje uitgeschakeld. Als er meerdere XY-posities gewenst zijn, vink dan het vakje aan en klik op de knop positie lijst bewerken om een apart venster te openen. Verplaats het werkgebied naar elke gewenste locatie en klik op de knop markeren om die positie in de software op te slaan. Herhaal dit totdat alle gewenste XY-posities zijn gemarkeerd. Sluit dit venster om door te gaan.
      3. Z-Stacks (slides; niet gebruikt in dit voorbeeld): voor studies van een enkele Z-positie, laat u het vakje uitgeschakeld. Als meerdere Z-posities gewenst zijn, Vink het vakje aan. Verplaats het werkgebied naar de gewenste begin-Z-positie en klik op de knop set naast het z-start- vak. Verplaats het werkgebied naar de gewenste eind-Z-positie en klik op de knop set naast het z-end- vak. Voer de gewenste stapgrootte (in microns) in het vak Z-stap in.
      4. Kanalen: Zorg ervoor dat de kanalen box is aangevinkt. Hier zijn kanalen de namen die worden gegeven aan de individuele excitatie golflengten. Beschikbare "kanalen" corresponderen met de in de stappen 2.1.2 en 2.1.3 beschreven "groepen".
         1. Groep: Klik op de vervolgkeuzelijst om een groep te selecteren waaruit de beschikbare excitatie golflengten moeten worden gekozen (bijv. 495 Nm dichroïde).
         2. Klik op het vak Keep sluiter open om de sluiter open te houden tussen overnames voor elk kanaal. Houd er rekening mee dat de sluiter nog steeds wordt gesloten tussen de opeenvolgende spectrale scans als dit vakje is aangevinkt, ervan uitgaande dat de optie autoshutter ook is geselecteerd in het hoofdvenster.
      5. Klik op de knop Nieuw om kanalen toe te voegen aan de acquisitie lijst. Houd er rekening mee dat de knop verwijderen kan worden gebruikt om kanalen te verwijderen die niet langer gewenst zijn en die op en neer kunnen worden gebruikt om een geselecteerd kanaal opnieuw te rangschikken.
         1. Zorg ervoor dat het selectievakje gebruiken? is geselecteerd voor elke gewenste golflengte in de spectrale scan.
         2. Configuratie: Klik op de vervolgkeuzelijst onder configuratie en kies de eerste golflengte in het gewenste spectrum bereik (bijv. 340 nm).
         3. Belichting: Dubbelklik op het vak onder belichting en voer de gewenste belichtingstijd voor de geselecteerde golflengte in (bijvoorbeeld "100" voor 100 MS). Zie paragraaf 5 ("gegevensverzameling") voor suggesties om geschikte blootstellings tijden te selecteren.
         4. Z-offset (niet van toepassing in een spectrale scan): laat dit vak leeg (bij 0) bij het uitvoeren van een spectrale scan.
         5. Z-stack: Zorg ervoor dat dit vakje is aangevinkt voor elke golflengte in het spectrale bereik als u een Z-stack uitvoert.
         6. Skip fr. (niet van toepassing op een spectrale scan): laat dit vak leeg (bij 0) bij het uitvoeren van een spectrale scan. Merk op dat het nuttig kan zijn om selectief frames over te slaan in het geval dat een of weinig excitatie golflengten significant krachtiger zijn dan andere of als individuele excitatie golflengten bijzonder fototoxisch blijken te zijn.
         7. Kleur: laat dit vak leeg bij het uitvoeren van een spectrale scan. Houd er rekening mee dat kleuren kunnen worden gekozen voor individuele golflengte banden voor data visualisatie doeleinden, maar kleur is ongeschikt voor daaropvolgende spectrale unmixing.
         8. Herhaal deze stappen totdat elke gewenste excitatie golflengte binnen het gegeven spectrale scanbereik wordt toegevoegd.
      6. Verwervings order: Klik op de vervolgkeuzelijst om te kiezen in welke volgorde de bovenstaande opties (2.1.4.1-2.1.4.5) zullen worden uitgevoerd. Voor spectrale scans zoals die hier worden weergegeven, is de verwervings order gewoon kanaal. Houd er rekening mee dat extra opties worden weergegeven als extra vakken worden gecontroleerd binnen het multidimensionale verwervings hulpmiddel [tijdpunten, meerdere posities (XY) en Z-Stacks (slices)] en toestaan dat de keuze van een positie of tijd eerst, gevolgd door een segment of Kanaal.
      7. Autofocus (niet gebruikt in dit voorbeeld): als er meerdere posities (xy) geselecteerd zijn, zijn er verschillende stijlen van autofocus beschikbaar. Klik op de knop Opties en selecteer een autofocus-methode in de vervolgkeuzelijst naast de knop sluiten .
      8. Overzicht: Bekijk dit venster voor een overzicht van het aantal tijdpunten, XY-posities, Z-segmenten, kanalen, het totale aantal afbeeldingen, het totale geheugen, de Scanduur en de aanschaf volgorde om ervoor te zorgen dat de vermelde informatie overeenkomt met de verwachte acquisitie-instellingen.
      9. Afbeeldingen opslaan: Zorg ervoor dat dit vakje is aangevinkt om de verzamelde gegevens op te slaan door gebruik te maken van het multidimensionale acquisitie hulpmiddel.
         1. Klik op de... knop naast maphoofdmap om een hoofdmap te kiezen waarin de bestanden worden opgeslagen. Noem de hoofdmap van de directory op een manier die relevante details van het experiment beschrijft (bijv. GCaMP-luchtweg gladde spiercellen).
         2. Voer in het vak naast naam prefix een naam in die de huidige beeld verwerving beschrijft (bijvoorbeeld FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Het is raadzaam om een naam prefix te maken die het gezichtsveld en de belichtingstijd identificeert, evenals andere relevante informatie zoals het object en het dichroïde filter dat wordt gebruikt. Houd er rekening mee dat de eerste afbeeldings stack die met deze instellingen is gemaakt, wordt opgeslagen met ' _1 ' na het naam prefix. Elke volgende stack met dezelfde hoofdmap en naam prefix wordt opgeslagen met "_n", waarbij "n" het aantal keren is dat een stapel met deze naam in de Directory is genomen.
         3. Klik op afzonderlijke afbeeldingsbestanden om te controleren of de afbeelding die bij elke excitatie golflengte wordt gegenereerd, wordt opgeslagen.
      10. Opslaan als: Klik op de knop Opslaan als... in de rechterbovenhoek van de multi-dimensionale acquisitie tool om deze acquisitie-instellingen op te slaan voor eenvoudig toekomstig gebruik. Houd er rekening mee dat de hoofdmap en de naam voorvoegsels ook worden opgeslagen.
      11. Verwerven: klik ten slotte op verwerven! knop om te beginnen met het verwerven van afbeeldingen volgens de hierboven gekozen acquisitie-instellingen.

3. spectrale respons correctie (optioneel):

1. Spectrale uitvoer correctie kan worden uitgevoerd om de spectrale respons van het systeem te kalibreren naar een bekende standaard, zoals een NIST-traceerbare lamp of een andere NIST-traceerbare standaard of instrument. Deze stap is vooral belangrijk als de resultaten worden vergeleken met andere spectrale beeldvormings instrumenten, spectrometers of tussen verschillende laboratoria. Dit proces is gerapporteerd in detail eerder^21,23.
   1. Gebruik een spectrometer die is gekalibreerd voor een NIST-traceerbare lichtbron (zoals LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) of een andere NIST-traceerbare standaard om het spectroradiometrische vermogen van de verlichting te verwerven, zoals gemeten in de monster fase. Voer een afzonderlijke correctie uit voor elke combinatie van lichtbron instelling, dichroïde spiegel en objectief. Gebruik een integriteits sfeer gekoppeld aan de spectrometer om de breedstralingverlichting nauwkeurig te meten vanuit de Microscoop doelstelling.
   2. Gebruik een integratiemethode, zoals de trapezium regel, om de spectroradiometrische gegevens te integreren over golflengten verlicht. Een 40 nm bandbreedte voor integratie gecentreerd rond de golflengte van het midden is voldoende voor de meeste filters met een nominale bandbreedte tussen 14-20 nm volledige breedte bij half-maximum (FWHM). De geïntegreerde waarde vertegenwoordigt de intensiteit van de spectrale verlichting bij elke excitatie golflengte band.
   3. Plot de geïntegreerde intensiteit van elke golflengte band als een functie van de golflengte van het excitatie centrum om visualisatie van het spectrale verlichtings intensiteits profiel mogelijk te maken.
   4. Bepaal de golflengte band met de laagste geïntegreerde intensiteit.
   5. Normaliseer het intensiteits Profiel van de spectrale belichting door de laagste geïntegreerde intensiteit te delen door de geïntegreerde intensiteit van elke golflengte band om een golflengte afhankelijke correctiefactor te genereren.

4. monstervoorbereiding

1. Maak een "blanco" monster (bijv. plaats een glazen dekglaasje in de celkamer en voeg 1 mL buffer toe). Deze buffer is eerder beschreven²⁴.
2. Bereid een ongelabeld monster om een monster autofluorescentie te bepalen (bv. plaats een glazen afdekplaat met ongegelabelde luchtweg gladde spiercellen^25,26 in de celkamer en voeg 1 ml buffer toe).
3. Bereid een afzonderlijk, enkelvoudig gelabeld voorbeeld voor elk fluorescerende label dat in het experiment wordt gebruikt als volgt:
   1. Voeg verdund mitochondriaal label toe aan buffer om een concentratie van 100 nM te bereiken. Voeg deze buffer toe aan de dekslip met gladde spiercellen van de luchtwegen. Inincuberen gedurende 20 min bij 20-25 °C. Verplaats de Afdeklijst naar de celkamer en voeg 1 mL buffer toe. Merk op dat de optimale concentratie van mitochondriaal label zal variëren door factoren zoals fabrikant, bijbehorende kleur, en gewenste specificiteit.
   2. Verplaats een dekslip met luchtweg gladde spiercellen die met de GCaMP-sonde²⁷ naar de celkamer zijn getransfeerd en voeg 1 ml buffer toe.
4. Bereid een of meer experimentele monsters met een mengsel van de gewenste fluorescentie etiketten.
   1. Voeg 1 mL buffer (100 nM-concentratie van het mitochondriale etiket) toe aan een dekslip met gladde spiercellen die met de GCaMP-sonde zijn getransffecteerd en gedurende 20 minuten bij 20-25 °C inkuilen. Verplaats de Afdeklijst naar de celkamer en voeg 1 mL buffer toe.

5. gegevensverzameling:

1. Controleer of de juiste dichroïde beamsplitter (bijv. 495 Nm dichroïde filter kubus), objectief (bijv. 60x water doelstelling) en camera (sCMOS camera) zijn geselecteerd.
2. Laad het voorbeeld in het werkgebied.
3. Dubbelklik op het vakje naast belichting [MS] en typ "100" om de belichtingstijd op 100 MS in te stellen. Houd er rekening mee dat de belichtingstijd mogelijk moet worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de intensiteit van de fluorescentie van het monster.
4. Selecteer 475 nm in het vervolgkeuzemenu van het hoofdvenster van Micro-Manager voor de eerste voorbeeldweergave. Houd er rekening mee dat 475 nm mogelijk niet de optimale golflengte is voor het bekijken van monsters of om te bepalen of oververzadiging in de afbeeldings stack zal plaatsvinden.
5. Klik op Live om het voorbeeld te bekijken.
   1. Klik op de knop Automatische intensiteit weergavebereik automatisch naast het histogram aan de onderkant van het venster om de minimum-en maximumwaarden in zinvolle visuele bereiken te brengen.
6. Gebruik de focus knoppen van de Microscoop om scherp te stellen op het monster. Het is vaak nuttig om de rand van het monster te vinden om te helpen bij het scherpstellen. Het monster zal worden geconcentreerd wanneer de rand functies in de afbeelding scherp worden weergegeven. Houd er rekening mee dat het mogelijk nodig is om meerdere malen op de knop auto te klikken tijdens het scherpstellen om te helpen bij het bekijken van het fluorescentie beeld. Bovendien kunnen sommige gebruikers het gemakkelijker vinden om zich op het monster te concentreren als de Microscoop in de transmissie modus staat.
   1. Als u zich in de transmissie modus concentreert, voor de veiligheid, zorg er dan eerst voor dat de spectrale lichtbron geen licht doorgeeft aan de oculair voordat het lichtpad voor transmissie beeldvorming wordt aangepast. Houd er ook rekening mee dat er kleine afwijkingen kunnen zijn tussen de focus van de transmissie en fluorescentie beelden. Wanneer aanvaardbare focus is bereikt, Herconfigureer het lichtpad voor spectrale fluorescentie Imaging.
7. Klik op de multi-D Acq. knop in de linkerbovenhoek van het venster om het multi-dimensionale verwervings hulpmiddel te openen (beschreven en geconfigureerd in sectie 2).
8. Kies een geschikt spectrale bereik voor spectrale verwerving (bijv. 360-485 nm voor de 495 Nm dichroïde filter) door te klikken op de knop laden... rechtsboven in het multi-dimensionale bijboekings hulpmiddel venster en navigeren naar de excitatie-instellingen eerder hebt opgeslagen (in stap 2.1.4.10). Zie discussie voor informatie over geschikte spectrale bereiken.
9. Verkrijg een achtergrond/blanco afbeelding die geen fluorescentie gegevens bevat die gebruikt worden voor achtergrond-en ruis aftrekken. Dit kan worden uitgevoerd met een leeg voorbeeld (stap 4,1) of door te navigeren naar een leeg gebied van een experimenteel monster. Zoals beschreven in stap 5,6, dit is het meest gemakkelijk te bereiken door het vinden van de rand van het monster dan het positioneren zodat de rand is gecentreerd in het gezichtsveld.
   1. Zodra de acquisitie-instellingen zijn bevestigd en een achtergrond gebied zichtbaar is, klikt u op de knop verwerven! om een spectrale afbeeldingsstapel met achtergrond en ruis te verkrijgen die later moet worden gebruikt voor aftrekken. Opgemerkt moet worden dat monsters waarschijnlijk intenser fluorescentie hebben, weg van de rand van het monster. Het kan raadzaam zijn om over het monster te bewegen om de "helderste" regio's te vinden en verschillende testbeeld stapels uit te voeren om de juiste acquisitie tijden te bepalen en overbelichting te voorkomen.
10. Neem een enkele afbeeldingsstapel op een gebied van het monster dat intens fluorescentie lijkt te hebben om ervoor te zorgen dat geen combinatie van golflengten en die belichtingstijden resulteren in overbelichting.
11. Gebruik ImageJ om te bevestigen dat geen golflengten overbelichte pixels bevatten.
    1. Klik in ImageJ op bestand > ≫ reeks afbeeldingen importeren en navigeer naar de map met de spectrale afbeeldingen die in stap 5,10 zijn gemaakt. Hiermee wordt een nieuw venster geopend. Klik op het vakje naast het aantal afbeeldingen en voer het aantal golflengten in dat is opgenomen in de spectrale scan (bijv. 26). Laat het Start beeld en de toename als "1". Klik op de knop OK om door te gaan.
    2. Druk op M op het toetsenbord om de meet functie van imagej te gebruiken. Zorg ervoor dat het nummer onder Max niet de bovenste detectiegrens van de camera is (bijv. 65.535). Herhaal dit voor elke afbeelding in de spectrale scan. Merk op dat de detectielimiet van de camera afhankelijk is van de camera zelf. De bovengrens wordt weergegeven in de rechterbovenhoek van het histogram in het hoofdvenster van MicroManager. Als alternatief kan de bovengrens worden bepaald door een afbeelding in ImageJ te openen en naar afbeelding te navigeren > ≫ helderheid/contrast aan te passen. Klik op de knop instellen in het resulterende pop-upvenster, voer een te grote waarde in (bijvoorbeeld 999.999) in de lege naast maximale weergegeven waardeen klik op OK om door te gaan. De maximale waarde die in het nieuwe histogram wordt weergegeven, moet de bovenste detectielimiet van de camera zijn.
    3. Als er afbeeldingen de bovenste detectielimiet van de camera bevatten (bijvoorbeeld 65.535), past u de belichtingstijd van de spectrale scan aan om ervoor te zorgen dat het maximale signaal in het spectrale bereik het dynamische bereik van de camera niet overschrijdt.
12. Verkrijg spectrale beeldgegevens van niet-gelabelde samples om een auto fluorescentie te bepalen. Verkrijg de scan voor de niet-gelabelde samples met een identiek golflengtebereik en camera-instellingen als de rest van het experiment (bijv. 360-485 Nm bij 100 MS per golflengte).
13. Verkrijg spectrale afbeeldingsgegevens van single-gelabelde samples om te gebruiken als spectrale besturingselementen om de spectrale bibliotheek te bouwen. Voer de scan voor elk label uit met een identiek golflengtebereik, belichtingstijd en camera-instellingen. Merk op dat een langere acquisitie tijd nodig kan zijn voor sommige monsters om nauwkeurige label spectrum detectie met minimale ruis bijdrage mogelijk te maken.
14. Metingen uitvoeren op een experimenteel monster (bijv. menselijke luchtweg gladde spiercellen met GCaMP-sonde en mitochondriale etiket).
    1. Plaats een dia of dekglaasje met het experimentele monster op de Microscoop.
    2. Selecteer een gezichtsveld met de juiste gelabelde cellen van het weefsel.
    3. Verkrijg de spectrale beeldgegevens met behulp van de gewenste acquisitie-instellingen, zoals hierboven beschreven.

6. beeldanalyse

1. Corrigeer afbeeldingen naar een platte spectrale respons.
   1. Trek het in punt 5,9 verkregen achtergrond spectrum af en vermenigvuldig met de in punt 3.1.5 vastgestelde correctiecoëfficiënt. Dit kan worden gedaan met een eenvoudige MATLAB-script of ImageJ-routine. Een MATLAB code voor aftrekken/correctie (gebruikt in dit voorbeeld) is beschikbaar op de website van de University of South Alabama Bioimaging resources.
      1. Laad de aftrek/correctie code in MATLAB.
      2. Klik op uitvoerenop het tabblad Editor. Hiermee opent u een nieuw venster met een BSQ-correctie knop. Klik op de knop correctie BSQ om een ander venster te openen met opties voor de werkmap, het achtergrond bestand, het correctiefactor bestand en de niet-gecorrigeerde TIFF-map.
         1. Gebruik de Blader... knop naast werkmap om het bestandspad te kiezen waar volgende vensters worden geopend. Navigeer naar de map met het opgeslagen achtergrond spectrum (in. dat-indeling).
         2. Gebruik de Blader... knop naast achtergrond bestand (. dat) om de map te openen die is gekozen in stap 6.1.1.2.1 en kies het gewenste achtergrond bestand (in. dat-formaat). Klik op de knop openen om door te gaan.
         3. Gebruik de knop Bladeren... naast correctiefactor (. dat) om een correctiefactor te kiezen. De map voor de correctiefactor wordt standaard ingesteld op de locatie van de bovenliggende MATLAB-code. Navigeer indien nodig naar de submap met het correctiefactor bestand (in. dat-indeling). Markeer het juiste correctiefactor bestand en klik op de knop openen om door te gaan.
         4. Gebruik de knop Bladeren... naast niet-gecorrigeerde TIFF-map om de in stap 6.1.1.2.1 gekozen map te openen en kies de map voor achtergrond aftrek en beeldcorrectie (dit is meestal de Pos0 map die onmiddellijk de RAW- spectrale beelden). Klik op de knop openen om door te gaan.
         5. Klik op de knop Klik voor spectrale correctie . Nadat de verwerking is voltooid, wordt een venster geopend met het bericht "BSQ-correctie voltooid". Klik op de knop OK om door te gaan. De correctie afbeeldingen worden opgeslagen in een nieuwe map met de oorspronkelijke onbewerkte spectrale afbeeldingsmap en een extra "_Gecorrigeerde" (bijvoorbeeld Pos0_Corrected).
2. Genereer de spectrale bibliotheek. Verschillende softwarepakketten kunnen worden gebruikt om spectrale gegevens uit afbeeldingen, waaronder ImageJ, te extraheren. Voor de beste resultaten Normaliseer elk hydroxyleind naar de golflengte band van de grootste intensiteit door te bepalen welke golflengte band de meest intense waarde heeft en de meting bij elke golflengte band door die maximale waarde te verdelen. Ook moet worden opgemerkt dat enkelvoudige besturingselementen die worden gegenereerd in auto fluorescerende monsters extra wijzigingen nodig hebben^{28,29,30,31,32}. Zie stap 6.2.4 en discussie voor meer informatie.
   1. Klik in ImageJ op bestand > ≫ reeks afbeeldingen importeren. Hiermee wordt een nieuw venster geopend. Navigeer naar de map met de gecorrigeerde spectrale afbeeldingen. Dubbelklik op een afbeeldingsbestand in de map om een nieuw venster te openen. Klik op het vakje naast het aantal afbeeldingen en voer het aantal golflengten in dat is opgenomen in de spectrale scan (bijv. 26). Laat het Start beeld en de toename als "1". Klik op de knop OK om door te gaan.
   2. Klik in het hoofdvenster van ImageJ op het pictogram veelhoek selecties en gebruik de muisaanwijzer door op de afbeelding te klikken om een veelhoek te maken rond een gebied dat fluorescentie gegevens bevat. Merk op dat er in de eerste golflengte weinig tot geen fluorescentie gegevens kunnen zijn. Navigeer naar een andere golflengte afbeelding en/of gebruik het gereedschap helderheid/contrast (afbeelding > ≫ helderheid/contrast aanpassen ≫ automatisch) om gebieden met fluorescentie gegevens van belang beter te visualiseren.
   3. Genereer met de veelhoek getekend het Z-asprofiel door te klikken op afbeelding ≫ stapels ≫ z-assig profiel plot. Hiermee wordt een nieuw venster geopend. Klik op Opslaan om de spectrale gegevens op te slaan als een CSV-bestand.
   4. Voer een aftrekken uit om een goede spectrale bibliotheek te garanderen met zuivere etiketten zonder besmetting met autofluorescentie. Gebruik de volgende vergelijking²⁹ om een zuiver spectrum te isoleren van het mengsel van een enkelvoudig label en fluorescentie:
      1
      Waar: s_pure is het zuivere spectrum van het label, s_gemengd is het gemeten spectrum van het monster dat is verontreinigd met autofluorescentie, s _autofl is het gemeten autofluorescentie spectrum, "a" is een scalaire vermenigvuldiger van het autofluorescentie spectrum (tussen 0 en 1, bijvoorbeeld 0,4), en "offset" is een offset (meestal 0). Varieer de "a"-term tot een waarde van near-zero wordt bereikt voor de schijnbare bijdrage van autofluorescentie. Aanvullende informatie is te vinden in diverse publicaties^{28,29,30,31,32}.
3. Ontmeng de spectrale beeldgegevens. De ontmengstap genereert een overvloed aan beeld voor elk fluorescerende etiket, waarbij overvloed de hoeveelheid relatief fluorescentie signaal in de afbeelding van het respectieve label is. Er zijn verschillende unmixing-algoritmen beschikbaar voor gebruik met imagej^33,34,35. Bovendien is een spectrale demengmatlab-code (gebruikt in dit voorbeeld) beschikbaar op de website van de University of South Alabama Bioimaging resources. Een uitgebreider overzicht van spectrale ontmenging is beschikbaar op³⁶.
   1. Laad de spectrale ontmengcode in MATLAB.
   2. Bewerk de golflengte. mat en Library. mat bestanden overeenkomen met de experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld "golflengte" als 360-485 in stappen van vijf).
      Opmerking: de corresponderende waarden voor die golflengten moeten worden geladen in "Library" voor elk fluorescerende etiket (en autofluorescentie). Endmember_Name moet de labels in dezelfde volgorde als de kolomwaarden van "Library". Merk op dat het bestand Library. mat zowel "Library" als "Endmember_Name"-variabelen moet bevatten.
   3. Klik op uitvoerenop het tabblad Editor. Hiermee wordt een nieuw venster geopend waarmee de gebruiker een map kan kiezen. Navigeer naar de map met de spectrale afbeeldingen die u niet wilt mixen. Eenmaal geselecteerd, zal dit een nieuw venster openen.
   4. Voer in de resulterende lege cellen de naam van de afbeelding in (bijvoorbeeld HASMC met GCaMP en Mito FOV1), het aantal golflengte banden (bijv. 26), het aantal tijdpunten (bijv. 1) en of een FRET meting gewenst is (bijv. n) in hun respectieve blanks. Als "n" is geselecteerd voor FRET, laat u beide spaties leeg. Druk op OK om door te gaan, waardoor een nieuw venster wordt geopend.
   5. Naviagate naar de map met het bestand golflengte. mat. Eenmaal geselecteerd, klikt u op openen om door te gaan, waardoor een nieuw venster wordt geopend.
   6. Navigeer naar de map met het bestand Library. mat. Eenmaal geselecteerd, klikt u op openen om door te gaan, waardoor de niet-gemengde afbeeldingen worden opgeslagen in een nieuwe "niet-gemengde" map in de map met de spectrale afbeeldingen.
4. Inspecteer de niet-gemengde spectrale beelden op kwaliteit.
   1. Open elke niet-gemengde afbeelding om de distributie van zuivere componenten visueel te inspecteren.
      1. Vergelijk de omvang van de fout afbeelding met die van de niet-gemengde afbeeldingen (vergelijkbaar met stap 5,11, dit kan worden gedaan via de meet functie van imagej). Als de grootte van het fout beeld qua grootte vergelijkbaar is met de niet-gemengde abundantie afbeeldingen, is het waarschijnlijk dat er signalen zijn in de spectrale beeldgegevens die niet nauwkeurig worden verantwoord door de spectrale bibliotheek en het lineaire spectrale ontmengproces.
      2. Vergelijk de fout afbeelding met de niet-gemengde afbeeldingen om te zien of er ongeïdentificeerde rest structuren zijn.

Representative Results

Een aantal belangrijke stappen van dit protocol zijn nodig om te zorgen voor het verzamelen van gegevens die zowel nauwkeurig en verstoken van Imaging en spectrale artefacten. Het overslaan van deze stappen kan resulteren in gegevens die significant lijken, maar niet kunnen worden geverifieerd of gereproduceerd met een ander spectrale beeldvormings systeem, waardoor eventuele conclusies met deze gegevens effectief worden tenietgedaan. Chief onder deze belangrijke stappen is de juiste spectrale uitvoer correctie (sectie 3). De correctiefactor compenseert voor golflengte afhankelijke variaties in de spectrale uitgang van het aftunable excitatiesysteem. Dit wordt bereikt door het schalen van golflengten met krachtige excitatie, zodat het optische verlichtings vermogen vergelijkbaar is met golflengten met een lage vermogens excitatie, waardoor een plat spectrale excitatie profiel wordt bereikt. Een voorbeeld van een ongepaste correctiefactor is een met zeer lage waarden (bijvoorbeeld < 0,001) bij een of meer golflengten, wat aangeeft dat de intensiteit gemeten bij die golflengten sterk moet worden verzwakt om een vlakke spectrale respons te bereiken.

Kalibratie van het systeem naar een NIST-traceerbare standaard zorgt ervoor dat gegevens die worden verzameld met het excitatie-Scanning spectrale beeldvormings systeem vergelijkbaar is met andere systemen die ook zijn gekalibreerd volgens NIST-traceerbaar normen. Daarom is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat elke correctiefactor de verzamelde gegevens op de juiste wijze aanpast. De nauwkeurigheid van een correctiefactor kan worden geverifieerd met het gebruik van een fluorescentie standaard, zoals NIST-traceerbaar fluorescein. Figuur 1 illustreert een geschikte en ongepaste correctiefactor, gevisualiseerd door middel van grafische en beeldgegevens. In dit geval was de spectrale uitgang bij 340 nm vrijwel onbestaand in vergelijking met de rest van het spectrale bereik, wat resulteerde in een bijna-nulwaarde (< 0,001) voor vrijwel elke golflengte. Toegepast op de afbeeldingsstapel, resulteert dit in near-zero-waarden door de meeste afbeeldingsstapels voor de meeste pixels.

Zoals vermeld in sectie 5, kunnen het excitatie bereik, geselecteerde fluor Foren en acquisitie-instellingen het potentieel creëren dat een of meerdere excitatie golflengte-bands oververzadigde pixels bevatten. Figuur 2 illustreert een voorbeeld waarin de belichtingstijd te lang is ingesteld voor verschillende van de golflengten van excitatie, waardoor de daaropvolgende afbeeldingen oververzadigde pixels bevatten. Dit is belangrijk om op te merken omdat, zoals de afbeelding laat zien, zowel de afzonderlijke afbeeldingen als de False-gekleurde afbeeldingen visueel lijken te zijn binnen acceptabele intensiteits bereiken.

De juiste selectie van een achtergrond gebied voor aftrekken is ook belangrijk voor gegevensvergelijking tussen systemen, omdat het elementen van cameraruis of strooilicht verwijdert voorafgaand aan NIST-traceerbare spectrale correctie (Figuur 3). Het is vaak handig voor latere beeldverwerkings-en gegevensanalyse stappen om een RGB-vals-gekleurd beeld van de spectrale afbeeldings stack te genereren om spectrale functies in de afbeelding te visualiseren. Afbeelding 4 toont een RGB-False-gekleurde afbeelding die wordt gegenereerd door drie geselecteerde golflengte banden samen te voegen (370 Nm = blauw, 420 nm = groen, 470 nm = rood).

Spectrale ontmenging vereist kennis van het spectrale Profiel van elke afzonderlijke fluorescentie bron. In het geval van excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming wordt dit gedaan door het verwerven van spectrale beeld stapels voor elke de (en autofluorescentie). Afbeelding 5 is opgenomen als voorbeeld voor het kiezen van regio's van besturingselementen met één label om een spectrale bibliotheek te genereren. Opgemerkt moet worden dat elke meting is genormaliseerd naar de piek golflengte.

Wanneer het spectrale ontmengproces correct wordt uitgevoerd, kan een spectrale beeld stapel worden gescheiden in de respectieve bijdragen van elk fluorescentie label. Afbeelding 6 toont een voorbeeld van een niet-gemengde spectrale afbeeldingsset, met afzonderlijke afbeeldingen voor elk van de volgende signalen: luchtweg gladde spiercellen autofluorescentie, een gcamp-sonde en een mitochondriaal label. De fout in verband met spectrale ontmenging wordt ook getoond en kan worden onderzocht om de intensiteitsniveaus van de fout te vergelijken met die van de niet-gemengde signalen. Berekening en interpretatie van deze fout is eerder besproken³⁷. Zoals weergegeven in Figuur 6, is er een hoge fout in verband met de nucleaire en perinucleaire gebieden van de cellen, wat aangeeft dat de gemeten spectra van die gebieden niet goed worden verantwoord door de spectra in de spectrale bibliotheek. Een potentiële bron van fout kan zijn dat de single-Label controles voor GCaMP en het mitochondriale label werden bereid met behulp van luchtweg gladde spiercellen, die een hoge inheemse autofluorescentie hebben. Vandaar dat het gcamp en het mitochondriale label geen zuivere hydroxyleind Spectra vertegenwoordigen. Bovendien kan het autofluorescentie signaal de bibliotheek Spectra voor de twee andere etiketten op een manier die niet correct werd verantwoord beïnvloeden, wat resulteert in een minder nauwkeurige aanpassing dan wanneer de etiketten werden verkregen met behulp van een cellijn met weinig tot geen conjugaat. Bovendien zijn voorbeelden opgenomen voor wanneer er te weinig of te veel componenten van een spectrale bibliotheek beschikbaar zijn, wat resulteert in een onderfitting en overfitting van de spectrale beeldgegevens, respectievelijk (Figuur 6, Figuur 7, Figuur 8, Afbeelding 9en tabel 1).

Zoals opgemerkt in paragraaf 6,2 en specifiek stap 6.2.4, "zuivere" Spectra verzameld van gelabelde cellen die ook autofluorescentie zal waarschijnlijk besmetten het spectrale profiel voor de zuivere component. Als zodanig moet er zorg voor worden genomen om de zuivere spectra van de etiketten van belang van hun autofluorescerende hosts te scheiden. Figuur 10 toont het verschil in ontmenging met "zuivere" spectra die zijn verontreinigd met autofluorescentie (gemengd) versus zuivere spectra, berekend volgens de in stap 6.2.4 beschreven methode. Het verschil doet zich vooral voor bij het ontmenging van het autofluorescentie signaal. Zonder de juiste signaal scheiding (bijv. aftrekken van de verontreiniging van autofluorescentie uit het GCaMP-spectrum), concurreren de autofluorescentie-en GCaMP-bibliotheek componenten voor dezelfde spectrale gegevens in elke pixel, wat resulteert in karakteristieke gaten of donkere vlekken in het autofluorescentie beeld.

Figuur 1 : Voorbeeldtoepassingen van ongepaste en geschikte correctiefactoren die worden gebruikt om afbeeldingen te corrigeren naar een platte spectrale respons. A) het uitzetten van ongepaste en passende correctiefactoren. B) een RGB-afbeelding die wordt gegenereerd met gebruik van de ongepaste correctiefactor (a). C) een RGB-afbeelding die wordt gegenereerd met hetzelfde gezichtsveld als B), behalve met het gebruik van een geschikte correctiefactor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2 : Voorbeelden die het belang van passende acquisitie-instellingen illustreren. (a, B) RGB-afbeeldingen gegenereerd door een geschikte acquisitie tijd (A, 100 MS) versus hetzelfde gezichtsveld met een verzadigen acquisitie tijd (B, 500 MS). Opgemerkt moet worden dat de RGB-afbeeldingen identiek lijken wanneer False-gekleurd. C) het gebied van belang dat is geselecteerd om de intensiteitswaarden van de meest intense gebieden van de punten a) en B) te onderzoeken. D) uitgezette intensiteitswaarden per golflengte van de 100 MS belichtingstijd afbeelding (A, zwarte lijn) en 500 MS belichtingstijd (B, rode lijn). Opgemerkt dient te worden dat pixel intensiteiten voor de blootstellingstijd van 500 MS de grens van het dynamische bereik van de detector (65.535 AU) bij 370 Nm hebben bereikt en niet afnemen tot 525 nm, resulterend in spectrale artefact. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3 : Selectie van een interessegebied voor achtergrond aftrekken. A) eenafbeelding met een ruwe, golflengte, gesummed intensiteit. B) de gebieden van de afbeelding die zijn geselecteerd om het pixel gemiddelde achtergrond spectrum te bepalen voor het aftrekken van de achtergrond, weergegeven in rood. (C) de achtergrond-afgetrokken, gecorrigeerd en samengevat intensiteit afbeelding. D) een RGB-kleuring van het gecorrigeerde beeld (C). Het proces van het genereren van een RGB-False-gekleurd beeld wordt weergegeven in Figuur 4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4 : Proces van het genereren van een RGB-False-gekleurde afbeelding. (a-C) Drie golflengte bands gelijkmatig verdeeld over de spectrale acquisitie Range werden geselecteerd voor False-kleuring (blauw = 370 Nm, groen = 420 nm, rood = 470 nm). D) de afbeelding met de opgevatte intensiteit die wordt gegenereerd door pixel intensiteiten toe te voegen uit alle golflengte banden in de afbeeldings kubus. (E-G) De afbeeldingen in deelvensters (A-C) met hun respectievelijke Zoek tabellen met valse kleuren zijn toegepast. H) de resulterende samengevoegde afbeelding van (E-G). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5 : Regio selectie van single-Label besturingselementen voor het genereren van spectrale bibliotheek. (A) RGB vals-gekleurd beeld van luchtweg gladde spier (ASM) cel autofluorescentie. B) in rood, de gebieden a) gekozen voor het autofluorescentie-onderdeel van de spectrale bibliotheek. (C) RGB-vals-gekleurde ASM-cellen met het mitochondriale label. (D) weergegeven in rood, regio's van (C) gekozen voor de mitochondriale Label component van de spectrale bibliotheek. Als gevolg van de auto fluorescentie van de ASM cellen gelokaliseerd in de buurt van de Nucleus, werden kleine regio's ver van de kernen geselecteerd om het mitochondriale etikettenspectrum te identificeren. (E) RGB-vals-gekleurde ASM-cellen die met de gcamp-sonde zijn getransffecteerd. (F) de regio's van (E) geselecteerd voor de gcamp-component van de spectrale bibliotheek worden rood weergegeven. Net als bij (D) werden de regio's uit de buurt van de kernen geselecteerd. G) de spectrale bibliotheek verkregen uit a-F, genormaliseerd tot een waarde van eenheid op de golflengte met het sterkste signaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figuur 6 : Voorbeeld van niet-gemengde afbeeldingsgegevens waarin niet-gemengde relatieve signaal bijdragen uit elk onderdeel van de bibliotheek kunnen worden gevisualiseerd. (a-D) De ongemixte overvloed aan GCaMP, mitochondriaal label, autofluorescentie en fout term. (E-G) De afbeeldingen in deelvensters (A-C) met hun respectievelijke Zoek tabellen met valse kleuren zijn toegepast. H) het samengestelde, samengevoegde, vals gekleurde beeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figuur 7 : Niet-gemengde relatieve signaal bijdragen, met inbegrip van de gemiddelde intensiteit en het percentage van de totale fluorescentie, uit een goed gedefinieerde spectrale bibliotheek. (a-D) De ongemixte overvloed voor autofluorescentie, GCaMP, mitochondriaal label en fout term. Opgemerkt moet worden dat de fout term minder dan 10% van het totale fluorescentie signaal omvat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figuur 8 : Niet-gemengde relatieve signaal bijdragen, met inbegrip van de gemiddelde intensiteit en het percentage van de totale fluorescentie, uit een spectrale bibliotheek die een onderdeel mist waarvan bekend is dat het in het monster wordt opgenomen (d.w.z. een ondergedefinieerde spectrale bibliotheek). (a-C) De ongemixte overvloed aan autofluorescentie, mitochondriaal label en fout term. Merk op dat het weglaten van GCaMP uit de spectrale bibliotheek de berekende relatieve signaal bijdragen uit de bibliotheek componenten en de fout term heeft verhoogd in vergelijking met Figuur 7. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 9 : Niet-gemengde relatieve signaal bijdragen, met inbegrip van de gemiddelde intensiteit en het percentage van de totale fluorescentie, uit een spectrale bibliotheek met een extra onderdeel waarvan bekend is dat het ontbreekt in het monster (d.w.z. een overgedefinieerde spectrale bibliotheek). (a-E) De ongemixte overvloed aan autofluorescentie, GCaMP, mitochondriaal label, nucleair label en fout term. Merk op dat de toevoeging van een nucleair label aan de spectrale bibliotheek de berekende relatieve signaal bijdragen van autofluorescentie heeft verlaagd, vergeleken met Figuur 7. Bovendien is de fout term lager dan de percentage fout die is opgegeven door de correct gedefinieerde spectrale bibliotheek. Dit komt omdat een overgedefinieerde bibliotheek bijna altijd een betere pasvorm voor de experimentele gegevens dan een goed gedefinieerde bibliotheek, hoewel overvloed signalen voor onderdelen waarvan bekend is dat ze afwezig zijn in het voorbeeld zijn (in werkelijkheid) artefacten van het overdefiniëren van de spectrale bibliotheek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 10 : Vergelijking van niet-gemengde beelden bij gebruik van een bibliotheek voor en na de juiste autofluorescentie contaminatie signaal aftrekken. A) de originele "zuivere" spectra die zijn afgeleid van de enkelvoudige besturingselementen in sterk autofluorescerende luchtweg gladde spiercellen vóór de geschaalde aftrekken gedetailleerd in stap 6.2.4. (B-D) De niet-gemengde autofluorescentie-, GCaMP-en nucleaire label afbeeldingen die zijn gegenereerd met (A) als de bibliotheek. E) de gecorrigeerde zuivere spectra die zijn afgeleid van enkelvoudige besturingselementen in sterk autofluorescerende luchtweg gladde spiercellen na geschaalde aftrekken. (F-H) De niet-gemengde autofluorescentie-, GCaMP-en Nuclear label beelden die worden gegenereerd met (E) als de bibliotheek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Gemiddelde intensiteit (AU)
	Juiste pasvorm	Underfitting	Overfitting
Conjugaat	187	299	164
GCaMP	139	-	140
Mitochondriaal label	246	318	248
Nucleair label	-	-	26
RMS-fout	53	126	43
Standaarddeviatie (AU)
	Juiste pasvorm	Underfitting	Overfitting
Conjugaat	362	442	315
GCaMP	168		168
Mitochondriaal label	344	388	345
Nucleair label	-	-	93
RMS-fout	62	126	44
Maximale intensiteit (AU)
	Juiste pasvorm	Underfitting	Overfitting
Conjugaat	6738	7409	6738
GCaMP	1336	-	1336
Mitochondriaal label	5098	5194	5098
Nucleair label	-	-	1257
RMS-fout	1050	1286	910
% van de totale fluorescentie
	Juiste pasvorm	Underfitting	Overfitting
Conjugaat	30	40%	26
GCaMP	22	43%	23
Mitochondriaal label	39%	-	40%
Nucleair label	-	-	4
RMS-fout	8	17	7

Tabel 1: Een tabel met een vergelijking van de gemiddelde, standaarddeviatie en maximale niet-gemengde abundantie intensiteitswaarden per niet-gemengde abundantie afbeelding uit een juiste spectrale bibliotheek en uit ondergedefinieerde of overgedefinieerde spectrale Bibliotheken, evenals het percentage van de totale fluorescentie per niet-gemengde abundantie afbeelding (de minimale niet-gemengde abundantie intensiteit voor elke afbeelding was altijd nul). Gegevens uit Figuur 7, Figuur 8en Figuur 9.

Discussion

Het optimale gebruik van een excitatie-Scanning hyperspectrale Imaging set-up begint met de bouw van het lichtpad. Met name de keuze van de lichtbron, filters (instelbaar en dichroïde), filter schakelmethode en camera bepalen het beschikbare spectrum bereik, mogelijke scansnelheid, detector gevoeligheid en ruimtelijke sampling. Mercury Arc-lampen bieden vele pieken van de excitatie golflengte, maar bieden geen platte spectrale uitgang en vereisen een aanzienlijke signaal reductie bij de uitgangen om de spectrale beeldgegevens terug te zetten naar een NIST-traceerbaar antwoord³⁸. Alternatieve lichtbronnen, zoals XE Arc-lampen en White Light supercontinuum-lasers, kunnen een meer uniforme spectrale uitvoer bieden die beter geschikt is voor excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming^38,39,40. Keuze uit lichtbron, instelbare filters en dichroïde filters bepalen het beschikbare spectrum bereik. Dit bereik moet worden gekozen met zorgvuldige afweging van de gewenste spectrale informatie van het experimentele monster.

Daarnaast moet rekening worden gehouden met het schakelmechanisme dat wordt gebruikt voor de instelbare filters, evenals met verschillende camera factoren zoals kwantum efficiëntie, pixelgrootte en beschikbare framesnelheden, aangezien deze factoren van invloed zijn op mogelijke bemonsteringsfrequenties^{41 ,42,43}. Echter, alle andere factoren die constant zijn, het gebruik van de excitatie-Scanning aanpak moet zorgen voor een verhoogde gevoeligheid en de mogelijkheid voor snellere beeldvorming, in vergelijking met de meeste radiografische Scanning spectrale beeldvormings benaderingen²¹.

Zoals opgemerkt in de inleiding, Hyperspectrale beeldvorming hier verwijst naar de aaneengesloten en spectraal overlappende aard van de verworven gegevens. Als zodanig moeten de mogelijkheden van het systeem in staat zijn om gegevens te verzamelen met behulp van afstand van excitatie centrum golflengten minder dan de helft van de afstand van de FWHM van de filters. Zoals eerder gerapporteerd, maakt een zorgvuldig gekozen array van dun-film instelbare filters het verzamelen van gegevens mogelijk met een middengolf lengte van 5 nm, een afstand die voldoende is om het excitatie spectrum te oversamplen met filters met FWHM tussen 14-20 Nm. Een dergelijke afstand geeft lichte redundantie in spectrale gegevensverzameling, waardoor de nauwkeurigheid van het ontmengproces waarschijnlijk toeneemt. De behandeling van zowel spectrale bereiken als het noodzakelijke minimum aantal golflengten voor nauwkeurige ontmenging is eerder besproken^44,45,46. Daartoe moet, gezien de bandbreedte van deze filters, het excitatie bereik worden geselecteerd om te eindigen bij een golflengte die iets lager is (5-10 nm lager) dan de cut-off golflengte van de dichroïde beamsplitter. Dit zal ervoor zorgen dat de gehele bandbreedte van de excitatie verlichting onder de afsluit golflengte van de dichroïde beamsplitter (bijv. 360-485 nm voor de 495 dichroïde filter) ligt om excitatie-emissie cross-talk te voorkomen.

Software om elke component van de hardware onafhankelijk te bedienen om High-Speed spectrale imaging scans te realiseren is vereist. De software moet in staat zijn om de sluiter te bedienen, selecteer excitatie golflengten, en het verwerven van beelden bij voldoende hoge snelheden om te voldoen aan de experimentele omstandigheden (exacte sample rate eisen zal variëren experiment, maar een voorbeeld doel zou kunnen zijn om te verwerven vier volledige spectrale beeld stapels per minuut). Complexere experimenten kunnen gebruik maken van meerdere dichroïde spiegels, doelstellingen of XYZ-locaties. Er zijn een aantal softwarepakketten beschikbaar voor het verzamelen van gegevens^47,48. Micro-Manager is een gratis open-source software voor Microscoop automatisering die een verscheidenheid aan aanpassingsmogelijkheden biedt. Bovendien bevat Micro-Manager een scripting panel voor aanvullende aanpassingen die niet beschikbaar zijn in de hoofdgebruikersinterface. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een aangepast script te gebruiken om de vertraging van 250 MS van de instelbare filter wisselaar te reduceren tot 10 MS bij alle excitatie golflengten, behalve de golflengte overgangen waarin het filter wiel draait naar een nieuw instelbare filter, waardoor de effectieve beeldvorming tijd door 240 MS per golflengte voor de meeste golflengten. Deze aanpassing heeft de overname van maximaal 30 golflengten in minder dan 4 s toegestaan. Ten slotte kan micro-manager naast andere omgevingen worden bediend, zoals MATLAB, om de Microscoop apparaatbesturing verder aan te passen.

Het bepalen van het juiste spectrale excitatie bereik, de acquisitie tijd en de initiële golflengte voor het bekijken van monsters en het daaropvolgende verzamelen van gegevens is erg belangrijk. Voor een onjuiste werking van afzonderlijke onderdelen van het systeem kan echter nog meer probleemoplossing nodig zijn. Elk onderdeel van het optische pad draagt bij aan de verkregen beeldgegevens. Daarom is het belangrijk om de spectrale respons en optische overdracht van optische componenten binnen het lichtpad te controleren, vooral als u probeert de algehele systeemrespons te optimaliseren. Lichtbronnen hebben vaak variabele intensiteits instellingen en kunnen tijdens de levensduur van de lamp⁴⁰minder stroom krijgen. Als een voorbeeld gedimd wordt weergegeven, kan de oorzaak van de lichtbron afnemen. De autoshutter-functie in Micro-Manager, in onze ervaring, werkt niet 100% van de tijd. Een gebrek aan signaal kan duiden op een gesloten sluiter. De initiële excitatie golflengte die in het configuratiebestand van Micro-Manager wordt opgeslagen, kan standaard een golflengte hebben met weinig of geen spectrale uitvoer, zoals het 340 nm-voorbeeld in Figuur 1.

Bovendien is het niet ongewoon om per ongeluk een excitatie golflengte te kiezen die boven de afsluit golflengte van de long-pass dichroïde beamsplitter ligt, wat resulteert in extra cross-talk en/of excitatie licht dat rechtstreeks naar de camera kan worden de camerasensor mogelijk beschadigen. Op dezelfde manier kan het aanpassen van het lichtpad voor transmissie beeldvorming resulteren in verlies van signaal naar de camera, afhankelijk van de configuratie van de Microscoop. Bovendien kan, zoals aangegeven in Figuur 2, de keuze van de initiële golflengte van de excitatie en de blootstellingstijd voor het bekijken van het monster passend lijken, maar in werkelijkheid resulteren in oververzadigde pixels bij andere excitatie golflengten. Dit feit zal niet duidelijk zijn, tenzij de pixel verzadiging voor elke afbeelding wordt gecontroleerd, dus het is vaak verstandig om een testbeeld stapel uit te voeren op een gebied van het monster dat de meest intense fluorescentie lijkt te bevatten.

Het is ook vermeldenswaard dat variabele intensiteiten aanwezig kunnen zijn in afbeeldingen die zijn gekozen voor achtergrond gebieden. Er dient op te worden toegezien dat deze regio's daadwerkelijk relevante beeldgegevens bevatten, aangezien de volgende stappen voor gegevens correctie dit signaal zullen aftrekken van de beeldgegevens die in andere gebieden van het monster zijn verkregen. Het is soms nodig om de transmissie instellingen te gebruiken en/of de belichtingstijd drastisch te verhogen om te controleren of de geselecteerde regio voor het meten van de achtergrond van het monster inderdaad geen monster bevat. Op dezelfde manier kunnen niet-gemengde beelden met donkere vlekken of gaten in het autofluorescentie beeld aanwezig zijn. Dit kan te wijten zijn aan een onjuiste bibliotheek veroorzaakt door autofluorescentie "besmetting" van de "zuivere" spectrale signalen van single-gelabelde cellen. Dit komt omdat elk "zuiver" spectrale signaal dat wordt verzameld uit een monster dat autofluorescentie bevat, steevast een aantal van de autofluorescentie Spectra zelf bevat, zelfs als deze in sporen bedragen. Er moet voor worden gezorgd dat de autofluorescentie signalen van de ééngelabelde bedieningselementen worden afgetrokken om een goede spectrale bibliotheek te garanderen, zoals bij verschillende gelegenheden door Mansfield et al.^{28,29,30, 31,32}

Hoewel niet aangetoond in dit artikel, kan het excitatie-Scanning spectrale beeldvormings systeem ook worden gebruikt voor timelapse-beeldvorming en beeldvorming over meerdere XY-locaties (of een groot gezichtsveld als gevolg van beeld stiksels) in meerdere focal vlakken. Als deze opties voor één experiment gewenst zijn, moet zorgvuldig worden nagedacht over het belang van de acquisitie order en de mogelijke effecten van fotobleaching. Het is ook vermeldenswaard dat als de werkelijke tijd die wordt genomen groter is dan de geschatte tijd (bijvoorbeeld, een afbeelding stack duurt 11 s te verwerven in plaats van de geschatte 10 s), Micro-Manager zal blijven om het geselecteerde aantal tijdpunten en/of posities te verwerven. Deze onjuiste berekening kan verbinding maken met meerdere tijdpunten en berekende tijdelijke steekproeven wijzigen, potentieel scheeftrekken alle conclusies die zijn gemaakt van de gegevens.

Dit voorbeeld demonstreert de mogelijkheid om drie bronnen van fluorescentie te scheiden binnen een 145 nm excitatie scanbereik. Eerdere experimenten met dit systeem konden tot vijf bronnen van fluorescentie scheiden binnen hetzelfde bereik. De tijd die nodig is voor deze beeld verwerving is minder dan 1 minuut, wat aanzienlijk sneller is dan de meeste spectrale beeldvormingssystemen met emissie scanning. Verbeteringen in het lichtpad, zoals het afstemmen van een hogere snelheids golflengte, kunnen deze beeldvormingstechnologie verder verbeteren tot snelheden die voldoende zijn voor spectrale beeldvorming met video snelheid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output