세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA)는 헬스케어 관련 감염의 주요 원인이며 관련 항생제내성은 상당한 임상적 과제1,^2,3이다. 따라서 새로운 치료 전략의 개발이 높은 우선 순위입니다. 그람 양성 병원체에 대한 유망한 치료 전략은 지방산 합성을 억제하는 것입니다, 막 인지질 생산을위한 요구 사항, S. 아우레우스에서,인산 을 포함 (PG),리실 -PG, 및 심장 리핀 4. 박테리아에서, 지방산 생산은 진핵 대응과 상당히 다른지방산 합성 II 통로 (FASII) 5를 통해 발생하며, FASII를 항생제 개발을위한 매력적인 표적으로 만들기^5,6 . FASII 억제제는 주로 지방산 탄소 사슬 신장에 필요한 효소인 FabI를 표적으로^7. 이 파비 억제제 트리클로산은 소비재 및의료기기 8,^9에광범위하게 사용된다. S. 아우레우스 감염 의 치료를 위한 여러 제약 회사에 의해 추가 FabI 억제제가 개발되고 있다^{10,11, 12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}. 그러나, S. 아우레우스를포함한 많은 그람 양성 병원체는 인지질 합성을 위한 외인성 지방산을 청소할 수 있으며, FASII 억제를 우회하여^27,28,29. 따라서, FASII 억제제의 임상적 잠재력은 숙주 지방산의 공급원및 병원체가 숙주^{27,28로부터}지방산을 추출하는 메커니즘에 대한 우리의 지식에 상당한 차이로 인해 논의된다. 이러한 격차를 해소하기 위해 지단백질 입자에서 외인성 지방산이 S. 아우레우스의막 인지질에 통합되는 것을 모니터링하는 편견없는 지질 분석 방법을 개발했습니다.

패혈증 동안, 숙주 지단백질 입자는 대부분의 숙주 지방산이 입자(30)와 연관됨에 따라, 혈관 내 숙주유래 지방산의 잠재적인 공급원을 나타낸다. 지단백질은 중성지방과 콜레스테롤 에스테르^31의소수성 코어를 둘러싸는 인지질과 단백질로 구성된 친수성 껍질로 구성됩니다. 지단백질의 4개의 주요 종류 - chylomicron, 아주 저밀도 지단백, 고밀도 지단백 및 저밀도 지단백 (LDL)-는 지질 수송 차량으로 호스트에 의해 생성되고, 지방산과 콜레스테롤을 전달합니다 혈관을 통해 세포를 숙주. LDL은 트리글리세라이드와 콜레스테롤 에스테르 를 포함한 에스테르화 지방산이 풍부하다^31. 우리는 이전에 고도로 정제된 인간 LDL이 PG 합성을 위한 외인성 지방산의 실행 가능한 근원이다는것을, 따라서 FASII 억제제 우회(32)를 위한 기계장치를 제공한다는 것을 입증했습니다. 인간 LDL을 정화하는 것은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있으며, 정제된 인간 LDL의 상업적 공급원은 일상적으로 사용하거나 대규모 세균 성 스크린을 수행하는 데 엄청나게 비쌉합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 지단백질 입자(33)의 풍부한 공급원인 닭달걀 노른자로부터LDL을 농축하는 절차를 수정했습니다. 우리는 성공적으로 S. 아우레우스^32의막에 인간 LDL 파생 된 지방산의 혼입을 모니터링하기 위해 비표적, 고분해능 / 정확한 질량 분석및 탠덤 질량 분석법을 사용했다. 이전에 보고된 방법과는 달리, 이 접근법은 3가지 주요 포도상 구균 인지질 유형에 대해 각각의 개별 지방산 이성미를 정량화할 수 있다. 올레산(18:1)은 S. 아우레우스 인지질^29,30,32에쉽게 통합되는 모든 숙주 지단백질 입자 내에 존재하는 불포화 지방산이다. S. 아우레우스는 올레산^{합성(29)을}할 수 없다; 따라서, 인지질 통합 올레산의 양은 포도상 구균 막⁽²⁹⁾내에서 숙주 지단백질 유래 지방산의 존재를 확립한다. 이러한 인지질 종은 여기에 기술된 최첨단 질량 분석 법에 의해 식별될 수 있으며, 지방산 공급원의 존재 상태에서 배양된 S. 아우레우스의 막 조성에 대한 전례 없는 분해능을 제공할 가능성이 높습니다. 감염 중 만남.

참고 : 닭 계란 노른자에서 LDL 입자의 농축을위한 다음 프로토콜은 무사 등에서 파생됩니다.

1. LDL 입자의 농축을위한 닭 계란 노른자 준비

1. 70% 에탄올 용액으로 껍질을 세척하여 두 개의 큰 닭고기 계란을 소독하고 공기 건조를 허용합니다.
2. 70% 에탄올 용액을 사용하여 계란 분리기를 소독하고 공기 건조를 허용합니다. 중간 크기의 비커의 입술에 계란 분리기를 부착합니다.
3. 각 달걀을 개별적으로 계란 분리기로 부수고 알부민이 비커로 흘러 들어오도록 합니다. 그대로 달걀 노른자는 분리기에 의해 유지됩니다.
4. 달걀 노른자를 30 mL의 멸균 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척하여 잔류 알부민을 제거합니다.
5. 달걀 노른자를 필터 용지에 부드럽게 놓습니다.
6. 멸균 피펫 팁으로 비텔린 멤브레인을 뚫고 멤브레인의 내용물을 멸균 된 50 mL 원추형 원심 분리관으로 배출하십시오. 멤브레인과 여과지를 버리십시오.

2. 닭 계란 노른자에서 LDL 함유 플라즈마의 분획

1. 약 2부부0.17M NaCl을 pH 7.0에 달걀 노른자에 넣고 힘차게 섞습니다. 그런 다음 이 용액을 4°C에서 60분 동안 혼합합니다.
2. 10°C에서 10,000 x g에서 45분 동안 달걀 노른자를 희석시키는 원심분리기.
3. 2.2단계를 반복합니다.

3. 플라즈마에서 LDL 입자의 절연

1. 플라즈마 분획을 40% 황산 암모늄(w/v)과 4°C에서 60분 동안 혼합합니다.
2. 420 mM NaOH 용액으로 플라즈마 분획의 pH를 8.7로 조정합니다.
3. 45 분 동안 4 °C에서 4 °C에서 달걀 노른자 희석을 45 분 동안 제거합니다. 팽창할 수 있도록 튜빙에 공간을 제공합니다.
4. 황산암모늄을 제거하기 위해 3L의 초순수에서 4°C에서 투석을 하였다. 볶음 바를 사용하여 물을 부드럽게 교반합니다.
5. 투석액을 멸균 50 mL 원점 원심분리관으로 옮김.
6. 45 분 동안 10,000 x g에서 4 °C에서 용액을 원심 분리. 조심스럽게 멸균 튜브에 상부 반고체 노란색 분획을 제거하고 4 °C에서 저장합니다.

4. 지방산의 근원으로 닭 LDL의 평가

1. 계대 배양 S. 아우레우스 세포를 5 mL의 지방산이 없는 1% 트립톤 국물을 넣고 37°C에서 밤새 배양하여 흔들림(225 rpm)을 하였다. 지방산 auxotrophs에 대 한, 지방산의 소스와 문화를 보충.
2. 1% 트립톤 국물에 0.1의 600 nm(OD_600)에서광학 밀도(OD)로 밤새 배양물을 희석한다. 피펫 50 μL의 셀 현탁액을 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰내로.
   참고: 지방산 auxotrophs로 작업할 때, 배양OD를 결정하기 전에 지방산의 이월을 제한하기 위해 트립톤 국물의 5 mL에 다시 두 권의 트립톤 국물로 밤새 배양을 씻고 다시 중단하십시오.
3. 처리되지 않은 컨트롤을 함유한 웰의 경우, 웰당 1% 트립톤 국물 50 μL을 추가합니다.
4. 실험용 세포 현탁액을 함유하는 우물에, 10% 임노른자 유래 LDL, 2 μM 트리클로산 또는 10% 달걀 노른자 유래 LDL 및 2 μM 트리클로산혼합물으로 보충된 1% 트립톤 국물 50 μL을 첨가한다.
   참고 : 이 시점에서, 각 우물은 100 μL을 포함하고 우물 당 계란 노른자 유래 LDL 및 트리클로산의 최종 농도는 각각 5 % 및 1 μM이 될 것입니다.
5. 37°C로 설정된 마이크로플레이트 리더를 사용하여 성장을 모니터링하기 위해 연속적인 선형 흔들림으로 시간에 따라 OD_600을 측정합니다.

5. 막 지질 분석을 위한 LDLs를 가진 S. 아우레우스의 배양.

1. 분리된 콜로니를 5 mL의 지방산 프리 1% 트립톤 국물을 배양하고 37°C에서 밤새 교양하여 흔들림(225 rpm)을 배양하였다.
2. 1:100을 1% 트립톤 국물의 50 mL를 함유하는 멸균 250 mL 배플 플라스크에 희석한다. 37°C에서 중간 로그 상(약 4시간)으로 배양하고 흔들림을 갖는다.
3. 배양 25 mL을 멸균 50 mL 원심분리기 튜브 및 펠릿 세포로 옮김을 전달한다. 상급체를 제거하고 1% 트립톤 국물의 750 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시켰다.
4. 재중단된 세포와 300 μL의 세포 현탁액을 멸균 된 1.5 mL 원심 분리튜브에 결합한다.
5. 원하는 최종 농도에 LDL을 추가하고 4 시간 동안 흔들림 (225 rpm)으로 37 °C에서 배양하십시오.
6. 16,000 x g에서 4°C에서 배양된 배양체를 2분 동안 2분 동안 살균한 PBS의 두 부량으로 세척한 후 반복한다.
7. 각 젖은 세포 펠릿의 무게를 기록합니다. 드라이 아이스 또는 액체 질소에 세포 펠릿을 스냅 동결하고 -80 °C에서 저장하거나 섹션 6으로 직접 진행하십시오.

6. S. 아우레우스 막 지질 추출

1. 냉동 S. 아우레우스 세포 펠릿을 드라이 아이스위에 놓습니다. 각 세포 펠릿 위에 0.5 mm 지르코늄 산화물 비드를 추가하고 셀 펠릿의 부피와 거의 동일한 비드를 사용하십시오.
   참고 : 지질 추출의이 방법에 대한 대안으로, 연구원은 세균 세포에서 지질을 정확하게하기위한 잘 설립 된 Bligh 및 다이어 또는 Folch 방법을 사용할 수 있습니다^34.
2. 740 μL의 75% 메탄올(HPLC 등급)을 세포 펠릿에 직접 -80°C로 냉각시.
3. 내부 표준으로 세포 1 mg당 50 μM 디미리스토일 포스파티딜콜린(메탄올로 제조)의 2 μL을 추가합니다. 시험관을 닫고 각 샘플을 포함하는 1.5 mL 원심분리기 튜브를 총알 블렌더 조직 균질화에 사용 가능한 포트에 넣습니다. 3 분 동안 2-3을 설정하여 낮은 속도로 샘플을 균질화하십시오.
4. 샘플을 시각적으로 검사하여 균질성을 검사합니다. 세포 덩어리가 보이면 2분 단위로 총알 블렌더에서 균질화를 계속하십시오.
5. 총알 블렌더에서 샘플을 제거하고 화학 연기 후드로 옮김.
6. 각 샘플 튜브에 클로로폼 270 μL을 추가합니다. 30 분 동안 적극적으로 샘플을 소용돌이.
   주의: 클로로포름은 발암 가능한 물질입니다.
7. 최소 2,000 x g에서최대 30 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 샘플을 원심 분리합니다. 호환 가능한 원심분리기 튜브와 더 빠른 속도를 사용할 수 있으며 원심분리 기간은 10분으로 단축될 수 있습니다.
8. 화학 연기 후드에서 단상 상한제를 수집하고 추출 튜브 의 바닥에있는 단백질 펠릿을 조심스럽게 피하면서 새로운 시험관으로 옮김을 옮김을 채취하십시오.
9. 단백질 펠릿에 75% 메탄올(HPLC 등급) 및 클로로폼 270 μL의 740 μL을 추가하고 위의 단계 6.6-6.8에 설명된 대로 각 샘플을 다시 추출합니다. 두 번째 추출의 상급체를 각 샘플에 대해 이전에 수집된 상급물질과 결합합니다.
10. 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 가스의 스트림 하에서 추출 용매를 증발하거나 원심 분리기농축기 (재료 표)를 사용하여 진공 상태.
11. 건조된 지질 추출물을 수성 1.0 mM 중탄산염 용액 1.0 mL로 3회 세척하고 6.10단계에서와 같이 샘플을 다시 건조시킵니다.
12. 말린 지질 추출물을 이소프로판올과 같은 적합한 비극성 용매로 재중단한다. 5.7단계에서 결정된 신선한 세포 중량 1mg당 20 μL을 사용하여 시료를 재중단한 후, 세포 펠릿의 무게가 알려지지 않은 경우, 이소프로판올 200 μL에서 샘플을 재중단하고 섹션 7로 진행한다.

7. 고분해능/정확한 질량분석법을 이용한 S. 아우레우스 지질 프로파일 분석

1. 전체 지질 분석을 수행하기 전에 실험 군으로부터 대표적인 시험 샘플을 선택하고 샘플 희석 인자의 범위에 걸쳐 분석하여 총 지질 농도가 선형 내에 속하는 샘플 희석 범위를 결정합니다. 질량 분석기에 대한 검출기 응답범위(35.
2. 지질 분석을 실시하는 각 시료 지질 추출물의 aliquots를 증발시켜, 불활성 기체 하에서 또는 진공 하에서 원심분리기 농축기(TableofMaterials)에서 aliquots를 건조시킴으로써.
3. 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS) 등급 이소프로판올:메탄올(2:1, v:v)에서 각각의 말린 지질 추출물을 재중단하여 20 mM 암모늄 포메이트를 함유하고, 7.1단계에서 결정된 바와 같이 최적의 시료 희석 인자에 상응하는 부피를 사용한다.
4. 표적지질 분석의 경우, 시료는 유동 주입 또는 추출물^35,36의직접 주입에 의한 크로마토그래피를 사용하지 않고 고해상도/정확한 질량 분석 플랫폼에 직접 도입될 수 있다. 7.3단계에서 제조된 희석된 지질 추출물을 적절한 자동 샘플러 바이알 또는 96웰 플레이트로 옮김을 전달한다.
5. 유동 주입 기반 분석을 위해, 자동 샘플러 바이알을 전자 유동이 장착된 HPLC(재료 표)와 같은 모세관/저유동 응용이 가능한HPLC 시스템의 온도 제어(15°C) 자동 샘플러에 배치합니다. 비례 및 흐름 모니터링 시스템.
6. 20 mMM 암모늄 포메이트를 함유한 LC-MS 등급 이소프로판올:메탄올(2:1, v:v)으로 HPLC 용매 저장소를 채웁니다.
7. 애질런트 Chemstation 소프트웨어를 사용하여 HPLC 자동 샘플러를 프로그래밍하여 5 μL 샘플 주사를 수행합니다. 인스트루먼트 메뉴에서 인젝터 설정설정을 선택하고 주입 볼륨 필드에 5.0을 입력합니다. 단위는 마이크로 리터로 제공됩니다. HPLC가 20 mM 암모늄 포르메이트를 함유하는 메탄올:이소프로판올의 분당 1 μL에서 이소크라테스 흐름으로 설정되어 있는지 확인합니다.
8. Chemstation 계측기 메뉴에서 펌프 설정을 선택한 다음 마이크로 흐름 모드 토글 스위치를 선택합니다.
9. 시간표 필드에 시간 0.00, 100% B, 흐름 1.0을입력합니다. 시간 10.0, 100% B, 흐름 1.0을입력하여 입력을 누르고 타임타임에서 두 번째 행을 만듭니다. 펌프 설정 메뉴 하단의 확인 버튼을 선택합니다. 이러한 설정은 분당 1.0 μL의 유량으로 10개의 분석 실행을 가능하게 합니다.
10. 낮은 유량(34G) 금속 바늘이 장착된 전기 분무 이온화 소스를 사용하여 HPLC 이송 라인에서 질량 분석기로 용루를 도입합니다.
11. Thermo Tune Plus 계측기 제어 소프트웨어를 사용하여 설정 메뉴를 선택하고 가열된 ESI 소스를선택합니다. 이온화 전압을 대화 상자의 해당 필드에 입력하여 이온화 전압을 4000V 및 시스 가스를 5(임의 단위)로 설정합니다. 마찬가지로 모세관 온도를 150°C로 설정하고 S 렌즈를 50%로 설정합니다.
    참고: 이러한 값은 각 질량 분석 플랫폼에 대해 최적화되어야 합니다.
12. 표적지질 분석의 경우 고분해능/정확한 질량 MS플랫폼(재료 표)을 검출기로 사용하십시오.
13. Thermo Tune Plus 소프트웨어를 사용하여 스캔 정의 버튼을 클릭하고 분석기 메뉴에서 FTMS를선택합니다. 질량 범위 필드를 법선으로 설정하고 해상도 필드에서 100,000을선택합니다. 검사 유형이 전체로 설정되어 있는지 확인합니다. 스캔 범위 메뉴에서 첫 번째 질량(m/z) 필드에 200을 입력하고 마지막 질량(m/z) 필드에 2000을 입력합니다.
14. 가장 풍부한 S. 아우레우스 지질을 검출하기 위해 부정적인 극성이 활용되었는지 확인하십시오.
15. 지질 구조와 지방산 성분을 확인하기 위해 관심 있는 스펙트럼 영역 내의 모든 지질 이온의 이온 매핑 탠덤 질량 분석법(MS/MS) 단편화를 사용하여 시료 분석을 반복합니다. 대안적으로, 관심 있는 선택된 지질 이온은 섹션 8에서 초기 지질 식별이 할당된 후에 MS/MS 분석을 행할 수 있다.

8. 내인성 S. 아우레우스 및 외인성 LDL 유래 지질을 식별하기 위한 데이터베이스 검색

1. Thermo Xcalibur 소프트웨어를 사용하여 관찰된 질량 정확도를 더욱 구체화합니다. Xcalibur에서 도구 메뉴에서 오프라인 재보정을 선택합니다. 오프라인 재보정 창이 열리면 파일 메뉴를 선택하고 열기 옵션을 선택하여 질량 스펙트럼 파일을 다시 보정할 수 있도록 로드합니다.
2. 관심 있는 파일을 열고 뷰 창 상단의 행 삽입 버튼을 전환하여 MS 실행에 대한 총 이온 크로마토그램을 봅니다. 총 이온 크로마토그램에서 관찰된 신호 피크의 한 쪽 가장자리에서 컴퓨터 마우스를 왼쪽으로 클릭하고 피크의 가장 넓은 부분을 가로질러 마우스를 드래그하여 획득된 MS 신호를 평균화합니다.
3. 스캔 필터 메뉴에서 전체 스캔 MS 데이터에 해당하는 필터를 선택합니다. 로드 Ref... 버튼을 선택하고 참조 파일을 선택하여 적어도 3개의 알려진 S. 아우레우스 내인성 지질의 이론적 단일동소토토 질량을 포함하는 참조 파일을 로드한다. 각 지질 단동이 원소 질량 옆에 있는 사용 상자를 선택합니다.
4. 보기 창 하단의 검색 단추를 클릭합니다. 이전과 같이 총 이온 크로마토그램에서 신호 피크를 가로질러 MS 신호를 다시 평균합니다.
5. 보기 창 아래쪽에 있는 변환 단추를 클릭합니다. 대화 변환 상자가 열리면 확인을클릭합니다. Thermo Scientific 이외의 공급업체의 질량 분석 플랫폼에서 데이터가 수집된 경우 이 단계를 생략합니다.
6. Xcalibur 소프트웨어를 사용하여 처리되지 않은 각 또는 LDL 처리된 각 샘플에 대해 재보정된 정확한 질량 피크 목록을 내보내 Excel 파일의 워크시트를 분리합니다. 퀄 브라우저 아이콘을 선택합니다. 파일 메뉴를 선택하고 열기 옵션을 선택하여 관심 있는 파일을 다시 보정합니다.
7. 8.2단계에서 기재된 바와 같이 총 이온 크로마토그램에서 넓은 피크에 걸쳐 신호를 평균한다.
8. 질량 스펙트럼 보기 창에서 엄지 손가락 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 보기를 선택 | 스펙트럼 목록. 동일한 메뉴에서 표시 옵션을 선택한 다음 표시 메뉴에서 모든 피크 토글 상자를 선택합니다. 확인 버튼을 클릭하여 보기 창을 닫습니다.
9. 질량 스펙트럼 보기 창에서 엄지 손가락 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 내보내기 | 클립 보드 (정확한 질량). 첫 번째 워크시트의 내보낸 데이터 셀 A1을 새 Excel 스프레드시트에 붙여넣습니다.
10. Excel 스프레드시트의 셀 A1에 질량 스펙트럼의 첫 번째 질량 데이터 포인트가 포함되도록 내보낸 데이터 파일에서 처음 8행의 텍스트를 삭제합니다. 내보낸 각 피크 목록에 대해 Excel 파일의 새 워크시트를 사용하여 각 재보정된 MS 파일내보내기를 반복합니다.
11. 지질 질량 스펙트럼 분석 (LIMSA) 소프트웨어³⁷ Excel에 대 한 추가 를 사용 하 여, Hewelt-Belka 외에 의해 설명 된 대로 알려진 된 S. 아우레우스 지질 종의 분자 수식을 포함 하는 데이터베이스를 구성 2014^38,뿐만 아니라 가설적으로 LDL에 존재할 수 있는 지질 종을 나타내는 수식.
    참고: 또한, 올레산(18:1) 및 리놀레산(18:2) 지방산^32와같은 주요 LDL 지방산을 통합한 가상의 세균 지질에 대한 잠재적인 분자 수식을 데이터베이스에 포함시키는 데 주의를 기울여야 합니다.
12. 데이터베이스를 구성하려면 빈 Excel 스프레드시트를 엽니다. 첫 번째 워크시트의 세포 A1에서, 질량 분광계에서 관찰된 이온 상태의 지질 종의 질량에 대응하는 데이터베이스에 첨가할 지질 종의 이론적/계산된 단일동공 질량을 입력한다. 세포 B1에서 PG(34:0)와 같은 지질 종에 대한 이름을 입력합니다.
13. 세포 C1에서, 질량 분광계에서 관찰된 지질의 이온 상태에 대응하는 지질 종에 대한 분자 공식을 입력한다. 세포 D1에서, 질량 분석기에서 관찰된 바와 같이 지질 종의 전하를 입력한다. 검색 가능한 데이터베이스에 입력될 다음 지질 종에 대한 새로운 항목을 시작하려면 셀 A2로 이동합니다.
14. 원하는 모든 지질 종이 데이터베이스에 입력 될 때까지 8.12 및 8.13 단계를 반복합니다. 데이터베이스 파일을 저장하고 Excel에서 열어 둡니다.
15. Excel에서 추가 기능 메뉴를 선택합니다. LIMSA 소프트웨어를 시작하려면 LIMSA를 선택합니다. 주 메뉴에서 복합 라이브러리... 버튼을 클릭합니다. 나타나는 새 창에서 컴파운드 가져오기를클릭합니다. 이렇게 하면 LIMSA 소프트웨어에서 사용할 복합 데이터베이스가 업로드됩니다.
16. 공급업체의 지침^35에따라 LIMSA 소프트웨어 Excel용 애드인을 사용하여 모든 MS 스펙트럼에서 정확한 질량 기반 지질 식별을 수행합니다. LIMSA 메인 메뉴에서 스펙트럼 유형 메뉴 에서 피크 목록을 선택합니다. MS 데이터가 수집된 극성에 해당하도록 양수 모드 또는 음수 모드를 선택합니다.
17. 피크 fwhm(m/z) 창에서 피크 찾기를 위해 원하는 질량 검색 창을 입력합니다. 고분해능/정확한 질량 MS 데이터의 경우 0.003-0.005 m/z의 질량 공차 검색 창을 권장합니다.
18. 감도 창에서 원하는 기준선 컷오프(예: 상대적 풍부도 0.01%)를 입력합니다. 동위원소 보정 메뉴에서 선형 맞춤 또는 빼기 알고리즘을 선택하며, 이 중 하나는 피크 목록 데이터와 함께 사용될 수 있습니다.
19. 사용 가능한 화합물 창 내에서 원하는 지질 종을 클릭하여 데이터베이스 검색에 포함할 지질 화합물을 강조 표시합니다. 추가 단추를 클릭하여 강조 표시된 지질 종을 검색 그룹에 추가합니다.
20. 추가된 화합물을 클릭한 다음 농도 창을 선택한 내부 표준의 해당 농도로 변경하여 내부 표준을 정의합니다.
21. 각 추가된 지질 종 및 내부 표준을 선택하고 클래스 필드에 클래스 이름(예: PG 또는 Lipid)을 입력하여 정량화할 내부 표준 및 선택된 지질 종에 속하는지 확인합니다.
22. 나중에 사용할 수 있도록 검색 가능한 지질 화합물 그룹을 저장하려면 그룹 메뉴 옆의 저장 단추를 클릭합니다.
23. 내보낸 모든 MS 피크 목록이 포함된 Excel 파일이 첫 번째 S. 아우레우스 MS 실행에 해당하는 시트에 열려 있는지 확인하고 LIMSA 주 메뉴에서 검색 단추를 클릭합니다.
    참고: LIMSA 데이터베이스 검색의 출력에는 8.12-8.13 단계로 구성된 데이터베이스에 있는 지질과 일치하는 질량 스펙트럼 피처 목록과 하나 이상의 선택된 정규화 후 일치하는 각 피처에 대한 농도가 포함됩니다. 내부 표준을 준수합니다.
24. Xcalibur 소프트웨어를 사용하여 확인된 각 지질 분자 종에 존재하는 지방산 성분을 확인하기 위해 관심 있는 지질 이온에 해당하는 m/z에 대한 정확한 질량 MS/MS 스펙트럼을 검사합니다. 퀄 브라우저 아이콘을 선택합니다. 파일 드롭다운 메뉴를 선택하고 열기 옵션을 선택하여 관심 있는 MS/MS 파일을 엽니다.
25. 질량 스펙트럼 보기 창에서 엄지 손가락 아이콘을 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 관심 있는 지질 m/z의 MS/MS 분석에 해당하는 스캔 필터를 선택하고 메뉴에서 범위를 선택합니다. 나타나는 새 창에서 필터 메뉴를 선택하여 검사를 선택합니다.
26. 8.2단계에서 기재된 바와 같이 총 이온 크로마토그램에 걸쳐 신호를 평균한다. 메타보애널리스트(www.metaboanalyst.ca) 소프트웨어를 사용하여 적절한 통계 테스트를 수행합니다. S. 아우레우스 지질 조성에서 치료되지 않은 및 LDL 처리 된 조건에 걸쳐 정규화 된 지질 풍부도를 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 평가하십시오.

닭 계란 노른자에서 LDL의 농축을위한 프로토콜은 그림1에 도시되어 있습니다. 이 과정은 전체 달걀 노른자를 식염수로 희석시키고 LDL을 함유하는 수용성 또는 혈장 분획으로부터 과립으로 지칭되는 달걀 노른자 고형물을 분리하는 것으로 시작된다(도1)33. 혈장 분획의 LDL 함량은 ~ 30-40 kDa β-livetins의 침전에의해 더욱 농축된다 (도 2)33. 140, 80, 65, 60 및 15 kDa에서 단백질 밴드의 존재는 LDL의아포단백질과 상관관계가 있다 (도 2)33,39. 트리클로산을 가진 처리는 지방산 자유로운 매체에 있는 S. 아우레우스의 성장을 억제합니다32. 우리는 이전에 외인성 지방산 공급원으로서 난자 노른자 플라즈마 또는 정제된 인간 LDL로 배양을 보충하는 것이 트리클로산 유발 성장 억제를 극복한다는 것을 입증하였다(도3)32. 유사하게, 농축된 난자 노른자 LDL을 함유한 트리클로산처리 배양물의 보충은 성장을 회복시다(그림 3). 또한, 난자 노른자 LDL의 첨가는 이전에 특징이 있는 S. 아우레우스 지방산 auxotroph(도4)32의성장을 지원한다. 외인성 지방산의 S. 아우레우스 혼입의 가장 정확한 질량 분석 기반 프로파일링을 위해, 성장 배지에서 자유 지방산의 존재를 제한하는 것이 중요하다. 트립톤 국물에 희석된 1% 트립톤 국물 및 닭계란 노른자 LDL의 유리 지방산 조성물은 유량 주입 고분해능/정확한 질량 분석법을채택하여 결정하였으며, 최소량의 유리 지방산을 발견하였다(그림 5). 동일한 비표적 질량 분석 분석은 닭 계란 노른자 LDLs. 직교 부분 최소 제곱 차별 분석 (OPLS-DA) 40에 노출 된 후 S. 아우레우스 인지질의 지방산 조성을 결정하기 위해 수행되었습니다. 풍부한 S. 아우레우스 막 인지질은 OPLS-DA 점수 플롯에 나타난 바와 같이 처리되지 않은 닭 계란 노른자 LDL 처리 조건의 명확한 클래스 분리를 입증했다 (그림6A). OPLS-DA 하중 플롯은 PLS-DA 모델에서 수많은 인화증글리세롤 종을 중요한 변수로 표시했습니다. 특히, 불포화 지방산을 함유하는 인지질은 외인성 지방산 혼입의 분자 마커로서, LDL의 부재 시에 배양된 세포에 비해 LDL 보충배양물에서 풍부하게 된다(도 6B). 이전 연구에 따르면 닭계란 노른자는 올레산(18:1)이 가장 풍부한41,42를가진 불포화 지방산의 풍부한 공급원이라는 것을 발견했습니다. 이러한 관찰과 일치하여, 우리는 S. 아우레우스 배양이 닭 계란 노른자 LDLS로 보충되었을 때 인지질 합성에 사용되는 가장 흔한 불포화 지방산인 올레산을 발견했습니다 (그림6C). 표 1은 S. 아우레우스가 난자 노른자 LDL의 존재 에서 성장될 때 막 인지질의 지방산 프로파일이 변경된다는 것을 더 나타낸다.

그림 1: 원심분리및 암모니아 황산염 침전물을 활용한 닭계란 노른자로부터의 LDL 농축 의 그림. (A) 닭계란 노른자로부터 LDL농축에 필요한 시약. (B) 플로우 차트는 LDL 농축 프로세스의 중요한 단계를 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: LDL농축 전후닭고기 달걀 노른자의 단백질 프로파일. 단백질 용해액은 RIPA 완충액을 사용하여 제조하였다. 단백질 용해(15 μg)를 8% 아크릴아미드 SDS-PAGE 겔에 적재하였다. 젤은 바이오 라드 단백질 시약으로 하룻밤 동안 염색되었다. LDL 관련 단백질의 kDA에 있는 분자량은 심상의 오른쪽을 따라 표시됩니다. M: 단백질 마커, Y: 닭 달걀 노른자 및 LDL: 닭 달걀 노른자 LDL 농축이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 달걀 노른자 유래 LDL은 트리클로산 유도 FASII 억제로부터 S. 아우레우스를 보호합니다. S. 아우레우스의 성장은 다음과 같은 조건에서 1% 트립톤 국물에 OD600의 측정을 통해 시간이 지남에 따라 모니터링되었다: 1% 트립톤 국물 (TB), 1 μM 트리클로산 (TCS), 1 % 달걀 노른자 플라즈마와 1 μM 트리클로산 (TCS + EYP), 5 % 달걀 노른자 LDL (LDL), 또는 1 μM 트리클로산과 5% 달걀 노른자 LDL (TCS + LDL). 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균이 도시된다. 오류 막대는 평균의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: S의 성장. 아우레우스 지방산 auxotroph는 달걀 노른자 유래 LDL에 의해 지원됩니다. 1% 트립톤 국물(TB)에서 지방산 auxotroph의 성장은 5% 달걀 노른자 LDL(LDL) 보충제의 유무에 관계없이 OD600의측정을 통해 시간이 지남에 따라 모니터링되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균이 도시된다. 오류 막대는 평균의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 1% 트립톤 국물 또는 닭계란 노른자 LDL로 측정된 자유 지방산 함량. 자유 지방산은 유량 주입 고분해능/정확한 질량 분광법 및 탠덤 질량 분광법에 의해 검출되었다. 단백질 1mg당 이온의 정규화된 수치는 1% 트립톤 국물과 1% 트립톤 국물에 5% 닭고기 달걀 노른자 LDL을 보충한 것으로 결정되었습니다.

도 6: 닭계란 노른자 저밀도 지단백질은 S. 아우레우스 인슈파티딜리세롤의 합성을 위한 외인성 지방산의 저장고이다. (A) 고분해능/정확한 질량분석법을 사용하여 확인된 닭계란 노른자 LDL 처리 및 미처리 S. 아우레우스 막 인지질의 직교 부분 최소 제곱 차별 분석의 점수 플롯. (B) 닭 계란 노른자 LDL의 부재 (WT + LDL)에서 자란 S. 아우레우스의 총 막 PG (UPG)와 비교하여 불포화 포스파티딜리세롤 (UPG)의 백분율은 막 PG의 S. 아우레우스는 (WT) 또는 (WT + LDL) 닭 계란 노른자 LDL과 함께 총 PG 지방산의 양비율의 백분율로 그래프화하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 닭계란 노른자 LDL의 존재에서 배양된 S. 아우레우스의 지방산 프로파일. 우리는 고해상도/정확한 MS 및 MS/MS를 활용하여 S. 아우레우스 PG. S. 아우레우스의 지방산 프로파일을 결정하기 위해 편향되지 않은 지질 분석을 사용하여 닭 계란 노른자 LDL의 유무및 부재 상태에서 배양되었으며, 이들의 PG 프로파일을 확인했습니다. 세포는 1% 트립톤 국물에서 배양된 세포의 세포와 비교하였다.

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