Summary
שיטה זו מספקת מסגרת ללימוד שילוב של חומצות שומן אקסוגני ממקורות מארחים מורכבים לקרומים חיידקיים, בעיקר סטייהילוקוקוס. כדי להשיג זאת, פרוטוקולים עבור העשרת ליפופרוטאין חלקיקים מחלמון ביצת עוף ובעקבות הפרופיל חומצות שומן לאחר מכן של פוספוליפידים חיידקיים ניצול ספקטרומטר מסה מתוארים.
Abstract
לשלב את חומצות השומן מהסביבה לתוך ממברנה פוספוליפידים. במהלך הזיהום, רוב חומצות השומן האקסוגני נמצאים בתוך ליפופרוטאין חלקיקים מארחים. חוסר ודאות נשאר באשר למאגרים של חומצות שומן מארח ומנגנונים שבהם חיידקים לחלץ חומצות שומן מן החלקיקים ליפופרוטאין. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקולים עבור העשרה של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) חלקיקים מחלמון ביצת עוף ולקבוע אם LDLs לשמש מאגרים חומצות שומן עבור האוראוס. שיטה זו מנצלת ניתוח lipidomic משוחדת ו LDLs עוף, מודל יעיל וחסכוני לחקר האינטראקציות בין LDLs וחיידקים. הניתוח של האינטגרציה האורבית של חומצות שומן אקסוגני מ LDLs מבוצע באמצעות ברזולוציה גבוהה/מדויק מאוד ספקטרומטריה ומדויקת ספקטרומטר מסה, המאפשר אפיון של הרכב חומצת שומן של החיידק קרום וזיהוי משוחדת של שילובים הרומן של חומצות שומן העולות ליפידים ממברנה חיידקי לאחר החשיפה LDLs. אלו טכניקות מתקדמות הספקטרומטר מסה להציע פרספקטיבה שאין כמוה של התאגדות חומצת שומן על ידי חשיפת חומצות שומן מסוימות האקסוסוגני שולבו הפוספוליפידים. השיטות המפורטות כאן הם להתאמה למחקר של פתוגנים חיידקיים אחרים ומקורות חלופיים של חומצות שומן מורכבות.
Introduction
סטפילוקוקוס-עמיד S. האוראוס (MRSA) הוא הגורם המוביל לזיהום הקשורות לבריאות הקשורים ועמידות לאנטיביוטיקה הקשורים הוא אתגר קליני ניכר1,2,3. לכן, ההתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות הרומן הוא בעדיפות גבוהה. אסטרטגיה לטיפול מבטיח פתוגנים גראם חיוביים היא סינתזה חומצת שומן מעכב, דרישה הייצור פוספוליפיד הממברנה, ב -S.האורמית, כולל זרחן (PG), ליצ-PG, ו-cardiolipin4. ב חיידקים, הייצור חומצת שומן מתרחשת באמצעות מסלול החומצות שומן סינתזה השני (פאפסי)5, אשר שונה באופן משמעותי מעמיתו איקריוטית, עושה fasii טרה אטרקטיבית לפיתוח אנטיביוטי5,6 . מעכבי FASII בעיקר היעד FabI, אנזים הדרוש חומצת שומן התארכות שרשרת פחמן7. Triclosan המדכא משמש באופן נרחב במוצרי הצרכן והרפואי8,9. מעכבי fabi נוספים מפותחים על ידי חברות תרופות מספר לטיפול בזיהום האוראוס10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. עם זאת, הרבה פתוגנים גראם חיוביים, כולל S.האוראוס, מסוגלים לניקוי חומצות שומן אקסוגני עבור סינתזה פוספוליפיד, לעקוף את העכבות האלה27,28,29. לפיכך, הפוטנציאל הקליני של מעכבי פאג'י הוא דיון בשל פערים ניכרים בידע שלנו על מקורות של חומצות שומן מארח ומנגנונים שבהם פתוגנים לחלץ חומצות שומן מן המארח27,28. כדי להתמודד עם הפערים האלה, פיתחנו lipidomic ניתוח שיטה משוחדת לפקח על שילוב של חומצת שומן אקסוגני מן ליפופרוטאין חלקיקים לתוך פוספוליפידים קרום של האוראוס.
במהלך אלח דם, ליפופרוטאין חלקיקים מארחים מייצגים מקור פוטנציאלי של חומצות שומן נגזרות מארח בתוך ואצלב, כרוב חומצות שומן מארח משויכים החלקיקים30. ליפורופנס מורכב פגז ידרופילי מורכב של פוספוליפידים וחלבונים התוחמים ליבת הידרופובי של טריגליצרידים ואסטרים כולסטרול31. ארבעה כיתות גדולות של ליפופרוטאינים-chylomicron, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד, ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה, וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) — מיוצרים על ידי המארח והפונקציה כמו כלי רכב הובלה ליפיד, אספקת חומצות שומן וכולסטרול אל ומ תאים מארחים באמצעות הכלי ואצלב. LDLs הם בשפע חומצת שומן esterified כולל טריגליצרידים ואסטרים כולסטרול31. בעבר הדגמנו כי LDLs אנושי מאוד מטוהרים הם מקור בר קיימא של חומצות שומן אקסוגני לסינתזה PG, ובכךלספק מנגנון עבור מעכבי fasii לעקוף את ה32. טיהור אנושי LDLs יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית זמן רב בעוד מקורות מסחריים של LDLs האדם מטוהרים הם יקרים מאוד לשימוש על בסיס שגרתי או לבצע מסכי חיידקי בקנה מידה גדול. כדי לטפל במגבלות אלה, שינו הליך להעשרה של LDLs מחלמון ביצת עוף, מקור עשיר ליפופרוטאין חלקיקים33. השתמשנו בהצלחה בספקטרום לא ממוקד, ברזולוציה גבוהה/מדויקת בספקטרומטר מסה ובספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לפקח על השילוב של חומצות השומן האנושיות הנגזרות LDL לתוך הקרום של S. האוראוס32. שלא כמו שיטות שדווחו קודם לכן, גישה זו יכולה לכמת חומצות שומן בודדות איזוers עבור כל אחד משלושת הסוגים העיקריים של פוספולילוטופיד זרחן. חומצה אולאית (18:1) היא חומצת שומן בלתי רווי בתוך כל חלקיקי ליפופרוטאין, כי הוא שולב בקלות לתוך S. האורליפידים פוספוליפיפיחלקיקים29,30,32. S. האוראוס אינו מסוגל לסינתזה חומצה אולאית29; לכן, כמות של פוספוליפיד משולב חומצה אולאית קובע את הנוכחות של ליפופרוטאין מארחים-חומצות שומן נגזרות בתוך קרום ממברנה משולבת29. אלה מינים פוספוליפיד יכול להיות מזוהה על ידי המדינה-of-the-אמנות השיטה הספקטרומטר המסה תיאר כאן, מציע ברזולוציה חסרת תקדים של הרכב הקרום של האוראוס תרבותי בנוכחות של מקור חומצת שומן זה סביר נתקלת בזמן ההדבקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול הבא להעשרת חלקיקי LDL מחלמון ביצת עוף נגזר מוסא ואח ' 200233.
1. הכנת חלמון ביצת עוף להעשרת חלקיקי LDL
- באמצעות שטיפת הפגזים עם התמיסה 70% אתנול והתרת האוויר ליבשה, מייבשים שתי ביצי עוף גדולות.
- בעזרת התמיסה של 70% אתנול. ואפשר לייבש את האוויר הצמד את מפריד הביצים אל שפתו של גביע בינוני בגודלו.
- לפצח כל ביצה בנפרד לתוך מפריד ביצים ולאפשר לאלבומין לזרום לתוך הגביע. את חלמון הביצה השלם יישמר על ידי המפריד.
- רוחצים את חלמון הביצה פעמיים עם 30 מ ל של תמיסת מלח סטרילית מוזרמת פוספט (PBS) כדי להסיר אלבומין שיורית.
- מניחים בעדינות את חלמון הביצה על נייר סינון.
- נקב את קרום vitelline עם קצה הצינור סטרילי ולנקז את התוכן של הקרום לתוך שפופרת סטרילי 50 mL הצנטריפוגה. התעלם מהקרום ומסנן הנייר.
2. שבירה של פלזמה המכילה LDL מחלמון ביצת עוף
- הוסף בערך שני כרכים של 0.17 M בתוך pH 7.0 לחלמון ביצה ומערבבים במרץ. ואז לערבב את הפתרון ב 4 ° צ' עבור 60 דקות.
- צנטריפוגה את חלמון הביצה דילול ב 10 ° צ' ב 10,000 x g עבור 45 דקות. להסיר את השבר פלזמה (supernatant) מן השבר הגרגירים (גלולה) לתוך הצינור מאחד סטרילי 50 mL.
- חזור על שלב 2.2.
3. בידוד חלקיקי LDL מפלסמה
- מערבבים את שבר פלזמה עם 40% אמוניום גופרתי (w/v) ב 4 ° צ' עבור 60 דקות.
- להתאים את ה-pH של שבר פלזמה עם פתרון 420 mM NaOH ל 8.7.
- צנטריפוגה את חלמון הביצה דילול ב 4 ° צ' ב 10,000 x g עבור משך של 45 דקות. להסיר את השבר העליון צהוב וצק לתוך 7 kda הנקבוביות בגודל צינור דיאליזה. לספק מקום צינורות כדי לאפשר לו להתנפח.
- Dialyze לילה ב 4 ° c ב 3 ליטר של מים באולטרסאונד כדי להסיר את אמוניום גופרתי. מתפרעים בעדינות את המים באמצעות בר מהומה.
- העברת פתרון דיאליזה לצינור צנטריפוגה 50 mL סטרילי.
- צנטריפוגה את הפתרון ב 4 ° צ' ב 10,000 x g עבור משך של 45 דקות. בזהירות להסיר את השבר הצהוב וצק העליון לצינור סטרילי ולאחסן ב 4 ° c.
4. הערכה של עוף LDLs כמקור של חומצות שומן
- תת-תרבות של התאים האורבית לתוך 5 מ ל של חומצות שומן חינם 1% טריטונים ציר ו דגירה לילה ב 37 ° c עם טלטול (225 rpm). לקבלת חומצות שומן, מוסף לתרבויות עם מקור שומני.
- לדלל תרבויות לילה לדחיסות אופטית (OD) ב 600 nm (OD600) של 0.1 בציר 1% טריטונים. פיפטה 50 μL של התא מושעה לתוך כל באר של התחתון עגול-בתחתית הצלחת 96.
הערה: כשעובדים עם מגוון שומני של חומצת שומן, רוחצים את התרביות לילה בשני כרכים של ציר טריטונים ומשתתים מחדש ב-5 מ ל של ציר טריטונים כדי להגביל את הנושא של חומצות שומן לפני קביעת מנת יתר של התרבות. - עבור בארות המכילות פקדים לא מטופל, להוסיף 50 μL של 1% טריטונים לבשר בבאר.
- לבארות המכילות את השעיות התא הניסיוני, להוסיף 50 μL של 1% טריטונים ציר בתוספת 10% חלמון ביצה-LDL נגזר, 2 μM triclosan, או תערובת של 10% חלמון ביצה-הנגזר LDL ו 2 μM triclosan.
הערה: בשלב זה, כל הטוב יכיל 100 μL ואת הריכוז הסופי של חלמון ביצה שנגזר LDL ו triclosan לכל טוב יהיה 5% ו-1 μM, בהתאמה. - למדוד OD600 לאורך זמן, באמצעות קורא מיקרופלייט להגדיר ב 37 ° צ' עם מתמשך, ליניארי טלטול לפקח על הצמיחה.
5. דגירה של S. האוראוס עם LDLs עבור ניתוח השומנים הממברנה.
- תרבות מושבה מבודדת לתוך 5 מ ל של חומצות שומן חינם 1% טריטונים ציר ו דגירה לילה ב 37 ° c עם טלטול (225 rpm).
- לדלל תרבויות לילה 1:100 לתוך מבחנה סטרילית 250 mL מבולבל המכיל 50 mL של 1% טריטונים מרק. דגירה לשלב באמצע יומן (כ 4 שעות) ב 37 ° צ' עם רעד.
- העברת 25 מ ל של התרבות לצינור צנטריפוגה סטרילי 50 mL ו הגלולה התאים. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-750 μL של ציר 1% טריטונים.
- לשלב את התאים שהושעו מחדש ואת סדרת מחלקים 300 μl של התא ההשעיה לתוך שפופרת של צנטריפוגה סטרילי 1.5 mL.
- הוסף LDLs לריכוז הסופי הרצוי הדגירה ב 37 ° צ' עם טלטול (225 rpm) עבור 4 h.
- צנטריפוגה את התרבויות ב 4 ° צ' ב 16,000 x g עבור משך של 2 דקות ולשטוף את כדורי התא בשני כרכים של PBS סטרילי ואז חוזר.
- הקלט את המשקל של כל. כדורית תא רטובה הקפא את כדורי התא על קרח יבש או בחנקן נוזלי ואחסן ב-80 ° c או המשך ישירות לסעיף 6.
6. הפקת שומנים ממברנות של האוראוס
- הניחו את כדורי התאים הקפואים. בקרח יבש הוסף 0.5 מ"מ חרוזים תחמוצת זירקוניום על גבי כל גלולה תא, באמצעות נפח של חרוזים בערך שווה נפח של הגלולה תא.
הערה: כחלופה לשיטה זו של הפקת שומנים בדם, החוקרים יכולים להשתמש היטב מבוססת Bligh, דייר או Folch שיטות עבור שומנים מדויקת מתאי בקטריאלי34. - הוסף 740 μL של 75% מתנול (כיתה) מקורר ל-80 ° c ישירות אל כדורי התא.
- הוסף 2 μL של 50 Μmlristoyl (מוכן ב מתנול) לכל 1 מ"ג תאים כסטנדרט פנימי. סגרו את צינור הבדיקה ומניחים את צינורות הצנטריפוגה 1.5 mL המכילים כל מדגם לתוך נמל זמין ב בלנדר תבליט רקמה הומוגניטובית. הומוגון הדגימות על מהירות נמוכה, הגדרת 2-3, עבור 3 דקות.
- בדוק באופן חזותי את הדגימות של הומוגניות. אם ניתן לראות גושים של תאים, המשיכו במגון בבלנדר התבליט בתוספות של 2 דקות.
- הסירו את הדגימות מבלנדר הכדורים. והעבירו אותם לתוך מכסה כימי
- הוסף 270 μL של כלורופורם לכל שפופרת לדוגמה. מערבולת הדגימות במרץ עבור 30 דקות.
התראה: כלורופורם הוא גורם מסרטן אפשרי. - צנטריפוגה את דגימות בצנטריפוגה שחקן ספסל עד 30 דקות במינימום 2,000 x g. מהירויות גבוהות יותר ניתן להשתמש עם צינורות צנטריפוגה תואם את משך הצנטריפוגה עשוי להיות מקוצר ל 10 דקות.
- בתוך כיסוי כימי, לאסוף את הסופרהסיק supernatant ולהעביר למבחנה חדשה בדיקה, תוך הימנעות בזהירות את הגלולה חלבון בחלק התחתון של צינור החילוץ.
- הוסף 740 μL של 75% מתנול (כיתה) ו 270 μL של כלורופורם לתוך הגלולה חלבון, ולחלץ מחדש כל מדגם כפי שמתואר בשלבים 6.6-6.8 לעיל. לשלב את supernatant מן החילוץ השני עם supernatant שנאסף בעבר עבור כל דוגמה.
- להתנדף את ממיסים החילוץ תחת זרם של גז אדיש כגון חנקן או ארגון, או תחת ואקום באמצעות מרכז צנטריפוגה (שולחן חומרים).
- לשטוף תמציות שומנים יבשים שלוש פעמים עם 1.0 mL של מימית 10 מ"מ ביקרבונט פתרון אמוניום מחדש לייבש את דגימות כמו בשלב 6.10.
- השהה מחדש את תמציות השומנים היבשים בממס מתאים לא קוטבי כגון איזופנול. השעיה מחדש דגימות באמצעות 20 μL ל 1 מ"ג של משקל התא החדש שנקבע בשלב 5.7 לחילופין, אם המשקל של כדורי התא אינו ידוע, השהה מחדש את דגימות ב 200 μL של איזופנול והמשך לסעיף 7.
7. אנליזה של פרופילי השומנים האוראוס ברזולוציה גבוהה/מדויקת ספקטרומטר מסה
- לפני ביצוע ניתוח השומנים המלא, בחר דגימות מבחן נציג מהקבוצה הניסיונית (s) ולנתח אותם על פני מגוון של גורמי דילול לדוגמה כדי לקבוע את טווחי דילול לדוגמה שבו ריכוזי השומנים הכולל ליפול בתוך הליניארי טווח של תגובת הגלאי לספקטרומטר המסה, כפי שמתואר בעבר35.
- התנדפים של כל תמצית שומנים במדגם להיות נתון ניתוח שומנים בדם, על ידי ייבוש מתחת גז אינרטי או תחת ואקום בתוך מרכז צנטריפוגה (טבלת חומרים).
- להשעות כל תמצית השומנים מיובשים בתוך כרומטוגרפיה נוזלית – ספקטרומטר מסה (LC-MS) כיתה איזופנול: מתנול (2:1, v:v) המכיל 20 מ"מ מילימטר אמוניום, באמצעות אמצעי אחסון המקבילה לגורם דילול לדוגמה אופטימלית כפי שנקבע בשלב 7.1.
- עבור ניתוח שומנים בלתי ממוקדים, ניתן להציג דגימות ישירות לפלטפורמה ברזולוציה גבוהה/מדויקת של המסה ספקטרומטריה ללא שימוש של כרומטוגרפיה על ידי הזרקת זרימה או עירוי ישיר של תמציות35,36. העבר את תמציות השומנים מדולל מוכן בשלב 7.3 לבקבוקון בקבוקון אוטומטי מתאים או 96-באר צלחת.
- לניתוח מבוסס-הזרקה, מניחים את מבחנות התצוגה האוטומטית לתוך שליטת טמפרטורה (15 ° c) של מערכת האבחון המסוגלת ליישומי הקפילר/לזרימה נמוכה, כגון (טבלת חומרים) המצוידים בזרימה אלקטרונית proportioning ומערכת ניטור זרימה.
- למלא את מאגרי הממיסים באמצעות מאגרים ברמת LC-MS: מתנול (2:1, v:v) המכיל 20 מילימטר אמוניום.
- באמצעות תוכנת Agilent Chemstation, התוכנית האוטומטית לחישוב לבצע 5 μL זריקות לדוגמה. מתפריט המכשיר , בחר הגדר מזרק, והקלד 5.0 בשדה אמצעי האחסון של ההזרקה. היחידות ניתנות בתור מיקרו-ליטר. ודא שהisocratic מוגדרת כ-flow ב-1 μL לכל מינימום של 2:1 (v:v) איזופנול: מתנול המכיל 20 מילימטר אמוניום.
- מתפריט הכלי ' תחנת כלים ', בחרו באפשרות ' הגדר משאבה ' . ..
- בשדות לוח הזמנים , הזן: Time 0.00, 100% B, זרימה 1.0. הכה Enter וליצור שורה נוספת בלוח הזמנים על ידי הזנת זמן 10.0, 100% B, תזרים 1.0. בחר את אישור לחצן בתחתית הגדרת תפריט משאבה. הגדרות אלה יאפשרו 10 הפעלה אנליטית בקצב הזרימה של 1.0 μL לכל דקה.
- הציגו משחררות מלקו העברת התרופות לספקטרומטר המסה באמצעות מקור מתכת אלקטרונון עם זרימה נמוכה (34 G) מחט ממתכת.
- בעזרת שימוש בתוכנת שליטה בחום פלוס, בחר בתפריט ההגדרה ובחר מקור ESI מחומם. הגדר את מתח האינון ל-4000 V ולנדן גז ל-5 (יחידות שרירותיות) על-ידי הקלדת ערכים אלה לתוך השדות המתאימים בתיבת הדו. באופן דומה, לקבוע את הטמפ ' הקפילר ל-150 ° צ' ו-S-עדשה ל 50%.
הערה: יש למטב ערכים אלה עבור כל פלטפורמת ספקטרומטר מסה. - עבור ניתוח שומנים בלתי ממוקד, להשתמש ברזולוציה גבוהה/מדויקת MS פלטפורמת המסה (טבלת חומרים) כמו הגלאי.
- שימוש בתוכנה תרמו-כוונון, לחץ על לחצן הגדרת סריקה , ובתפריט מנתח בחר ftms. הגדר את שדה טווח המסה כרגיל ובשדה הפתרון, בחר 100,000. ודא שסוג הסריקה מוגדר כמלא. תחת התפריט טווחי סריקה , הזן 200 בשדה המסה הראשונה (m/z) והזן 2000 בשדה המסה האחרון (m/z).
- ודא כי קוטביות שלילית מנוצל כדי לזהות את הנפוצים ביותר S. שומנים בעלי הברית.
- חזור על ניתוח לדוגמה באמצעות מיפוי יונים טנדם ספקטרומטר מסה (MS/MS) הפיצול של כל יוני שומנים בתוך אזור ספקטרלי של עניין כדי לאשר מבנים השומנים ומרכיבים חומצת שומן. לחילופין, יוני השומנים הנבחרים של עניין עשוי להיות נתון לניתוח MS/MS לאחר הזהות הראשונית השומנים הוקצו בסעיף 8.
8. מאגר נתונים המחפש לזיהוי שומנים אנדוגניים ואקסוגני LDL-נגזרים
- השתמש בתוכנה תרמו Xcalibur כדי לחדד עוד יותר את הדיוק ההמוני שנצפו. ב-Xcalibur, תחת תפריט כלים , בחר באפשרות כייל מייל לא מקוון. לאחר פתיחת החלון ' כייל לא מקוון ', טען את קובץ הספקטרום ההמוני לכיול מכייל על-ידי בחירת תפריט הקובץ ובחירה באפשרות הפתוחה.
- פתח את קובץ הריבית, החלף את הלחצן ' הוסף שורה ' בחלק העליון של חלון התצוגה, כדי להציג את ה-ion כרומטוגרם עבור הפעלת MS. ממוצע אותות MS שנרכשו על ידי שמאל לחיצה על עכבר המחשב על קצה אחד של שיא האות נצפתה ב-ion כרומטוגרם יון כולל גרירת העכבר על פני החלק הרחב ביותר של הפסגה.
- תחת התפריט מסנן סריקה , בחר את המסנן המתאים לנתוני הסריקה המלאה של MS. טען קובץ התייחסות המכיל את ההמונים המונאיזופית התיאורטית של לפחות שלושה שומנים בעלי שם. . .. ובחירת קובץ הייחוס. בדוק את תיבת השימוש לצד כל מסה מונואיזופית ליפיד.
- לחץ על לחצן החיפוש בתחתית חלון התצוגה. ממוצע מחדש של אות ה-MS על פני שיא האות ב-ion chromatogram הכולל כפי שנעשה בעבר.
- לחץ על כפתור המר ליד החלק התחתון של חלון הצפייה. כאשר תיבת הדו המרת דו-שיח נפתחת, לחץ על אישור. השמט שלב זה אם הנתונים נאספו בפלטפורמות של ספקטרומטר מסה מספקים שאינם תרמו-מדעי.
- באמצעות תוכנה Xcalibur, לייצא את הרשימה השנייה מדויק השיא מדויקת של המסה עבור כל מטופל או LDL מטופל המדגם לגליונות עבודה נפרדים של קובץ Excel. בחר בסמל הדפדפן Qual . פתח את קובץ הריבית הכיול הכייל על-ידי בחירת תפריט קובץ ובחירה באפשרות הפתוחה.
- ממוצע האות לאורך השיא הרחב של כרומטוגרם יון כולל כמתואר בשלב 8.2.
- לחץ לחיצה ימנית על סמל הנעץ בחלון התצוגה של הספקטרום ההמוני ובחר באפשרות תצוגה | רשימת הספקטרום. באותו תפריט, בחרו ' אפשרויות תצוגה ' ולאחר מכן כל התיבה ' סמן ' בתפריט ' תצוגה '. לחץ על אישור לחצן כדי לסגור את חלון הצפייה.
- לחץ לחיצה ימנית על סמל הנעץ בחלון הצפייה בספקטרום ההמוני שוב ובחר בייצוא | לוח (מאסה מדויקת). הדבקת תא הנתונים המיוצא A1 בגליון העבודה הראשון לגיליון אלקטרוני חדש של Excel.
- מחק את 8 השורות הראשונות של הטקסט בקובץ הנתונים המיוצא, כגון תא A1 בגיליון האלקטרוני של Excel מכיל את נקודת הנתונים ההמונית הראשונה מהספקטרום ההמוני. חזור על הייצוא של כל קובץ MS שעבר הכיול החוזר, תוך שימוש בגליון עבודה חדש בקובץ Excel עבור כל רשימת הפסגה המיוצאת.
- באמצעות ניתוח המסה ספקטרלי ליפיד (LIMSA) תוכנה37 תוספת עבור Excel, לבנות מסד נתונים המכיל נוסחאות מולקולריות של מינים ידועים השומנים של האוראוס כפי שמתואר על ידי hewelt-belka et al. 201438, כמו גם נוסחאות המייצגות מינים שומנים בדם שיכלו להיות נוכחים ב-LDL.
הערה: בנוסף, יש לנקוט כדי לכלול נוסחאות מולקולריות פוטנציאליות במסד הנתונים עבור שומנים חיידקיים היפותטי כי יש שילב חומצות השומן הגדולות LDL, כגון אולאית (18:1) ו לינולאית (18:2) חומצות שומן32. - כדי לבנות את מסד הנתונים, פתח גיליון אלקטרוני ריק של Excel. בתא A1 בגליון העבודה הראשון, הקלד את המסה התיאורטית/מחושבת המונאיזופית של מינים השומנים שיתווספו למסד הנתונים, בהתאם למסה של מינים השומנים במדינה יונית שנצפתה בספקטרומטר המסה. בתא B1, הזן שם עבור מינים השומנים, כגון PG (34:0).
- בתא C1, הזן את הנוסחה המולקולרית עבור מינים השומנים, המתאים למצב היונית של השומנים שנצפו בספקטרומטר המסה. בתא D1, הזן את המטען של מינים השומנים כפי שנצפו בספקטרומטר המסה. עבור לתא A2 כדי להתחיל ערך חדש עבור מינים השומנים הבאים שיוזנו במסד הנתונים הניתן לחיפוש.
- חזור על השלבים 8.12 ו 8.13 עד כל המינים הרצויים השומנים הוזנו לתוך מסד הנתונים. שמור את קובץ מסד הנתונים והשאר אותו פתוח ב-Excel.
- ב-Excel, בחר בתפריט תוספות ב-. בחר באפשרות limsa כדי להפעיל את תוכנת limsa. מהתפריט הראשי, לחץ על לחצן הספריה המורכבת. .. בחלון החדש שמופיע, לחץ על יבא תרכובות. פעולה זו תטען את מסד הנתונים המורכב לשימוש על-ידי תוכנת LIMSA.
- בצע מדויק המוני המוני שומנים בהתבסס על כל MS ספקטרום באמצעות התוספת של תוכנת LIMSA עבור Excel לפי הוראות הספק35. מהתפריט הראשי LIMSA, בחר באפשרות ' מרב רשימה ' תחת התפריט ' סוג ספקטרום '. בחר במצב חיובי או במצב שלילי כדי להתכתב עם הקוטביות שבה הוכנסו נתוני MS.
- בחלון שיא fwhm (m/z) , הזן את חלון החיפוש המבוקש הרצוי לאיתור שיא. חלון חיפוש של עמידות המונית של 0.003-0.005 m/z מומלץ לנתוני MS ברזולוציה גבוהה/מדויקת.
- בחלון הרגישות , הזן את הניתוק הרצוי (לדוגמה, 0.01% שפע יחסי). בתפריט תיקון איזוטופ , בחר באפשרות התאמה ליניארית או באלגוריתמים לחיסור, שאחד מהם עשוי לשמש עם נתוני רשימת השיא.
- הדגש תרכובות השומנים כדי לכלול בחיפוש במסד הנתונים על ידי לחיצה על מינים ליפיד הרצוי בתוך החלון תרכובות זמין . לחצו על הלחצן ' הוסף ' כדי להוסיף מינים מודגשים של השומנים לקבוצת החיפוש.
- הגדר סטנדרטים פנימיים על ידי לחיצה על תרכובות שנוספו , ואז לשנות את חלון הריכוז לריכוז המתאים של התקן הפנימי שנבחר.
- ודא שהסטנדרט הפנימי ומינים השומנים הנבחרים שייכים לאותו שם מחלקה על-ידי בחירת כל מיני מינים שנוספו לשומנים ותקן פנימי והקלדת שם מחלקה (כגון PG או ליפיד) בשדה Class.
- כדי לשמור את הקבוצה הניתנת לחיפוש של תרכובות השומנים לשימוש עתידי, לחץ על לחצן שמור לצד התפריט קבוצות .
- ודא שהקובץ של Excel המכיל את כל רשימות השיא של MS שיוצאו פתוח לגיליון התואם ל -ms. הראשון של הארה ב ולאחר מכן לחץ על לחצן החיפוש מהתפריט הראשי limsa.
הערה: הפלט של החיפוש של מסד הנתונים LIMSA יכלול רשימה של תכונות ספקטרליות המוני המותאמות לשומנים הנמצאים במסד הנתונים שנבנה בשלבים 8.12-8.13, כמו גם ריכוזים עבור כל תכונה תואמת בעקבות נורמליזציה לאחד או יותר נבחר סטנדרטים פנימיים. - השתמש בתוכנה Xcalibur כדי לבחון את המסה MS/MS ספקטרום מדויק עבור m/z המתאים יוני השומנים של עניין כדי לאשר את המרכיבים חומצת שומן הנמצאים בכל מיני מולקולות השומנים שזוהו. בחר בסמל הדפדפן Qual . פתח את קובץ MS/MS של הריבית על- ידי בחירה בתפריט הנפתח של הקובץ ובחירה באפשרות Open. ..
- בחר את מסנן הסריקה המתאים לניתוח MS/MS של מודל ליפיד/ת' של עניין על ידי לחיצה ימנית על סמל הנעץ בחלון התצוגה ספקטרום המסה ובחר טווחים מהתפריט. בחלון החדש שיופיע, בחר בתפריט סינון כדי לבחור בסריקה.
- ממוצע האות לאורך כרומטוגרם יון כולל כמתואר בשלב 8.2. השתמש בתוכנת מטבוליזם (www.metaboanalyst.ca) כדי לבצע בדיקות סטטיסטיות מתאימות. הערכת הבדל משמעותי סטטיסטית של הרכב השומנים האוראוס על ידי השוואת שומנים מנורמל השומנים מתוך תנאים לא מטופלים LDL מטופל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול להעשרת ה-LDL מחלמון ביצת עוף מומחש באיור 1. תהליך זה מתחיל על ידי לדלל חלמון ביצה שלמה עם מלוחים והפרדת מוצקים חלמון ביצה המכונה גרגירים מן השבר מסיס או פלזמה המכיל את LDLs (איור 1)33. תוכן ה-LDL של השבר פלזמה מועשר עוד יותר על ידי משקעים של ~ 30-40 kDa β-livetins (איור 2)33. הנוכחות של להקות חלבונים ב 140, 80, 65, 60 ו 15 kda לתאם עם האפורוטבנים של LDLs (איור 2)33,39. טיפול עם triclosan מעכב את הצמיחה של S. האוראוס ב32מדיה ללא חומצות שומן. בעבר הדגמנו כי להשלים את התרבויות עם חלמון ביצה פלזמה או מטוהרים האדם LDLs כמו מקורות חומצות שומן אקסוגני מתגבר על משבר הגדילה triclosan המושרה (איור 3)32. באופן דומה, תוספת של התרבויות שטופלו triclosan עם חלמון ביצה מועשר LDL משחזר את הצמיחה (איור 3). יתר על כן, תוספת של חלמון ביצה LDLs לתמוך בצמיחה של שומני בעבר מאופיין חומצות שומן (איור 4)32. עבור מדויק ביותר ספקטרומטר המסה המבוסס על פרופיל של שילוב S. האורלנו של חומצות שומן אקסוגני, חשוב להגביל את הנוכחות של חומצות שומן חופשיות במדיום הצמיחה. הרכב חומצות שומן חינם של 1% טריטונים מרק וחלמון ביצת עוף LDLs מדולל בציר טריטונים נקבע על ידי שימוש הזרקת זרימה ברזולוציה גבוהה/מדויק המסה ספקטרומטר ומצא כמויות מינימליות של חומצת שומן בחינם (איור 5). אותו ניתוח הספקטרומטר מסה בלתי ממוקד בוצע כדי לקבוע את הרכב חומצת שומן של הפוספולידים זרחן לאחר החשיפה ביצי עוף חלמון LDLs. בדיקת מבדיל חלקית לפחות ריבועים (opls-DA)40 של שפע של הממברנה הקרום פוספוליפידים הפגינו הפרדה ברורה מחלקה של חלמון ביצה ועוף ביצת LDL תנאים, כפי שמוצג בעלילה הציונים OPLS-DA (איור 6a). העלילה OPLS-DA לטעינת הראו מינים רבים של פוספליגלילרול כמשתנים חשובים במודל PLS-DA. בעיקר, פוספוליפידים המכילים חומצות שומן בלתי רווי, סמן מולקולרי של התאגדות חומצות שומן אקסוסוגני, מועשר בתרבויות LDL בתוספת לעומת התאים מודבטים בהעדר LDLs (איור 6B). מחקרים קודמים מצאו כי ביצת עוף חלמוני הם מקור עשיר של חומצות שומן בלתי רווי עם חומצה אולאית (18:1) להיות הנפוץ ביותר41,42. בהסכם עם תצפיות אלה, מצאנו חומצה אולאית להיות חומצות שומן בלתי רווי הנפוץ ביותר מנוצל לסינתזה פוספוליפיד כאשר תרבויות S. האורארה היו בתוספת ביצת עוף חלמון LDLs (איור 6c). טבלה 1 ממחישה כי פרופילי חומצות שומן של פוספוליפידים ממברנה משתנים כאשר S. האורארה גדל בנוכחות של חלמון ביצה LDL.
איור 1: איור של העשרה LDL מחלמון ביצת עוף באמצעות צנטריפוגה ומשקעים סולפט אמוניה. (א) את הריאגנטים הדרוש להעשרת ה-LDL מחלמון ביצת עוף. (ב) תרשים הזרימה מתאר את השלבים המשמעותיים של תהליך העשרת ה-LDL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פרופיל חלבון של חלמון ביצת עוף לפני ואחרי העשרה עבור LDL. ליקוטים חלבונים הוכנו באמצעות מאגר ריפה. ליפוסט חלבון (15 μg) נטען לתוך 8% אקרילאמיד-ג'ל לעמוד. ג'ל היה מוכתם בן לילה עם הכימית של ביו ראד חלבון. משקולות מולקולרית kDa של החלבונים המשויכים LDL מסומנים לאורך הצד הימני של התמונה. M: סמן חלבון, Y: חלמון ביצת עוף, ו-LDL: עוף ביצה חלמון העשרה בבקשה לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חלמון ביצה נגזר LDLs להגן על S. האוראוס מ triclosan המושרה מעכבות FASII כון. . הגידול של ס' אורלוס היתה תחת פיקוח על הזמן באמצעות מדידה של OD600 בציר 1% טריטונים בתנאים הבאים: 1% טריטונים (TB), 1 μm TRICLOSAN (Tcs), 1 μm triclosan עם 1% ביצה פלזמה (TCS + eyp), 5% חלמון ביצה ldl (ldl), או 1 μm triclosan עם 5% חלמון ביצה LDL (TCS + LDL). הממוצע משלושה ניסויים עצמאיים מוצג. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צמיחה של S. האוראוס חומצות שומן מסייע לחומצה ביצה הנגזרת LDL. הצמיחה של שומן חומצה שומני ב 1% טריטונים ציר (TB) עם או בלי 5% חלמון ביצה ldl (ldl) התוספת היה פיקוח על הזמן באמצעות מדידה של OD600. הממוצע משלושה ניסויים עצמאיים מוצג. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התוכן השומן ללא שומן נמדד ב 1% טריטונים ציר או חלמון ביצת עוף LDL. חומצות שומן חינם זוהו על ידי הזרקת זרימה ברזולוציה גבוהה/מדויק המסה ספקטרומטר המסה וטנדם מיסת. מספרים מנורמל של יונים לכל מ ג של חלבון נקבע במשך 1% טריטונים ציר ו 1% טריטונים בתוספת של 5% עוף ביצה חלמון LDLs. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: חלמון ביצת עוף בצפיפות נמוכה ליפופרוטאינים הם מאגר של חומצות שומן אקסוגני לסינתזה של הזרחן האורקסיליגלינול. (א) מגרש ציונים של הריבועים החלקיים ביותר לפחות לניתוח מבדיל של ביצי עוף ביצה LDL מטופל ו -S. האורוליפידים קרום מטופל מזוהה באמצעות ברזולוציה גבוהה/מדויקת המסה ספקטרומטר. (ב) אחוז בלתי רווי פוספוליגליל (upg) לעומת הקרום הכולל של ה- PG של האוראוס גדל בהעדר (wt) או נוכחות (wt + LDL) של ביצת עוף חלמון LDLs. (C) חומצת שומן בלתי רווי (ufa) פרופיל של ממברנה PG של S. האוראוס גדל ללא (wt) או עם (WT + LDL) חלמון ביצת עוף LDLs בגרף כאחוז מכמות הסכום הכולל של חומצות שומן PG. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| WT מתורבת בציר טריטונים | WT מתורבת במרק טריטונים בתוספת LDLs | |||||
| פוספליגליל (TC: TDB)מ | שפע של מנורמל/mg של חלבון | SD | חומצות שומןc | שפע של מנורמל/mg של חלבון | SD | חומצות שומןc |
| 24:0 | 0 | 0 | NDb | 0.052031116 | 0.02677 | ND |
| 26:0 | 0 | 0 | ND | 0.009539117 | 0.00362 | ND |
| 28:0 | 0.127937113 | 0.04528 | 15:0_13:0 | 0.167643281 | 0.02392 | 15:0_13:0 |
| 28:1 | 0.006765427 | 0.00157 | ND | 0.002776821 | 0.00372 | 15:0_13:1 |
| 30:0 | 8.680180809 | 2.68375 | 15:0_15:0 | 14.04873592 | 2.4531 | 15:0_15:0 |
| 30:1 | 0 | 0 | ND | 0.010152161 | 0.00449 | 15:1_15:0, 13:1_15:0 |
| 31:0 | 4.150511117 | 1.31658 | 16:0_15:0, 14:0_15:0 | 10.17590926 | 1.88431 | 16:0_15:0, 14:0_15:0, 18:0_15:0 |
| 31:1 | 0.016156004 | 0.01216 | 13:1_15:0, 12:1_15:0 | 0.473478683 | 0.09063 | 13:1_15:0, 18:1_15:0, 12:1_15:0 |
| 32:0 | 29.29259262 | 8.82993 | 15:0_17:0 | 48.24342037 | 8.95664 | 15:0_17:0, 16:0_17:0 |
| 32:1 | 0.02074815 | 0.00941 | ND | 0.307044942 | 0.07305 | 18:1_14:0, 16:1_14:0 |
| 33:0 | 9.000460122 | 2.78194 | 18:0_15:0, 16:0_15:0 | 15.4531776 | 2.98171 | 18:0_15:0, 16:0_15:0 |
| 33:1 | 0.162934812 | 0.04796 | ND | 2.921832928 | 0.30851 | 18:1_15:0 |
| 33:2 | 0 | 0 | ND | 0.167492702 | 0.03211 | 18:1_15:1, 18:2_15:0 |
| 34:0 | 12.3064043 | 3.70242 | 19:0_15:0, 17:0_15:0 | 18.40129157 | 3.21385 | 19:0_15:0, 17:0_15:0 |
| 34:1 | 0 | 0 | ND | 1.423605186 | 0.20066 | 18:1_16:0 |
| 34:2 | 0.000470922 | 0.00082 | ND | 0.156133734 | 0.03929 | 18:2_16:0 |
| 35:0 | 5.727462455 | 1.74583 | 20:0_15:0, 16:0_15:0 | 7.771538992 | 1.28515 | 20:0_15:0, 16:0_15:0, 18:0_15:0 |
| 35:1 | 0.17337586 | 0.05727 | 20:1_15:0 | 0.772202525 | 0.08526 | 20:1_15:0, 18:1_15:0 |
| 35:2 | 0 | 0 | ND | 0.038758757 | 0.01481 | 18:2_17:0, 18:1_17:1 |
| 36:0 | 0.671004303 | 0.2116 | 21:0_15:0, 19:0_15:0 | 0.967295024 | 0.2572 | 21:0_15:0, 20:0_15:0, 19:0_15:0, 22:0_15:0 |
| 36:2 | 0 | 0 | ND | 0.495485065 | 0.04473 | 18:1_18:1, 18:2_18:0 |
| 36:3 | 0 | 0 | ND | 0.059268233 | 0.02291 | 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_18:1 |
| 37:0 | 0.060466411 | 0.01961 | 22:0_15:0, 20:0_15:0 | 0.114526894 | 0.01852 | 22:0_15:0, 20:0_15:0, 18:0_15:0 |
| 38:2 | 0 | 0 | ND | 0.079469521 | 0.02872 | 18:2_20:0, 16:1_20:1 |
| מהווה זוהתה כ-[M-H]- יוני. TC, אורך שרשרת כולל; TDB, המספר הכולל של אגרות חוב כפולות. | ||||||
| ב ND, לא נקבע | ||||||
| ג חומצות שומן מפורטות בסדר השפע איזומר. קו תחתון בין שינויי חומצת שומן מעיד על כך שכל חומצת שומן יכולה להיות נוכחת בSN1 או בSN2, כלומר, כדוגמת ספקטרומטר מסה דו-מושביים בלבד, אינה יכולה לשלול את האפשרות שמינים משומנים קיימים כתערובת של איזונים מיקומיים. | ||||||
שולחן 1: חומצות שומן בפרופיל S. האוראוס תרבותי בנוכחות חלמון ביצת עוף LDLs. השתמשנו ניתוח lipidomic בלתי משוחדת ניצול ברזולוציה גבוהה/מדויק MS ו-MS/MS כדי לקבוע את הפרופיל חומצת שומן של האוראס PG. s. האוראוס היה מודחה בנוכחות או היעדרות של חלמון ביצת עוף LDLs, ואת הפרופיל PG של אלה התאים הושוו לתאים המתורבתות בציר של 1% טריטונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. האוראוס משלבת חומצות שומן אקסוגני לתוך ממברנה פוספוליפידים27,32,43. סינתזה פוספוליפיד באמצעות חומצות שומן אקסוגני עוקף פפסי עיכוב אבל גם משנה את המאפיינים ביופיזיים של הממברנה27,32,44. בעוד שילוב של חומצות שומן אקסוגני לתוך פוספוליפידים של פתוגנים גראם חיוביים הוא מתועד היטב, הפערים נשארים בזהות של מאגרי חומצות שומן מארח ושינויים מבניים לכל אחד משלושת הסוגים העיקריים של פוספוליפיד זרחן שנובע מהתאגדות חומצת שומן אקסוגני. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים אשר יכול להיות מועסק: אני) להעשיר חלקיקי LDL מחלמון ביצת עוף, מקור של חומצות שומן, ii) לקבוע את ההשפעות של חומצות שומן אקסוגני על הצמיחה של S.האוראוס, ו iii) לנצל ניתוח lipidomic משוחדת ניטור שומן האקסוגני חומצת התאגדות לתוך פוספוליפידים קרום של S.האוראוס. שיטת הספקטרומטר מסה המתקדמת המסופקת במחקר זה, מציעה פרספקטיבה יוצאת דופן של הרכב הממברנה של האוראוס שגדל בנוכחות חומצות שומן אקסוגני.
כמה פתוגנים גראם חיוביים לנצל חומצות שומן אקסוסוגני עבור סינתזה הממברנה, כמו עם S. האוראוס, המקורות האפשריים של חומצות שומן אקסוגני במהלך הזיהום מובנים בצורה גרועה27,43. ניתוח הצמיחה המתואר כאן יכול להיות שונה כדי להעריך את התפשטות של פתוגנים גראם חיוביים אחרים בנוכחות של ליפופרוטאינים אם הקינטיקה הצימוגניות של כל פתוגן נחשבים. בנוסף, מקורות מארחים מורכבים אחרים של חומצות שומן אקסוגני יכול להיבדק באמצעות פרוטוקול זה אם ההשפעות הפוטנציאליות של מקור חומצות שומן על צפיפות אופטית ברקע נשלטים. כמו-כן, השיטה המתוארת בספקטרומטר המסה לניתוח של שומנים חיידקיים היא גמישה מספיק כדי לאפשר הערכת לימוד כמעט מכל מין חיידקי. כמו נתונים המסה מדויק ליפיד נאסף ב ' סריקה מלאה ' MS mode, קצת הידע פריורי של התוכן השומנים של מינים חיידקיים של עניין נדרש, בניגוד שיטות אנליטיות ממוקדות מבוסס על דפוסי פיצול ידוע של שומנים ספציפיים 32 , 45 , 46. בזרימת העבודה האנליטית "לא ממוקדת" שאנו מתארים, ניתוח נתונים במורד הזרם, ובמיוחד בחיפוש אחר השיא ההמוני מדויק נגד מסד נתונים שומנים בדם, הם שלבי מפתח הניתנים להתאמה גבוהה ועשויים לתמוך במגוון רחב של חיידקים מינים וטיפולים ניסיוניים. בעת בנייה או בחירה של מסד נתונים הניתן לחיפוש כדי לאפשר זיהוי של מינים השומנים, החוקרים חייבים לשקול מגוון רחב של מינים היפוגניים שומנים היפותטי, תוך שהוא גם מאפשר זיהוי של שומנים אקסוגני הרומן או בלתי צפויות שנגזרו מהטיפול הניסיוני.
במחקר הנוכחי, ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה/מדויקת (טבלת חומרים) הועסק בשל יכולות המסה ברזולוציה גבוהה במיוחד/מדויקת. לחילופין, רבים אחרים ברזולוציה גבוהה/מדויקת המסה פלטפורמות מדויקות ניתן ליישם בהצלחה כדי לבצע ניתוח שומנים בלתי ממוקד. באופן דומה, מגוון רחב של שיטות מבוא לדוגמה, כולל אינפוזיה ישירה, הפחתת הריסוס אלקטרוליזיה, או באמצעות מטריקס בסיוע לייזר אינון, המאפשרים ניתוח ישיר של תמציות השומנים, יכול להיות מנוצל כדי לאסוף במהירות נתוני lipidomic שאינם מיועדים ליעד. הכללת כרומטוגרפיה נוזלית לפני הקדמה למדגם, כאשר נעשה שימוש בשילוב עם ברזולוציה גבוהה/מדויק מאוד ספקטרומטר המסה, יכול לאפשר את הרזולוציה של מינים השומנים isobaric במהלך סריקה מלאה MS נתונים איסוף. עם זאת, הכללת כרומטוגרפיה מחייבת להבטיח כי השיטה הכרוגרפית של הבחירה היא מגוונת מספיק כדי לאפשר הפרדה וזיהוי של מינים בלתי צפויים או מיני שומנים באופן שיכול להיות נוכח בעקבות הטיפולים הניסיוניים. ניתן לבצע חיפוש במסד נתונים כדי לזהות שומנים הקיימים בערכת הנתונים באמצעות כל מסד נתונים זמין הניתן לחיפוש בציבור. בעוד תוכנות limsa מאפשר פיתוח נתיישב של מסדי נתונים המוגדרים על-ידי המשתמש של עשרות אלפי מינים היפותטי השומנים, אפשרויות רבות אחרות קיימות עבור זיהוי שומנים מן ברזולוציה גבוהה/מדויקת MS שיא רשימות. קונסורציום מפות ליפיד (www.lipidmaps.org) מספק כלים לחיפוש מסדי נתונים חישוביים וניסיוניים של ליפידים היפותטי באמצעות ברזולוציה גבוהה/מדויק MS-השיא רשימות בתוך סובלנות המונית המוגדרת על-ידי המשתמש, ותוכנות רבות ספקים מציעים פתרונות משלהם לניתוח נתוני lipidomics.
עקומת הצמיחה מוצלחת בניתוח חומצות שומן אקסוגני תלויה במספר גורמים כולל טוהר LDL והגבלת רמות חומצות שומן ברקע. זיהוי נאות של השבר המכיל LDL הוא קריטי. הפרוטוקול והאיור 1 מדגימים את השבר הנכון לשמירה על כל שלב בתהליך ההעשרה. יש לנו הצלחה עם השימוש 40% אמוניום גופרתי (טוהר ≥ 99.5%) למשקעים ולהסרת הβ-livetins. עם זאת, אחרים דיווחו כי טוהר וריכוז של אמוניה גופרתית הוסיף פלזמה חלמון ביצה יכול להשפיע באופן משמעותי את השלב הזה47. הגבלת הזיהום אמוניום גופרתי ב העשרה LDL חשוב הכנה LDL לשמש assays כמו ריכוזים גבוהים של אמוניום גופרתי יכול להגביל את הצמיחה48. במהלך דיאליזה, שטח פנוי בשפע בצינורות הדיאליזה יש לספק כדי לאפשר דיפוזיה והסרה של אמוניום גופרתי. אופטימיזציה נוספת של תהליך הדיאליזה עשויה לכלול שינויי מים נוספים במהלך הדגירה של הלילה. מצאנו לילה דיאליזה כדי לספק את התוצאות הטובות ביותר, אם כי מוסא ואח ' לדווח על הדיאליזה של 6 h זה מספיק. זה קריטי כי הריכוז ההתחלתי של תאים בעקומות הגדילה נשמרים עקבי בין ניסויים. עבור S. האוראוס, מדלל תאים ל-OD הראשונית600 של 0.05 סיפקה את התוצאות העקביות ביותר. בנוסף, ריכוזים גבוהים של מעכבי FASII סדר יכול לגרום להשפעות שאינן ספציפיות על התאים החיידקיים. לדוגמה, ריכוזי triclosan מעל 7 μM לגרום נזק קרום cytoplasmic ב- S. האוראוס, לכן יש צורך כי הריכוז של תרכובת זו יישארו מתחת לרמה זו49. יש לנו מצאנו ריכוז triclosan הסופי של 1 μM תוצאות הצמיחה התפתחות assays. בעת הערכת מקור פוטנציאלי של חומצות שומן אקסוגני לסינתזה פוספוליפיד בקטריאלי, חשוב למזער את תרומת חומצת השומן של מדיום התרבות. בעשור האמור לעיל, מדיום התרבות של 1% טריטונים תומך בצמיחה נאותה של האוראוס ויש לו זיהום חומצות שומן מינימליות29,32.
הגבלת רמות חומצות שומן הרקע חשוב במיוחד עבור פרופיל במורד המסה ספקטרומטר השומן המבוסס על פרופילי שומן. אחרים דיווחו על כמות חומצות שומן חינם בחלמון ביצת עוף הוא נמוך באופן טבעי41 והניתוח שלנו תומך במסקנה זו (איור 5). באמצעות ציר טריטונים ושטיפת תאים באופן יסודי עם PBS לאחר הדגירה חיוניים. בנוסף, חשוב לשקול את שלב הצמיחה של התאים. בחרנו באמצע יומן השלב תאים כדי להבטיח סינתזה פוספוליפיד בקטריאלי מספיק. אחרים מקורות פוטנציאליים מזהם חומצות שומן אקסוגני עשוי להיות הציג לאחר הצמיחה חיידקים, כגון במהלך שלבי החילוץ השומנים או הכנה לדוגמה הבאים לפני ניתוח המסה ספקטרומטריה50. חומצות שומן אקסוגני הציג בכל שלב של הכנה לדוגמה ניתן לזהות כחומצות שומן חינם במהלך ניתוח ספקטרומטר המסה. אפיית מעבדה כלי זכוכית בתנור בטמפרטורה גבוהה (לפחות 180 ° c) לילה יכול להסיר חומצות שומן אקסוגני מצינורות הבדיקה המשמשים להפקת שומנים ואחסון שומנים בדם. בנוסף, אספקה מעבדה כולל פלסטיק ניתן לשטוף עם מתנול כדי להפחית את הרקע חומצת שומן50. חומצות שומן שיורית מניתוחים קודמים עשויים גם לזהם משטחים פנימיים של ספקטרומטר המסה עצמו. לכן מומלץ מאוד להכללה של חללים אנליטיים במהלך ניתוח ספקטרומטר המסה לקביעת רמות הרקע של חומצות שומן חופשיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין כל גילוי.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי המעבדה האמר על הערכה קריטית של כתב היד ותמיכה בעבודה זו. ד ר אלכס הורביץ מאוניברסיטת קולורדו בית הספר לרפואה סיפק AH1263. ד ר. כריס ווטרס מעבדה באוניברסיטת מישיגן סטייט סיפק ריאגנטים. עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקאי הענקת 16SDG30170026 וכספים האתחול לספק על ידי אוניברסיטת מישיגן סטייט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium sulfate | Fisher | BP212R-1 | ≥99.5% pure |
| Cell culture incubator | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE |
| Costar assay plate | Corning | 3788 | 96 well |
| Filter paper | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Large chicken egg | N/A | N/A | Common store bought egg |
| Microplate spectrophotometer | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus strain AH1263 | N/A | N/A | Provided by Alex Horswill of the University of Colorado |
| Dialysis tubing | Pierce | 68700 | 7,000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A4561 | |
| Chloroform (reagent grade) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (LC-MS grade) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | ≥99.5% pure |
| Ammonium formate | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur software | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Scientific | high resolution/accurate mass MS | |
| Agilent 1260 capillary HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Vacuum Concentrators | Thermo Scientific |
References
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
- Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
- Zhang, Y. M., Rock, C. O.
- Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
- Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
- Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
- Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
- Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
- Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
- Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
- Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
- Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
- Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
- Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
- Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
- Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
- Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
- Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
- Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
- Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
- Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
- Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
- Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
- Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
- Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
- Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
- Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
- Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
- Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
- Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
- Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
- Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
- Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
- Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
- Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
- Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
- Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
- Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
- Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
- Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
- Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
- Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
- Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
- Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
- Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
- Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).
