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Biochemistry

Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

Este método fornece um quadro para estudar a incorporação de ácidos graxos exógenos de fontes hospedeiras complexas em membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para conseguir isto, os protocolos para o enriquecimento de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha e do perfil de ácido gordo subseqüente de fosfolipídios bacterianos que utilizam a espectrometria maciça são descritos.

Abstract

Staphylococcus aureus e outros patógenos gram-positivos incorporam ácidos graxos do ambiente em fosfolipídios de membrana. Durante a infecção, a maioria dos ácidos graxos exógenos estão presentes dentro de partículas de lipoproteínas hospedeiras. A incerteza permanece quanto aos reservatórios de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais as bactérias extraem ácidos graxos das partículas de lipoproteínas. Neste trabalho, descrevemos protocolos de enriquecimento de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) da gema de ovo de frango e determinando se os LDLs servem como reservatórios de ácidos graxos para S. aureus. Este método explora análise lipidomica imparcial e LDLs de frango, um modelo eficaz e econômico para a exploração de interações entre LDLs e bactérias. A análise da integração de S. aureus de ácidos graxos exógenos de LDLs é realizada utilizando espectrometria de massas de alta resolução/acurada e espectrometria de massas em tandem, possibilitando a caracterização da composição de ácidos graxos da bactéria membrana e identificação imparcial de combinações novas de ácidos gordos que se levantam em lipídios bacterianos da membrana em cima da exposição aos LDLs. Estas técnicas avançadas da espectrometria maciça oferecem uma perspectiva incomparável da incorporação do ácido gordo revelando os ácidos gordos exógenos específicos incorporados nos phospholipids. Os métodos aqui descritos são adaptáveis ao estudo de outros patógenos bacterianos e fontes alternativas de ácidos graxos complexos.

Introduction

S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é a principal causa de infecção associada à saúde e a resistência antibiótica associadaé um desafio clínico considerável1,2,3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas é uma prioridade alta. Uma estratégia de tratamento promissora para patógenos gram-positivos está inibindo a síntese de ácidos graxos, uma exigência para a produção de fosfolipídios de membrana que, em S. aureus, inclui fosfatidilglicerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina4. Em bactérias, a produção de ácidos graxos ocorre através da via de síntese de ácidos graxos II (fasii)5, que é consideravelmente diferente da contraparte eucariótica, tornando fasii um alvo atrativo para o desenvolvimento de antibióticos5,6 . Os nervos inibidores de FASII primeiramente alvo FabI, uma enzima exigida para o alongamento da corrente do carbono do ácido gordo7. O inibidor da Fabi Triclosan é amplamente utilizado em bens de consumo e de saúde8,9. Inibidores adicionais de Fabi estão sendo desenvolvidos por diversas empresas farmacêuticas para o tratamento da infecçãopor S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. No entanto, muitos patógenos gram-positivos, incluindo S. aureus, são capazes de eliminar os ácidos graxos exógenos para a síntese de fosfolipídios, contornando a inibição do fasii27,28,29. Assim, o potencial clínico dos inibidores do fasii é debatido devido a lacunas consideráveis em nosso conhecimento sobre as fontes de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais os patógenos extraem ácidos graxos do hospedeiro27,28. Para abordar essas lacunas, desenvolvemos um método de análise lipidomica imparcial para monitorar a incorporação de ácidos graxos exógenos de partículas de lipoproteínas em fosfolipídios de membrana de S. aureus.

Durante a sepse, as partículas de lipoproteínas hospedeiras representam uma fonte potencial de ácidos graxos derivados do hospedeiro dentro da vasculatura, pois a maioria dos ácidos graxos hospedeiros está associada às partículas30. As lipoproteínas consistem em um escudo hidrófilo composto de fosfolipídios e proteínas que envolvem um núcleo hidrofóbico de triglicerídeos e ésteres de colesterol31. Quatro classes principais de lipoproteínas--chylomicron, lipoproteína muito de baixa densidade, lipoproteína de alta densidade, e lipoproteína de baixa densidade (LDL)-são produzidos pelo hospedeiro e funcionam como veículos de transporte lipídico, entregando ácidos graxos e colesterol de e para células hospedeiras através da vasculatura. Os LDLs são abundantes em ácidos graxos esterificados, incluindo triglicerídeos e ésteres de colesterol31. Nós temos demonstrado previamente que os LDLs humanos altamente purified são uma fonte viável de ácidos gordos exógenos para a síntese do PG, assim fornecendo um mecanismo para o desvio32do inibidor de fasii. As LDLs humanas purificantes podem ser tecnicamente desafiadoras e demoradas, enquanto as fontes comerciais de LDLs humanas purificadas são proibitivamente caras de usar em uma base rotineira ou para realizar telas bacterianas em grande escala. Para abordar estas limitações, nós modificamos um procedimento para o enriquecimento de LDLs da gema de ovo da galinha, uma fonte rica de partículas do lipoproteína33. Nós usamos com sucesso a espectrometria maciça unalvejada, de alta resolução/exata e a espectrometria maciça em tandem para monitorar a incorporação de ácidos gordos LDL-derivados humanos na membrana de S. aureus32. Ao contrário dos métodos previamente relatados, esta aproximação pode quantificar isómeros individuais do ácido gordo para cada um dos três tipos estafilocócica principais do fosfolipídeo. O ácido oleico (18:1) é um ácido graxo insaturado presente em todas as partículas de lipoproteínas hospedeiras que é prontamente incorporada aos fosfolipídeos de S. aureus 29,30,32. S. aureus não é capaz de síntese de ácido oleico29; Portanto, a quantidade de ácido oleico incorporado ao fosfolipídios estabelece a presença de ácidos graxos derivados da lipoproteína hospedeira dentro da membrana estafilocócica29. Estas espécies de fosfolípidos podem ser identificadas pelo método de espectrometria de massas de última geração descrito aqui, oferecendo uma resolução sem precedentes da composição da membrana de S. aureus cultivada na presença de uma fonte de ácidos graxos que provavelmente encontros durante a infecção.

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Protocol

Nota: o seguinte protocolo para enriquecimento de partículas de LDL da gema de ovo de galinha é derivado de Moussa et al. 200233.

1. preparação de gema de ovo de galinha para enriquecimento de partículas de LDL

  1. Sanitize dois ovos de galinha grandes lavando as conchas com 70% de solução de etanol e deixe secar ao ar.
  2. Sanitize o separador de ovo usando 70% solução de etanol e deixe secar ao ar. Prenda o separador de ovos no lábio de uma taça de tamanho médio.
  3. Rachar cada ovo individualmente no separador do ovo e permitir que o albume flua no béquer. A gema de ovo intacta será mantida pelo separador.
  4. Lave a gema de ovo duas vezes com 30 mL de soro fisiológico tampão de fosfato estéril (PBS) para remover o albúmen residual.
  5. Coloque suavemente a gema de ovo no papel de filtro.
  6. Perfure a membrana do vitelina com uma ponta estéril da pipeta e drene o índice da membrana em um tubo de centrifugação cônico estéril de 50 ml. Descarte a membrana e o papel de filtro.

2. fraccionamento do plasma contendo LDL da gema de ovo de galinha

  1. Adicione aproximadamente dois volumes de 0,17 M de NaCl a pH 7,0 à gema de ovo e misture vigorosamente. Em seguida, misture esta solução a 4 ° c por 60 min.
  2. Centrifugue a diluição da gema de ovo a 10 ° c a 10.000 x g durante 45 min. Retire a fração plasmática (sobrenadante) da fração granular (pellet) para um tubo cônica de 50 ml estéril.
  3. Repita o passo 2,2.

3. isolação de partículas de LDL do plasma

  1. Misture a fração plasmática com 40% de sulfato de amônio (w/v) a 4 ° c por 60 min.
  2. Ajuste o pH da fração plasmática com uma solução de NaOH de 420 mM para 8,7.
  3. Centrifugue a diluição da gema de ovo a 4 ° c a 10.000 x g durante uma duração de 45 min. Remova a fração amarela do semi-sólido superior na tubulação da diálise do tamanho de pore de 7 kDa. Forneça o quarto na tubulação para permitir que inchar.
  4. Dialyze durante a noite a 4 ° c em 3 L de água ultrapura para remover o sulfato de amônio. Agitar suavemente a água usando uma barra de agitação.
  5. Transfira a solução diafiltrado em um tubo de centrifugação cônico estéril de 50 ml.
  6. Centrifugue a solução a 4 ° c a 10.000 x g durante uma duração de 45 min. Retire cuidadosamente a fração amarela do semi-sólido superior para um tubo estéril e armazene a 4 ° c.

4. avaliação de LDLs de frango como fonte de ácidos graxos

  1. Células de subcultura S. aureus em 5 ml de caldo de triptona 1% sem ácidos graxos e incubar durante a noite a 37 ° c com agitação (225 rpm). Para auxotrofos de ácidos graxos, culturas de suplemento com uma fonte de ácidos graxos.
  2. Diluir culturas durante a noite para uma densidade óptica (OD) em 600 nm (OD600) de 0,1 em 1% de caldo de triptona. Pipeta 50 μL da suspensão da pilha em cada poço de uma placa 96-well do redondo-fundo.
    Nota: ao trabalhar com auxotróficos de ácidos graxos, lave as culturas durante a noite em dois volumes de caldo de triptona e ressuspender em 5 mL de caldo de triptona para limitar o transporte de ácidos graxos antes de determinar o OD da cultura.
  3. Para os poços que contenham controles não tratados, adicione 50 μL de caldo de triptona a 1% por poço.
  4. Para os poços contendo as suspensões de células experimentais, acrescente 50 μL de caldo de triptona a 1% suplementado com LDL a 10% de gema de ovo, 2 μM de triclosan, ou uma mistura de 10% de LDL e 2 μM de triclosan derivados de gema de ovo.
    Nota: neste ponto, cada poço conterá 100 μL e a concentração final de LDL e triclosan derivados de gema de ovo por poço será de 5% e 1 μM, respectivamente.
  5. Medir OD600 ao longo do tempo, usando um leitor de microplacas definido em 37 ° c com agitação contínua e linear para monitorar o crescimento.

5. incubação de S. aureus com LDLs para análise lipídica de membrana.

  1. Cultura uma colônia isolada em 5 mL de ácido gordo-livre 1% caldo de triptona e incubar durante a noite a 37 ° c com agitação (225 rpm).
  2. Diluir as culturas durante a noite 1:100 num balão estéril de 250 mL, contendo 50 mL de caldo de triptona a 1%. Incubar à fase do mid-log (aproximadamente 4 h) em 37 ° c com agitação.
  3. Transfira 25 mL de cultura para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL e segue as células. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em 750 μL de 1% de caldo de triptona.
  4. Combine as células ressuscipended e alíquota 300 μL da suspensão celular em um tubo de centrifugação estéril de 1,5 mL.
  5. Adicionar LDLs à concentração final desejada e incubar a 37 ° c com agitação (225 rpm) por 4 h.
  6. Centrifugue as culturas em 4 ° c em 16.000 x g por uma duração de 2 minutos e lave as pelotas da pilha em dois volumes de PBS estéril a seguir repita.
  7. Anote o peso de cada pellet de células molhadas. Encaixe-congele as pelotas da pilha no gelo seco ou no nitrogênio líquido e armazene-o a-80 ° c ou Prossiga diretamente à seção 6.

6. extração de lipídios da membrana de S. aureus

  1. Coloque as pelotas de células S. aureus congeladas em gelo seco. Adicione 0,5 mm de óxido de zircônio grânulos em cima de cada célula pellet, usando um volume de grânulos aproximadamente igual ao volume do pellet celular.
    Nota: como uma alternativa a este método de extração lipídica, os pesquisadores podem usar os métodos bem estabelecidos Bligh e Dyer ou Folch para exigentes lipídios de células bacterianas34.
  2. Adicionar 740 μL de 75% de metanol (grau HPLC) refrigerados a-80 ° c diretamente às pastilhas celulares.
  3. Adicionar 2 μL de 50 μm ácido fosfatidilcolina (preparado em metanol) por 1 mg de células como um padrão interno. Feche o tubo de ensaio e coloque os tubos de centrifugação de 1,5 mL contendo cada amostra numa porta disponível num homogeneizador de tecido Bullet Blender. Homogeneizar as amostras em baixa velocidade, definindo 2-3, por 3 min.
  4. Inspecione visualmente as amostras para a homogeneidade. Se houver aglomerações de células visíveis, continue a homogeneização no liquidificador Bullet em incrementos de 2 min.
  5. Retire as amostras do Bullet Blender e transfira para uma capa de fumaça química.
  6. Adicionar 270 μL de clorofórmio a cada tubo de amostragem. Vórtice as amostras vigorosamente por 30 min.
    Atenção: o clorofórmio é um possível carcinógeno.
  7. Centrifugue as amostras em uma centrífuga de bancada por até 30 min a um mínimo de 2.000 x g. Velocidades mais rápidas podem ser usadas com tubos de centrifugação compatíveis e a duração da centrifugação pode ser encurtada para 10 min.
  8. Em uma capa de fumaça química, colete o sobrenadante monofásico e transfira para um novo tubo de ensaio, enquanto evita cuidadosamente a pelota da proteína na parte inferior do tubo de extração.
  9. Adicione 740 μL de 75% de metanol (grau HPLC) e 270 μL de clorofórmio ao pellet de proteínas e extraia cada amostra como descrito nos passos 6.6-6.8 acima. Combine o sobrenadante da segunda extração com o sobrenadante previamente coletado para cada amostra.
  10. Evate os solventes da extração um córrego do gás inerte tal como o nitrogênio ou o Argon, ou o vácuo usando um concentrador da centrifugação (tabela dos materiais).
  11. Extratos lipídicos secos de lavagem três vezes com 1,0 mL de solução aquosa de bicarbonato de amônio de 10 mM e resecar as amostras como na etapa 6,10.
  12. Ressuscitou os extratos lipídicos secos em um solvente não polar adequado, como isopropanol. Resuspender as amostras utilizando 20 μL por 1 mg de peso das células frescas determinada no passo 5,7 Alternativamente, se o peso das pastilhas celulares for desconhecido, Ressuspender as amostras em 200 μL de isopropanol e proceder à seção 7.

7. análise de perfis lipídicos de S. aureus utilizando espectrometria de massas de alta resolução/exata

  1. Antes da realização de uma análise lipídica completa, selecionar amostras de teste representativas do (s) grupo (es) experimental e analisá-las em uma série de fatores de diluição da amostra para determinar as faixas de diluição da amostra nas quais as concentrações totais de lipídios caem dentro da linha linear intervalo de resposta do detector para o espectrómetro de massa, como descrito anteriormente35.
  2. Evaporam alíquotas de cada extrato lipídico amostral para serem submetidos à análise lipídica, secando as alíquotas gás inerte ou vácuo em um concentrador centrífugos (tabela de materiais).
  3. Ressuspender cada extrato lipídico seco em cromatografia líquida – espectrometria de massas (LC-MS) grau isopropanol: metanol (2:1, v:v) contendo 20 mM de amónio, utilizando volumes equivalentes a um fator de diluição da amostra ideal, conforme determinado na etapa 7,1.
  4. Para uma análise lipídica não direcionada, as amostras podem ser introduzidas diretamente na plataforma de espectrometria de massas de alta resolução/precisão sem o uso de cromatografia por injeção de fluxo ou infusão direta de extratos35,36. Transfira os extratos lipídicos diluídos preparados na etapa 7,3 para um frasco de amostrador automático apropriado ou placa de 96 poços.
  5. Para análise baseada em injeção de fluxo, coloque os frascos de amostrador automático em um amostrador automático com controle de temperatura (15 ° c) de um sistema de HPLC capaz de aplicações capilares/de baixo fluxo, como uma HPLC (tabela de materiais) equipada com um fluxo eletrônico sistema de monitoramento de fluxo e dosagem.
  6. Encha os reservatórios do solvente da HPLC com isopropanol da classe de LC-MS: metanol (2:1, v:v) que contem o formate do amónio de 20 milímetros.
  7. Utilizando o software Agilent Chemstation, Programe o amostrador automático HPLC para realizar injeções de amostra de 5 μL. No menu instrumento , selecione Configurar Injectore digite 5,0 no campo volume de injeção. As unidades são dadas como microlitros. Assegure-se de que a HPLC esteja ajustada ao fluxo isocrática em 1 μl por o minuto de 2:1 (v:v) isopropanol: metanol que contem o formate do amónio de 20 milímetros.
  8. No menu de instrumentos do chemstation, selecione Configurar bomba... e, em seguida, selecione o interruptor de alternância do modo de fluxo micro .
  9. Nos campos de horário , insira: Time 0, 0, 100% B, Flow 1,0. Aperte Enter e crie uma segunda linha no cronograma inserindo time 10,0, 100% B, Flow 1,0. Selecione o botão OK na parte inferior do menu da bomba configurada . Essas configurações habilitará 10 execuções analíticas a uma taxa de fluxo de 1,0 μL por minuto.
  10. Introduza o eluído da linha de transferência do HPLC ao espectrómetro maciço usando uma fonte da ionização do electrospray cabida com uma agulha do metal do baixo-fluxo (34 G).
  11. Usando o software de controle de instrumentos Thermo Tune Plus, selecione o menu de configuração e selecione fonte de ESI aquecida. Defina a voltagem de ionização para 4000 V e o gás da bainha para 5 (unidades arbitrárias) digitando esses valores nos campos correspondentes da caixa de diálogo. Similarmente, ajuste o temp capilar a 150 ° c e a S-lente a 50%.
    Observação: esses valores precisam ser otimizados para cada plataforma de espectrometria de massa.
  12. Para análise lipídica não direcionada, use uma plataforma de MS maciça de alta resolução/precisão (tabela de materiais) como o detector.
  13. Usando o software Thermo Tune Plus, clique no botão definir digitalização e, no menu analisador , selecione FTMs. Defina o campo intervalo de massa como normal e, no campo resolução , selecione 100.000. Verifique se o tipo de digitalização está definido como completo. No menu intervalos de digitalização , insira 200 no primeiro campo de massa (m/z) e insira 2000 no último campo de massa (m/z).
  14. Certifique-se de que a polaridade negativa é utilizada para detectar os lipídios S. aureus mais abundantes.
  15. Repita a análise da amostra usando o mapeamento de íons em tandem espectrometria de massas (MS/MS) fragmentação de todos os íons lipídicos dentro de uma região espectral de interesse, a fim de confirmar estruturas lipídicas e constituintes de ácidos graxos. Alternativamente, os íons lipídicos selecionados de interesse podem ser submetidos à análise de MS/MS após as identificações iniciais de lipídios terem sido atribuídas na seção 8.

8. pesquisa da base de dados para identificar S. aureus endógenos e os lipídios LDL-derivados exógenos

  1. Use o software Thermo Xcalibur para refinar ainda mais a precisão da massa observada. No Xcalibur, no menu ferramentas , selecione o Recalibrate offline. Depois que a janela Recalibrate offline for aberta, carregue o arquivo de espectro de massa para ser recalibrado selecionando o menu arquivo e selecionando a opção abrir .
  2. Abra o arquivo de interesse, alterne o botão Inserir linha na parte superior da janela de exibição, para exibir o cromatograma de íons total para a execução de MS. Média dos sinais de MS adquiridos clicando com o botão esquerdo do mouse em uma borda do pico de sinal observado no cromatograma de íons total e arrastando o mouse pela parte mais ampla do pico.
  3. No menu filtro de digitalização , selecione o filtro correspondente aos dados de verificação completa do MS. Carregue um arquivo de referência contendo as massas teóricas monoisotópicas de pelo menos três lipídios endógenos conhecidos de S. aureus selecionando o botão Load ref... e selecionando o arquivo de referência. Verifique a caixa de uso ao lado de cada massa monoisotópica lipídica.
  4. Clique no botão Pesquisar na parte inferior da janela de visualização. Re-Average o sinal do MS através do pico do sinal no cromatograma total do íon como feito previamente.
  5. Clique no botão converter perto da parte inferior da janela de visualização. Quando a caixa de diálogo converter for aberta, clique em OK. Omitir esta etapa se os dados foram coletados em plataformas de espectrometria de massa de fornecedores que não sejam a thermo Scientific.
  6. Usando o software Xcalibur, exporte as listas de pico de massa precisas recalibradas para cada amostra não tratada ou tratada com LDL para separar planilhas de um arquivo do Excel. Selecione o ícone do navegador de qual . Abra o arquivo recalibrado de interesse, selecionando o menu arquivo e selecionando a opção abrir.. . .
  7. Média do sinal através do pico largo no cromatograma de íon total como descrito na etapa 8,2.
  8. Clique com o botão direito no ícone de Thumbtack na janela de visualização do espectro de massa e selecione Ver | Lista de espectro. No mesmo menu, selecione Opções de exibição e, em seguida, todos os picos caixa de alternância no menu Exibir . Clique no botão OK para fechar a janela de visualização.
  9. Botão direito do mouse no ícone de Thumbtack na janela de visualização de espectro de massa novamente e selecione o Export | Área de transferência (massa exata). Cole a célula de dados exportados a1 da primeira planilha em uma nova planilha do Excel.
  10. Exclua as primeiras 8 linhas de texto no arquivo de dados exportado, de forma que a célula a1 da planilha do Excel contenha o primeiro ponto de dados em massa do espectro de massa. Repita a exportação de cada arquivo MS recalibrado, usando uma nova planilha no arquivo do Excel para cada lista de pico exportado.
  11. Usando o software de análise de massa espectral de lipídios (LIMSA)37 Add-in para o Excel, construa um banco de dados contendo fórmulas moleculares de espécies de lipídios de S. aureus conhecidas, conforme descrito por Hewelt-belka et al. 201438, bem como fórmulas que representam espécies lipídicas que poderiam hipoteticamente estar presentes no LDL.
    Nota: Adicionalmente, deve-se tomar cuidado para incluir fórmulas moleculares potenciais na base de dados para os lipídios bacterianos hipotéticos que incorporaram os principais ácidos graxos LDL, como os ácidos graxos oleico (18:1) e linoleico (18:2)32.
  12. Para construir o banco de dados, abra uma planilha do Excel em branco. Na célula a1 da primeira planilha, digite a massa monoisotópica teórica/computada das espécies lipídicas a serem adicionadas ao banco de dados, correspondendo à massa das espécies lipídicas no estado iônico observado no Espectrómetro de massas. Na célula B1, insira um nome para as espécies lipídicas, como PG (34:0).
  13. Na célula C1, entrar a fórmula molecular para as espécies lipídicas, correspondendo ao estado iônico do lipídio observado no Espectrómetro de massa. Na célula D1, entrar a carga da espécie lipídica, como observado no Espectrómetro de massa. Mova para a célula A2 para iniciar uma nova entrada para a próxima espécie lipídica a ser inserida no banco de dados pesquisável.
  14. Repita as etapas 8,12 e 8,13 até que todas as espécies de lipídios desejadas tenham sido inseridas no banco de dados. Salve o arquivo de banco de dados e deixe-o aberto no Excel.
  15. No Excel, selecione o menu Add-ins no. Selecione limsa para iniciar o software limsa. No menu principal, clique no botão biblioteca composta. ... Na nova janela que aparece, clique em importar compostos. Isso carregará o banco de dados composto para uso pelo software LIMSA.
  16. Realize identificações de lipídios com base em massa exata em todos os espectros MS usando o software LIMSA Add-in para Excel de acordo com as instruções do fornecedor35. No menu principal do LIMSA, selecione lista de picos no menu tipo de espectro . Selecione modo positivo ou modo negativo para corresponder com a polaridade na qual os dados de MS foram adquiridos.
  17. Na janela de pico FWHM (m/z) , insira a janela de pesquisa em massa desejada para encontrar o pico. Uma janela de pesquisa de tolerância maciça de 0,003-0,005 m/z é recomendada para dados de MS em massa de alta resolução/precisos.
  18. Na janela de sensibilidade , insira o corte de linha de base desejado (por exemplo, 0, 1% de abundância relativa). No menu de correção de isótopos , selecione ajuste linear ou subtrair algoritmos, um dos quais pode ser usado com dados de lista de pico.
  19. Realce compostos lipídicos para incluir na pesquisa de banco de dados clicando em espécies lipídicas desejadas dentro da janela de compostos disponíveis . Clique no botão Adicionar para adicionar espécies de lipídios destacadas ao grupo de pesquisa.
  20. Definir padrões internos clicando em compostos adicionados, em seguida, alterando a janela de concentração para a concentração correspondente do padrão interno selecionado.
  21. Assegure-se de que o padrão interno e as espécies de lipídios selecionadas a serem quantificadas pertençam ao mesmo nome de classe selecionando cada espécie lipídica adicionada e padrão interno e digitando um nome de classe (como PG ou lipídio) no campo classe.
  22. Para salvar o grupo pesquisável de compostos lipídicos para uso futuro, clique no botão salvar ao lado do menu grupos .
  23. Certifique-se de que o arquivo do Excel que contém todas as listas de pico de MS exportadas esteja aberto à folha correspondente à primeira execução de S. aureus MS e clique no botão Pesquisar no menu principal do limsa.
    Observação: a saída da pesquisa de banco de dados LIMSA incluirá uma lista de recursos espectrais de massa combinados com lipídios presentes no banco de dados construídos nas etapas 8.13, bem como concentrações para cada recurso correspondente após a normalização para um ou mais selecionados normas internas.
  24. Use o software Xcalibur para examinar espectros de MS/MS em massa precisos para m/z correspondendo a íons lipídicos de interesse, a fim de confirmar os constituintes de ácidos graxos presentes em cada espécie molecular lipídica identificada. Selecione o ícone do navegador de qual . Abra o arquivo MS/MS de interesse selecionando o menu suspenso arquivo e selecionando a opção abrir... .
  25. Selecione o filtro de digitalização correspondente à análise MS/MS de um lipídio m/z de juros, clicando com o botão direito do mouse no ícone de Thumbtack na janela de visualização do espectro de massa e selecione intervalos no menu. Na nova janela exibida, selecione o menu filtro para selecionar a digitalização.
  26. Média do sinal através do cromatograma de íons total conforme descrito na etapa 8,2. Use o software MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) para realizar testes estatísticos apropriados. Avalie a diferença estatisticamente significante na composição lipídica de S. aureus comparando as abundâncias de lipídios normalizadas em condições tratadas e com LDL tratada.

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Representative Results

O protocolo para o enriquecimento de LDL da gema de ovo de galinha é ilustrado na Figura 1. Este processo começa por diluir a gema de ovo inteira com soro fisiológico e separar os sólidos de gema de ovo referidos como grânulos da fração solúvel ou plasmática contendo os LDLs (Figura 1)33. O teor de LDL da fração plasmática é ainda mais enriquecido pela precipitação do ~ 30-40 kDa β-livetins (Figura 2)33. A presença de bandas proteicas em 140, 80, 65, 60 e 15 kDa correlacionou-se com as apóproteínas de LDLs (Figura 2)33,39. O tratamento com triclosan inibe o crescimento de S. aureus em meios livres de ácidos graxos32. Já demonstramos que a suplementação de culturas com plasma de gema de ovo ou LDLs humanas purificadas como fontes de ácidos graxos exógenos supera a inibição do crescimento induzido por triclosan (Figura 3)32. Da mesma forma, a suplementação de culturas tratadas com triclosan com o LDL enriquecido de gema de ovo restaura o crescimento (Figura 3). Além disso, a adição de LDLs de gema de ovo suporta o crescimento de um auxotroph de ácidos graxos de S. aureus previamente caracterizado (figura 4)32. Para o perfilamento de massa mais preciso com base em espectrometria de S. aureus incorporação de ácidos graxos exógenos, é importante limitar a presença de ácidos graxos livres no meio de crescimento. A composição de ácidos graxos livres de 1% de caldo de triptona e LMR de gema de ovo de galinha diluída em caldo de triptona foi determinada empregando-Se espectrometria de massa de alta resolução/precisão de fluxo e encontrou quantidades mínimas de ácidos graxos livres (Figura 5). A mesma análise de espectrometria de massas não direcionada foi realizada para determinar a composição de ácidos graxos de Fosfolipídeos de S. aureus após exposição a LDLs de gema de ovo de galinha. análise discriminante de mínimos quadrados ortogonais parciais (opls-DA)40 de Fosfolipídeos de membrana S. aureus abundantes demonstraram separação clara da classe de condições tratadas com a gema de ovo não tratada e de frango, como mostrado no gráfico de escores opls-da (Figura 6a). O lote de cargas OPLS-DA indicou numerosas espécies de fosfatidilgliceróis como variáveis importantes no modelo PLS-DA. Notavelmente, os fosfolipídios contendo ácidos graxos insaturados, um marcador molecular de incorporação de ácidos graxos exógenos, são enriquecidos nas culturas suplementadas com LDL, em comparação com as células incubados na ausência de LDLs (Figura 6B). Estudos prévios descobriram que as gemas de ovos de frango são uma fonte rica de ácidos graxos insaturados com ácido oleico (18:1) sendo a mais abundante41,42. De acordo com essas observações, encontramos o ácido oleico como o ácido graxo mais comum utilizado para a síntese de fosfolipídios quando as culturas de S. aureus foram suplementadas com LDLs de gema de ovo de galinha (Figura 6C). A tabela 1 ilustra ainda que os perfis de ácidos graxos dos fosfolipídios da membrana são alterados quando S. aureus é cultivado na presença de gema de ovo LDL.

Figure 1
Figura 1: uma ilustração do enriquecimento de LDL da gema de ovo da galinha que utiliza a centrifugação e a precipitação do sulfato da amônia. (A) os reagentes necessários para o enriquecimento de LDL da gema de ovo de galinha. (B) o fluxograma retrata as etapas significativas do processo de enriquecimento de LDL. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: perfil proteico da gema de ovo de galinha antes e após o enriquecimento para LDL. Os lisados proteicos foram preparados com tampão RIPA. O lisado da proteína (15 μg) foi carregado em um gel de SDS-PAGE do acrilamida de 8%. Os géis foram manchados durante a noite com Bio Rad protein reagente. Os pesos moleculares em kDa de proteínas associadas ao LDL são denotados ao longo do lado direito da imagem. M: marcador da proteína, Y: gema de ovo da galinha, e LDL: o enriquecimento do LDL do gema de ovo da galinha estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: os LDLs derivados de gema de ovo protegem S. aureus da inibição do fasii induzida por triclosan. O crescimento de S. aureus foi monitorado ao longo do tempo através da medição de OD600 em caldo de tryptona 1% nas seguintes condições: 1% de caldo de TRIPTONA (TB), 1 μm de triclosan (TCS), 1 μm de triclosan com 1% de plasma de gema de ovo (TCS + EYP), 5% de gema de ovo Triclosan com 5% de gema de ovo LDL (TCS + LDL). A média de três experimentos independentes é mostrada. As barras de erro representam o desvio padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: crescimento de um S. o auxotroph de ácidos graxos aureus é apoiado pelo LDL derivado de gema de ovo. O crescimento de um auxotroph de ácidos graxos em 1% de caldo de triptona (TB) com ou sem suplementação de 5% de LDL de gema de ovo (LDL) foi monitorado ao longo do tempo através da mensuração de OD600. A média de três experimentos independentes é mostrada. As barras de erro representam o desvio padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: teor de ácidos graxos livres medidos em 1% de caldo de triptona ou de gema de ovo de galinha LDL. Ácidos graxos livres foram detectados por injeção de fluxo de alta resolução/espectrometria de massa exata e espectrometria de massas em tandem. O número normalizado de íons por mg de proteína foi determinado para 1% de caldo de triptona e 1% de caldo de triptona suplementado com 5% de ovo de galinha LDLs. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: as lipoproteínas de baixa densidade da gema de ovo de galinha são um reservatório de ácidos graxos exógenos para síntese de fosfatidilglicerol de S. aureus . (A) gráfico de escores de análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais de Fosfolipídeos de membrana de S. aureus tratados com LDL e sem tratamento, identificados por espectrometria de massas de alta resolução/precisão. (B) percentagem de fosfatidilglicerol insaturado (UPG) em comparação com a membrana total PG de S. aureus CULTIVADA na ausência (WT) ou presença (WT + LDL) de LDLs de gema de ovo de galinha. (C) perfil de ácidos graxos insaturados (Ufa) de membrana PG de S. aureus cultivado sem (WT) ou com (WT + LDL) de ovo de galinha LDLs de gema grafado como uma percentagem da quantidade de ácidos graxos PG totais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

WT cultivado em caldo de triptona WT cultivado em caldo de triptona suplementado com LDLs
Glicerol do Phosphatidyl (TC: TDB)a Abundância de íons normalizados/mg de proteína Sd Ácidos graxosc Abundância de íons normalizados/mg de proteína Sd Ácidos graxosc
24:0 0 0 Db 0, 52031116 0, 2677 Nd
26:0 0 0 Nd 0, 9539117 0, 362 Nd
28:0 0,127937113 0, 4528 15:0_13:0 0,167643281 0, 2392 15:0_13:0
28:1 0, 6765427 0, 157 Nd 0, 2776821 0, 372 15:0_13:1
30:0 8,680180809 2,68375 15:0_15:0 14, 4873592 2,4531 15:0_15:0
30:1 0 0 Nd 0, 10152161 0, 449 15:1_15:0, 13:1_17:0
31:0 4,150511117 1,31658 16:0_15:0, 14:0_17:0 10,17590926 1,88431 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0
31:1 0, 16156004 0, 1216 13:1_15:0, 12:1_19:0 0,473478683 0, 9063 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0
32:0 29,29259262 8,82993 15:0_17:0 48,24342037 8,95664 15:0_17:0, 16:0_16:0
32:1 0, 2074815 0, 941 Nd 0,307044942 0, 7305 18:1_14:0, 16:1_16:0
33:0 9, 460122 2,78194 18:0_15:0, 16:0_17:0 15,4531776 2,98171 18:0_15:0, 16:0_17:0
33:1 0,162934812 0, 4796 Nd 2,921832928 0,30851 18:1_15:0
33:2 0 0 Nd 0,167492702 0, 3211 18:1_15:1, 18:2_15:0
34:0 12,3064043 3,70242 19:0_15:0, 17:0_17:0 18,40129157 3,21385 19:0_15:0, 17:0_17:0
34:1 0 0 Nd 1,423605186 0,20066 18:1_16:0
34:2 0, 470922 0, 82 Nd 0,156133734 0, 3929 18:2_16:0
35:0 5,727462455 1,74583 20:0_15:0, 18:0_17:0 7,771538992 1,28515 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0
35:1 0,17337586 0, 5727 20:1_15:0 0,772202525 0, 8526 20:1_15:0, 18:1_17:0
35:2 0 0 Nd 0, 38758757 0, 1481 18:2_17:0, 18:1_17:1
36:0 0,671004303 0,2116 21:0_15:0, 19:0_17:0 0,967295024 0,2572 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0
36:2 0 0 Nd 0,495485065 0, 4473 18:1_18:1, 18:2_18:0
36:3 0 0 Nd 0, 59268233 0, 2291 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1
37:0 0, 60466411 0, 1961 22:0_15:0, 20:0_17:0 0,114526894 0, 1852 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0
38:2 0 0 Nd 0, 79469521 0, 2872 18:2_20:0, 16:1_20:1
um Detectado como [M-H]- íons. TC, comprimento total da cadeia; TDB, número total de ligações duplas.
b ND, não determinado
c Os ácidos graxos são listados em ordem de abundância de isômero. Um sublinhado entre as designações de ácidos graxos indica que cada ácido graxo pode estar presente na posição SN1 ou SN2, pois a espectrometria de massas em tandem isoladamente não pode descartar a possibilidade de que as espécies lipídicas existam como uma mistura de isómeros posicionais.

Tabela 1: perfil de ácidos graxos de S. aureus cultivado na presença de LDLs de gema de ovo de galinha. Utilizamos uma análise lipidomica imparcial, utilizando MS e MS/MS de alta resolução/precisão para determinar o perfil de ácidos graxos de s. aureus PG. s. aureus foi incubada na presença ou ausência de LDLs de gema de ovo de galinha, e o perfil PG destes as pilhas foram comparadas àquela das pilhas cultivadas no caldo de triptona de 1%.

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Discussion

S. aureus incorpora ácidos graxos exógenos em seus fosfolipídios de membrana27,32,43. A síntese de fosfolipídios usando ácidos graxos exógenos ignora a inibição do fasii, mas também altera as propriedades biofísicas da membrana27,32,44. Embora a incorporação de ácidos graxos exógenos em fosfolipídios de patógenos gram-positivos esteja bem documentada, as lacunas permanecem na identidade dos reservatórios de ácidos graxos hospedeiros e as alterações estruturais em cada um dos três principais tipos de fosfolípidos estafilocócicos que resultam da incorporação de ácidos graxos exógenos. Aqui, nós descrevemos os protocolos que podem ser empregados para: i) enriquecer as partículas de LDL da gema de ovo da galinha, uma fonte de ácidos gordos, II) determinar os efeitos de ácidos gordos exógenos no crescimento de S. aureus, e III) utilizar uma análise lipidomicas imparcial para monitorização da incorporação de ácidos graxos exógenos em fosfolipídios de membrana de S. aureus. O método avançado de espectrometria de massas fornecido neste estudo oferece uma perspectiva extraordinária da composição da membrana de S. aureus cultivada na presença de ácidos graxos exógenos.

Vários patógenos gram-positivos utilizam ácidos graxos exógenos para síntese de membrana e, como com S. aureus, as possíveis fontes de ácidos graxos exógenos durante a infecção são pouco compreendidas27,43. A análise de crescimento descrita aqui pode ser modificada para avaliar a proliferação de outros patógenos gram-positivos na presença de lipoproteínas se a cinética de crescimento de cada patógeno for considerada. Adicionalmente, outras fontes complexas do anfitrião de ácidos gordos exógenos podiam ser testadas usando este protocolo se os efeitos potenciais da fonte do ácido gordo na densidade ótica do fundo são controlados. Além disso, o método de espectrometria de massas descrito para análise de lipídios bacterianos é suficientemente flexível para permitir a avaliação de lipidome de praticamente qualquer espécie bacteriana. Como os dados de massa precisos lipídicos são coletados em modo de "varredura completa", pouco a priori o conhecimento do conteúdo lipídico das espécies bacterianas de interesse é necessário, diferentemente de métodos analíticos direcionados baseados em padrões de fragmentação conhecidos de lipídios específicos 32 , 45 , 46. no fluxo de trabalho analítico "não direcionado" que descrevemos, a análise de dados a jusante e, em particular, a procura de listas de pico de massa precisas contra um banco de dados lipídico, são etapas-chave altamente adaptáveis e podem suportar uma ampla gama de bactérias espécies e tratamentos experimentais. Ao construir ou escolher um banco de dados pesquisável para permitir a identificação de espécies lipídicas, os pesquisadores devem considerar uma ampla gama de espécies de lipídios endógenas hipotéticas, enquanto também permitindo a detecção de lipídios exógenos novos ou imprevistos derivados do tratamento experimental.

No presente estudo, um espectrómetro de massa de alta resolução/precisão (tabela de materiais) foi empregado devido à sua ultra alta resolução/capacidade de massa exata. Alternativamente, inúmeras outras plataformas de espectrometria de massas de alta resolução/precisão podem ser implementadas com sucesso para realizar análises lipídicas não direcionadas. Similarmente, uma escala larga de métodos da introdução da amostra que incluem a infusão direta, a ionização do electrospray do dessorção, ou a ionização Matrix-assistida do dessorção do laser, que permitem a análise direta de extratos do lipido, poderiam ser utilizadas para coletar ràpida dados lipidomicos não direcionados. A inclusão da cromatografia líquida antes da introdução da amostra, quando usada em combinação com a espectrometria maciça de alta resolução/exata, pode permitir a definição de algumas espécies isobáricas do lipido durante a coleta de dados completa do MS da varredura. Entretanto, a inclusão de cromatografia necessita garantir que o método cromatográfico de escolha seja versátil o suficiente para possibilitar a separação e a detecção de espécies lipídicas não antecipadas ou novas que possam estar presentes após tratamentos experimentais. A pesquisa de banco de dados para identificar lipídios presentes no conjunto de dados pode ser executada usando qualquer banco de dados pesquisável disponível publicamente. Enquanto o software LIMSA permite o desenvolvimento facile de bancos de dados definidos pelo usuário de dezenas de milhares de espécies de lipídios hipotéticas, inúmeras outras opções existem para identificar lipídios de alta resolução/listas de pico de massa exata MS. O consórcio de mapas LIPÍDICOS (www.lipidmaps.org) fornece ferramentas para pesquisar bancos de dados computacionais e experimentais de lipídios hipotéticos usando listas de pico de alta resolução/precisos MS gerados dentro de uma tolerância de massa definida pelo usuário, e muitos softwares os fornecedores oferecem suas próprias soluções para analisar dados do Shotgun.

Curva de crescimento bem sucedida e análise de ácidos graxos exógenos é dependente de vários fatores, incluindo a pureza de LDL e limitando os níveis de ácidos graxos de fundo. A identificação adequada da fração contendo LDL é crucial. O protocolo acima e a Figura 1 ilustram a fração correta a reter para cada etapa do processo de enriquecimento. Tivemos sucesso com o uso de 40% de sulfato de amônio (pureza ≥ 99,5%) para a precipitação e remoção subsequente de β-livetins. No entanto, outros relataram que a pureza e concentração de sulfato de amônia adicionado ao plasma de gema de ovo pode impactar significativamente esta etapa47. Limitar a contaminação do sulfato de amónio no enriquecimento de LDL é importante para a preparação de LDL para ser usado em ensaios bacterianos, como altas concentrações de sulfato de amônio podem restringir o crescimento48. Durante a diálise, um amplo espaço livre no tubo de diálise deve ser fornecido para permitir a difusão e remoção do sulfato de amônio. Uma maior otimização do processo de diálise pode incluir alterações de água adicionais durante a incubação durante a noite. Encontramos diálise durante a noite para fornecer os melhores resultados, embora Moussa et al. relatar diálise de 6 h é suficiente. É fundamental que a concentração inicial de células nas curvas de crescimento sejam mantidas consistentes entre os ensaios. Para S. aureus, diluindo células para um OD inicial600 de 0, 5 forneceu os resultados mais consistentes. Adicionalmente, altas concentrações de inibidores da FASII podem resultar em efeitos não específicos em células bacterianas. Por exemplo, as concentrações de triclosan acima de 7 μM induzem danos na membrana citoplasmática em S. aureus, portanto, é necessário que a concentração deste composto permaneça abaixo desse nível49. Nós encontramos uma concentração final do triclosan de 1 μM resulta em ensaios reprodutíveis do crescimento. Ao avaliar uma potencial fonte de ácidos graxos exógenos para a síntese de fosfolípidos bacterianos, é importante minimizar a contribuição do ácido graxo do meio de cultura. Nos ensaios acima, o meio de cultura de 1% de triptona suporta o crescimento adequado de S. aureus e tem contaminação mínima de ácidos graxos29,32.

Limitar os níveis de ácidos graxos de fundo é particularmente importante para o perfil de ácidos graxos à base de espectrometria de massa a jusante. Outros relataram que a quantidade de ácidos graxos livres na gema de ovo de frango é naturalmente baixa41 e nossa análise apóia essa conclusão (Figura 5). O uso de caldo de triptona e a lavagem completa de células com PBS após a incubação são essenciais. Além disso, é importante considerar a fase de crescimento das células. Nós escolhemos pilhas da fase do meados de-registro para assegurar a síntese bacteriana ampla do fosfolipídeo. Outras potenciais fontes contaminantes de ácidos graxos exógenos podem ser introduzidas após o crescimento bacteriano, como durante as etapas de extração lipídica ou preparação da amostra subsequente antes da análise de espectrometria de massas50. Os ácidos graxos exógenos introduzidos em qualquer etapa da preparação da amostra podem ser detectados como ácidos graxos livres durante a análise de espectrometria de massas. Bicarbonato de vidro de laboratório em um forno de alta temperatura (pelo menos 180 ° c) durante a noite pode remover ácidos graxos exógenos de tubos de ensaio utilizados para a extração de lipídios e armazenamento lipídico. Adicionalmente, as fontes do laboratório que incluem plásticos podem ser enxaguadas com o metanol para reduzir o fundo do ácido gordo50. Os ácidos graxos residuais de análises prévias também podem contaminar as superfícies internas do próprio espectrómetro de massa. A inclusão de espaços analíticos durante a análise de espectrometria de massas para determinação de níveis de fundo de ácidos graxos livres é, portanto, fortemente aconselhada.

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Disclosures

Os autores não têm divulgações.

Acknowledgments

Agradecemos aos membros do laboratório Hammer por sua avaliação crítica do manuscrito e apoio deste trabalho. Dr. Alex Horswill da Universidade de Colorado School of Medicine gentilmente forneceu AH1263. Dr. Chris Waters laboratório na Universidade Estadual de Michigan forneceu reagentes. Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association Grant 16SDG30170026 e os fundos de arranque fornecem pela Universidade Estadual de Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

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References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

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Bioquímica edição 147 Staphylococcus aureus ácido graxo lipoproteína espectrometria de massas fosfolipídeo gema de ovo Shotgun
Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana
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Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

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