Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

Bu yöntem, özellikle Staphylococcus aureusgibi kompleks ana kaynaklardan gelen eksojen yağ asitleri dahil etmek için bir çerçeve sağlar. Bunu başarmak için, tavuk yumurtası sarısı ve kütle spektrometresi kullanan bakteriyel fosfolipidlerin sonraki yağ asidi profillerinden lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için protokoller açıklanmıştır.

Abstract

Staphylococcus aureus ve diğer gram-pozitif patojenler, çevreye gelen yağ asitleri membranlı fosfolipidlere dahil ederler. Enfeksiyon sırasında, eksojen yağ asitleri çoğunluğu ana lipoprotein parçacıkları içinde mevcut. Belirsizlik, ana yağ asitleri rezervuarında ve bakterilerin lipoprotein parçacıklarından yağ asitleri özü olan mekanizmalar olarak kalır. Bu çalışmanın içinde, tavuk yumurtası sarısı ile düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) parçacıklarının zenginleşmesi ve LDL 'Lerin S. aureusiçin yağ asidi rezervuarları olarak hizmet edip etmediğini belirlemek için protokoller açıklanmaktadır. Bu yöntem, tarafsız lipidomik analiz ve tavuk Ldıs, Ldıs ve bakteriler arasındaki etkileşimlerin keşfi için etkili ve ekonomik bir model istismar. LDL 'lerden eksojen yağ asitleri S. aureus entegrasyonu Analizi yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ve tandem kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir, bakteriyel yağ asidi bileşiminin karakterizasyonu sağlayan membran ve Ldıs maruz kaldıktan sonra bakteriyel membran lipidlerde ortaya çıkan yağ asitleri yeni kombinasyonları tarafsız tanımlaması. Bu gelişmiş kütle spektrometresi teknikleri, fosfolipidlere dahil edilen özel eksojen yağ asitlerini açığa çıkararak yağ asidi birleştirmesi için eşsiz bir perspektif sunar. Burada özetlenen Yöntemler diğer bakteriyel patojenlerin incelenmesi ve karmaşık yağ asitleri alternatif kaynaklarının uyarlanabilir.

Introduction

Metikiline dayanıklı S. aureus (MRSA) sağlık bağlantılı enfeksiyonun önde gelen nedenidir ve ilişkili antibiyotik direnci önemli bir klinik zorluk1,2,3. Bu nedenle, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi yüksek önceliktir. Gram-pozitif patojenler için umut verici bir tedavi stratejisi yağ asidi sentezini inhibe ediyor, S. aureus'ta fosfatidilgliserin (PG), lysyl-PG ve kardiyolipin4içeren membran fosfolipid üretiminin bir gereksinimi. Bakterilerde, yağ asidi üretimi yağ asidi sentezi II yolu (fasii)5ile gerçekleşir, bu da ökaryotik mevkidaşı 'ndan önemli ölçüde farklıdır, antibiyotik gelişimi için fasii 'ye cazip bir hedef haline gelir5,6 . FASıı inhibitörleri öncelikle FabI hedef, yağ asidi karbon zincir uzaması için gerekli bir enzim7. Fabi inhibitörü triklosan, tüketici ve tıbbi malların8,9' da geniş çapta kullanılmaktadır. Ek Fabi inhibitörleri S. aureus enfeksiyonu tedavisi için çeşitli ilaç şirketleri tarafından geliştirilmiştir10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Ancak, S. aureusdahil olmak üzere birçok gram-pozitif patojenler, fosfolipid sentezi için eksojen yağ asitleri atma yeteneğine sahiptir, fasii inhibisyonu bypass27,28,29. Bu nedenle, fasii inhibitörlerinin klinik potansiyeli, ana yağ asitleri kaynaklarının bilgilerimizde önemli boşluklar ve patojenler,27,28ana gelen yağ asitleri ayıklamak mekanizmaları nedeniyle tartışılır. Bu boşlukları ele almak için, lipoprotein parçacıklarından S. aureusmembran fosfolipidlerine kadar eksojen yağ asidin birleştirildiğini izlemek için tarafsız bir lipidomik analiz yöntemi geliştirdik.

Sepsis sırasında, ana yağ asitleri çoğunluğu parçacıklar30ile ilişkili olarak ev sahibi lipoprotein parçacıkları damar içinde ev sahibi türetilmiş yağ asitleri potansiyel bir kaynak temsil eder. Lipoproteinler, trigliserid ve kolesterol esterlerinin hidrofobik çekirdeğini kapsayan fosfolipidler ve proteinlerden oluşan hidrofilik bir kabuk oluşur31. Lipoproteinleri dört ana sınıfları--chylomicron, çok düşük yoğunluklu lipoprotein, yüksek yoğunluklu lipoprotein, ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL)-, lipid taşıma araçları olarak ev sahibi ve fonksiyon tarafından üretilen yağ asitleri ve kolesterol teslim ve hücreleri damar üzerinden barındırabilir. LDLs trigliserid ve kolesterol esterleri de dahil olmak üzere esterleşmiş yağ asidi bol31. Daha önce son derece saflaştırılmış insan Ldıs PG sentezi için eksojen yağ asitleri uygun bir kaynak olduğunu göstermiştir, böylece FASıı inhibitörü bypass32için bir mekanizma sağlar. İnsan LDL 'Leri arındırmak, teknik olarak zorlu ve zaman alıcı olabilir, çünkü saflaştırılmış insan LDL 'lerin ticari kaynakları rutin olarak kullanmak veya büyük ölçekli bakteriyel ekranlar gerçekleştirmek için yasak şekilde pahalıdır. Bu sınırlamaları gidermek için, biz tavuk yumurta sarısı, lipoprotein parçacıkları33zengin bir kaynak ldls zenginleştirme için bir prosedür değiştirildi. İnsan LDL türevi yağ asitlerinin S. aureus32membranı içine eklenmesi için hedefsiz, yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ve tandem kütle spektrometresi başarıyla kullandık. Daha önce bildirilen yöntemlerden farklı olarak, bu yaklaşım üç büyük stafilokok fosfolipid türünün her biri için bireysel yağ asidi izomerleri ölçebilir. Oleik asit (18:1) S. aureus fosfolipidler29,30,32içine kolayca dahil tüm ev sahibi lipoprotein parçacıkları içinde mevcut doymamış bir yağ asidi. S. aureus oleik asit sentezi29yeteneğine sahip değildir; Bu nedenle, fosfolipid-Incorporated oleik asit miktarı stafilokok membran içinde Host lipoprotein türetilmiş yağ asitleri varlığı kurar29. Bu fosfolipid türler, burada açıklanan State-of-the-art kitle spektrometresi yöntemi ile tespit edilebilir, bir yağ asidi kaynağının varlığında S. aureus küllik eşsiz çözünürlüğü sunan büyük olasılıkla enfeksiyon sırasında karşılaşır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: tavuk yumurtası sarısı gelen LDL partiküllerin zenginleştirme için aşağıdaki protokol Moussa ve al. 200233.

1. LDL parçacıklarının zenginleşmesi için tavuk yumurtası sarısı hazırlanması

  1. 70% etanol çözeltisi ile kabukları yıkayarak iki büyük tavuk yumurtası sanitize ve kuru hava sağlar.
  2. % 70 etanol çözeltisi kullanarak yumurta ayırıcı sanitize ve kuru hava sağlar. Yumurta ayırıcı orta ölçekli bir Beaker dudak üzerine takın.
  3. Her yumurtayı tek başına yumurta ayırıcı içine çatlak ve albümin Beaker içine akmasına izin. Bozulmamış yumurta sarısı ayırıcı tarafından korunacaktır.
  4. Kalıntı Albumen kaldırmak için 30 mL steril fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yumurta sarısı iki kez yıkayın.
  5. Yumurta sarısı hafifçe filtre kağıdı üzerine yerleştirin.
  6. Vitellus membranı steril bir pipet ucu ile delin ve membran içeriğini steril 50 ml konik Santrifüjlü tüpüne boşaltın. Membranı ve filtre kağıdını atın.

2. tavuk yumurtası sarısı gelen LDL içeren plazma fraksiyonlama

  1. Yaklaşık iki hacim ekleyin 0,17 M NaCl pH 7,0 için yumurta sarısı ve karıştırma şiddetle. Daha sonra 60 dk için 4 °C ' de bu çözümü karıştırın.
  2. Yumurta sarısı seyreltme 10 °C de 10.000 x g 45 dk. plazma fraksiyonu (supernatant) granüler fraksiyondan (Pelet) steril bir 50 ml konik tüpüne çıkarın.
  3. 2,2 adımı yineleyin.

3. LDL partiküllerinin plazma yalıtımı

  1. Plazma fraksiyonu 60 dk için 4 °C ' de% 40 amonyum sülfat (w/v) ile karıştırın.
  2. 8,7 için 420 mM NaOH çözeltisi ile plazma fraksiyonu pH ayarlayın.
  3. Yumurta sarısı seyreltmesini 4 °c ' de 10.000 x g 'de 45 dakika süreyle santrifüjün. üst yarı sert sarı kesir 7 kDa gözenek boyutu Dializ boru içine çıkarın. Şişmesine izin vermek için tüpte Oda sağlayın.
  4. Dialyze gece 4 °c içinde 3 L ultra saf su amonyum sülfat kaldırmak için. Hafifçe karıştırın Bar kullanarak su karıştırır.
  5. Transfer Medil çözeltisi steril 50 ml konik Santrifüjlü tüp içine.
  6. Solüsyonu 4 °c ' de 10.000 x g 'de 45 dakika süreyle santrifüjle çıkarın. üst yarı sert sarı fraksiyonu steril bir tüpe ve 4 °c ' de saklamak için dikkatle kaldırın.

4. yağ asitleri kaynağı olarak tavuk Ldıs değerlendirmesi

  1. Subculture S. aureus hücreleri 5 ml yağ asidi-ücretsiz% 1 Tripton suyu ve gece 37 °c ' de sallama (225 rpm) ile inkübe edilir. Yağ asidi auxotrophs için, yağ asitleri kaynağı ile kültürler ek.
  2. % 1 Tripton suyu içinde 0,1 600 Nm (OD600) bir optik yoğunluklu (OD) bir gece kültürlerini seyreltmeli. Pipet 50, hücre süspansiyonunun her bir yuvarlak alt 96-kuyu plakasının her bir kuyunun içine μL.
    Not: yağ asidi auxotrophs ile çalışırken, tryptone suyu ve pelletini iki hacim içinde gece kültürlerini yıkayın 5 ml Tripton suyu kültür od belirlenmeden önce yağ asitleri ile sınırlamak için.
  3. Tedavi edilmeyen kontroller içeren kuyular için, iyi başına% 1 tryptone suyu 50 μL ekleyin.
  4. Deneysel hücre süspansiyonları içeren kuyular için,% 10 yumurta sarısı türevi LDL, 2 μM Triclosan veya% 10 yumurta sarısı türevi LDL ve 2 μM Triclosan karışımı ile% 1 Tripton suyu 50 μL ekleyin.
    Not: Bu noktada, her iyi 100 μL içerir ve yumurta sarısı türevi LDL ve Triklosan son konsantrasyonu sırasıyla 5% ve 1 μM olacaktır.
  5. Ölçüm OD600 zaman içinde, 37 °c ' de ayarlanan bir Mikroplaka okuyucuyu kullanarak sürekli, doğrusal sallayarak büyümeyi izlemek için.

5. membran lipid analizi için S. aureus 'un ldıs ile inkübasyon.

  1. 5 mL yağ asidi-ücretsiz% 1 Tripton suyu içine izole koloniye kültür ve 37 °C ' de sallama (225 rpm).
  2. Dilute gece kültürler 1:100 steril bir 250 mL 1% Tripton suyu ile 50 mL içeren şaşkın Flask içine. 37 °C ' de sallama aşamasında (yaklaşık 4 saat) giriş aşamasına kadar inküye yapın.
  3. Transfer 25 mL kültür steril 50 mL santrifüj tüp ve Pelet hücreleri. Süpernatant kaldırmak ve% 1 Tripton suyu 750 μL içinde hücre Pelet pelletini.
  4. Hücre süspansiyonunun resuspended hücreleri ve kısım 300 μL 'yi steril 1,5 ml santrifüj tüpüne birleştirin.
  5. İstenen son konsantrasyona Ldıs ekleyin ve 37 °C ' de 4 saat boyunca sallayarak (225 rpm)
  6. 2 dakika süreyle 16.000 x g 'de 4 °c ' de kültürler Santrifüjü ve iki adet steril PBS hücre Pelet yıkayın sonra tekrar.
  7. Her ıslak hücre Pelet ağırlığı kaydedin. Kuru buzda veya sıvı nitrojendeki hücre pelalini,-80 °C ' de saklayın veya doğrudan Bölüm 6 ' ya geçin.

6. S. aureus membran lipidlerinin çıkarılması

  1. Dondurulmuş S. aureus hücre peletleri kuru buzda yerleştirin. Her hücre Pellet üstüne 0,5 mm Zirkonyum oksit boncuk ekleyin, yaklaşık hücre Pellet hacmine eşit boncuk hacmi kullanarak.
    Not: lipid ekstraksiyon bu yönteme bir alternatif olarak, araştırmacılar bakteriyel hücrelerden34için titiz lipidler için Iyi kurulan Bligh ve Dyer veya Folch yöntemlerini kullanabilirsiniz.
  2. 75% metanol (HPLC Grade) 740 μL 'yi doğrudan hücre pelletine-80 °C ' ye soğutulmuş şekilde ekleyin.
  3. Dahili standart olarak 1 mg hücre başına 2 μL 50 μM dimyristoyl Fosfatidilkolin (metanol içinde hazırlanmış) ekleyin. Test tüpünü kapatın ve her bir numuneyi içeren 1,5 mL Santrifüjü tüpleri Bullet Blender doku homogenizer içinde kullanılabilir bir bağlantı noktasına yerleştirin. Düşük hızda örnekleri homojenize, ayar 2-3, 3 dakika.
  4. Numuneleri homojenlik için görsel olarak inceleyin. Hücrelerin kümeleri görünür ise, 2 dk artışlarla Bullet Blender homojenizasyon devam edin.
  5. Bullet Blender örnekleri çıkarın ve kimyasal duman kaputu transfer.
  6. Her numune tüpüne 270 μL kloroform ekleyin. Numuneleri 30 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde Vortex.
    DIKKAT: kloroform olası bir kanserojendir.
  7. Numuneleri en az 2.000 x g'de 30 dakikaya kadar olan bir tezgah santrifüjinde santrifüjün. Uyumlu santrifüj tüpleri ile daha hızlı kullanılabilir ve santrifüjleme süresi 10 dakikaya kısalabilir.
  8. Bir kimyasal duman kaputu içinde, monohasik süpernatant toplamak ve yeni bir test tüpü transfer, dikkatle ekstraksiyon tüp altındaki protein Pelet kaçınarak.
  9. Ekleme 740 μL 75% metanol (HPLC Grade) ve 270 μL kloroform protein Pellet, ve yeniden her örnek olarak açıklandığı gibi ayıklamak 6.6-6.8 yukarıda. Her örnek için daha önce toplanan süpernatant ile ikinci ekstraksiyon süpernatant birleştirin.
  10. Ekstraksiyon çözücüleri nitrojen veya Argon gibi inert gaz akışı altında veya santrifüj konsantratörü (malzeme tablosu) kullanarak vakum altında buharlaştırıcı.
  11. 1,0 mL sulu 10 mM Amonyum Bikarbonat çözeltisi ile üç kez kurutulur ve 6,10 adımda olduğu gibi numuneleri yeniden kurutun.
  12. Kuru lipid özleri isopropanol gibi uygun bir polar olmayan çözücüde yeniden resuspend. 5,7 adımda belirlenen 20 μl başına 1 mg taze hücre ağırlığı kullanılarak pelletini örnekleri alternatif olarak, hücre Pelet ağırlığı bilinmiyorsa, 200 μL izopropanol içinde örnekleri pelletini ve Bölüm 7 ' ye geçin.

7. yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi kullanılarak S. aureus lipid profillerinin Analizi

  1. Tam bir lipid analizi yapmadan önce, deneysel gruptan (s) temsili test örneklerini seçin ve toplam lipid konsantrasyonunun doğrusal olarak düşeceği örnek seyreltme aralıklarını belirlemek için bir dizi numune seyreltme faktörü üzerinden bunları analiz edin daha önce açıklandığı gibi kitle spektrometresi için dedektör yanıtı aralığı35.
  2. Her örnek lipid ekstresinin plakaya lipid analizine tabi olmak için buharlaştırıcı, inert gaz veya vakum altında bir Santrifüjü konsantratörde (malzeme tablosu) altında plakaya kurutmak.
  3. Sıvı kromatografi – kütle spektrometresi (LC-MS) dereceli isopropanol: metanol (2:1, v:v) ile 20 mM amonyum format içeren her bir kurutulmuş lipid ekstresi, 7,1 adımda belirlenen optimal bir örnek seyreltme faktörüne eşdeğer birimler kullanarak yeniden resuspend.
  4. Hedeflenen olmayan bir lipid analizi için numuneler, akış enjeksiyonu veya ekstrelerin doğrudan infüzyon35,36ile Kromatografi kullanmadan yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi platformuna doğrudan sunulabilir. 7,3 adımda hazırlanan seyreltilmiş lipid ekstrelerini uygun bir Otomatik Örnekleyici şişe veya 96-Well plakaya aktarın.
  5. Akış enjeksiyonu bazlı analiz için, Otomatik Örnekleyici şişeleri, elektronik akışa sahip bir HPLC (malzeme tablosu) gibi kapiller/düşük akış uygulamaları yapabilen bir HPLC sisteminin sıcaklık kontrollü (15 °c) Otomatik Örnekleyici içine yerleştirin Ölçüleme ve akış izleme sistemi.
  6. HPLC solvent rezervuarları LC-MS Grade isopropanol ile doldurun: metanol (2:1, v:v), 20 mM amonyum Format içerir.
  7. Agilent Chemstation yazılımını kullanarak, HPLC Otomatik Örnekleyici programını 5 μL numune enjeksiyonunu gerçekleştirin. Enstrüman menüsünden enjektör ayarla'Yı seçin ve enjeksiyon hacmi alanına 5,0 yazın. Birimler microliters olarak verilir. HPLC 'nin en az 2:1 (v:v) Isopropanol: 20 mM amonyum format içeren metanol başına 1 μL 'de izokrat akışına ayarlandığından emin olun.
  8. Chemstation Instrument menüsünden pompa ayarla... öğesini seçin ve ardından mikro akış modu geçiş anahtarını seçin.
  9. Zamanlama alanlarına girin: zaman 0,00, 100% B, Flow 1,0. ENTER tuşuna basın ve saat 10,0, 100% B, Flow 1,0girerek zamanlama ikinci bir satır oluşturun. Set up pompa menüsünün altındaki ok düğmesini seçin. Bu ayarlar, dakikada 1,0 μL akış hızında 10 analiz çalıştırmasını sağlayacaktır.
  10. Düşük akışlı (34 G) metal iğne ile donatılmış bir elektrosprey iyonizasyon kaynağı kullanarak HPLC transfer hattından kütle spektrometresi ile birlikte kurtulabilirsiniz.
  11. Thermo Tune Plus enstrüman kontrol yazılımını kullanarak Kurulum menüsünü SEÇIP ısıtmalı ESI kaynağı'nı seçin. Bu değerleri diyalog kutusunun ilgili alanlarına yazarak, iyonlaştırma voltajını 4000 V ve kılıf gazına 5 (rasgele üniteler) olarak ayarlayın. Benzer şekilde, kapiller Temp 150 °C ve S-lens% 50 için ayarlayın.
    Not: Bu değerlerin her kütle spektrometresi platformu için optimize edilmesi gerekir.
  12. Hedefsiz lipid analizi için dedektör olarak yüksek çözünürlüklü/doğru kütle MS platformu (malzeme tablosu) kullanın.
  13. Thermo Tune Plus yazılımını kullanarak tarama tanımla düğmesini tıklayın ve Analyzer menüsünde FTMs'i seçin. Kütle aralığı alanını normal olarak ayarlayın ve çözünürlük alanında 100.000seçin. Tarama türünün tamolarak ayarlandığından emin olun. Tarama aralıkları menüsünün altında, ilk kütle (m/z) alanına 200 girin ve son kütle (m/z) alanına 2000 girin.
  14. En bol S. aureus lipidleri tespit etmek için negatif polariteden yararlandığından emin olun.
  15. Lipid yapılarını ve yağlı asit bileşenlerinin onaylanması için spektral bir bölgede tüm lipid iyonlarının iyon haritalama tandem kütle spektrometresi (MS/MS) parçalanma kullanarak örnek analizini tekrarlayın. Alternatif olarak, Bölüm 8 ' de ilk lipid tanımlayıcısı atantıktan sonra seçilen lipid iyonları MS/MS analizine tabi tutulabilir.

8. endojen S. aureus ve EKSOJEN LDL türevi lipidleri tanımlamak için veritabanı arama

  1. Daha fazla gözlenen kütle doğruluğu rafine Thermo Xcalibur yazılımı kullanın. Xcalibur 'da, Araçlar menüsünün altında, çevrimdışı yeniden kalibreetme seçeneğini belirleyin. Çevrimdışı yeniden kalibre etme penceresi açıldığında, Dosya menüsü seçerek ve Açık seçeneğini belirleyerek yeniden kalibre edilecek kütle spektrumlu dosyasını yükleyin.
  2. İlgi dosyasını açın, MS çalıştırmak için toplam iyon kromatogram görüntülemek için görünüm penceresinin üst satırında satır ekle düğmesini değiştirin. Toplam iyon kromatogram içinde gözlenen sinyal zirvesinde bir kenar üzerinde bilgisayar fareyi sol tıklayarak ve zirveye en geniş kısmı boyunca fareyi sürükleyerek alınan MS sinyalleri ortalama.
  3. Tarama filtresi menüsünün altında, tam tarama MS verilerine karşılık gelen filtreyi seçin. Yük ref... düğmesini seçip referans dosyasını seçerek en az üç bilinen S. aureus endojen lipidlerinin teorik monoizotopik kitlelerini içeren bir referans dosyası yükleyin. Her lipid monoizotopik kütlenin yanındaki kullanım kutusunu işaretleyin.
  4. Görüntüleme penceresinin altındaki Ara düğmesini tıklatın. Daha önce yapılan toplam iyon kromatogram içinde sinyal zirvesinde MS sinyali yeniden ortalama.
  5. Görüntüleme penceresinin alt kısmına yakın olan Dönüştür düğmesini tıklatın. Dönüştür iletişim kutusu açıldığında, Tamam'ı tıklatın. Veri, Thermo Scientific dışındaki satıcılardan gelen kütle spektrometresi platformlarda toplanırsa bu adımı atlayın.
  6. Xcalibur yazılımını kullanarak, bir Excel dosyasının çalışma sayfalarını ayırmak için her tedavi edilmemiş veya LDL tedavi edilen örnek için yeniden kalibre edilmiş doğru kitle tepe listelerini dışa aktarın. Qual tarayıcı simgesini seçin. Dosya menüsünü seçip açık... seçeneğini belirleyerek yeniden kalibre edilen ilgi alanı dosyasını açın.
  7. 8,2 adımda açıklandığı gibi toplam iyon kromatogram içinde geniş tepe genelinde sinyal ortalama.
  8. Kütle spektrumlu görüntüleme penceresindeki raptiye simgesine sağ tıklayın ve Görünüm | Spektrum listesi. Aynı menüden görüntüleme seçenekleri 'ni ve ardından görüntü menüsündeki Tüm zirveler geçiş kutusunu seçin. İzleme penceresini kapatmak için Tamam düğmesini tıklatın.
  9. Kütle spektrumlu görüntüleme penceresinde tekrar raptiye simgesine sağ tıklayın ve ihracat | Pano (tam kütle). Dışa aktarılan veri hücresini ilk çalışma sayfasının a1 'i yeni bir Excel elektronik tablosuna yapıştırın.
  10. Dışa aktarılan veri dosyasındaki ilk 8 satır metnini, Excel elektronik tablosunun a1 hücresinin kitle spektrumundan ilk kitle veri noktasını içerdiğinden silin. Her dışa aktarılan en yüksek liste için Excel dosyasındaki yeni bir çalışma sayfasını kullanarak, her yeniden kalibre edilmiş MS dosyasının dışa aktarmayı yineleyin.
  11. Excel için eklenti37 lipid kütle spektral analizi (lımsa) yazılımı kullanarak, bilinen S. aureus lipid türlerinin moleküler formülleri Hewelt-belka ve ark. 201438tarafından açıklandığı gibi içeren bir veritabanı inşa LDL 'de varsayımsal olarak mevcut olabilecek lipid türlerini temsil eden formüller.
    Not: Ayrıca, önemli LDL yağ asitleri, oleik (18:1) ve linoleik (18:2) yağ asitleri gibi dahil olan varsayımsal bakteriyel lipidler için veritabanında potansiyel moleküler formüller eklemek için bakım alınmalıdır32.
  12. Veritabanını oluşturmak için boş bir Excel elektronik tablosu açın. İlk çalışma sayfasının a1 hücresinde, veri tabanına eklenecek olan lipid türlerinin teorik/hesaplanan monoizotopik kütlesini, kütle spektrometresini gözlemlenen iyonik durumda lipid türlerinin kütlesine karşılık gelen yazın. B1 hücresinde, örneğin PG (34:0) gibi lipid türleri için bir ad girin.
  13. C1 hücresinde, kütle spektrometresi gözlenen lipid iyonik durumuna karşılık gelen lipid türleri için moleküler formülü girin. D1 hücresinde, kütle spektrometresi gözlenen lipid türünün şarj girin. Aranabilir veritabanında girilen sonraki lipid türlerinin yeni girişini başlatmak için a2 hücresine gidin.
  14. 8,12 ve 8,13 tüm istenen lipid türleri veritabanına girilinceye kadar adımları yineleyin. Veritabanı dosyasını kaydedin ve Excel 'de açık bırakın.
  15. Excel 'de, Eklentiler menüsünü seçin. LıMSA yazılımını başlatmak için Limsa 'yı seçin. Ana menüden bileşik kitaplık... düğmesini tıklatın. Görüntülenen yeni pencerede, bileşikler al'ı tıklatın. Bu, bileşik veritabanını LıMSA yazılımı tarafından kullanılmak üzere yükleyecektir.
  16. 35tedarikçinin talimatlarına göre Excel için LıMSA yazılım eklentisini kullanarak tüm MS Spectra 'da doğru kütle bazlı lipid tanımlayıcısı gerçekleştirin. LıMSA ana menüsünden spektrum türü menüsünün altındaki tepe listesi 'ni seçin. MS verilerinin alındığını gösteren polarite ile karşılık vermek için pozitif mod veya negatif mod 'u seçin.
  17. Peak fwhm (m/z) penceresinde, en yüksek bulgu için istenen kütle arama penceresini girin. 0.003-0.005 m/z kütle tolerans arama penceresi yüksek çözünürlüklü/doğru kütle MS verileri için önerilir.
  18. Duyarlılık penceresinde, istenen taban çizgisi kesmenizi (örneğin,% 0,01 bağıl bolluk) girin. IZotope düzeltme menüsünde, en yüksek liste verileriyle kullanılabilecek Doğrusal sığdırma veya çıkarma algoritmaları 'nı seçin.
  19. Kullanılabilir bileşikler penceresi içinde istenilen lipid türlerini tıklayarak veritabanı arama dahil etmek için lipid bileşikleri vurgulayın. Vurgulanan lipid türlerini arama grubuna eklemek için Ekle düğmesini tıklayın.
  20. Eklenen bileşiklere tıklayarak iç standartları tanımlayın, sonra da seçilen iç standardın ilgili konsantrasyonuna konsantrasyon penceresini değiştirerek.
  21. Her bir katma lipid türünü ve iç standardı seçerek ve sınıf alanında bir sınıf adı (PG veya lipid gibi) yazarak aynı sınıf adına ait olan iç standart ve seçilmiş lipid türlerinin niceklendirilecek olduğundan emin olun.
  22. Gelecekteki kullanım için aranabilir lipid bileşikleri grubunu kaydetmek için gruplar menüsünün yanındaki Kaydet düğmesini tıklatın.
  23. Tüm dışa aktarılan MS tepe listelerini içeren Excel dosyasının ilk S. aureus MS çalışmasına karşılık gelen sayfaya açık olduğundan emin olun ve ardından LıMSA ana menüsünden arama düğmesini tıklatın.
    Not: LıMSA veritabanı aramasının çıktısı, 8.12-8.13 adımlarında oluşturulan veritabanında bulunan lipidlere eşleşen kitlesel spektral özelliklerin bir listesini, hem de bir veya daha fazla seçilen normalleştirme aşağıdaki her eşleşen özellik için konsantrasyonları içerir iç standartlar.
  24. Kullanmak Xcalibur yazılım için doğru kütle MS/MS spektrumları incelemek için m/z her tanımlanan lipid moleküler türler mevcut yağ asit bileşenlerini onaylamak için ilgi lipid iyonlarını karşılık gelen. Qual tarayıcı simgesini seçin. Dosya açılır menüsünü seçip açık... SEÇENEĞINI belirleyerek ılgı alanı MS/MS dosyasını açın.
  25. Kütle spektrumlu görüntüleme penceresindeki raptiye simgesine sağ farenin tıklanması ve menüden aralıkları seçmek suretiyle bir lipid m/z 'nin MS/MS analizine karşılık gelen tarama filtresini seçin. Görüntülenen yeni pencerede, taramayı seçmek için filtre menüsünü seçin.
  26. 8,2 adımda açıklandığı gibi toplam iyon kromatogram boyunca sinyal ortalama. Uygun istatistiksel testler gerçekleştirmek için MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) yazılımını kullanın. Tedavi edilmemiş ve LDL tedavi edilen koşullarda normalleştirilmiş lipid abundaları karşılaştırarak S. aureus lipid bileşiminde istatistiksel olarak anlamlı fark değerlendir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tavuk yumurtası sarısı tarafından LDL zenginleştirme Protokolü Şekil 1' de gösterilmiştir. Bu işlem, tüm yumurta sarısı ile tuz seyreltilerek başlar ve yumurta sarısı katıları ayrıştırmadan veya plazma kesir Ldıs içeren granül olarak adlandırılan ayıran (Şekil 1)33. Plazma fraksiyonu LDL içeriği daha fazla yağış ile zenginleştirilmiştir ~ 30-40 kDa β-livetins (Şekil 2)33. 140, 80, 65, 60 ve 15 kDa protein bandlarının varlığı ldls apoproteinleri ile ilişkilendirir (Şekil 2)33,39. Triklosan ile tedavi yağ asidi-ücretsiz medya32 S. aureus büyümesini inhibe. Daha önce, eksojen yağlı asit kaynakları gibi yumurta sarısı plazma veya saflaştırılmış insan Ldıs ile tamamlayıcı kültürlerin Triclosan kaynaklı büyüme inhibisyonu üstesinden geldiğini göstermiştir (Şekil 3)32. Benzer şekilde, zenginleştirilmiş yumurta sarısı LDL ile Triclosan tedavi edilen kültürlerin takviyesi büyüme geri yükler (Şekil 3). Dahası, yumurta sarısı LDL 'lerin ilavesi daha önce karakterize edilen S. aureus yağ asidi eotroph büyümesini destekler (şekil 4)32. S. aureus 'un eksojen yağ asitleri ile birleştirilmesinin en doğru Kütle Spektrometrisi bazlı profillemesi için, büyüme ortamında serbest yağ asitlerinin varlığını sınırlamak önemlidir. Ücretsiz yağ asidi bileşimi 1% Tripton suyu ve tavuk yumurta sarısı LDLs Tripton suyu içinde seyreltilmiş, akış enjeksiyonu yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi istihdam ve az miktarda serbest yağ asidi bulundu (Şekil 5). Tavuk yumurtası sarısı LDL 'larına maruz kaldıktan sonra S. aureus fosfolipidlerin yağ asidi bileşiminin belirlenmesi için aynı hedefsiz kütle spektrometresi analizi yapıldı. ortogonal kısmi en az kareler ayrımcılık ANALIZI (opls-DA)40 bol S. aureus membran fosfolipidler, OPLS-da skorlarında gösterildiği gibi, tedavi edilmemiş ve tavuk yumurtası sarısı LDL-tedavi koşulları net sınıf ayrımı göstermiştir (Şekil 6a). OPLS-DA yükleri Arsa PLS-DA modelinde önemli değişkenler olarak sayısız fosfatidilgliserin türleri göstermiştir. Özellikle, doymamış yağ asitleri içeren fosfolipitler, eksojen yağ asidi birleşmesi bir moleküler Marker, Ldıs yokluğunda inküte hücrelere kıyasla LDL tamamlayıcı kültürlerde zenginleştirilmiştir (Şekil 6B). Önceki çalışmalar tavuk yumurta sarısı oleik asit ile doymamış yağ asitleri zengin bir kaynak olduğunu bulduk (18:1) en bol41olmak,42. Bu gözlemlerle anlaşmada, S. aureus kültürlerinin tavuk yumurtası sarısı ldıs (Şekil 6c) ile takviye edildiğinde fosfolipid sentezinde kullanılan en yaygın doymamış yağ asidi olarak oleik asit bulduk. Tablo 1 , S. aureus yumurta sarısı LDL varlığında yetişen zaman membran fosfolipidlerin yağ asidi profillerinin değiştirildiğini göstermektedir.

Figure 1
Resim 1: santrifüjleme ve amonyak sülfat yağış kullanarak tavuk yumurtası sarısı gelen LDL zenginleştirme bir Illustration. (A) tavuk yumurtası SARıSı gelen LDL zenginleştirme için gerekli reaktifler. (B) akış ÇIZELGESI, LDL zenginleştirme sürecinin önemli adımlarını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: LDL için zenginleştirme işleminden önce ve sonra tavuk yumurtası sarısı protein profili. Protein endoglikozidazları RIPA tampon kullanılarak hazırlanmıştır. Protein lysate (15 μg)% 8 akrilamid SDS-PAGE jeli içine yüklendi. Jeller bir gecede Bio Rad protein reakajıyla lekelendiler. LDL ilişkili proteinlerin kDa moleküler ağırlıkları görüntünün sağ tarafında gösterilir. M: protein Marker, Y: tavuk yumurtası sarısı, ve LDL: tavuk yumurtası sarısı LDL zenginleştirme Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: yumurta sarısı türevi Ldıs, S. aureus ' ı Triclosan KAYNAKLı fasıı inhibisyonu 'ndan korur. S. aureus 'un büyümesi, aşağıdaki koşullarda od600 % 1 Tripton suyu ölçümü yoluyla zaman içinde izleniyor: 1% Tripton suyu (TB), 1 μm Triklosan (TCS),% 1 yumurta sarısı plazma (TCS + EYP),% 5 yumurta sarısı LDL (LDL), veya 1 μm olan 1 μm Triklosan % 5 yumurta sarısı LDL (TCS + LDL) ile Triklosan. Üç bağımsız deneyden gelen ortalama gösterilir. Hata çubukları ortalama standart sapmasını temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: S 'nin büyümesi . aureus yağlı asit auxotroph yumurta sarısı TÜREVI LDL tarafından desteklenir. Bir yağlı asit auxotroph büyüme 1% Tripton suyu (TB) ile veya olmadan 5% yumurta SARıSı LDL (LDL) TAKVIYESI OD600ölçümü ile zaman içinde izleniyor. Üç bağımsız deneyden gelen ortalama gösterilir. Hata çubukları ortalama standart sapmasını temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: serbest yağ asidi içeriği% 1 Tripton suyu veya tavuk yumurtası SARıSı LDL olarak ölçülür. Serbest yağ asitleri, akış enjeksiyonu yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ve tandem kütle spektrometresi ile tespit edildi. Protein mg başına iyonların normalleştirilmiş sayısı% 1 Tripton suyu ve% 1 Tripton suyu ile% 5 tavuk yumurtası sarısı LDLs ile tamamlayıcı olarak belirlendi. bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 6
Şekil 6: tavuk yumurtası sarısı düşük yoğunluklu lipoproteinler S. aureus fosfatidilgliserin sentezinde eksojen yağ asitleri rezervuar vardır. (A) yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi kullanılarak tanımlanan tavuk YUMURTASı sarısı LDL tedavi edilen ve işlenmemiş S. aureus membran fosfolipidlerin ortogonal kısmi en az kareler ayrımcılık analizinin skorları. (B) doymamış fosfatidilgliserin yüzdesi (UPG) S. aureus toplam membran pg ile KARŞıLAŞTıRıLDıĞıNDA yokluğunda yetiştirilen (WT) veya VARLıĞı (WT + LDL) tavuk yumurta sarısı ldıs. (C) DOYMAMıŞ yağ ASIDI (Ufa) membran pg profili S. aureus olmadan YETIŞTIRILEN (WT) veya (WT + LDL) tavuk yumurtası sarısı ldıs toplam pg yağ asitleri miktarının yüzdesi olarak grafik. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

WT tryptone suyu içinde kültürlü WT, ldıs ile tamamlayıcı tryptone suyu kültürlü
Phospfatidyl gliserol (TC: TDB)a Normalleştirilmiş iyon bolluk/mg protein Sd Yağ asitleric Normalleştirilmiş iyon bolluk/mg protein Sd Yağ asitleric
24:0 0 0 (D ) 0,052031116 0,02677 Nd
26:0 0 0 Nd 0,009539117 0,00362 Nd
28:0 0,127937113 0,04528 15:0_13:0 0,167643281 0,02392 15:0_13:0
28:1 0,006765427 0,00157 Nd 0,002776821 0,00372 15:0_13:1
30:0 8,680180809 2,68375 15:0_15:0 14,04873592 2,4531 15:0_15:0
30:1 0 0 Nd 0,010152161 0,00449 15:1_15:0, 13:1_17:0
31:0 4,150511117 1,31658 16:0_15:0, 14:0_17:0 10,17590926 1,88431 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0
31:1 0,016156004 0,01216 13:1_15:0, 12:1_19:0 0,473478683 0,09063 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0
32:0 29,29259262 8,82993 15:0_17:0 48,24342037 8,95664 15:0_17:0, 16:0_16:0
32:1 0,02074815 0,00941 Nd 0,307044942 0,07305 18:1_14:0, 16:1_16:0
33:0 9,000460122 2,78194 18:0_15:0, 16:0_17:0 15,4531776 2,98171 18:0_15:0, 16:0_17:0
33:1 0,162934812 0,04796 Nd 2,921832928 0,30851 18:1_15:0
33:2 0 0 Nd 0,167492702 0,03211 18:1_15:1, 18:2_15:0
34:0 12,3064043 3,70242 19:0_15:0, 17:0_17:0 18,40129157 3,21385 19:0_15:0, 17:0_17:0
34:1 0 0 Nd 1,423605186 0,20066 18:1_16:0
34:2 0,000470922 0,00082 Nd 0,156133734 0,03929 18:2_16:0
35:0 5,727462455 1,74583 20:0_15:0, 18:0_17:0 7,771538992 1,28515 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0
35:1 0,17337586 0,05727 20:1_15:0 0,772202525 0,08526 20:1_15:0, 18:1_17:0
35:2 0 0 Nd 0,038758757 0,01481 18:2_17:0, 18:1_17:1
36:0 0,671004303 0,2116 21:0_15:0, 19:0_17:0 0,967295024 0,2572 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0
36:2 0 0 Nd 0,495485065 0,04473 18:1_18:1, 18:2_18:0
36:3 0 0 Nd 0,059268233 0,02291 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1
37:0 0,060466411 0,01961 22:0_15:0, 20:0_17:0 0,114526894 0,01852 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0
38:2 0 0 Nd 0,079469521 0,02872 18:2_20:0, 16:1_20:1
bir [M-H]- ions olarak algılandı. TC, toplam zincir uzunluğu; TDB, toplam çift bağ sayısı.
b ND, belirlenmemiş
c Yağ asitleri izomer bolluk sırasına kadar listelenir. Yağ asidi gösterimler arasındaki bir alt çizgi, her yağ asidin ya SN1 veya SN2 pozisyonunda bulunacağını gösterir, ancak tandem kütle spektrometresi tek başına lipid türlerinin konumsal izomerlerin karışımı olarak mevcut olma olasılığını ortaya çıkaramaz.

Tablo 1: S. aureus 'un yağlı asit profili, tavuk yumurtası sarısı ldıs 'in varlığında kültürlü. Biz S. aureus PG. s. aureus yağ asidi profilini belirlemek için yüksek çözünürlüklü/doğru MS ve MS/MS kullanarak tarafsız bir lipidomic analiz kullanılan tavuk yumurta sarısı ldıs varlığı veya yokluğunda inkübe EDILDI, ve bu PG profili hücreler,% 1 Tripton suyunda kültürlü hücrelerle karşılaştırıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

S. aureus membran fosfolipidlerin içine eksojen yağ asitleri birleştirir27,32,43. Eksojen yağ asitleri kullanarak fosfolipid sentezi fasii inhibisyonu atlar ama aynı zamanda membranın Biyofizik özelliklerini değiştirir27,32,44. Gram-pozitif patojenlerin fosfolipidlerine eksojen yağ asitleri eklenmesi iyi belgelenmiş olmakla beraber, ana yağ asidi rezervuarları ve üç büyük stafilokok fosfolipid türünün her biri için yapısal değişikliklerin kimliklerinde boşluklar kalır eksojen yağ asidi birleştirilmesine neden olur. Burada, biz için istihdam edilebilir protokolleri tarif: i) tavuk yumurta sarısı, yağ asitleri kaynağı, ii) eksojen yağ asitleri S. aureusbüyümesi üzerindeki etkilerini belirlemek ve iii) için tarafsız bir lipidomic ANALIZI kullanmak LDL parçacıklar zenginleştirmek S. aureusmembran fosfolipidlere eksojen yağ asidi birleşmesini izleme. Bu çalışmada sağlanan gelişmiş kütle spektrometresi yöntemi, eksojen yağ asitlerinin varlığında yetiştirilen S. aureus membran bileşiminin olağanüstü bir perspektifi sunar.

Birkaç gram-pozitif patojenler membran sentezi için eksojen yağ asitleri kullanır ve s. aureus ile birlikte, enfeksiyon sırasında eksojen yağ asitleri olası kaynakları kötü anlaşılır27,43. Burada açıklanan büyüme analizi, her bir patojenin büyüme kinetiği dikkate alınırsa, lipoproteinler varlığını diğer gram-pozitif patojenlerin proliferasyonu değerlendirmek için değiştirilebilir. Ayrıca, arka plan optik yoğunlukta yağ asidi kaynağının potansiyel etkileri kontrol edilse de, eksojen yağ asitlerinin diğer karmaşık konak kaynakları bu protokol kullanılarak test edilebilir. Dahası, bakteriyel lipidlerin analizi için açıklanan kütle spektrometresi yöntemi, neredeyse her bakteri türünden lipidome değerlendirmeyi sağlamak için yeterince esnektir. Lipid doğru kütle verileri ' tam tarama ' MS modunda toplanır olarak, spesifik lipidlerin bilinen parçalanma desenlerine dayalı hedeflenen analitik yöntemlerden farklı olarak, ilgi bakteriyel türlerin lipid içeriğinin küçük bir priori bilgisi gereklidir 32 , 45 , 46. ' hedeflenmemiş ' analitik iş akışında, akış veri analizinin ve özellikle de lipid veritabanına karşı doğru kitlesel zirve listelerinin aranması, yüksek derecede uyarlanabilir ve geniş bir bakteri yelpazesine destek olabilecek önemli adımlardan biridir. türleri ve deneysel tedaviler. Lipid türlerinin tanımlanmasını sağlamak için aranabilir bir veritabanı oluştururken veya seçerken, araştırmacılar çok çeşitli varsayımsal endojen lipid türlerini düşünmelidir, ayrıca yeni veya öngörülemeyen eksojen lipidlerin saptanmasına izin verirken, elde edilen deneysel tedavi.

Bu çalışmada, ultra yüksek çözünürlüklü/doğru kütle yetenekleri nedeniyle yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi (malzeme tablosu) kullanıldı. Alternatif olarak, diğer birçok yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi platformları, hedefsiz lipid analizini gerçekleştirmek için başarıyla uygulanabilir. Benzer şekilde, doğrudan infüzyon, desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon veya Matris Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyon dahil olmak üzere örnek giriş yöntemlerinin geniş bir yelpazede, lipid özler doğrudan analiz sağlayan, hızlı bir şekilde toplamak için kullanılabilir hedeflenmemiş lipidomic veri. Numune giriş öncesinde sıvı kromatografi dahil, yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ile birlikte kullanıldığında, tam tarama MS veri toplama sırasında bazı isobarik lipid türlerinin çözünürlüğüne izin verebilir. Bununla birlikte, kromatografinin eklenmesi, deneysel tedavilerin ardından mevcut olabilecek beklenmeyen veya yeni lipid türlerinin ayrılması ve algılanmasını sağlamak için kromatografik seçim yönteminin yeterince çok yönlü olmasını gerektirmesini gerektirmektedir. Veri kümesinde bulunan lipidleri tanımlamak için veritabanı araması, genel olarak kullanılabilir herhangi bir aranabilir veritabanı kullanılarak gerçekleştirilebilir. LıMSA yazılımı, on binlerce varsayımsal lipid türünün Kullanıcı tanımlı veritabanlarının facile gelişimini sağlarken, yüksek çözünürlüklü/doğru kütle MS zirve listelerinden lipidleri belirlemek için çok sayıda diğer seçenek var. LIPID MAPS Konsorsiyumu (www.lipidmaps.org), Kullanıcı tanımlı kütle toleransı içinde yüksek çözünürlüklü/doğru MS üretilen tepe listelerini kullanarak varsayımsal lipidlerin hesaplamalı ve deneysel veritabanları arama araçları sağlar ve birçok yazılım satıcıları, lipidomics verilerini analiz etmek için kendi çözümlerini sunar.

Başarılı büyüme eğrisi ve eksojen yağ asidi analizi, LDL saflığı ve arka plan yağ asidi düzeylerini sınırlamak gibi çeşitli etkenlere bağlıdır. LDL içeren fraksiyonunun doğru tanımlaması çok önemlidir. Yukarıdaki protokol ve Şekil 1 , zenginleştirme işleminin her adımında korumak için doğru kesir göstermektedir. Biz% 40 amonyum sülfat (saflık ≥ 99,5%) kullanımı ile başarı vardı yağış ve β-livetins sonraki kaldırılması için. Ancak, diğerleri yumurta sarısı plazmaya eklenen amonyak sülfat saflık ve konsantrasyon önemli ölçüde bu adım47etkileyebilir bildirdi. LDL zenginleştirme içinde amonyum sülfat kontaminasyonu sınırlandırılması, bakterilerin yüksek konsantrasyonlarının büyüme48kısıtlayabilirim gibi bakteriyel asdlarında kullanılmak üzere LDL hazırlama için önemlidir. Dializ sırasında Dializ tüpünün geniş boş alanı, amonyum sülfat difüzyon ve çıkarılması için izin verilmelidir. Diyaliz sürecinin daha da optimizasyonuna gece kuluçbe sırasında ek su değişiklikleri dahil olabilir. Biz en iyi sonuçları sağlamak için bir gecede diyaliz bulduk, rağmen Moussa ve al. rapor diyaliz 6 h yeterli. Büyüme eğrilerinde hücrelerin başlangıç konsantrasyonunun denemeler arasında tutarlı tutulması önemlidir. S. aureus için, 0,05 BIR ilk od600 için seyreltilme hücreleri en tutarlı sonuçlar sağladı. Ayrıca, yüksek konsantrasyonlarda FASıı inhibitörleri bakteriyel hücreler üzerinde spesifik olmayan etkilere neden olabilir. Örneğin, 7 μM ' nin üzerindeki Triklosan konsantrasyonları S. aureus 'ta sitoplazmik membran hasarına yol açabilir, bu nedenle bu bileşiğin konsantrasyonunun bu seviye49altında kalması gereklidir. 1 μM ' lik son bir Triklosan konsantrasyonu, yeniden üretilebilen büyüme sonuçları bulduk. Bakteriyel fosfolipid sentezi için eksojen yağ asitleri olası bir kaynağını değerlendirirken, kültür ortamının yağ asidi katkısı en aza indirmek için önemlidir. Yukarıdaki olarak,% 1 triptone kültür orta S. aureus yeterli büyüme destekler ve minimal yağ asit kontaminasyonu vardır29,32.

Arka plan yağ asidi düzeylerini sınırlamak özellikle aşağı kütle spektrometresi bazlı yağ asidi profilleme için önemlidir. Diğerleri tavuk yumurtası sarısı ücretsiz yağ asitleri miktarını rapor doğal olarak düşük41 ve bizim analiz bu sonucu destekler (Şekil 5). Kuluçkerden sonra tryptone suyu ve PBS ile iyice yıkama hücrelerinin kullanılması esastır. Ayrıca, hücrelerin büyüme aşaması dikkate almak önemlidir. Biz geniş bakteriyel fosfolipid sentezini sağlamak için orta günlük faz hücrelerini seçti. Eksojen yağ asitleri diğer potansiyel kontamine kaynakları bakteriyel büyüme sonrası ortaya çıkabilir, gibi lipid ekstraksiyon adımları sırasında veya sonraki numune hazırlama kitle spektrometri Analizi öncesinde50. Numune hazırlığı herhangi bir adımda tanıtıldı eksojen yağ asitleri kitle spektrometri analizi sırasında serbest yağ asitleri olarak tespit edilebilir. Yüksek sıcaklık fırınında (en az 180 °C) bir gecede laboratuvar cam pişirme, lipid ekstraksiyon ve lipid depolama için kullanılan test tüplerinden eksojen yağ asitleri kaldırabilir. Ayrıca, plastik dahil Laboratuvar malzemeleri yağ asidi arka plan50azaltmak için metanol ile durulanır olabilir. Önceki analizlerden kalan yağ asitleri de kitle spektrometresi iç yüzeylerini kirletebilir. Serbest yağ asitleri arka plan düzeylerinin belirlenmesi için kitle spektrometresi analizi sırasında analitik boşluklar eklenmesi bu nedenle şiddetle tavsiye edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklamaları yok.

Acknowledgments

Biz bu işin el yazması ve destek kritik değerlendirme için Hammer laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. Dr Alex Horswill üniversite Colorado Okulu tıp nazik AH1263 sağladı. Dr. Chris Waters laboratuar Michigan State Üniversitesi reaktifler sağladı. Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği Grant 16, 30170026 ve başlangıç fonları Michigan State Üniversitesi tarafından sağlanan tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Biyokimya sayı 147 Staphylococcus aureus yağ asidi lipoprotein kütle spektrometresi fosfolipid yumurta sarısı lipidomics
Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delekta, P. C., Lydic, T. A.,… More

Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter