Summary
ヒトにおけるガルバニック前庭刺激は、前庭機能の改善を示す。しかし、これらの効果がどのように起こるかは不明です。ここでは、C57BL/6マウスにおける個々の中間前庭核ニューロンにおける正弦波および確率的電気ノイズを適用し、適切な刺激振幅を評価する方法について述べた。
Abstract
ガルバニック前庭刺激 (GVS) バランスまたは前庭障害を持つ個人のバランス対策を改善することが示されています。.これは、弱い信号の検出を増加させるために、低レベル/サブ閾値刺激を非線形系に適用すると定義される確率共鳴(SR)現象に起因することが提案される。しかし、SRが人間のバランスにプラスの効果を示す方法はまだ不明です。これは、個々のニューロンに対する前音および確率的ノイズの影響の最初のデモンストレーションの一つです。全細胞パッチクランプ電気生理学を用いて、C57BL/6マウスの中間前庭核(MVN)の個々のニューロンに直接正弦波および確率的ノイズを適用することができる。ここでは、副弦神経および確率的刺激がサブしきい値であることを確認するためにMVNニューロンの閾値を決定する方法を示し、これから、各タイプのノイズがMVNニューロンゲインに及ぼす影響を決定する。我々は、サブ閾値の副弦性および確率的ノイズが基底発射速度に影響を与えることなくMVN内の個々のニューロンの感度を調節できることを示す。
Introduction
前庭(またはバランス)システムは、聴覚、プロプライサティブ、身体感覚および視覚情報を統合することによって、バランス感覚を制御します。前庭系の劣化は、年齢の関数として起こることが示されており、バランスの赤字1、2をもたらすことができます。しかし、前庭系の機能を標的とする治療法は乏しい。
ガルバニック前庭刺激(GVS)は、人間3、4、5、6内のバランス対策、自律機能および他の感覚モダリティを改善することが示されている。これらの改善は、サブ閾値ノイズ7、8の適用を介して非線形系における弱い信号の検出の増加である確率共鳴(SR)現象に起因すると言われている。これらの研究は、静的9、10および動的11、12バランス、および眼カウンタロール(OCR)13などの前庭出力試験の改善を示している。しかし、これらの研究の多くは、ホワイトノイズ9、着色ノイズ13、異なる刺激周波数範囲および閾値化技術などの刺激パラメータの異なる組み合わせを使用しています。したがって、最適な刺激パラメータは未知のままであり、このプロトコルは最も効果的なパラメータの決定に役立つ。刺激パラメータに加えて、刺激の種類は、治療および実験的有効性においても重要である。上記のヒトにおける作業は電気ノイズ刺激を用いて行われ、一方、生体内動物の作業の多くは、機械的14、15または光遺伝学的16ノイズ刺激を使用している。このプロトコルは、前庭核への影響を調べるために電気ノイズを使用します。
以前は、一次前庭アフェレントを刺激するGVSの適用は、リスサル17、チンチラ18、ニワトリ胚15およびモルモット14において生体内で行われていた。しかし、これらの研究のうちの2つだけが、GVSが一次前庭アフェレント14、15のゲインに及ぼす影響を調べた。これらの実験は、前庭核に課される刺激の正確なパターンが決定できないことを意味する生体内で行われた。我々の知るうう上、中枢神経系19の個々の酵素的に解離されたニューロンに確率的ノイズを適用したのは他の1つの研究のみである。しかし、中前庭核では適切な刺激パラメータと閾値化技術を評価する実験は行われておらず、このプロトコルは前庭内の個々のニューロンに対する刺激効果をより正確に決定する。核。
ここでは、中間前庭核(MVN)の個々のニューロンに正弦波および確率的(電気)ノイズを直接適用する方法を説明し、ニューロン閾値を決定し、ゲイン/感度の変化を測定する。
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Protocol
記載されたすべての実験プロトコルは、シドニー大学動物倫理委員会によって承認されました(承認されたプロトコル番号:2018/1308)。
1. 動物
注:マウスはオーストラリアのげっ歯類センター(ARC;パース(オーストラリア)、シドニー大学の医療財団ビル動物施設で開催。
- 環境濃縮を伴う通常の12時間の光/暗いサイクルでマウスを維持します。
- すべての実験にオスとメスのC57BL/6マウス(3~5週齢)を使用します。
2. ソリューションの準備
- 29 mM NaHCO 3、11 mMグルコース、120mM NaCl、3.3 mM KCl、1.4 mM NaH2PO 4、2.2 mM MgCl2、2.77 mM CaCl2からなる人工脳脊髄液(ACSF)の1Lを調出します。
- 29 mM NaHCO 3、11 mMブドウ糖、241.5 mMスクロース、3.3 mM KCl、1.4 mM NaH2PO 4、2.2 mMMgCl 2、2.77 mM CaCl2を含有するスクロース-ACSF(sACSF)の200 mLを調製する。ACSFおよびsACSFにCaCl2を含める前に、カルボゲン(95%O2および5%CO2)を使用して溶液をガス化し、7.4のpHを確立し、カルシウム沈殿(曇り)を避ける。
- 70 mMグルコン酸カリウム、70 mM KCl、2 mM NaCl、10 mM HEPES、4 mM EGTA、4 mM Mg2-ATP、0.3 mM Na3-GTP で構成されるK+ベースの細胞内溶液を調製します。7.3の最終的なpHと(KOHを使用して調節される)。
注:0.22 μm フィルターで細胞内溶液をフィルタリングし、-20 °C で溶液の 0.5 mL アリコートを保存することをお勧めします。
3. 脳幹の準備
- 脳幹抽出の前に、sACSFをカルボゲンで平衡化し、氷スラリーが形成されるように-80°Cで25分間冷却します。
- イソファルンでマウスを麻酔する (3-5%)酸素で飽和(3 mL/分)。後ろ足の反射神経が存在しない場合は、鋭いステンレススチール製のはさみでマウスを切断します。
- カミソリの刃(丸みを#22)を使用して皮膚に矢状切開を行うことによって頭蓋骨を露出させます。
- 標準的なパターンのはさみのペアの尖った端を使用して、ラムダで小さな切開を行い、縦方向の裂け合いに沿って切断します。
- ペアの頭頂骨と後頭部の骨を、浅い曲がりくねったピアソンロンゲールのペアを使用して慎重に反映します。
注:この全体の手順の間に脳は、以前に調製された氷冷sACSFスラリーを使用して、その場で連続的に浴びられる。 - 前脳から脳幹を分離し、カミソリの刃(#11ストレート)を使用して、パリエト後頭硫黄と口蓋髄を切り取ります。
- 分離された脳幹の腹部の端を以前に切られた台形のポリスチレンブロックに取り付けます。解剖した組織の周りの余分な液体をティッシュペーパーの芯で取り除き、切断段階への良好な組織接着を確保する。
注:ポリスチレンブロックは台形で切断され、中脳のrostral端が脊髄にフィットし、テーパーを確保します。 - シアノクリレート接着剤を使用して、付属の脳幹の骨の端を切断段階に固定してポリスチレンブロックを固定します。
- 0.16 mm/s の事前速度と 3.00 mm の振動振幅を使用して、MVN の 200 μm 横スライスを準備します。
注:MVNの位置は、Paxinosおよびフランクリンマウス脳アトラス(図79-89)20を用いて決定される。MVN(アトラスでMVeとしてリストされている)は、第4心室に直ちに心室に位置し、小脳の付着直前(劣ったコリキュリとオペックスの間)の直前に最も大きい。 - プラスチック製のピペットを使用して、記録前に少なくとも30分間、25°Cで炭水化物化されたACSFに座っているフィルターペーパーディスクにスライスを転送します。
4. 楽器
- 標準的な電気生理学的セットアップを使用して、全細胞パッチクランプ技術21を実行します。
- マイクロピペットプーラー上の2段階プロトコル(熱ステップ1:70、熱ステップ2:45)を使用してマイクロピペットを調製します(材料の表を参照)。マイクロピペットは、お風呂に入れたときに内部溶液で3-5 MΩの範囲の最終的な抵抗を持っている必要があります。
注:使用する設定は、室内の温度によって異なる場合があり、頻繁に変更される場合があります。
5. 全細胞パッチクランプ電気生理学
- MVN内の個々のニューロンから全細胞パッチクランプ記録を得るために、K+ベースの内部溶液が記録ピペット内で使用される。
- インキュベーションチャンバから記録室に単一のティッシュスライスを転送し、U字型の重量にナイロン糸を使用してスライスを固定します。3 mL/minの流量で25 °Cで炭化性ACSFと記録室を連続的に浸透させる。
- マイクロピペットを内部溶液で充填した後、低電力(10x)対物レンズを使用してMVNを見つけます。高出力(40倍)の目的を使用して、MVN内の個々のニューロンを見つけることができます。
注:セル品質は、セル全体の構成を達成しようとする際に、セルの品質記録と耐久性を確保するために不可欠です。良い細胞は、球状の形状、反射細胞膜と目に見えない核を示します。悪い細胞は、大きな目に見える核(卵のような)と腫れ/縮小した外観を持つことになります。 - ピペットで組織を破る前に、ピペットの先端から破片を押し出すために少量の正の圧力を加えます。
- マイクロマニピュレーターを使用してピペットを選択したニューロンに向かって移動し、小さなディンプルがニューロン膜上に形成されるはずです。正の圧力を放出し、少量の負圧を加えます。
- 1 GΩシールが達成されたら、吸引ポートを通してピペットホルダーに穏やかな短く鋭い正圧を加えて膜を破裂させ、セル全体構成を作成します。
- 標準的な技術21、22を使用して全細胞電流クランプ記録を作る。
6. 個々の中間前庭核ニューロンへの正弦波および確率的ノイズの適用
- 3 ~24 pA の振幅の範囲で確率的ノイズと静弦ノイズを適用して、ニューロンのしきい値と発射速度を決定します。
- より低い刺激強度と高い刺激強度をグループ化して感覚閾値を決定し、ANOVAを実行して差異を観察します(補足図1に示すように)。
- 偏光電流ステップが各現在のレベルに注入された10s期間の平均発射速度を計算します(すなわち、7つの合計エピソード;図1)
- 平均発射速度値を使用して、発射速度と現在のプロットを比較して発生レートを生成し、線形回帰解析を実行して、最適適合線の勾配を決定します。最適適合線の勾配は、ニューロンゲイン22を示す。
図1:制御、静音および確率的ノイズプロトコルの図式プロファイル。(A) MVN ニューロンに適用される制御 (ノイズなし) プロトコル。(B) 2 Hz の周波数を持つ中因性ノイズ プロトコル (C)電源スペクトルの大部分が ≤2 Hz である確率的ノイズ プロトコル。ここで提示する各プロトコルは±6 pAの振幅を有し、10s脱分極電流は50 pAまで10pA増加する。真の刺激は偏光電流ステップを持たないため、ニューロンゲインの変化を決定するこれらのプロトコルの最初のエピソードです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
初期記録は、個々のMVNニューロンの基底発射速度に対する静信神経および確率的ノイズが及ぼす影響と、刺激がニューロンのゲインにどのように影響するかについての情報を提供することができる。図2は、制御(ノイズなし)記録と比較した場合、MVNニューロンの基底発射速度を変化させるのは、静音ノイズも確率的ノイズも変わらないことを示している。この情報は、個々のニューロンの閾値を決定するために重要です。ガルバニック前庭刺激をヒトに適用する際に、刺激がサブしきい値13であることを保証するために感覚閾値タスクが実行される。サブ閾値刺激は、確率共鳴(SR)現象7,8の重要な構成要素である。インビトロでは、この閾値化タスクを異なる方法で実行する必要があり、ニューロンの活性または基底発射速度が選択されています。これは、刺激が可能な限りサブしきい値に近く、したがって人間の研究に匹敵することを保証します。図2Bは、選択されたノイズレベル(6pA)がサブしきい値であることを強調し、平均発射速度が12pA(実験閾値)から増加し始めることを観察することができる。この閾値は、12 pA閾値(18および24 pA)以上の刺激レベルと下(3および6 pA)をグループ化することによって客観的に決定され、補足図1に示されている。
次に、ニューロンゲインは、ノイズ(対照)ノイズの有無にかかわらず、一連の脱分極電流ステップ(0〜50pA、10pA増加)にニューロンを与えることによって評価された(図1)。これらの結果は、確率的ノイズが中前庭系のニューロンに及ぼす可能性のある影響を決定する上で重要であり、したがって、GVSが人間のバランスに対するその影響を引き起こす可能性がある。図3は、6 pAのサブ閾値振幅で適用される副弦波(図3B)および確率的(図3A)ノイズがMVNニューロンのゲインを変化させることができることを示す。これらの結果は、各10s電流ステップ中の発射速度を測定し、線形回帰分析を実行して、最適適合のラインからのゲイン(勾配)を計算することによって評価されました。
図2:MVNニューロン発射速度に対する静音および確率的ノイズの影響(A) 6 pA振幅における確率的(SN;中間トレース)および中間ノイズ(ボトムトレース)は、制御(ノイズなし、トップトレース)と比較して、個々のMVNニューロンの基礎発射速度に有意な影響を及ぼさない。(B) 制御に応答する MVN ニューロンの発射速度 (n = 53)、確率的および前音のノイズ プロトコル (現在のステップなし) 振幅 3 (SN、 n = 30; sine、 n = 6) 6 (SN、 n = 46; sine、 n = 17) 12 (SN、 n = 13)、 n = 5;sine、n = 0)および 24 (SN、n = 8;sine、n = 0) pA。線/ひげは最大値と最小値を示し、ボックスは 25番目の -75パーセンシレを示し、ボックス内の線は平均発射速度(スパイク/s)を示します。破線は、補足図1に示す3及び6pA(12pA以下)および18及び24pA(12pA以上)以内の平均発射率をプールすることによって選択された実験閾値を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:中陰性および確率的ノイズはMVNニューロンゲインを変化させる。(A) 各脱分極電流ステップにおけるMVNニューロン発射速度および確率的ノイズに応答して対応するゲイン計算。(B) 提示されたデータは、図3Aと同じ方法で生成されたが、静弦ノイズの適用中に生成された。(C, D)グラフは、A とBの最適適合の線から計算されたゲインを表します。誤差バーは、S.D.統計的有意性が、対照条件と実験条件の間で最適な線の勾配を比較する線形回帰分析によって決定されたことを示します。**p < 0.02;p < 0.01.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:12 pA閾値の客観的決定。12 pA未満(3および6 pA)および12 pA(18および24 pA)以上の発射率をプールし、平均した。これらの平均値は、ANOVAを使用して分析され、シャムと>12 pAと<12 pAと>12 pAの間の統計的有意性を使用して分析されました。*p < 0.05.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
前庭系に対するガルバニック前庭刺激(GVS)の効果は、ヒト3、13、23、モルモット14、げっ歯類18および非ヒト霊長類24における生体内で強調されている。しかし、これらの研究のいずれも、前庭系における個々のニューロンの感度に対する電気ノイズの直接的な影響を評価していない。ここでは、個々の中間前庭核(MVN)ニューロンに直接確率的ノイズのインビトロ適用を示す。
個々のMVNニューロンに直接確率的ノイズを適用する主な目的は、ノイズがニューロン感受性に直接影響を及ぼしているかどうかを決定することです。したがって、確率的共振(SR)が人間のバランスにどのように影響するかを確立する。SR が明らかになるには、個々のニューロンがあからにして活性化されないように、刺激をサブしきい値にする必要があります7 (図2)。したがって、インビトロニューロン発射速度は、制御(刺激なし)条件に匹敵し続ける必要があります。このステップは、SR現象を強調するためにプロトコルにとって重要であり、他のニューロン集団では異なる可能性があるため、わずかに異なる実行が行われます。
この調製物は、動物14、15、17、18における生体内作業における以前の作業よりも明確な利点を提供するが、まだいくつかの注意点がある。第一に、刺激は個々のニューロンに適用されるため、確率的および正弦波ノイズの閾値化は、集団レベルで何が起こっているかを表さない場合があります。しかし、このプロトコルを使用すると、単一のニューロンレベルで変化を分析し、この情報を使用して、行動研究で何が起こるかをその後でモデル化できます。第二に、これらの電気生理学的記録は、自然活性をシミュレートするために直接電流注入に対する自発的な活動または応答を表示するニューロンに限定される。これは、自発的な神経活動21を示すので、これらの電気刺激の効果をテストするためのターゲットとしてMVNを選択する理由の一つである。
個々のMVNニューロンの全細胞パッチクランプ記録を使用する利点は、応答がより確実に前庭系の特定の出力にリンクできることです。行動研究は、眼前庭誘発筋原電位(oVEMP)および眼対ロール(ORS)のよりマクロレベル13の測定を通じて、耳部眼経路に関するそのような情報を提供することができる。電気生理学的記録を通じて、特定の核関与に関する情報、したがって、関与する特定の経路を解明することができる。さらに、生体内の一次前庭アフェレントを刺激する前の研究は、GVSがどのように機能するかに関する重要な情報を提供したが、中央前庭核がどのように反応するかを直接評価することはできない14,15,17 、18.したがって、全細胞パッチクランプ記録の感度と精度を強調することは、GVSが前庭機能を改善する方法を解明するのに役立ちます。
将来の研究は、自発的な活動を示す他のニューロン集団にこのプロトコルを適用することができます。ある研究は、ラット19の身体感覚および聴覚皮質内の非自発的に活動的な神経集団に確率的ノイズを適用した。しかし、これは酵素的に解離されたピラミッドニューロンの細胞懸濁液中で行われ、特に電圧クランプ実験を用いて後の細胞から採取されたNa+電流を記録した。このプロトコルでは、MVNニューロンの自発的活性は、現在のクランプ実験を用いて脳幹の横スライス内の個々のニューロンから記録された。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
SPSは、シドニー大学大学院研究奨学金によって支援されました.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl | Scharlau | CA01951000 | Used for ACSF and sACSF |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Used for ACSF and sACSF |
| EGTA | Sigma | E0396-25G | Used for K-based intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | Used for K-based intracellular solution |
| KCl | Chem-supply | PA054-500G | Used for ACSF, sACSF and intracellular solution |
| K-gluconate | Sigma | P1847-100G | Used for K-based intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187-500MG | Used for K-based intracellular solution |
| MgCl | Chem-supply | MA00360500 | Used for ACSF and sACSF |
| Na3-GTP | Sigma | G8877-100MG | Used for K-based intracellular solution |
| NaCl | Chem-supply | SO02270500 | Use for ACSF and intracellular solution |
| NaH2PO4•2H2O | Ajax | AJA471-500G | Used for ACSF and sACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761-1KG | Used for ACSF and sACSF |
| Sucrose | Chem-supply | SA030-500G | Used for sACSF |
| Isoflurane | Henry Schein | 1169567762 | Used for anaesthetising mice |
| EQUIPMENT | |||
| Borosilicate glass capillaries | Warner instruments | GC150T-7.5 | 1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length |
| Data acquisition software | Axograph | Used for electrophysiology and analysis | |
| Friedmen-Pearson Rongeurs | World precision instruments | 14089 | Used for dissection |
| Micropipette puller | Narishige | PP-830 | Used for micropipette |
| Multiclamp amplifier | Axon instruments | 700B | Used for electrophysiology |
| pH meter | Sper scientific | 860033 | Used for internal solution |
| Standard pattern scissors | FST | 14028-10 | Used for dissection |
| Sutter micromanipulator | Sutter | MP-225/M | Used for electrophysiology |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | Used for electrophysiology |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Used for slicing brain tissue |
References
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