Summary
Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.
Abstract
Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een opkomende technologie in systemen en synthetische biologie voor de in vitro productie van eiwitten. Als CFP'S echter verder gaan dan het laboratorium en een wijdverspreide en standaard just-in-time productietechnologie worden, moeten we de prestatielimieten van deze systemen begrijpen. In de richting van deze vraag, ontwikkelden we een robuust protocol om te kwantificeren 40 verbindingen die betrokken zijn bij glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, energiemetabolisme en cofactor regeneratie in CFPS reacties. De methode maakt gebruik van interne normen gelabeld met 13c-aniline, terwijl verbindingen in het monster zijn guarderivaten met 12c-aniline. De interne normen en het monster werden gemengd en geanalyseerd met reversed-phase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC/MS). De co-elutie van verbindingen geëlimineerd ionen onderdrukking, waardoor de nauwkeurige kwantificering van metaboliet concentraties over 2-3 ordes van grootte, waar de gemiddelde correlatiecoëfficiënt 0,988 was. Vijf van de 40-verbindingen waren niet gelabeld met aniline, maar ze werden nog steeds gedetecteerd in het CFPS-monster en gekwantificeerd met een standaard curve methode. De chromatografische uitvoering duurt ongeveer 10 minuten om te voltooien. Samen hebben we een snelle, robuuste methode ontwikkeld voor het scheiden en nauwkeurig kwantificeren van 40-verbindingen die betrokken zijn bij CFP'S in één LC/MS-run. De methode is een uitgebreide en nauwkeurige benadering om het celvrije metabolisme te karakteriseren, zodat we uiteindelijk de opbrengst, productiviteit en energie-efficiëntie van cel-vrije systemen kunnen begrijpen en verbeteren.
Introduction
Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een veelbelovend platform voor de vervaardiging van eiwitten en chemicaliën, een toepassing die traditioneel is gereserveerd voor levende cellen. Cel-vrije systemen zijn afgeleid van ruwe celextracten en elimineren de complicaties geassocieerd met celgroei1. Bovendien biedt CFPS directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder interferentie van een celwand. Een fundamenteel begrip van de prestatiegrenzen van de cel-vrije processen ontbreekt echter. High-throughput methoden voor de kwantificering van metaboliet zijn waardevol voor de karakterisering van het metabolisme en zijn van cruciaal belang voor de bouw van metabole computationele modellen2,3,4. Veelgebruikte methoden voor het bepalen van de metaboliet concentraties zijn nucleaire magnetische resonantie (NMR), Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR), enzym gebaseerde testen en massaspectrometrie (MS)5,6,7 ,8. Echter, deze methoden worden vaak beperkt door hun onvermogen om efficiënt te meten van meerdere verbindingen tegelijk en vereisen vaak een steekproefgrootte groter is dan de typische cel-vrije reacties. Bijvoorbeeld, enzym gebaseerde assays kunnen vaak alleen worden gebruikt voor het kwantificeren van één samengestelde in een run, en zijn beperkt wanneer de grootte van het monster klein is, zoals in de cel-vrije eiwitsynthese Reacties (meestal uitgevoerd op een schaal van 10-15 μL). Ondertussen vereist NMR een grote overvloed aan metabolieten voor detectie en kwantificering5. In de richting van deze tekortkomingen bieden chromatografie methoden in combinatie met massaspectrometrie (LC/MS) verschillende voordelen, waaronder hoge gevoeligheid en de mogelijkheid om meerdere soorten gelijktijdig te meten9; de analytische complexiteit neemt echter aanzienlijk toe met het aantal en de diversiteit van de soorten die worden gemeten. Het is daarom belangrijk om methoden te ontwikkelen die het hoge doorvoer potentieel van LC/MS-systemen volledig realiseren. Verbindingen in een monster worden gescheiden door vloeistofchromatografie en geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie. Het signaal van de verbinding hangt af van de concentratie en de ionisatie-efficiëntie, waarbij de ionisatie kan variëren tussen verbindingen en kan ook afhangen van de monstermatrix.
Het bereiken van dezelfde ionisatie-efficiëntie tussen het monster en de normen is een uitdaging bij het gebruik van LC/MS om analyten te kwantificeren. Verder wordt kwantificering uitdagender met de diversiteit van de metaboliet als gevolg van signaal splitsing en heterogeniteit in Proton affiniteit en polariteit10. Ten slotte kan de co-eluting-matrix van het monster ook invloed hebben op de ionisatie-efficiëntie van de verbindingen. Om deze problemen aan te pakken, kunnen metabolieten chemisch worden afgeleid, waardoor de scheidings resolutie en gevoeligheid door LC/MS-systemen worden vergroot, terwijl tegelijkertijd de signaal splitsing in sommige gevallen10,11wordt verlaagd. Chemische derivatisatie werkt door specifieke functionele groepen van metabolieten te taggen om hun fysische eigenschappen zoals charge of hydrofobiciteit aan te passen om de ionisatie-efficiëntie te verhogen11. Verschillende tagstoffen kunnen worden gebruikt om verschillende functionele groepen te targeten (bijv. amines, hydroxyls, fosfaten, carbonzuren, enz.). Aniline, een dergelijke derivatisatie-agent, richt zich op meerdere functionele groepen tegelijk, en voegt een hydrofobe component toe aan hydrofiele moleculen, waardoor hun scheidings resolutie en signaal12toenemen. Om het co-eluting-matrix-ionen onderdrukkings effect aan te pakken, ontwikkelden Yang en collega's een techniek op basis van groepsspecifieke interne standaard technologie (GSIST)-labeling waarbij normen zijn gelabeld met 13C aniline-isotopen en vermengd met het monster 12,13. De metaboliet en de corresponderende interne standaard hebben dezelfde ionisatie-efficiëntie omdat ze co-elute, en hun intensiteit ratio kan worden gebruikt om de concentratie in het experimentele monster te kwantificeren.
In deze studie ontwikkelden we een protocol voor het opsporen en kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij de glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, het energiemetabolisme en de cofactor-regeneratie bij CFPS-reacties. De methode is gebaseerd op de GSIST-benadering, waarbij we 12c-aniline en 13c-aniline gebruikten om metabolieten te taggen, te detecteren en te kwantificeren met behulp van omgekeerde fase LC/MS. Het lineaire bereik van alle verbindingen omspannen 2-3 ordes van grootte met een gemiddelde correlatiecoëfficiënt van 0,988. Dus, de methode is een robuuste en nauwkeurige benadering van interrogaat cel-vrije metabolisme, en eventueel hele-celextracten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van reagentia voor aniline-tagging
- Bereid een aniline oplossing van 6 M bij pH 4,5. Werk in een afzuigkap, combineer 550 μL aniline met 337,5 μL LCMS water en 112,5 μL van 12 M zoutzuur (HCl) in een centrifugebuis. Vortex goed en bewaren bij 4 °C.
Opmerking: aniline kan gedurende 2 maanden bij 4 °C worden bewaard.
Let op: aniline is zeer giftig en moet in een rook afzuigkap worden bewerkt. Zoutzuur is zeer corrosief - Bereid een aniline oplossing van 6 M 13C bij pH 4,5. Combineer 250 mg 13C6-aniline met 132 μL water en 44 μl van 12 M HCl. Vortex goed en bewaren bij 4 °c.
- Bereid 200 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) oplossing. Los 2 mg EDC op in 10 μL water voor elk monster dat moet worden gelabeld en Vortex goed.
Opmerking: EDC oplossing moet worden bereid op dezelfde dag als de reactie. EDC fungeert als een katalysator voor de derivatisering van verbindingen met aniline12.
2. voorbereiding van de normen
- Maak afzonderlijke stamoplossingen van alle verbindingen opgelost in LC/MS-kwaliteit water (tabel 1).
-
Voorbereiding van de interne standaardvoorraad oplossing
- Combineer alle verbindingen met uitzondering van Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP), flavine adenine dinucleotide (FAD), acetyl coenzym A (ACA) en glycerol 3-fosfaat (Gly3P), met de juiste volumes om Creëer een 2 mM stockoplossing van alle verbindingen.
- Combineer NAD, NADP, FAD, ACA en Gly3P met de juiste volumes om een 2 mM stockoplossing te creëren.
3. bereiding van het monster (Figuur 1)
- Quench en neerslaan van de eiwitten in een cel-vrije eiwitsynthese reactie door toevoeging van een gelijk volume ijskoude 100% ethanol aan de reactie. Centrifugeer het monster bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Breng de supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis.
Opmerking: monsters kunnen op dit punt bij-80 °C worden bewaard en op een later tijdstip worden geanalyseerd
4. etiketteer reactie
-
Etiketterings monster met 12C-aniline oplossing
- Breng 6 μL monster over in een nieuwe centrifugebuis om het volume met water tot 50 μL te brengen.
Opmerking: volume steekproefgrootte kan afhangen van de specifieke CFPS-reactie. - Voeg 5 μL 200 mg/mL EDC-oplossing toe.
- Voeg 5 μL 12C-aniline oplossing toe.
NB: de aniline oplossing wordt in twee fasen gescheiden. Meng goed voordat u de reactie toevoegt. - Vortex de reactie met zacht schudden voor 2 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder na 2 uur de buisjes uit de shaker en voeg 1,5 μL Triethylamine (thee) toe aan de reactie in een rook afzuigkap.
Opmerking: Triethylamine verhoogt de pH van de oplossing die de aniline-tagreactie stopt en de verbindingen stabiliseert.
Let op: Triethylamine is giftig en veroorzaakt irritatie van de ogen en de luchtwegen. - Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 3 min.
- Breng 6 μL monster over in een nieuwe centrifugebuis om het volume met water tot 50 μL te brengen.
-
Labeling van interne standaarden met 13C-aniline oplossing
- Verdun de interne voorraadoplossing tot 80 μM met een eindvolume van 50 μL.
Opmerking: de concentratie van interne normen kan worden aangepast aan de niveaus die dicht bij het experimentele monster liggen. - Voeg 5 μL 200 mg/mL EDC-oplossing toe.
- Voeg 5 μL 13C-aniline oplossing toe.
- Vortex de reactie met zacht schudden voor 2 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder na 2 uur de buizen van de shaker en voeg 1,5 μL thee toe aan de reactie in een rook afzuigkap.
- Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 3 min.
- Verdun de interne voorraadoplossing tot 80 μM met een eindvolume van 50 μL.
-
Gelabelde interne standaard en gelabeld voorbeeld combineren
- Meng 25 μL 12c-aniline met het gelabelde monster met 25 μl 13c-aniline-standaard.
- Overbrengen naar een injectieflacon met automatische sampler en analyseren via de LC/MS-procedure.
-
Een standaard curve voor niet-gelabelde metabolieten maken
- Verdunde stamoplossing van niet-gelabelde metabolieten (NAD, NADP, FAD, ACA en Gly3P) tot de eindconcentraties van 320 μM, 80 μM, 20 μM en 5 μM met een volume van 50 μL.
- Voeg 5 μL 200 mg/mL EDC-oplossing toe.
- Voeg 5 μL 12C-aniline oplossing toe.
- Vortex de reactie met zacht schudden voor 2 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder na 2 uur de buizen van de shaker en voeg 1,5 μL thee toe aan de reactie in een rook afzuigkap.
- Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 3 min.
- Breng supernatant over naar een injectieflacon met automatische sampler en Analyseer deze met de LC/MS-procedure.
Opmerking: de niet-gelabelde metabolieten volgen dezelfde procedure als het monster om de monstermatrix te repliceren om een vergelijkbare ionisatie-efficiëntie te behouden.
5. instelling van de LC/MS-procedure
-
Bereiding van oplosmiddelen
- Bereid 5 mM Tri-Butylamine (TBA) waterige oplossing aangepast aan pH 4,75 met azijnzuur.
Opmerking: TBA in de mobiele fase helpt de analyten bereiken goede resolutie en scheiding14. - Bereid 5 mM TBA in acetonitril (ACN).
- Bereid wasoplosmiddel met 5% water en 95% ACN.
- Bereid het reinigings solvent met 95% water en 5% ACN.
- Bereid 5 mM Tri-Butylamine (TBA) waterige oplossing aangepast aan pH 4,75 met azijnzuur.
- Instellen van MS-voorwaarden
- Stel de massaspectrometer in op de negatieve Ion-modus met een sonde temperatuur van 520 °C, negatieve capillaire spanning van-0,8 kV, positieve capillaire spanning van 0,8 kV, en stel de software in om gegevens te verzamelen op 5 punten/s.
- Stel geselecteerde Ion-opnames (SIR) in voor elke metaboliet met gespecificeerde kegel spanningen en massa-overlaad waarden (m/z). Zie tabel 1.
-
Het initialiseren van LC/MS volgens de instructies van de fabrikant
- Prime solvent lijnen in de solvent Manager gedurende 3 min.
- Prime Wash solvent (5% water, 95% ACN) en purge solvent (95% water, 5% ACN) gedurende 5 cycli gedurende 15 sec.
- Stel de Sample Manager in op 10 °C.
- Installeer een C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 150mm) kolom en Initialiseer de kolom met 100% ACN bij 0,3 mL/min gedurende 10 min.
- Staat de kolom op 95% water en 5% ACN op 0,3 mL/min gedurende 10 minuten voorafgaand aan het introduceren van oplosmiddelen met buffers.
- Voorwaarde voor de kolom op 95% oplosmiddel A (5mM TBA waterige, pH 4,75) en 5% oplosmiddel B (5 mM TBA in ACN) bij 0,3 mL/min gedurende 10 min.
- Stel een verloop protocol in met de elutie beginnend bij 95% oplosmiddel A en 5% oplosmiddel B, verhoogd tot 70% oplosmiddel B in 10 min, verhoogd tot 100% oplosmiddel B in 2 minuten en gehouden bij 100% oplosmiddel B gedurende 3 min. terugkeren naar de initiële condities (95% oplosmiddel A , 5% oplosmiddel B) over 1 min en houd 9 min vast om de kolom opnieuw te evenwichts-
- Staat de kolom met het verloop Protocol 3 keer vóór eventuele injecties op de kolom.
-
Injecteren van monster en normen
- Injecteer 5 μL van het monster in de kolom en verkrijg de juiste m/z-ionen intensiteiten voor het 12C-aniline gelabelde monster.
- Injecteer nogmaals 5 μL van hetzelfde monster, maar deze keer verkrijgt u de m/z-intensiteiten voor de 13C-aniline-normen.
Opmerking: ons LC/MS-systeem is niet in staat om zowel 12c-als 13c m/z-intensiteiten te verwerven op de gespecificeerde Sir time-Vensters, omdat het te veel gegevens is om te verwerven in het opgegeven tijdvenster. Daarom injecteren we hetzelfde monster twee keer. - Injecteer niet-gelabelde metaboliet normen van de laagste concentratie tot het hoogste en noteer de juiste m/z-ionen intensiteiten.
6. kwantificering
- Export methode maken
- In software voor gegevensverzameling selecteert u bestand ≫ nieuwe methode ≫ export methode.
- Geef een bestandsnaam op, bijvoorbeeld AnilineTagging_Date.
- Controleer het ASCII -bestand exporteren en kies een map waarin u het tekstbestand wilt exporteren.
- In rapport type, selecteer Samenvatting door alle.
- In scheidingstekens, voor kolom Selecteer a ,. Voor rijselecteert u [CR] [If].
- Selecteer in tabelde optie exporteren en vervolgens tabel bewerken om samplename, gebied, hoogte, bedrag en eenhedenop te nemen.
- Exportmethode opslaan.
- Kwantificeren van metabolieten met interne standaarden met behulp van Data Acquisition software
- Klik onder het tabblad sample sets met de rechtermuisknop op de bijbehorende LC/MS run en selecteer View as > channels.
- Selecteer alle SIR kanalen voor de 13C-aniline interne normen van één injectie, klik met de rechtermuisknop en selecteer recensie.
- Als het venster indeling van kredietbrief verwerkingsmethode niet automatisch wordt weergegeven, gaat u naar de lay-out ≫ verwerkingsmethode weergeven.
- Ga in de indeling van de methode processingnaar het tabblad integratie en stel apextrack in als het algoritme.
- Ga naar het tabblad vloeiend maken en stel het type in op mean en het gladmakende niveau op 13.
Opmerking: elk vloeiend niveau kan worden geselecteerd, zolang deze consistent is voor alle voorbeelden. - Schakel MS 3D - verwerkinguit op het tabblad MS - kanaal .
- In het SIR Channel-venster integreer je elke piek, één kanaal per keer. Zodra een piek is geïntegreerd, gaat u naar opties ≫ vulling van resultaat en de details van de piek zullen worden ingevuld op de componenten tab. Wijzig de piek naam in de corresponderende samengestelde naam.
- Zodra alle SIR-kanalen zijn geëvalueerd, slaat u de verwerkingsmethode op en sluit u het venster.
- Selecteer alle SIR kanalen van de 13c-aniline en 12c-aniline Tagged sample, klik met de rechtermuisknop en selecteer proces.
- Schakel het selectievakje proces in, selecteer gespecificeerde verwerkingsmethode gebruikenen kies de verwerkingsmethode die u zojuist hebt opgeslagen. Vink ook het vakje exporteren aan, selecteer gebruik gespecificeerde exportmethode en kies de opgeslagen exportmethode die eerder is gemaakt. Klik op OK.
- Open het geëxporteerde tekstbestand met Excel en bereken de concentratie van het onbekende samengestelde met behulp van:
waar Cx, i de concentratie is van het onbekende monster voor metaboliet i, ax, i is het geïntegreerde gebied van de onbekende metaboliet i, eenStd, i is het geïntegreerde gebied van de interne standaard van metaboliet i, CStd, i is de concentratie van de interne standaard van metaboliet i, en D is de verdunningsfactor.
- Kwantificeren van niet-gelabelde metabolieten met standaard curve
- Klik onder het tabblad sample sets met de rechtermuisknop op de bijbehorende LC/MS run en selecteer View as > channels.
- Selecteer alle SIR channels voor de niet-gelabelde standaarden van één injectie, klik met de rechtermuisknop en selecteer recensie.
- Als het venster indeling van kredietbrief verwerkingsmethode niet automatisch wordt weergegeven, gaat u naar de lay-out ≫ verwerkingsmethode weergeven.
- Ga in de indeling van de methode processing naar het tabblad integratie en stel apextrack in als het algoritme.
- Ga naar het tabblad vloeiend maken en stel het type in op mean en het gladmakende niveau op 13.
Opmerking: elk vloeiend niveau kan worden geselecteerd, zolang deze consistent is voor alle voorbeelden. - Schakel MS 3D - verwerkinguit op het tabblad MS - kanaal .
- In het SIR Channel-venster integreer je elke piek, één kanaal per keer. Zodra een piek is geïntegreerd, gaat u naar opties ≫ vulling van resultaat en de details van de piek zullen worden ingevuld op de componenten tab. Wijzig de piek naam in de corresponderende samengestelde naam.
- Zodra alle SIR-kanalen zijn geëvalueerd, slaat u de verwerkingsmethode op en sluit u het venster.
- Klik onder het tabblad sample sets met de rechtermuisknop op de Voorbeeldset en selecteer voorbeeld wijzigen.
- Selecteer bedrag in het nieuwe venster.
- Selecteer kopiëren van proces methode en kies de proces methode die zojuist is opgeslagen.
- Voer de concentratie van elke metaboliet in voor elke injectieflacon en voer de eenheid in als < μM voor elk onderdeel (of de corresponderende eenheid) en selecteer OK.
- Selecteer de Voorbeeldset opnieuw, klik met de rechtermuisknop, Bekijk als ≫ kanalen.
- Selecteer alle SIR-kanalen van de niet-gelabelde metabolieten voor de standaarden, klik met de rechtermuisknop en selecteer proces.
- Vink het vakje proces aan en kies gespecificeerde verwerkingsmethode gebruiken. Selecteer de juiste verwerkingsmethode en klik op OK.
- Selecteer SIR channels voor alle niet-gelabelde metabolieten voor de samples, klik met de rechtermuisknop en selecteer proces.
- Schakel het selectievakje proces in, selecteer gespecificeerde verwerkingsmethode gebruiken en kies de verwerkingsmethode die zojuist is opgeslagen. Vink ook het vakje exporteren aan, selecteer gebruik gespecificeerde exportmethode en kies de opgeslagen exportmethode die eerder is gemaakt. Klik op OK.
- Kwantificeer de niet-gelabelde metabolieten met de standaard curve en exporteer de resultaten naar een tekstbestand naar de opgegeven map.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als proof-of-concept gebruikten we het protocol om metabolieten te kwantificeren in een E. coli gebaseerd CFPS systeem dat groen fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukt. De CFPS-reactie (14 μL) werd uitgeblust en gedeproteïniseerd met ethanol. De CFPS sample werd vervolgens getagd met 12c-aniline, terwijl de normen werden getagd met 13c-aniline. Het gelabelde monster en de normen werden vervolgens gecombineerd en geïnjecteerd in de LC/MS (Figuur 1). Het protocol ontdekte en kwantificeerd 40 metabolieten die betrokken waren bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme met behulp van interne normen, terwijl een standaard curve voor 5 van de metabolieten die niet met aniline waren gelabeld, ook werd ontwikkeld (Figuur 2). De diverse metabolieten die bij deze trajecten betrokken waren, waren een klasse van gefosforyleerd suikers, fosfocarboxylzuren, carbonzuren, nucleotiden en cofactoren. De derivatisatie met aniline introduceerde een hydrofobe groep in hydrofiele moleculen die een effectievere scheiding mogelijk maken met behulp van omgekeerde fase chromatografie12. Daarnaast kon de methode de scheiding van structurele isomeer paren zoals glucose 6-fosfaat en fructose-6-fosfaat in één LC/MS-run mogelijk gemaakt. De Mass over charge (m/z) ratio en retentietijd van elke compound werden voorafgaand aan het experiment geïdentificeerd door 1 mM van één verbinding per keer te injecteren en het massaspectrum te vergelijken met de blanco (tabel 1).
De aantoonbaarheidsgrens en het bereik van lineariteit voor alle verbindingen werden geschat door een standaard curve te produceren die varieerde van 0,10 μM tot 400 μM (tabel 2). De gemiddelde correlatiecoëfficiënt (R2) voor alle verbindingen was 0,988 en de meeste verbindingen hadden een lineair bereik van 3-ordes van grootte. Drie verbindingen hadden opmerkelijke verzadiging effecten, vooral alpha-ketoglutaraat die een lineair bereik van 0,1 μM tot 25 μM had. Isocitraat en citraat hadden ook verzadiging effecten boven 100 μM.
Figuur 1: schematische werkstroom voor aniline-tagging. De celvrije eiwitsynthese reactie is gedeproteiniseerd en gelabeld met 12c-aniline, terwijl een standaardvoorraad mengsel is gelabeld met 13c-aniline. Beide mengsels worden vervolgens gemengd met een 1:1-volumetrische verhouding en geanalyseerd door LC/MS. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: overlapt geselecteerde ionen chromatogrammen voor 40 metabolieten. Massa chromatogram uit één LC/MS-run van een standaard mengsel van 40 μM van 40 metabolieten. Pieken werden geïdentificeerd door hun retentietijd en m/z-waarden voor elke compound. De volledige samengestelde namen en de afkortingen ervan worden weergegeven in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Piek nummer | Metaboliet | Afkorting | KEGG ID | Retentietijd (min) | 12C m/z | 13C m/z | nonlabel m/z | Cv | MS soorten | |
| 1 | Glycerol 3-fosfaat | Gly3P | C00093 | 3,85 | 153 | 10 | M – H2O – H | |||
| 2 | Nicotinamide adenine dinucleotide | Nad | C00003 | 3,96 | 698 | 10 | M + cl – H | |||
| 3 | Glucose | GLC | C00031 | 4,06 | 289,9 | 296 | 15 | M + A + cl-H | ||
| 4 | Sedoheptulose 7-fosfaat | S7P | C05382 | 5,41 | 364 | 370 | 10 | M + A – H | ||
| 5 | Fructose-6-fosfaat | F6P | C00085 | 5,48 | 334 | 340 | 10 | M + A – H | ||
| 6 | Guanosine adenosinemonofosfaat | Gmp | C00144 | 5,57 | 437,05 | 443 | 10 | M + A – H | ||
| 7 | Ribulose 5-fosfaat | RL5P | C00199 | 5,58 | 304 | 310 | 10 | M + A – H | ||
| 8 | Cytidine-monofosfaat | Cmp | C00055 | 5,59 | 397,09 | 403 | 10 | M + A – H | ||
| 9 | Lactaat | Lac | C00186 | 5,77 | 164,05 | 170 | 10 | M + A – H | ||
| 10 | Adenosinemonofosfaat | Amp | C00020 | 5,85 | 421,1 | 427,1 | 10 | M + A – H | ||
| 11 | Uridine monofosfaat | Ump | C00105 | 5,88 | 398,07 | 404 | 10 | M + A – H | ||
| 12 | Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat | NADP | C00006 | 6,39 | 724 | 10 | M-H2O – H | |||
| 13 | 3-fosfoglycerinezuur | 3PG | C00197 | 6,63 | 242 | 248,06 | 15 | M + A – H2O – H | ||
| 14 | Cytidine difosfaat | Cdp | C00112 | 6,72 | 477 | 483 | 10 | M + A – H | ||
| 15 | Guanosine-difosfaat | Bbp | C00035 | 6,87 | 517 | 523 | 10 | M + A – H | ||
| 16 | Adenosine-difosfaat | Adp | C00008 | 6,94 | 501 | 507 | 10 | M + A – H | ||
| 17 | Uridine difosfaat | Udp | C00015 | 6,97 | 478 | 484 | 10 | M + A – H | ||
| 18 | Flavine adenine dinucleotide | Fad | C00016 | 7,03 | 784,15 | 15 | M – H | |||
| 19 | Fructose 1,6-bisfosfaatis | F16P | C05378 | 7,1 | 395,95 | 402,1 | 10 | M + A – H2O – H | ||
| 20 | Gluconaat 6-fosfaat | 6PG | C00345 | 7,11 | 425,1 | 437 | 10 | M + 2A – H | ||
| 21 | Nicotinamide adenine dinucleotide verminderd | NADH | C00004 | 7,23 | 633,13 | 639,08 | 10 | M + A + H2O – Nicotinamide – H | ||
| 22 | Glucose-6-fosfaat | G6P | C00668 | 7,32 | 409,1 | 421,1 | 10 | M + 2A – H | ||
| 23 | Ribose 5-fosfaat | R5P | C00117 | 7,54 | 379,1 | 391,1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 24 | Erythrose 4-fosfaat | E4P | C00279 | 7,71 | 348,9 | 361 | 10 | M + 2A – H | ||
| 25 | Cytosinetrifosfaat | Ctp | C00075 | 7,84 | 557 | 563 | 5 | M + A – H | ||
| 26 | Guanosine trifosfaat | Gtp | C00044 | 7,93 | 597 | 603 | 5 | M + A – H | ||
| 27 | Oxalacetaat | OAA | C00036 | 7,94 | 281 | 293 | 25 | M + 2A – H | ||
| 28 | Alpha-ketoglutaraat | Akg | C00026 | 7,95 | 295 | 307,1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 29 | Uridine trifosfaat | Utp | C00075 | 7,97 | 558 | 564 | 10 | M + A – H | ||
| 30 | Adenosinetrifosfaat | Atp | C00002 | 8,03 | 581 | 587 | 15 | M + A – H | ||
| 31 | Dimethylfumaraat | FUM | C00122 | 8,09 | 265 | 277,1 | 10 | M + 2A – H | ||
| 32 | Pyruvaat | Pyr | C00022 | 8,09 | 162 | 168 | 25 | M + A – H | ||
| 33 | Malate | Mal | C00149 | 8,09 | 283,06 | 295,15 | 10 | M + 2A – H | ||
| 34 | D-Glyceraldehyde 3-fosfaat | Gap | C00118 | 8,09 | 319 | 331,1 | 5 | M + 2A – H | ||
| 35 | Acetyl-coenzym A | Aca | C00024 | 8,16 | 790 | 10 | M – H2O – H | |||
| 36 | Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat gereduceerd | Nadph | C00005 | 8,23 | 694,92 | 700,82 | 10 | M + A – Nicotinamide – H | ||
| 37 | Fosfoenolpyruvate | Pep | C00074 | 8,28 | 317 | 329,1 | 20 | M + 2A – H | ||
| 38 | Succinaat | SUCC | C00042 | 8,64 | 267,07 | 279,1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 39 | Isocitraat | TEKORTREDUCERENDE | C00311 | 10,13 | 398 | 416 | 10 | M + 3A – H2O – H | ||
| 40 | Citraat | Cit | C00158 | 10,46 | 416,1 | 434,06 | 20 | M + 3A – H | ||
Tabel 1: identificatie-en etiketterings resultaten van metabolieten. De bijbehorende piek getal, retentietijd, m/z-waarde voor niet-gelabelde, 12c en 13c gelabeld, en MS soorten. MS species, een staat voor aniline tag.
| Piek nr. | Metaboliet | Afkorting | KEGG ID | Concentratie (mM) | SD (n = 3) | Aantoonbaarheidsgrens (μM) | Begrenzing van het lineaire bereik (μM) | R ^ 2 | |
| 1 | Glycerol 3-fosfaat | Gly3P | C00093 | 0,377 | 0,034 | 0,1 | 400 | 0,995 | |
| 2 | Nicotinamide adenine dinucleotide | Nad | C00003 | 0,052 | 0,010 | 0,39 | 400 | 0,993 | |
| 3 | Glucose | GLC | C00031 | 0,002 | 0,000 | 0,1 | 400 | 0,997 | |
| 4 | Sedoheptulose 7-fosfaat | S7P | C05382 | 0,007 | 0,000 | 0,16 | 400 | 0,988 | |
| 5 | Fructose-6-fosfaat | F6P | C00085 | 0,029 | 0,004 | 0,1 | 400 | 0,986 | |
| 6 | Guanosine adenosinemonofosfaat | Gmp | C00144 | 0,007 | 0,001 | 0,39 | 100 | 0,992 | |
| 7 | Ribulose 5-fosfaat | RL5P | C00199 | 0,035 | 0,002 | 0,39 | 400 | 0,996 | |
| 8 | Cytidine-monofosfaat | Cmp | C00055 | 0,045 | 0,001 | 0,1 | 100 | 0,992 | |
| 9 | Lactaat | Lac | C00186 | 2,134 | 0,048 | 0,1 | 400 | 0,988 | |
| 10 | Adenosinemonofosfaat | Amp | C00020 | 0,020 | 0,002 | 0,1 | 100 | 0,992 | |
| 11 | Uridine monofosfaat | Ump | C00105 | 0,021 | 0,000 | 0,1 | 100 | 0,997 | |
| 12 | Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat | NADP | C00006 | 0,014 | 0,002 | 0,34 | 400 | 0,950 | |
| 13 | 3-fosfoglycerinezuur | 3PG | C00197 | 6,125 | 0,239 | 0,1 | 100 | 0,996 | |
| 14 | Cytidine difosfaat | Cdp | C00112 | 0,202 | 0,029 | 0,39 | 400 | 0,997 | |
| 15 | Guanosine-difosfaat | Bbp | C00035 | 0,146 | 0,027 | 1,5625 | 400 | 0,984 | |
| 16 | Adenosine-difosfaat | Adp | C00008 | 0,797 | 0,161 | 0,39 | 400 | 0,995 | |
| 17 | Uridine difosfaat | Udp | C00015 | 0,212 | 0,036 | 0,39 | 400 | 0,991 | |
| 18 | Flavine adenine dinucleotide | Fad | C00016 | 0,008 | 0,001 | 0,1 | 400 | 0,958 | |
| 19 | Fructose 1,6-bisfosfaatis | F16P | C05378 | 3,643 | 0,105 | 0,39 | 400 | 0,989 | |
| 20 | Gluconaat 6-fosfaat | 6PG | C00345 | 0,017 | 0,001 | 0,39 | 400 | 0,989 | |
| 21 | Nicotinamide adenine dinucleotide verminderd | NADH | C00004 | 0,063 | 0,028 | 0,39 | 100 | 0,972 | |
| 22 | Glucose-6-fosfaat | G6P | C00668 | 0,046 | 0,002 | 0,1 | 400 | 0,984 | |
| 23 | Ribose 5-fosfaat | R5P | C00117 | 0,055 | 0,005 | 0,39 | 100 | 0,999 | |
| 24 | Erythrose 4-fosfaat | E4P | C00279 | 0,038 | 0,007 | 0,39 | 400 | 0,979 | |
| 25 | Cytosinetrifosfaat | Ctp | C00075 | 0,896 | 0,078 | 6,25 | 100 | 0,998 | |
| 26 | Guanosine trifosfaat | Gtp | C00044 | 0,870 | 0,109 | 6,25 | 100 | 0,993 | |
| 27 | Oxalacetaat | OAA | C00036 | 0,023 | 0,008 | 0,56 | 400 | 0,997 | |
| 28 | Alpha-ketoglutaraat | Akg | C00026 | 0,391 | 0,020 | 0,1 | 25 | 0,979 | |
| 29 | Uridine trifosfaat | Utp | C00075 | 0,845 | 0,092 | 1,5625 | 400 | 0,998 | |
| 30 | Adenosinetrifosfaat | Atp | C00002 | 1,557 | 0,188 | 1,5625 | 400 | 0,991 | |
| 31 | Dimethylfumaraat | FUM | C00122 | 0,576 | 0,100 | 1,5625 | 100 | 0,999 | |
| 32 | Pyruvaat | Pyr | C00022 | 5,813 | 0,804 | 0,39 | 400 | 0,993 | |
| 33 | Malate | Mal | C00149 | 2,548 | 0,269 | 0,1 | 400 | 0,991 | |
| 34 | D-Glyceraldehyde 3-fosfaat | Gap | C00118 | 2,194 | 0,367 | 0,1 | 100 | 0,974 | |
| 35 | Acetyl-coenzym A | Aca | C00024 | 0,196 | 0,044 | 0,1 | 100 | 0,991 | |
| 36 | Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat gereduceerd | Nadph | C00005 | 0,006 | 0,010 | 0,14 | 100 | 0,990 | |
| 37 | Fosfoenolpyruvate | Pep | C00074 | 3,442 | 0,345 | 0,1 | 100 | 0,962 | |
| 38 | Succinaat | SUCC | C00042 | 5,683 | 0,573 | 0,1 | 320 | 0,999 | |
| 39 | Isocitraat | TEKORTREDUCERENDE | C00311 | 0,003 | 0,006 | 0,39 | 100 | 0,998 | |
| 40 | Citraat | Cit | C00158 | 0,002 | 0,001 | 0,1 | 100 | 0,981 | |
Tabel 2: kwantificering van de metaboliet in een representatief CFPS-monster. De concentratie van elke metaboliet en de standaarddeviatie. Detectiegrens, het bereik van de lineariteit en de correlatiecoëfficiënt die uit standaard curven zijn vastgesteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cel-vrije systemen hebben geen celwand, dus er is directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder dat complexe monstervoorbereiding nodig is. Er is echter heel weinig werk verzet om grondige en robuuste protocollen te ontwikkelen voor het meten van de celvrije reactie systemen. In deze studie ontwikkelden we een snelle, robuuste methode om metabolieten te kwantificeren in celvrije reactie mengsels en mogelijk in hele celextracten. Individuele kwantificering van metabolieten in complexe mengsels, zoals die gevonden in cel-vrije reacties, of hele cellen extracten, is een uitdaging om verschillende redenen. Centraal staat onder meer de scheikundige diversiteit. De array van functionele groepen die gelijktijdig aanwezig zijn in deze mengsels (bijv. carbonzuren, amines, fosfaten, hydroxyls, enz.) verhoogt de analytische complexiteit aanzienlijk. Om dit te omzeilen, gebruikten we een aniline derivatisatie methode in combinatie met 13C interne normen om hydrofobe componenten in de metaboliet mengsels te introduceren. Met behulp van deze methode, we robuust gedetecteerd en gekwantificeerd 40 metabolieten in een cel-vrije reactie in een enkele LC/MS run. Het protocol Tagged 35 van de 40 verbindingen in deze studie, terwijl de resterende 5 verbindingen werden gekwantificeerd met een standaard curve methode. Eerder werk suggereerde dat de reactieomstandigheden een intramoleculair zout vormden tussen de amine-en fosfaatgroep die derivatisatie12inhiemde. Reactieomstandigheden werden niet geïdentificeerd voor gelijktijdige derivatisering van alle 40 verbindingen; het huidige alternatief is echter kwantificering met een standaard curve methode. Hoewel we deze techniek hebben gedemonstreerd in een celvrij reactiemengsel, kan het ook waarschijnlijk worden toegepast op extracten van hele cellen, waardoor de absolute kwantificering van intracellulaire metabolieten concentraties mogelijk wordt. Deze laatste toepassing is relevant voor een aantal belangrijke kwesties in de biotechnologie en de menselijke gezondheid.
De hier gepresenteerde methode was gebaseerd op een vorige techniek (gsist) die werd toegepast op extracten van hele cellen van de gist S. cerevisiae12,13. In deze studie, we uitgebreid het aantal verbindingen die kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd, met inbegrip van alle 12 nucleotiden (xMP, xDP, xTP, waarbij x is A, C, G en U). Toevoeging van deze verbindingen kan belangrijke biologische implicaties hebben. Bijvoorbeeld, deze nucleotiden zijn sterk betrokken bij transcriptie en vertaalprocessen, dat is een van de centrale processen van belang in CFPS toepassingen, en meer in het algemeen de verbindingen zijn belangrijk in een verscheidenheid van fysiologische functies. Daarnaast waren we in staat azijnzuur te detecteren dat een belangrijke metaboliet is bij het onderzoeken van overloop metabolisme. Echter, we hebben het niet opgenomen in de studie omdat er een significante vermindering van signaal in meerdere verbindingen, vooral Nicotinamide adenine dinucleotide verlaagd (NADH) en nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat verlaagd (NADPH) wanneer azijnzuur aan het standaard mengsel is toegevoegd. Azijnzuur had een hoge aantoonbaarheidsgrens van 612 μM, dus op deze hoge niveaus had het een negatief effect op de signalen van de andere metabolieten. Desondanks kan azijnzuur in monsters nog steeds worden opgespoord en gekwantificeerd door een standaard curve te creëren met alleen azijnzuur in de injectieflacon. Azijnzuur had een m/z-waarde van 134,0, retentietijd van 5,78 min, en een lineair bereik van 612 μM tot 5000 μM (R2 = 0,986) wanneer gelabeld met 12C-aniline. De overgebleven metabolieten niet elkaars ionen signaal te veranderen en vertegenwoordigen een uitgebreid mengsel te karakteriseren CFPS metabolisme. Het hier gepresenteerde protocol is beperkt tot metabolieten die betrokken zijn bij centraal koolstof-en energiemetabolisme. Dus, de huidige methode is niet in staat te meten metaboliet overvloed van andere trajecten die van belang kunnen zijn, zoals vetzuur en aminozuur metabolisme.
Samen hebben we een snel, robuust protocol ontwikkeld voor de karakterisering en absolute kwantificering van 40 verbindingen die betrokken zijn bij de glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, het energiemetabolisme en de cofactor-regeneratie in CFP'S Reacties. De methode werd gebaseerd op interne normen met een label van 13c-aniline, terwijl het monster werd getagd met 12c-aniline. De interne normen en monster verbindingen hebben ionen onderdrukkings effecten gecoeerd en geëlimineerd die een nauwkeurige kwantificering van individuele metabolieten in complexe metaboliet mengsels mogelijk hebben gemaakt. We identificeerden een totaal van 40 verbindingen (41, met inbegrip van azijnzuur) die kunnen worden opgespoord en gekwantificeerd in een celvrij reactiemengsel; de lijst van metabolieten kan echter verder worden uitgebreid en aangepast aan het specifieke biochemische proces van belang. Zo biedt de methode een robuuste en nauwkeurige benadering om de celvrije stofwisseling te karakteriseren, wat potentieel cruciaal is voor het verbeteren van de opbrengst, productiviteit en energie-efficiëntie van cel-vrije processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het beschreven werk werd gesteund door het centrum op de fysica van kanker metabolisme door middel van Award nummer 1U54CA210184-01 van het National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Cancer Institute of de National Institutes of Health. De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D.
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
