Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en robust protokol for at kvantificere 40 forbindelser involveret i Central Carbon og energimetabolisme i celle-fri proteinsyntese reaktioner. Den celle frie syntese blanding er derivatized med anilin for effektiv adskillelse ved hjælp af omvendt fase væskekromatografi og derefter kvantificeret ved massespektrometri ved hjælp af isotopisk mærkede interne standarder.

Abstract

Celle-fri Proteinsyntese (CFP'ER) er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi til in vitro-produktion af proteiner. Men hvis CFP'ER kommer til at bevæge sig ud over laboratoriet og blive en udbredt og standard lige i tiden fremstillingsteknologi, skal vi forstå de præstationsgrænser for disse systemer. Mod dette spørgsmål, vi udviklet en robust protokol til kvantificere 40 forbindelser involveret i glycolyse, pentose fosfat pathway, tricarboxylsyre cyklus, energimetabolisme og cofaktor regenerering i CFPS reaktioner. Metoden bruger interne standarder Tagged med 13c-Anilin, mens forbindelser i prøven er derivatized med 12c-anilin. De interne standarder og prøven blev blandet og analyseret ved omvendt fase væskekromatografi-massespektrometri (LC/MS). Co-eluering af forbindelser eliminerede ionsuppression, hvilket gjorde det muligt nøjagtigt at kvantificere metabolitten koncentrationer over 2-3 størrelsesordener, hvor den gennemsnitlige korrelationskoefficient var 0,988. Fem af de 40 forbindelser blev ukodet med Anilin, men de blev stadig påvist i CFPS-prøven og kvantificerede med en standardkurve metode. Kromatografi kørslen tager ca. 10 min. for at fuldføre. Tilsammen udviklede vi en hurtig og robust metode til at adskille og præcist kvantificere 40-forbindelser, der er involveret i CFP'ER, i en enkelt LC/MS-løbetur. Metoden er en omfattende og præcis tilgang til at karakterisere cellefri metabolisme, så vi i sidste ende kan forstå og forbedre udbyttet, produktiviteten og energieffektiviteten af celle frie systemer.

Introduction

Celle-fri Proteinsyntese (CFP'ER) er en lovende platform for fremstilling af proteiner og kemikalier, en applikation, der traditionelt har været forbeholdt levende celler. Celle frie systemer er afledt af rå celleekstrakter og eliminere komplikationer forbundet med cellevækst1. Derudover giver CFP'ER mulighed for direkte adgang til metabolitter og de biosyntetiske maskiner uden indblanding fra en cellevæg. Der har imidlertid manglet en grundlæggende forståelse af præstations grænserne for celle frie processer. High-gennemløb metoder til metabolisering kvantificering er værdifulde for karakterisering af stofskiftet og er afgørende for opførelsen af metaboliske beregningsmæssige modeller2,3,4. Fælles metoder, der anvendes til bestemmelse af metabolitten koncentrationer omfatter nuklear magnetisk resonans (NMR), Fourier transformation-infrarød spektroskopi (ft-IR), enzym-baserede assays, og massespektrometri (MS)5,6,7 ,8. Men, disse metoder er ofte begrænset af deres manglende evne til effektivt at måle flere forbindelser på én gang og ofte kræver en prøvestørrelse større end typiske celle-fri reaktioner. For eksempel kan enzym baserede assays ofte kun bruges til at kvantificere en enkelt forbindelse i en løbetur og er begrænset, når Prøvestørrelsen er lille, såsom i celle frie proteinsyntese reaktioner (typisk på en 10-15 μL skala). I mellemtiden kræver NMR en høj forekomst af metabolitter til påvisning og kvantificering5.  Mod disse mangler, kromatografi metoder i tandem med massespektrometri (LC/MS) giver flere fordele, herunder høj følsomhed og evnen til at måle flere arter samtidigt9; den analytiske kompleksitet stiger imidlertid betydeligt med antallet og mangfoldigheden af de arter, der måles. Det er derfor vigtigt at udvikle metoder, der fuldt ud realisere de høje gennemløb potentiale LC/MS-systemer. Forbindelser i en prøve adskilles ved hjælp af væskekromatografi og identificeres gennem massespektrometri. Signalet af forbindelsen afhænger af dets koncentration og ioniserings effektivitet, hvor ioniseringen kan variere mellem forbindelser og kan også afhænge af prøve matrixen.

Opnåelse af samme ioniserings effektivitet mellem prøven og standarderne er en udfordring, når LC/MS bruges til at kvantificere analytter. Yderligere, kvantificering bliver mere udfordrende med metabolitten mangfoldighed på grund af signal opdeling og heterogenitet i proton affinitet og polaritet10. Endelig kan Co-eluting matrix af prøven også påvirke ioniserings effektiviteten af forbindelserne. For at løse disse problemer, metabolitter kan være kemisk derivatized, øge separation opløsning og følsomhed ved LC/MS-systemer, mens samtidig faldende signal opdeling i nogle tilfælde10,11. Kemisk derivatisering virker ved at tagge specifikke funktionelle grupper af metabolitter til at justere deres fysiske egenskaber som ladning eller hydrofobicitet for at øge ioniserings effektivitet11. Forskellige mærknings agenter kan anvendes til at målrette mod forskellige funktionelle grupper (f. eks. aminer, hydroxyls, phosphater, carboxylsyrer osv.). Aniline, en sådan forædling agent, mål flere funktionelle grupper på én gang, og tilføjer en hydrofobe komponent i hydrofile molekyler, og dermed øge deres separation opløsning og signal12. For at imødegå den Co-eluting matrix ion suppression effekt, Yang og kollegaer udviklet en teknik baseret på gruppe specifik intern standard teknologi (gsist) mærkning, hvor standarder er mærket med 13C anilin isotoper og blandes med prøven 12,13. Metabolitten og den tilsvarende interne standard har samme ioniserings effektivitet, da de er co-elute, og deres intensitets forhold kan anvendes til at kvantificere koncentrationen i den eksperimentelle prøve.

I denne undersøgelse udviklede vi en protokol til påvisning og kvantificering af 40-forbindelser, der er involveret i glykolyse, pentose-fosfat vejen, tricarboxylsyrecyklussen, energimetabolisme og cofaktor regenerering i CFPS-reaktioner. Metoden er baseret på GSIST tilgang, hvor vi brugte 12c-aniline og 13c-anilin til at mærke, opdage og kvantificere metabolitter ved hjælp af omvendt fase LC/MS. Det lineære område af alle forbindelser strakte 2-3 størrelsesordener med en gennemsnitlig korrelationskoefficient på 0,988. Således, metoden er en robust og præcis tilgang til afhøre celle-fri metabolisme, og muligvis helcelle ekstrakter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. klargøring af reagenser til anilin mærkning

  1. Forbered en 6 M anilin opløsning ved pH 4,5. Arbejder i en hætte, kombinere 550 μL anilin med 337,5 μL LCMS kvalitet vand og 112,5 μL af 12 M saltsyre (HCl) i et centrifugeglas. Vortex brønd og opbevares ved 4 °C.
    Bemærk: anilin kan opbevares ved 4 °C i 2 måneder.
    Forsigtig: anilin er meget giftigt og bør behandles med i en røg hætte. Saltsyre er meget ætsende
  2. Forbered en 6 M 13C anilin opløsning ved pH 4,5. Kombiner 250 mg 13C6-anilin med 132 μL vand og 44 μl af 12 M HCL. vortex brønd og opbevares ved 4 °c.
  3. Forbered 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochlorid (EDC) opløsning. 2 mg EDC opløses i 10 μL vand for hver prøve, der skal mærkes, og vortex brønd.
    Bemærk: EDC-opløsningen skal tilberedes samme dag som reaktionen. EDC fungerer som en katalysator for derivatisering af forbindelser med anilin12.

2. udarbejdelse af standarder

  1. Lav separate stamopløsninger af alle forbindelser opløst i LC/MS grade vand (tabel 1).
  2. Klargøring af intern standard stamopløsning
    1. Kombinere alle forbindelser undtagen nicotinamid adenin dinucleotid (NAD), nicotinamid adenin dinucleotidphosphat (NADP), Flavin adenin dinucleotid (FAD), acetyl coenzym A (ACA) og glycerol 3-fosfat (Gly3P), med passende volumener til at Opret en 2 mM stamopløsning af alle forbindelser.
  3. Kombiner NAD, NADP, FAD, ACA og Gly3P med passende volumener til at skabe en 2 mM stamopløsning.

3. klargøring af prøven (figur 1)

  1. Dæmpere og udfældede proteinerne i en celle-fri proteinsyntese reaktion ved at tilføje en tilsvarende mængde iskold 100% ethanol til reaktionen. Prøven centrifugeres ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °c. Supernatanten overføres til et nyt centrifugeglas.
    Bemærk: prøverne kan opbevares ved-80 °C på dette tidspunkt og analyseres på et senere tidspunkt

4. mærkning reaktion

  1. Mærkning prøve med 12C-anilin opløsning
    1. 6 μL af prøven overføres til et nyt centrifugeglas, og volumenet bringes op på 50 μL med vand.
      Bemærk: volumen stikprøvestørrelse kan afhænge af den specifikke CFPS-reaktion.
    2. Tilsæt 5 μL 200 mg/mL EDC opløsning.
    3. Tilsæt 5 μL 12C-anilin opløsning.
      Bemærk: anilinopløsningen adskilles i to faser. Bland godt før tilsætning til reaktionen.
    4. Hvirv reaktionen med blid omrystning i 2 timer ved stuetemperatur.
    5. Efter 2 timer fjernes rørene fra rysteapparatet og tilsættes 1,5 μL triethylamin (te) til reaktionen i en stinkhætte.
      Bemærk: triethylamin hæver pH-værdien af opløsningen, som standser anilin-mærknings reaktionen og stabiliserer forbindelserne.
      Forsigtig: triethylamin er giftigt og forårsager irritation af øjnene og luftvejene.
    6. Centrifugeres ved 13.500 x g i 3 min.
  2. Mærkning af interne standarder med 13C-anilin opløsning
    1. Fortyndet intern stamopløsning til 80 μM med en endelig volumen på 50 μL.
      NB: koncentrationen af de interne standarder kan justeres til et niveau, der er tæt på den eksperimentelle prøve.
    2. Tilsæt 5 μL 200 mg/mL EDC opløsning.
    3. Tilsæt 5 μL 13C-anilin opløsning.
    4. Hvirv reaktionen med blid omrystning i 2 timer ved stuetemperatur.
    5. Efter 2 timer fjernes rørene fra rysteapparatet og tilsættes 1,5 μL te til reaktionen i en stinkhætte.
    6. Centrifugeres ved 13.500 x g i 3 min.
  3. Kombinere Tagged intern standard og Tagged Sample
    1. Bland 25 μL 12c-anilin mærket prøve med 25 μl af 13c-anilin mærket standard.
    2. Overfør til et Auto-sampler-hætteglas, og analysér efter LC/MS-proceduren.
  4. Oprettelse af en standardkurve for ukodede metabolitter
    1. Fortyndet stamopløsning af umærkede metabolitter (NAD, NADP, FAD, ACA og Gly3P) til endelige koncentrationer på 320 μM, 80 μM, 20 μM og 5 μM med et volumen på 50 μL.
    2. Tilsæt 5 μL 200 mg/mL EDC opløsning.
    3. Tilsæt 5 μL 12C-anilin opløsning.
    4. Hvirv reaktionen med blid omrystning i 2 timer ved stuetemperatur.
    5. Efter 2 timer fjernes rørene fra rysteapparatet og tilsættes 1,5 μL te til reaktionen i en stinkhætte.
    6. Centrifugeres ved 13.500 x g i 3 min.
    7. Overfør supernatanten til et Auto-sampler-hætteglas, og analysér efter LC/MS-proceduren.
      Bemærk: de umærkede metabolitter følger samme procedure som prøven for at replikere prøve matrixen for at opretholde en tilsvarende ioniserings effektivitet.

5. opsætning af LC/MS procedure

  1. Klargøring af opløsningsmidler
    1. Tilbered 5 mM Tri-butylamin (TBA) vandig opløsning justeret til pH 4,75 med eddikesyre.
      Bemærk: TBA i den mobile fase hjælper analytterne opnå god opløsning og separation14.
    2. Forbered 5 mM TBA i acetonitril (ACN).
    3. Forbered vaske solvens med 5% vand og 95% ACN.
    4. Forbered rensevæske med 95% vand og 5% ACN.
  2. Opsætning af MS-betingelser
    1. Sæt massespektrometer til negativ ion-tilstand med en sonde temperatur på 520 °C, negativ kapillær spænding på-0,8 kV, positiv kapillar spænding på 0,8 kV, og Indstil softwaren til at erhverve data ved 5 punkter/s.
    2. Indstil valgte ion-optagelser (SIR) for hver metabolit med specificerede kegle spændinger og masse overladning (m/z) værdier. Se tabel 1.
  3. Initialisering af LC/MS i henhold til producentens anvisninger
    1. Primære opløsningsmiddel linjer i solvent manageren i 3 min.
    2. Prime vaske solvens (5% vand, 95% ACN) og rense opløsningsmiddel (95% vand, 5% ACN) for 15 s for 5 cyklusser.
    3. Indstil eksempel styringen til 10 °C.
    4. Installer en C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 150mm) kolonne og Initialiser kolonne med 100% ACN ved 0,3 mL/min i 10 min.
    5. Tilstand kolonnen på 95% vand og 5% ACN ved 0,3 mL/min i 10 min før indførelse af opløsningsmidler med buffere.
    6. Tilstand kolonnen ved 95% solvens A (5mM TBA vandig, pH 4,75) og 5% solvens B (5 mM TBA i ACN) ved 0,3 mL/min i 10 min.
    7. Indstil en graduerings protokol med elueringsprocessen startende ved 95% solvens A og 5% solvens B, forhøjet til 70% solvens B i 10 min, opløftet til 100% solvens B i 2 min. og opbevares ved 100% solvens B i 3 min. tilbagevenden til Initial tilstande (95% solvens A , 5% solvens B) over 1 min og hold i 9 min for at re-ækvibrere søjlen.
    8. Tilstand kolonnen med gradient protokol 3 gange før eventuelle injektioner på kolonnen.
  4. Intravenøs prøve og standarder
    1. 5 μL af prøven indsprøjtes i kolonnen, og de relevante m/z ion-intensiteter for 12C-anilin-mærket udtages.
    2. Injicer 5 μL af samme prøve igen, men denne gang får du m/z ion intensiteterne for de 13C-anilinmærkede standarder.
      Bemærk: vores LC/MS system er ikke i stand til at erhverve både 12c og 13c m/z INTENSITETER på den angivne Sir tid Windows, da det er for meget data at erhverve i det angivne tidsvindue. Derfor indsprøjtes den samme prøve to gange.
    3. Injicer ukodede metabolit-standarder fra laveste koncentration til højest og Optag de relevante m/z ion intensiteter.

6. kvantificering

  1. Opretter eksport metode
    1. I software til dataindsamling skal du vælge filer ≫ ny metode ≫ eksport metode.
    2. Angiv et filnavn, f. AnilineTagging_Date.
    3. Indskrive den eksport ASCII fil og gide en bibliotek hen til eksport den tekst fil hen til.
    4. Vælg Resume for allei rapport type.
    5. I afgrænsere, for kolonne select a ,. I rækkenskal du vælge [CR] [IF].
    6. I tabelskal du vælge Eksporter og derefter Rediger tabel for at medtage samplename, område, højde, beløb og enheder.
    7. Gem eksport metode.
  2. Kvantificering af metabolitter med interne standarder ved hjælp af dataindsamling software
    1. Under fanen Eksempelsæt skal du højreklikke på den tilsvarende LC/MS -kørsel og vælge Vis som > kanaler.
    2. Vælg alle SIR kanaler for 13C-aniline interne standarder for en injektion, højreklik og vælg anmeldelse.
    3. Hvis vinduet Opsætning af LC-behandlingsmetode ikke vises automatisk, skal du gå til Vis ≫ layout for behandlingsmetode.
    4. Gå til fanen integration i layout for behandlingsmetode, og Angiv apextrack som algoritmen.
    5. Gå til fanen udjævning , og Indstil typen til middelværdi og udjævningen til 13.
      Bemærk: ethvert udjævningen niveau kan vælges, så længe det er konsistent på tværs af alle prøver.
    6. Deaktiver MS 3D - behandlingunder fanen MS - kanal .
    7. I SIR Channel vinduet, integrere hver top, en kanal ad gangen. Når et højdepunkt er integreret, skal du gå til indstillinger ≫ Udfyld fra resultat , og detaljerne i toppen vil blive udfyldt under fanen komponenter . ændre spids navnet til det tilsvarende sammensatte navn.
    8. Når alle SIR kanaler er blevet evalueret, gemme behandlingsmetode og lukke vindue.
    9. Vælg alle SIR kanaler af 13c-aniline og 12c-anilin Tagged eksempel, højreklik og vælg proces.
    10. Markér feltet proces , Vælg Brug den angivne behandlingsmetode, og vælg den behandlingsmetode, der netop er gemt. Kontroller også eksport boksen, Vælg Brug den angivne eksport metode, og vælg den gemte eksport metode, der blev oprettet tidligere. Klik på OK.
    11. Åbn den eksporterede tekstfil med Excel og Beregn koncentrationen af det ukendte stof ved hjælp af:
      Equation 1
      hvor Cx, jeg er koncentrationen af den ukendte prøve for metabolit i, etx, jeg er det integrerede område af den ukendte metabolit i, enSTD, jeg er det integrerede område af den interne standard af metabolit i, CSTD, jeg er den koncentrationen af den interne standard for metabolit i, og D er fortyndingsfaktoren.
  3. Kvantificering af umærkede metabolitter med standardkurve
    1. Under fanen Eksempelsæt skal du højreklikke på den tilsvarende LC/MS-kørsel og vælge Vis som > kanaler.
    2. Vælg alle SIR kanaler for ukodede standarder for en injektion, højreklik og vælg anmeldelse.
    3. Hvis vinduet Opsætning af LC-behandlingsmetode ikke vises automatisk, skal du gå til Vis ≫ layout for behandlingsmetode.
    4. Gå til fanen integration i layout for behandlingsmetode, og Angiv apextrack som algoritmen.
    5. Gå til fanen udjævning , og Indstil typen til middelværdi og udjævningen til 13.
      Bemærk: ethvert udjævningen niveau kan vælges, så længe det er konsistent på tværs af alle prøver.
    6. Deaktiver MS 3D - behandlingunder fanen MS - kanal .
    7. I SIR Channel vinduet, integrere hver top, en kanal ad gangen. Når et højdepunkt er integreret, skal du gå til indstillinger ≫ Udfyld fra resultat , og detaljerne i toppen vil blive udfyldt under fanen komponenter . ændre spids navnet til det tilsvarende sammensatte navn.
    8. Når alle SIR kanaler er blevet evalueret, gemme behandlingsmetode og lukke vindue.
    9. Under fanen Eksempelsæt skal du højreklikke på eksempel sættet og vælge alter Sample.
    10. Vælg beløb i det nye vindue.
    11. Vælg Kopiér fra proces metode, og vælg den proces metode, der lige er blevet gemt.
    12. Indtast koncentrationen af hver metabolit for hvert hætteglas, og Indtast enheden som < μM for hver komponent (eller den tilsvarende enhed), og vælg OK.
    13. Vælg eksempel sættet igen, højreklik, Vis som ≫ kanaler.
    14. Vælg alle SIR kanaler af ukodede metabolitter for standarderne, højreklik og vælg proces.
    15. Markér afkrydsningsfeltet proces , og vælg Brug den angivne behandlingsmetode. Vælg den relevante behandlingsmetode, og klik på OK.
    16. Vælg SIR kanaler for alle ukodede metabolitter til prøverne, højreklik og vælg proces.
    17. Markér feltet proces , Vælg Brug den angivne behandlings metode, og vælg den behandlingsmetode, der lige er blevet gemt. Kontroller også eksport boksen, Vælg Brug den angivne eksport metode , og vælg den gemte eksport metode, der blev oprettet tidligere. Klik på OK.
    18. Kvantificere de ukodede metabolitter med standardkurven og eksportere resultaterne til en tekstfil til den angivne mappe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et proof-of-koncept brugte vi protokollen til at kvantificere metabolitter i et E. coli -baseret CFPS-system, der udtrykker grønt fluorescerende protein (gfp).  CFPS-reaktionen (14 μL) blev standset og deproteiniseret med ethanol. CFPS-prøven blev derefter mærket med 12c-Anilin, mens standarderne blev mærket med 13c-anilin. Den mærkede prøve og standarderne blev derefter kombineret og injiceret i LC/MS (figur 1). Protokollen afslørede og kvantificerede 40 metabolitter involveret i central kulstof-og energimetabolisme ved hjælp af interne standarder, mens en standardkurve for 5 af metabolitterne, der ikke var mærket med Anilin, også blev udviklet (figur 2). De forskellige metabolitter, der var involveret i disse veje, var en klasse af phosphorylerede sukkerarter, phosphocarboxylsyrer, carboxylsyrer, nukleotider og cofactors. Derivatiseringen med anilin introducerede hydrofobe-delen i hydrofile-molekyler, som lettede en mere effektiv adskillelse ved hjælp af omvendt fase kromatografi12. Desuden, metoden aktiveret adskillelse af strukturelle isomer par såsom glucose 6-phosphat og fruktose 6-phosphat i en enkelt LC/MS Run. Hver sammensatte masse overladning (m/z) ratio og retentionstiden blev identificeret forud for forsøget ved at injicere 1 mM af et stof ad gangen og sammenligne masse spektret til blank (tabel 1).

Detektionsgrænsen og rækkevidden af lineariteten for alle forbindelser blev anslået ved at producere en standardkurve, der varierede fra 0,10 μM til 400 μM (tabel 2). Den gennemsnitlige korrelationskoefficient (R2) for alle forbindelser var 0,988, og de fleste forbindelser havde et lineært interval på 3-størrelsesordener. Tre forbindelser havde bemærkelsesværdige mætningseffekter, især Alpha-ketoglutarat, som havde et lineært interval fra 0,1 μM til 25 μM. isocitrat og citrat havde også mætningseffekter over 100 μM.

Figure 1
Figur 1: skematisk arbejdsgang for anilin-tagging. Den celle frie proteinsyntese reaktion er deproteiniseret og mærket med 12c-Anilin, mens en standard bestand blanding er mærket med 13c-anilin. Begge blandinger blandes derefter ved et 1:1 volumetrisk forhold og analyseres med LC/MS. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: overlappede udvalgte ionkromatogrammer for 40 metabolitter. Massekromatogram fra en enkelt LC/MS-kørsel af en 40 μM standard blanding af 40 metabolitter. Toppe blev identificeret ved deres retentions tid og m/z værdier for hver forbindelse. Komplette sammensatte navne og deres forkortelser er anført i tabel 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Spids antal Metabolit Forkortelse KEGG ID Retentions tid (min.) 12C m/z 13C m/z ikke-label m/z Cv MS-arter
1 Glycerol 3-phosphat Gly3P C00093 3,85 153 10 M – H2O – H
2 Nicotinamid adenin dinucleotid Nad C00003 3,96 698 10 M + CL – H
3 Glukose GLC C00031 4,06 289,9 296 15 M + A + CL-H
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 5,41 364 370 10 M + A – H
5 Fruktose 6-phosphat F6P C00085 5,48 334 340 10 M + A – H
6 Guanossinmonophosphat Gmp C00144 5,57 437,05 443 10 M + A – H
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 5,58 304 310 10 M + A – H
8 Cytidinmonophosphat Cmp C00055 5,59 397,09 403 10 M + A – H
9 Laktat Lac C00186 5,77 164,05 170 10 M + A – H
10 Adenosinmonophosphat Amp C00020 5,85 421,1 427,1 10 M + A – H
11 Uridin-monophosphat Ump C00105 5,88 398,07 404 10 M + A – H
12 Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat NADP C00006 6,39 724 10 M-H2O – H
13 3-fosfoglycerinsyre 3PG C00197 6,63 242 248,06 15 M + A – H2O – H
14 Cytidindiphosphat Cdp C00112 6,72 477 483 10 M + A – H
15 Guanosindiphosphat Bnp C00035 6,87 517 523 10 M + A – H
16 Adenosin-diphosphat Adp C00008 6,94 501 507 10 M + A – H
17 Uridin-diphosphat Udp C00015 6,97 478 484 10 M + A – H
18 Flavin adenin dinucleotid FAD C00016 7,03 784,15 15 M – H
19 Fructose-1,6-bisphosphat F16P C05378 7,1 395,95 402,1 10 M + A – H2O – H
20 Gluconat 6-phosphat 6PG C00345 7,11 425,1 437 10 M + 2A – H
21 Nicotinamid adenin dinucleotid reduceret Nadh C00004 7,23 633,13 639,08 10 M + A + H2O – nicotinamid – H
22 Glucose 6-fosfat G6P C00668 7,32 409,1 421,1 10 M + 2A – H
23 Ribose 5-fosfat R5P C00117 7,54 379,1 391,1 15 M + 2A – H
24 Erythrose 4-fosfat E4P C00279 7,71 348,9 361 10 M + 2A – H
25 Cytidintrifosfat Ctp C00075 7,84 557 563 5 M + A – H
26 Guanosin trifosfat GTP C00044 7,93 597 603 5 M + A – H
27 Oxalacetat OAA C00036 7,94 281 293 25 M + 2A – H
28 Alpha-ketoglutarat Akg C00026 7,95 295 307,1 15 M + 2A – H
29 Uridin trifosfat Utp C00075 7,97 558 564 10 M + A – H
30 Adenosintrifosfat Atp C00002 8,03 581 587 15 M + A – H
31 Tenofovirdisoproxilfumarat FUM C00122 8,09 265 277,1 10 M + 2A – H
32 Pyruvat Pyr C00022 8,09 162 168 25 M + A – H
33 Malate Mal C00149 8,09 283,06 295,15 10 M + 2A – H
34 D-glyceraldehyd-3-phosphat Kløft C00118 8,09 319 331,1 5 M + 2A – H
35 Acetyl-coenzym A Aca C00024 8,16 790 10 M – H2O – H
36 Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat reduceret NADPH C00005 8,23 694,92 700,82 10 M + A – nicotinamid – H
37 Carboxylase Pep C00074 8,28 317 329,1 20 M + 2A – H
38 Succinat SUCC C00042 8,64 267,07 279,1 15 M + 2A – H
39 Isocitrat ICIT C00311 10,13 398 416 10 M + 3A – H2O – H
40 Citrat Cit C00158 10,46 416,1 434,06 20 M + 3A – H

Tabel 1: identifikation og mærkning resultater af metabolitter. Hver sammensat er tilsvarende peak nummer, retentions tid, m/z værdi for ikke-mærket, 12c og 13c mærket, og MS arter. MS arter, en står for anilin tag.

Peak No. Metabolit Forkortelse KEGG ID Koncentration (mM) SD (n = 3) Detektionsgrænse (μM) Grænse for lineær rækkevidde (μM) R ^ 2
1 Glycerol 3-phosphat Gly3P C00093 0,377 0,034 0,1 400 0,995
2 Nicotinamid adenin dinucleotid Nad C00003 0,052 0,010 0,39 400 0,993
3 Glukose GLC C00031 0,002 0,000 0,1 400 0,997
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 0,007 0,000 0,16 400 0,988
5 Fruktose 6-phosphat F6P C00085 0,029 0,004 0,1 400 0,986
6 Guanossinmonophosphat Gmp C00144 0,007 0,001 0,39 100 0,992
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 0,035 0,002 0,39 400 0,996
8 Cytidinmonophosphat Cmp C00055 0,045 0,001 0,1 100 0,992
9 Laktat Lac C00186 2,134 0,048 0,1 400 0,988
10 Adenosinmonophosphat Amp C00020 0,020 0,002 0,1 100 0,992
11 Uridin-monophosphat Ump C00105 0,021 0,000 0,1 100 0,997
12 Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat NADP C00006 0,014 0,002 0,34 400 0,950
13 3-fosfoglycerinsyre 3PG C00197 6,125 0,239 0,1 100 0,996
14 Cytidindiphosphat Cdp C00112 0,202 0,029 0,39 400 0,997
15 Guanosindiphosphat Bnp C00035 0,146 0,027 1,5625 400 0,984
16 Adenosin-diphosphat Adp C00008 0,797 0,161 0,39 400 0,995
17 Uridin-diphosphat Udp C00015 0,212 0,036 0,39 400 0,991
18 Flavin adenin dinucleotid FAD C00016 0,008 0,001 0,1 400 0,958
19 Fructose-1,6-bisphosphat F16P C05378 3,643 0,105 0,39 400 0,989
20 Gluconat 6-phosphat 6PG C00345 0,017 0,001 0,39 400 0,989
21 Nicotinamid adenin dinucleotid reduceret Nadh C00004 0,063 0,028 0,39 100 0,972
22 Glucose 6-fosfat G6P C00668 0,046 0,002 0,1 400 0,984
23 Ribose 5-fosfat R5P C00117 0,055 0,005 0,39 100 0,999
24 Erythrose 4-fosfat E4P C00279 0,038 0,007 0,39 400 0,979
25 Cytidintrifosfat Ctp C00075 0,896 0,078 6,25 100 0,998
26 Guanosin trifosfat GTP C00044 0,870 0,109 6,25 100 0,993
27 Oxalacetat OAA C00036 0,023 0,008 0,56 400 0,997
28 Alpha-ketoglutarat Akg C00026 0,391 0,020 0,1 25 0,979
29 Uridin trifosfat Utp C00075 0,845 0,092 1,5625 400 0,998
30 Adenosintrifosfat Atp C00002 1,557 0,188 1,5625 400 0,991
31 Tenofovirdisoproxilfumarat FUM C00122 0,576 0,100 1,5625 100 0,999
32 Pyruvat Pyr C00022 5,813 0,804 0,39 400 0,993
33 Malate Mal C00149 2,548 0,269 0,1 400 0,991
34 D-glyceraldehyd-3-phosphat Kløft C00118 2,194 0,367 0,1 100 0,974
35 Acetyl-coenzym A Aca C00024 0,196 0,044 0,1 100 0,991
36 Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat reduceret NADPH C00005 0,006 0,010 0,14 100 0,990
37 Carboxylase Pep C00074 3,442 0,345 0,1 100 0,962
38 Succinat SUCC C00042 5,683 0,573 0,1 320 0,999
39 Isocitrat ICIT C00311 0,003 0,006 0,39 100 0,998
40 Citrat Cit C00158 0,002 0,001 0,1 100 0,981

Tabel 2: kvantificering af metabolitten i en repræsentativ CFPS-prøve. Koncentrationen af hver metabolit og standardafvigelsen. Detektionsgrænse, interval af linearitet og korrelationskoefficient identificeret fra standardkurver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Celle frie systemer har ingen cellevæg, og der er således direkte adgang til metabolitter og de biosyntetiske maskiner uden behov for kompleks prøveforberedelse. Men meget lidt arbejde er blevet gjort for at udvikle grundige og robuste protokoller til kvantitativt afhøre celle-fri reaktionssystemer. I denne undersøgelse udviklede vi en hurtig, robust metode til at kvantificere metabolitter i celle frie reaktionsblandinger og potentielt i helcelle ekstrakter. Individuel kvantificering af metabolitter i komplekse blandinger, såsom dem, der findes i celle frie reaktioner, eller fuldcelle ekstrakter, er udfordrende af flere årsager. Centralt blandt disse årsager er kemisk diversitet. Rækken af funktionelle grupper, som samtidig findes i disse blandinger (f. eks. carboxylsyrer, aminer, phosphater, hydroxyls osv.), øger i høj grad den analytiske kompleksitet. For at omgå dette, brugte vi en anilin forædling metode i kombination med 13C interne standarder for at indføre hydrofobe komponenter til metabolitten blandinger. Ved hjælp af denne metode, vi solidt påvist og kvantificeret 40 metabolitter i en celle-fri reaktion i en enkelt LC/MS Run. Protokollen Tagged 35 af 40 forbindelser i denne undersøgelse, mens de resterende 5 forbindelser blev kvantificeret med en standardkurve metode. Tidligere arbejde foreslog reaktions forholdene dannede et intramolekulært salt mellem Amin og fosfatgruppe, der hæmmede forædling12. Der blev ikke identificeret reaktionsbetingelser for samtidig derivatisering af alle 40-forbindelser; men det nuværende alternativ er kvantificering med en standardkurve metode. Mens vi demonstrerede denne teknik i en celle-fri reaktionsblanding, kunne det også sandsynligvis anvendes på helcelle ekstrakter, hvilket potentielt tillod den absolutte kvantificering af intracellulære metabolitters koncentrationer. Sidstnævnte ansøgning har relevans for en række vigtige spørgsmål inden for bioteknologi og menneskers sundhed.

Den metode, der præsenteres her, var baseret på en tidligere teknik (gsist), som blev anvendt på helcelle ekstrakter af gær S. cerevisiae12,13. I denne undersøgelse, vi udvidet antallet af forbindelser, som kunne påvises og kvantificeres, herunder alle 12 nukleotider (xMP, XDP, xtp, hvor x er A, C, G og U). Tilsætning af disse forbindelser kan have vigtige biologiske konsekvenser. For eksempel er disse nukleotider stærkt involveret i transskription og oversættelsesprocesser, som er en af de centrale processer af interesse i CFPS-applikationer, og mere generelt er forbindelserne vigtige i en række fysiologiske funktioner. Desuden var vi i stand til at påvise eddikesyre, som er en vigtig metabolit, når man undersøger overløb metabolisme. Men vi har ikke inkludere det i undersøgelsen, fordi der var en signifikant reduktion af signalet i flere forbindelser, især nicotinamid adenin dinucleotid reduceret (NADH) og nicotinamid adenin dinucleotid fosfat reduceret (NADPH) når eddikesyre blev føjet til standard blandingen. Eddikesyre havde en høj detektionsgrænse på 612 μM, således at det på disse høje niveauer havde en negativ effekt på de andre metabolitters signaler. På trods af dette kan eddikesyre stadig påvises og kvantificeres i prøver ved at skabe en standardkurve med kun eddikesyre i hætteglasset. Eddikesyre havde en m/z-værdi på 134,0, retentionstiden på 5,78 min og et lineært område fra 612 μM til 5000 μM (R2 = 0,986), når det blev mærket med 12C-anilin. De resterende metabolitter ændrede ikke hinandens ion-signal og repræsenterer en omfattende blanding, der karakteriserer CFPS-metabolismen. Den protokol, der præsenteres her, er begrænset til metabolitter involveret i central kulstof og energimetabolisme. Således er den nuværende metode ikke i stand til at måle metabolitten overflod fra andre veje, der kan være af betydning, såsom fedtsyre og aminosyre metabolisme.

Tilsammen udviklede vi en hurtig, robust protokol til karakterisering og absolut kvantificering af 40 forbindelser, der er involveret i glycolyse, pentose fosfat pathway, tricarboxylsyre cyklussen, energimetabolisme og cofaktor regenerering i cfp'er Reaktioner. Metoden var baseret på interne standarder mærket med 13c-Anilin, mens prøven blev mærket med 12c-anilin. De interne standarder og prøve forbindelser medeluppes og eliminerede ionundertrykkelses effekter, hvilket gav mulighed for nøjagtig kvantificering af individuelle metabolitter i komplekse metabolit blandinger. Vi identificerede i alt 40 forbindelser (41, hvis inklusive eddikesyre), der kan påvises og kvantificeres i en celle-fri reaktionsblanding; listen over metabolitter kan dog udvides og tilpasses til den særlige biokemiske proces af interesse. Således, metoden giver en robust og præcis tilgang til at karakterisere celle-fri metabolisme, som er potentielt afgørende for at forbedre udbyttet, produktivitet og energieffektivitet af celle-fri processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Det beskrevne arbejde blev støttet af Center på fysik af kræft metabolisme gennem Award nummer 1U54CA210184-01 fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af National Cancer Institute eller National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Tags

Biokemi celle-fri proteinsyntese væskekromatografi-massespektrometri anilin tagging central Carbon energimetabolisme intern standard metaboliske netværk isotop mærkning
Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S.,… More

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter