Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en robust protokoll for å kvantifisere 40 forbindelser involvert i Sentral karbon og energi metabolisme i celle-fri protein syntese reaksjoner. Den celle frie syntese blandingen er derivatized med anilin for effektiv separasjon ved hjelp av reversert-fase flytende kromatografi og deretter kvantifisert av masse massespektrometri bruker isotopically merket interne standarder.

Abstract

Celle-fri proteinsyntese (CFPS) er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi for in vitro produksjon av proteiner. Men hvis CFPS kommer til å gå utover laboratoriet og bli en utbredt og standard akkurat i tide produksjon teknologi, må vi forstå ytelsen grensene for disse systemene. Mot dette spørsmålet, utviklet vi en robust protokoll for å kvantifisere 40 forbindelser involvert i Glykolysen, den pentose fosfat veien, tricarboxylic syre syklus, energi metabolisme og kofaktor regenerering i CFPS reaksjoner. Metoden bruker interne standarder merket med 13c-anilin, mens forbindelser i utvalget er derivatized med 12c-anilin. Den interne standarder og prøven ble blandet og analysert av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC/MS). Eluering av forbindelser eliminert ion undertrykkelse, slik at nøyaktig kvantifisering av metabolitten konsentrasjoner over 2-3 størrelsesordener der den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienten var 0,988. Fem av de 40 forbindelsene ble umerkede med anilin, men de ble likevel oppdaget i CFPS prøven og kvantifisert med en standard kurve metode. Det kromatografiske løpe tar ca 10 min å fullføre. Til sammen har vi utviklet en rask, robust metode for å skille og nøyaktig kvantifisere 40 forbindelser involvert i CFPS i en enkelt LC/MS Run. Metoden er en omfattende og nøyaktig tilnærming til å karakterisere celle-fri metabolisme, slik at til slutt, kan vi forstå og forbedre avkastningen, produktivitet og energieffektivisering av celle-frie systemer.

Introduction

Cell-fri proteinsyntese (CFPS) er en lovende plattform for produksjon av proteiner og kjemikalier, et program som tradisjonelt har vært forbeholdt levende celler. Cell-frie systemer er avledet fra rå celle ekstrakter og eliminere komplikasjoner forbundet med cellevekst1. I tillegg gir CFPS for direkte tilgang til metabolitter og biosyntetiske maskiner uten innblanding av en cellevegg. Imidlertid har en fundamental forståelse av ytelsen grensene for celle-fri prosesser manglet. Høy gjennomstrømming metoder for metabolitten kvantifisering er verdifulle for karakterisering av metabolisme og er avgjørende for bygging av metabolske beregningsorientert modeller2,3,4. Vanlige metoder som brukes til å bestemme metabolitten konsentrasjoner inkluderer kjernefysisk magnetisk resonans (NMR), Fourier Transform-infrarød spektroskopi (FT-IR), enzym-baserte analyser, og Mass massespektrometri (MS)5,6,7 ,8. Men disse metodene er ofte begrenset av deres manglende evne til å effektivt måle flere forbindelser samtidig og ofte krever en utvalgsstørrelse større enn typiske celle-frie reaksjoner. Enzymbasert analyser kan for eksempel ofte bare brukes til å kvantifisere en enkelt forbindelse i en løpetur, og er begrenset når utvalgsstørrelsen er liten, for eksempel i celle frie protein syntese reaksjoner (vanligvis kjøres på en 10-15-skala på μL). I mellomtiden krever NMR en høy overflod av metabolitter for deteksjon og kvantifisering5.  Mot disse svakhetene, kromatografi metoder i tandem med masse massespektrometri (LC/MS) gir flere fordeler, inkludert høy følsomhet og evnen til å måle flere arter samtidig9; imidlertid øker den analytiske kompleksiteten betraktelig med antallet og mangfoldet av arter som måles. Det er derfor viktig å utvikle metoder som fullt ut realiserer potensialet i LC/MS-systemer med høy gjennomstrømming. Sammensetninger i en prøve er adskilt av flytende kromatografi og identifisert gjennom masse massespektrometri. Signalet av det sammensatte avhenger av konsentrasjonen og ionisering effektivitet, hvor ionisering kan variere mellom forbindelser og kan også avhenge av utvalget matrise.

Å oppnå samme ionisering effektivitet mellom prøven og standardene er en utfordring ved bruk av LC/MS for å kvantifisere analytter. Videre blir kvantifisering mer utfordrende med metabolitten mangfold på grunn av signal splitting og heterogenitet i Proton affinitet og polaritet10. Til slutt, den co-tent matrise av prøven kan også påvirke ionisering effektiviteten av forbindelsene. For å løse disse problemene, kan metabolitter være kjemisk derivatized, øke separasjon oppløsning og følsomhet av LC/MS systemer, samtidig redusere signal splitting i noen tilfeller10,11. Kjemisk derivatization fungerer ved å tagge spesifikke funksjonsgrupper av metabolitter for å justere sine fysiske egenskaper som ladning eller hydrofobisiteten for å øke ionisering effektivitet11. Ulike merking agenter kan brukes til å målrette ulike funksjonelle grupper (f. eks aminer, hydroksyler, fosfater, kar bok syls syrer, etc.). Anilin, en slik derivatization agent, mål flere funksjonelle grupper samtidig, og legger en hydrofobe komponent i hydrofile molekyler, og dermed øke deres separasjon oppløsning og signal12. For å håndtere co-tent Matrix ion undertrykkelse effekt, Yang og kolleger utviklet en teknikk basert på Group Specific intern standard Technology (GSIST) merking der standarder er merket med 13C anilin isotoper og blandes med prøven 12,13. Metabolitten og tilsvarende interne standarden har samme ionisering effektivitet siden de co-eluere, og deres intensitet ratio kan brukes til å kvantifisere konsentrasjonen i den eksperimentelle prøven.

I denne studien, utviklet vi en protokoll for å oppdage og kvantifisere 40 forbindelser involvert i Glykolysen, den pentose fosfat veien, tricarboxylic syre syklus, energi metabolisme og kofaktor regenerering i CFPS reaksjoner. Metoden er basert på GSIST tilnærming, der vi brukte 12c-anilin og 13c-anilin å merke, oppdage og kvantifisere metabolitter bruker reversert-fase LC/MS. Den lineære rekkevidden av alle forbindelser spredte 2-3 størrelsesordener med en gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient på 0,988. Således er metoden en robust og nøyaktig tilnærming til å forhøre celle-fri metabolisme, og muligens hel celle ekstrakter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av reagenser for anilin merking

  1. Forbered en 6 M anilin løsning på pH 4,5. Ved å arbeide i hette, kombinerer 550 μL av anilin med 337,5 μL av LCMS-grade vann og 112,5 μL av 12 M saltsyre (HCl) i et sentrifugerør. Vortex godt og oppbevares ved 4 ° c.
    Merk: anilin kan oppbevares ved 4 ° c i 2 måneder.
    FORSIKTIG: anilin er svært giftig og bør strikkes med en avtrekksvifte. Saltsyre er svært etsende
  2. Forbered en 6 M 13C anilin-løsning ved pH 4,5. Kombiner 250 mg 13c6-anilin med 132 μL vann og 44 μL av 12 M HCL. Vortex godt og oppbevares ved 4 ° c.
  3. Forbered 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) løsning. Løs opp 2 mg EDC i 10 μL vann for hver prøve som skal merkes og Vortex godt.
    Merk: EDC løsningen skal være forberedt på samme dag som reaksjonen. EDC fungerer som en katalysator for derivatization av forbindelser med anilin12.

2. utarbeidelse av standarder

  1. Lag separate lager løsninger av alle forbindelser oppløst i LC/MS klasse vann (tabell 1).
  2. Utarbeidelse av intern standardlager løsning
    1. Kombiner alle forbindelser unntatt nikotinamid adenine dinucleotide (NAD), nikotinamid adenine dinucleotide fosfat (NADP), Flavin adenine dinucleotide (FAD), acetyl koenzym A (ACA), og glyserol 3-fosfat (Gly3P), med de aktuelle volumer til opprette en 2 mM lagerløsning av alle forbindelser.
  3. Kombiner NAD, NADP, FAD, ACA, og Gly3P med de riktige volumene for å lage en 2 mM lagerløsning.

3. utarbeidelse av prøven (figur 1)

  1. Slukke og fremskynde proteiner i en celle-fri protein syntese reaksjon ved å legge et lik volum av iskald 100% etanol til reaksjonen. Sentrifuger prøven ved 12 000 x g i 15 min ved 4 ° c. Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør.
    Merk: prøver kan lagres ved-80 ° c på dette punktet og analyseres på et senere tidspunkt

4. merking reaksjon

  1. Merkings prøve med 12C-anilin løsning
    1. Overfør 6 μL av prøven inn i et nytt sentrifugerør og Bring volumet til 50 til μL med vann.
      Merk: volum utvalgsstørrelsen kan avhenge av den spesifikke CFPS-reaksjonen.
    2. Tilsett 5 μL 200 mg/mL EDC løsning.
    3. Tilsett 5 μL av 12C-anilin løsning.
      Merk: den anilin løsningen skiller seg i to faser. Bland godt før du legger til reaksjonen.
    4. Vortex reaksjonen med mild risting for 2 t ved romtemperatur.
    5. Etter 2 timer, Fjern rørene fra shaker og tilsett 1,5 μL av triethylamine (te) til reaksjonen i en avtrekksvifte.
      Merk: Triethylamine hever pH i løsningen som stopper anilin merking reaksjonen og stabiliserer forbindelsene.
      FORSIKTIG: Triethylamine er giftig og forårsaker irritasjon i øynene og luftveiene.
    6. Sentrifuger på 13 500 x g i 3 min.
  2. Merking av interne standarder med 13C-anilin løsning
    1. Fortynne den interne lager løsningen til 80 μM med et endelig volum på 50 μL.
      Merk: konsentrasjon av interne standarder kan justeres til nivåer nær den eksperimentelle prøven.
    2. Tilsett 5 μL 200 mg/mL EDC løsning.
    3. Tilsett 5 μL av 13C-anilin løsning.
    4. Vortex reaksjonen med mild risting for 2 t ved romtemperatur.
    5. Etter 2 timer, Fjern rørene fra shaker og tilsett 1,5 μL te til reaksjonen i en avtrekksvifte.
    6. Sentrifuger på 13 500 x g i 3 min.
  3. Kombinere merkede interne standard og merkede sample
    1. Bland 25 μL av 12c-anilin merket prøve med 25 μL av 13c-anilin merket standard.
    2. Overfør til et hetteglass med automatisk sampler og analyser av LC/MS-prosedyren.
  4. Opprette en standard kurve for ikke-kodet metabolitter
    1. Fortynne lagerløsning av umerkede metabolitter (NAD, NADP, FAD, ACA, og Gly3P) til endelige konsentrasjoner av 320 μM, 80 μM, 20 μM og 5 μM med et volum på 50 μL.
    2. Tilsett 5 μL 200 mg/mL EDC løsning.
    3. Tilsett 5 μL av 12C-anilin løsning.
    4. Vortex reaksjonen med mild risting for 2 t ved romtemperatur.
    5. Etter 2 timer, Fjern rørene fra shaker og tilsett 1,5 μL te til reaksjonen i en avtrekksvifte.
    6. Sentrifuger på 13 500 x g i 3 min.
    7. Overfør supernatanten til et hetteglass med automatisk sampler og analyser ved LC/MS-prosedyren.
      Merk: de umerkede metabolitter følger samme prosedyre som prøven for å gjenskape prøvematrisen for å opprettholde tilsvarende ionisering effektivitet.

5. oppsett av LC/MS-prosedyre

  1. Tilberedning av løsemidler
    1. Klargjør 5 mM tre-butylamine (TBA) vandig oppløsning justert til pH 4,75 med eddiksyre.
      Merk: TBA i den mobile fasen hjelper analytter oppnå god oppløsning og separasjon14.
    2. Forbered 5 mM TBA i acetonitril (ACN).
    3. Forbered vask løsemiddel med 5% vann og 95% ACN.
    4. Klargjør rensevæske med 95% vann og 5% ACN.
  2. Oppsett av MS-tilstander
    1. Sett masse spektrometer til negativ ion modus med en sonde temperatur på 520 ° c, negativ kapillær spenning på-0,8 kV, positiv kapillær spenning på 0,8 kV, og sett programvaren til å hente data ved 5 poeng/s.
    2. Sett valgte ion innspillinger (SIR) for hver metabolitten med spesifiserte membran spenninger og masse over kostnad (m/z) verdier. Se tabell 1.
  3. Initialisere LC/MS i henhold til produsentens instruksjoner
    1. Prime løsemiddel linjer i løsningsmiddel lederen i 3 min.
    2. Prime vaske løsemiddel (5% vann, 95% ACN) og rensevæske (95% vann, 5% ACN) for 15 s for 5 sykluser.
    3. Sett prøve lederen til 10 ° c.
    4. Installer en C18-kolonne (1,7 μm, 2.1 mm x 150mm) og Initialiser kolonne med 100% ACN på 0,3 mL/min i 10 minutter.
    5. Condition kolonnen på 95% vann og 5% ACN ved 0,3 mL/min i 10 min før innføre løsemidler med buffere.
    6. Tilstand kolonnen på 95% løsemiddel A (5mM TBA vandig, pH 4,75) og 5% løsemiddel B (5 mM TBA i ACN) ved 0,3 mL/min for 10 min.
    7. Sett opp en gradient protokoll med eluering starter på 95% løsemiddel A og 5% løsemiddel B, hevet til 70% løsemiddel B i 10 min, hevet til 100% løsemiddel B i 2 min og holdt på 100% løsemiddel B i 3 min. tilbake til første betingelser (95% løsemiddel A , 5% løsemiddel B) over 1 min og hold i 9 min for å re-likevekt kolonnen.
    8. Betingelse kolonnen med gradient protokollen 3 ganger før eventuelle injeksjoner på kolonnen.
  4. Sprøytebruk av prøver og standarder
    1. Injiser 5 μL av prøven i kolonnen og Skaff riktig intensitet på 12C-anilin som er tagget.
    2. Injiser 5 μL av samme prøve på nytt, men denne gangen skaffer du deg en intensitet på 13C-anilin kodede standarder.
      Merk: vårt LC/MS-system er i stand til å erverve både 12c og 13c m/z INTENSITET på den angitte Sir tid Vinduer, siden det er for mye data å erverve i det angitte tidsvinduet. Derfor injiserer vi den samme prøven to ganger.
    3. Injiser standarder med umerkede metabolitten fra lavest konsentrasjon til høyest, og ta opp de riktige intensiteten på m/z-ion.

6. kvantifisering

  1. Oppretter Export-metode
    1. I datainnsamlingsprogram vare velger du fil ≫ ny metode ≫ Export-metoden.
    2. Angi et filnavn, for eksempel AnilineTagging_Date.
    3. Sjekk Export ASCII -filen og velg en katalog for å eksportere tekstfilen til.
    4. I rapport typevelger du Sammendrag etter alle.
    5. I skilletegnfor kolonne velger du a ,. Velg [CR] [IF]for rad.
    6. I tabellvelger du Eksporter og deretter Rediger tabell for å inkludere SampleName, område, høyde, beløp og enheter.
    7. Lagre eksport metode.
  2. Kvantifisere metabolitter med interne standarder ved hjelp av datainnsamling programvare
    1. Under prøven sett tab, rett falle i staver det tilsvarende LC/MULTIPLE SCLEROSIS løpe og velge utsikt idet > kanalene.
    2. Velg alle SIR kanaler for 13C-anilin interne standarder for en injeksjon, høyreklikk og velg gjennomgang.
    3. Hvis vinduet LC Processing metode oppsett ikke vises automatisk, går du til Vis ≫ behandling metode oppsett.
    4. I behandling metode oppsett, gå til kategorien integrasjon og sett ApexTrack som algoritmen.
    5. Gå til utjevning kategorien og sette typen til å bety og utjevning nivå til 13.
      Merk: du kan velge et utjevningsnivå, så lenge det er konsistent i alle prøvene.
    6. Inne det MULTIPLE SCLEROSIS kanalen tab, arbeidsudyktig MULTIPLE SCLEROSIS 3D bearbeiding.
    7. I vinduet SIR-kanal integrerer du hver topp, én kanal om gangen. Når en topp er integrert, gå til alternativer ≫ Fyll fra resultat og detaljene i toppen vil bli fylt i komponenter kategorien. endre topp navnet til det tilsvarende sammensatte navnet.
    8. Når alle SIR kanalene er evaluert, lagrer du behandlingsmetoden og lukker vinduet.
    9. Velge alle herr kanalene av det 13c-anilin og 12C-anilin merket eksemplar, rett falle i staver og velge forarbeide.
    10. Sjekk prosessen bokse med, velge Bruk spesifiserte bearbeiding metoden, og foretrekker behandlingen metoden det er rettferdig bevart. Sjekk også Export -boksen, Velg Bruk spesifisert eksport metode og velg den lagrede eksport metoden opprettet tidligere. Klikk på OK.
    11. Åpne den eksporterte tekstfilen med Excel og Beregn konsentrasjonen av det ukjente sammensatte ved hjelp av:
      Equation 1
      der Cx, er jeg konsentrasjonen av den ukjente prøven for metabolitten i, ax, er jeg den integrerte delen av den ukjente metabolitten i, enSTD, jeg er den integrerte delen av den interne standarden av metabolitten i, CSTD, i er konsentrasjon av den interne standarden på metabolitten i, og D er fortynning faktor.
  3. Kvantifisere umerkede metabolitter med standard kurve
    1. Under prøven Sett tab, rett falle i staver det tilsvarende LC/MULTIPLE SCLEROSIS løpe og velge utsikt idet > kanalene.
    2. Velg alle SIR kanaler for de umerkede standardene for en injeksjon, høyreklikk og velg gjennomgang.
    3. Hvis vinduet LC Processing metode oppsett ikke vises automatisk, går du til Vis ≫ behandling metode oppsett.
    4. I behandling metode oppsett, gå til kategorien integrasjon og angi ApexTrack som algoritmen.
    5. Gå til utjevning kategorien og sette typen til å bety og utjevning nivå til 13.
      Merk: du kan velge et utjevningsnivå, så lenge det er konsistent i alle prøvene.
    6. Inne det MULTIPLE SCLEROSIS kanalen tab, arbeidsudyktig MULTIPLE SCLEROSIS 3D bearbeiding.
    7. I vinduet SIR-kanal integrerer du hver topp, én kanal om gangen. Når en topp er integrert, gå til alternativer ≫ Fyll fra resultat og detaljene i toppen vil bli fylt i komponenter kategorien. endre topp navnet til det tilsvarende sammensatte navnet.
    8. Når alle SIR kanalene er evaluert, lagrer du behandlingsmetoden og lukker vinduet.
    9. Under prøven Sett tab, rett falle i staver på eksemplar sette og velge alter eksemplar.
    10. Velg beløp i det nye vinduet.
    11. Velg Kopier fra prosess metode, og velg prosess metoden som nettopp ble lagret.
    12. Angi konsentrasjonen av hver metabolitten for hvert hetteglass og angi enheten som < μM for hver komponent (eller tilsvarende enhet) og velg OK.
    13. Velg prøve settet på nytt, høyreklikk, Vis som ≫ kanaler.
    14. Velg alle SIR kanaler med umerkede metabolitter for standardene, høyreklikk og velg prosess.
    15. Sjekk prosessen bokse med og foretrekker Bruk spesifiserte bearbeiding metoden. Velg riktig behandlingsmetode og klikk OK.
    16. Velg SIR kanaler for alle umerkede metabolitter for prøvene, høyreklikk og velg prosess.
    17. Sjekk prosessen bokse med, velge Bruk spesifiserte bearbeiding metoden, og foretrekker behandlingen metoden det var rettferdig bevart. Sjekk også Export -boksen, velg Bruk spesifisert eksport metode og velg den lagrede eksport metoden opprettet tidligere. Klikk på OK.
    18. Kvantifisere de umerkede metabolitter med standardkurven og eksportere resultatene til en tekstfil til den angitte katalogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et proof-of-konsept, vi brukte protokollen til å kvantifisere metabolitter i en E. coli basert CFPS system uttrykker grønt fluorescerende PROTEIN (GFP).  CFPS-reaksjonen (14 μL) ble slukket og deproteinized med etanol. CFPS-prøven ble deretter merket med 12c-anilin, mens standardene ble merket med 13c-anilin. Den kodede prøven og standardene ble deretter kombinert og injisert i LC/MS (figur 1). Protokollen oppdaget og kvantifisert 40 metabolitter er involvert i Sentral karbon og energi metabolisme ved hjelp av interne standarder, mens en standard kurve for 5 av metabolitter som ikke var merket med anilin ble også utviklet (figur 2). De ulike metabolitter som er involvert i disse veiene var en klasse av fosforylert sukker, phosphocarboxylic syrer, kar bok syls syrer, nukleotider, og kofaktorer. Den derivatization med anilin innført en hydrofobe moiety i hydrofile molekyler som lettere mer effektiv separasjon bruker reversert-fase kromatografi12. I tillegg metoden aktivert separasjon av strukturelle isomer parene som glukose 6-fosfat og fruktose 6-fosfat i en enkelt LC/MS kjøre. Hver sammensatte masse over kostnader (m/z) ratio og oppbevaring tid ble identifisert før eksperimentet ved å injisere 1 mM av en sammensatte om gangen og sammenligne massen spekteret til blank (tabell 1).

Grensen for påvisning og rekkevidde av linearitet for alle forbindelser ble estimert ved å produsere en standard kurve som varierte fra 0,10 μM til 400 μM (tabell 2). Den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienten (R2) for alle forbindelser var 0,988 og de fleste forbindelser hadde en lineær rekkevidde på 3-bestillinger av størrelsesorden. Tre forbindelser hadde bemerkelsesverdige metnings effekter, spesielt Alpha-Ketoglutarate som hadde en lineær rekkevidde fra 0,1 μM til 25 μM. Isocitrate og citrate hadde også metnings effekter over 100 μM.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av arbeidsflyt for anilin tagging. Cellen-fri protein syntese reaksjonen er deproteinized og merket med 12c-anilin, mens en standardlager blandingen er merket med 13c-anilin. Begge blandinger blandes deretter ved et 1:1 volumforhold og analyseres av LC/MS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: overlappende valgte ion-kromatogrammene for 40 metabolitter. Mass kromatogram fra en enkelt LC/MS kjøre av en 40 μM standard blanding av 40 metabolitter. Peaks ble identifisert av deres oppbevaring tid og m/z verdier for hver sammensatte. Fullstendige sammensatte navn og forkortelser er listet opp i tabell 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Høyeste tall Metabolitt Forkortelse KEGG-ID Tid for oppbevaring (min) 12C m/z 13C m/z nonlabel m/z CV MS arter
1 Glyserol 3-fosfat Gly3P C00093 3,85 153 10 M-H2O-H
2 Nikotinamid adenine dinucleotide Nad C00003 3,96 698 10 M + CL – H
3 Glukose GLC C00031 4,06 289,9 296 15 M + A + CL-H
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 5,41 364 370 10 M + A-H
5 Fruktose 6-fosfat F6P C00085 5,48 334 340 10 M + A-H
6 Guanosin monofosfat Gmp C00144 5,57 437,05 443 10 M + A-H
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 5,58 304 310 10 M + A-H
8 Cytidinanaloger monofosfat CMP C00055 5,59 397,09 403 10 M + A-H
9 Laktat Lac C00186 5,77 164,05 170 10 M + A-H
10 Adenosin monofosfat Amp C00020 5,85 421,1 427,1 10 M + A-H
11 Uridindifosfatglukuronosyltransferase monofosfat Ump C00105 5,88 398,07 404 10 M + A-H
12 Nikotinamid adenine dinucleotide fosfat NADP C00006 6,39 724 10 M-H2O-H
13 3-Phosphoglyceric acid 3PG C00197 6,63 242 248,06 15 M + A – H2O – H
14 Cytidinanaloger uridindifosfatglukuronosyltransferase Cdp C00112 6,72 477 483 10 M + A-H
15 Guanosin uridindifosfatglukuronosyltransferase Bnp C00035 6,87 517 523 10 M + A-H
16 Adenosin uridindifosfatglukuronosyltransferase Adp C00008 6,94 501 507 10 M + A-H
17 Uridindifosfatglukuronosyltransferase uridindifosfatglukuronosyltransferase Udp C00015 6,97 478 484 10 M + A-H
18 Flavin adenine dinucleotide Kjepphest C00016 7,03 784,15 15 M-H
19 Fruktose 1, 6-bisphosphate F16P C05378 7,1 395,95 402,1 10 M + A – H2O – H
20 Gluconate 6-fosfat 6PG C00345 7,11 425,1 437 10 M + 2A – H
21 Nikotinamid adenine dinucleotide redusert NADH C00004 7,23 633,13 639,08 10 M + A + H2O – nikotinamid – H
22 Glukose 6-fosfat G6P C00668 7,32 409,1 421,1 10 M + 2A – H
23 Ribose 5-fosfat R5P C00117 7,54 379,1 391,1 15 M + 2A – H
24 Erythrose 4-fosfat E4P C00279 7,71 348,9 361 10 M + 2A – H
25 Cytidinanaloger trifosfat Ctp C00075 7,84 557 563 5 M + A-H
26 Guanosin trifosfat Gtp C00044 7,93 597 603 5 M + A-H
27 Oxalacetate OAA C00036 7,94 281 293 25 M + 2A – H
28 Alpha-Ketoglutarate Akg C00026 7,95 295 307,1 15 M + 2A – H
29 Uridindifosfatglukuronosyltransferase trifosfat Utp C00075 7,97 558 564 10 M + A-H
30 Adenosin trifosfat Atp C00002 8,03 581 587 15 M + A-H
31 Fumarat FUM C00122 8,09 265 277,1 10 M + 2A – H
32 Pyruvat Pyr C00022 8,09 162 168 25 M + A-H
33 Malate MAL C00149 8,09 283,06 295,15 10 M + 2A – H
34 D-glyceraldehyde 3-fosfat Gap C00118 8,09 319 331,1 5 M + 2A – H
35 Acetyl-koenzym A Aca C00024 8,16 790 10 M-H2O-H
36 Nikotinamid adenine dinucleotide fosfat redusert NADPH C00005 8,23 694,92 700,82 10 M + A – nikotinamid – H
37 Phosphoenolpyruvate Pep C00074 8,28 317 329,1 20 M + 2A – H
38 Succinate AV C00042 8,64 267,07 279,1 15 M + 2A – H
39 Isocitrate ICIT C00311 10,13 398 416 10 M + 3A-H2O-H
40 Citrate Cit C00158 10,46 416,1 434,06 20 M + 3A-H

Tabell 1: identifisering og merking resultater av metabolitter. Hver sammensatte tilsvarende peak Number, oppbevaring tid, m/z verdi for umerkede, 12c og 13c merket, og MS arter. MULTIPLE SCLEROSIS Art, en står for anilin tag.

Topp nr. Metabolitt Forkortelse KEGG-ID Konsentrasjon (mM) SD (n = 3) Grense for påvisning (μM) Grense for lineær rekkevidde (μM) R ^ 2
1 Glyserol 3-fosfat Gly3P C00093 0,377 0,034 0,1 400 0,995
2 Nikotinamid adenine dinucleotide Nad C00003 0,052 0,010 0,39 400 0,993
3 Glukose GLC C00031 0,002 0,000 0,1 400 0,997
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 0,007 0,000 0,16 400 0,988
5 Fruktose 6-fosfat F6P C00085 0,029 0,004 0,1 400 0,986
6 Guanosin monofosfat Gmp C00144 0,007 0,001 0,39 100 0,992
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 0,035 0,002 0,39 400 0,996
8 Cytidinanaloger monofosfat CMP C00055 0,045 0,001 0,1 100 0,992
9 Laktat Lac C00186 2,134 0,048 0,1 400 0,988
10 Adenosin monofosfat Amp C00020 0,020 0,002 0,1 100 0,992
11 Uridindifosfatglukuronosyltransferase monofosfat Ump C00105 0,021 0,000 0,1 100 0,997
12 Nikotinamid adenine dinucleotide fosfat NADP C00006 0,014 0,002 0,34 400 0,950
13 3-Phosphoglyceric acid 3PG C00197 6,125 0,239 0,1 100 0,996
14 Cytidinanaloger uridindifosfatglukuronosyltransferase Cdp C00112 0,202 0,029 0,39 400 0,997
15 Guanosin uridindifosfatglukuronosyltransferase Bnp C00035 0,146 0,027 1,5625 400 0,984
16 Adenosin uridindifosfatglukuronosyltransferase Adp C00008 0,797 0,161 0,39 400 0,995
17 Uridindifosfatglukuronosyltransferase uridindifosfatglukuronosyltransferase Udp C00015 0,212 0,036 0,39 400 0,991
18 Flavin adenine dinucleotide Kjepphest C00016 0,008 0,001 0,1 400 0,958
19 Fruktose 1, 6-bisphosphate F16P C05378 3,643 0,105 0,39 400 0,989
20 Gluconate 6-fosfat 6PG C00345 0,017 0,001 0,39 400 0,989
21 Nikotinamid adenine dinucleotide redusert NADH C00004 0,063 0,028 0,39 100 0,972
22 Glukose 6-fosfat G6P C00668 0,046 0,002 0,1 400 0,984
23 Ribose 5-fosfat R5P C00117 0,055 0,005 0,39 100 0,999
24 Erythrose 4-fosfat E4P C00279 0,038 0,007 0,39 400 0,979
25 Cytidinanaloger trifosfat Ctp C00075 0,896 0,078 6,25 100 0,998
26 Guanosin trifosfat Gtp C00044 0,870 0,109 6,25 100 0,993
27 Oxalacetate OAA C00036 0,023 0,008 0,56 400 0,997
28 Alpha-Ketoglutarate Akg C00026 0,391 0,020 0,1 25 0,979
29 Uridindifosfatglukuronosyltransferase trifosfat Utp C00075 0,845 0,092 1,5625 400 0,998
30 Adenosin trifosfat Atp C00002 1,557 0,188 1,5625 400 0,991
31 Fumarat FUM C00122 0,576 0,100 1,5625 100 0,999
32 Pyruvat Pyr C00022 5,813 0,804 0,39 400 0,993
33 Malate MAL C00149 2,548 0,269 0,1 400 0,991
34 D-glyceraldehyde 3-fosfat Gap C00118 2,194 0,367 0,1 100 0,974
35 Acetyl-koenzym A Aca C00024 0,196 0,044 0,1 100 0,991
36 Nikotinamid adenine dinucleotide fosfat redusert NADPH C00005 0,006 0,010 0,14 100 0,990
37 Phosphoenolpyruvate Pep C00074 3,442 0,345 0,1 100 0,962
38 Succinate AV C00042 5,683 0,573 0,1 320 0,999
39 Isocitrate ICIT C00311 0,003 0,006 0,39 100 0,998
40 Citrate Cit C00158 0,002 0,001 0,1 100 0,981

Tabell 2: metabolitten kvantifisering i en REPRESENTATIV CFPS-prøve. Konsentrasjonen av hver metabolitten og standardavviket. Grense for påvisning, utvalg av linearitet og korrelasjonskoeffisient identifisert fra standard kurver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Celle frie systemer har ingen cellevegg, og dermed er det direkte tilgang til metabolitter og biosyntetiske maskiner uten behov for komplekse prøve forberedelser. Men svært lite arbeid har blitt gjort for å utvikle grundige og robuste protokoller for å kvantitativt avhøre celle-fri reaksjons systemer. I denne studien utviklet vi en rask og robust metode for å kvantifisere metabolitter i celle frie reaksjonsblandinger og potensielt i hel celle ekstrakter. Individuell kvantifisering av metabolitter i komplekse blandinger, slik som de som finnes i celle-frie reaksjoner, eller hel celle ekstrakter, er utfordrende av flere grunner. Sentralt blant disse grunnene er kjemisk mangfold. Rekken av funksjonelle grupper samtidig tilstede i disse blandinger (f. eks, kar bok syls syrer, aminer, fosfater, hydroksyler, etc.) i stor grad øker den analytiske kompleksiteten. For å omgå dette, brukte vi en anilin derivatization metode i kombinasjon med 13C interne standarder for å innføre hydrofobe komponenter til metabolitten blandinger. Ved hjelp av denne metoden, robust vi oppdaget og kvantifisert 40 metabolitter i en celle-fri reaksjon i en enkelt LC/MS kjøre. Protokollen merket 35 av 40 forbindelser i denne studien, mens de resterende 5 forbindelser ble kvantifisert med en standard kurve metode. Tidligere arbeid foreslo reaksjons forholdene dannet en intramolekylær salt mellom Amin og fosfat gruppe som hemmet derivatization12. Reaksjons forholdene ble ikke identifisert for samtidige derivatization av alle 40 forbindelser; Imidlertid er gjeldende alternativ kvantifisering med en standard kurve metode. Mens vi demonstrerte denne teknikken i en celle-fri reaksjons blanding, kan det også sannsynlig brukes til hel celle ekstrakter, og dermed potensielt gir den absolutte kvantifisering av intracellulære metabolitter konsentrasjoner. Sistnevnte programmet har relevans til en rekke viktige spørsmål i bioteknologi og menneskers helse.

Metoden som presenteres her var basert på en tidligere teknikk (GSIST) som ble brukt til hel celle ekstrakter av gjær S. cerevisiae12,13. I denne studien utvidet vi antall forbindelser som kunne oppdages og kvantifisert, inkludert alle 12 nukleotider (xMP, xDP, xTP, der x er A, C, G og U). Tilsetting av disse forbindelsene kan ha viktige biologiske implikasjoner. For eksempel disse nukleotider er tungt involvert i transkripsjon og oversettelse prosesser, som er en av de sentrale prosessene av interesse for CFPS applikasjoner, og mer generelt forbindelsene er viktige i en rekke fysiologiske funksjoner. I tillegg var vi i stand til å oppdage eddiksyre som er en viktig metabolitten når undersøke overløp metabolisme. Men vi ikke inkludere den i studien fordi det var en betydelig reduksjon av signal i flere forbindelser, spesielt nikotinamid adenine dinucleotide redusert (NADH) og nikotinamid adenine dinucleotide fosfat redusert (NADPH) når eddiksyre ble tilsatt til standard blandingen. Eddiksyre hadde en høy grense for påvisning av 612 μM, og dermed på disse høye nivåer det hadde en negativ effekt på de andre metabolitter signaler. Til tross for dette kan eddiksyre fortsatt oppdages og kvantifisert i prøver ved å lage en standard kurve med bare eddiksyre i hetteglasset. Eddiksyre hadde en m/z verdi på 134,0, oppbevaring tid på 5,78 min, og en lineær rekkevidde fra 612 μM til 5000 μM (R2 = 0,986) når merket med 12C-anilin. De resterende metabolitter ikke endre hverandres ion signal og representerer en omfattende blanding å karakterisere CFPS metabolisme. Protokollen som presenteres her er begrenset til metabolitter involvert i Sentral karbon og energi metabolisme. Dermed er den nåværende metoden ikke kan måle metabolitten overflod fra andre veier som kan være av betydning, for eksempel fatty acid og aminosyre metabolisme.

Til sammen utviklet vi en rask, robust protokoll for karakterisering og absolutt kvantifisering av 40 forbindelser involvert i Glykolysen, den pentose fosfat veien, tricarboxylic syre syklus, energi metabolisme, og kofaktor regenerering i CFPS Reaksjoner. Metoden var avhengig av interne standarder merket med 13c-anilin, mens prøven ble merket med 12c-anilin. Den interne standarder og sample forbindelser co-eluert og eliminert ion-undertrykking effekter som muliggjøre nøyaktig kvantifisering av individuelle metabolitter i komplekse metabolitten blandinger. Vi identifiserte totalt 40 forbindelser (41, hvis inkludert eddiksyre) som kan oppdages og kvantifisert i en celle-fri reaksjons blanding; Imidlertid kan listen over metabolitter bli ytterligere utvidet og justert mot den spesielle biokjemiske prosessen av interesse. Dermed gir metoden en robust og nøyaktig tilnærming for å karakterisere celle-fri metabolisme, som er potensielt kritisk til å forbedre utbyttet, produktivitet og energieffektivisering av celle-frie prosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet beskrevet ble støttet av Center på Physics of Cancer metabolisme gjennom Award Number 1U54CA210184-01 fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Cancer Institute eller National Institutes of Health. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Tags

Biokjemi celle-fri proteinsyntese flytende kromatografi-masse massespektrometri anilin merking sentral karbon energi metabolisme intern standard metabolske nettverk isotopanrikning merking
Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S.,… More

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter