Summary
이 프로토콜에서는 선천성 심장 결함과 관련된 마우스의 발달 표현형을 정성적및 정량적으로 분석하는 절차를 설명합니다.
Abstract
선천성 심장 결함 (CHD)는 모든 살아있는 출생의 1%까지 영향을 미치는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형입니다. 그러나, CHD에 대 한 근본 원인은 여전히 제대로 이해. 개발 마우스는 마우스와 인간 사이의 심장 발달 프로그램이 매우 보존되기 때문에 CHD의 연구를위한 가치있는 모델을 구성한다. 이 프로토콜은 원하는 임신 단계의 마우스 배아를 생산하는 방법, 하류 처리를 위해 심장을 분리하고 보존하는 방법, 조직학에 의한 일반적인 유형의 CHD를 식별하는 정량적 방법(예: 심실 중격)을 상세히 기술합니다. 결함, 심방 중격 결함, 특허 덕터스 동맥 동맥 및 일반적인 근육 다짐 표현형을 측정하는 정량적 조직 적 방법. 이러한 방법은 시료 준비, 수집 및 분석과 관련된 모든 단계를 명확하게 하여 과학자들이 CHD를 정확하고 재현가능하게 측정할 수 있도록 합니다.
Introduction
CHD는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형이고 출생 결함 관련 죽음의 주요한 원인1,2,3,4,5,6. 신생아의 약 90 %가 CHD에서 생존하지만, 환자의 삶과 의료 시스템에 무거운 부담을 부과, 수년에 걸쳐 상당한 이환율 및 의료 개입과 자주연관7,8,9,10. 순전히 유전 적 요인 의 외부, CHD의 원인은 제대로 이해4. 미국 심장 협회 및 기타 소스 에 따라 모든 CHD 케이스의 ~ 56-66 %를 차지하는 미확인 원인2,3,4,11. 잘 알려진 인자는 유전 적 돌연변이, CNV, 드 노보 단일 뉴클레오티드 변이체, 및 이수성염을 포함한다. 모성생활2,12,경제적 박탈, 인종13을연결하는 역학 연구에서 제시한 바와 같이 환경 및 식이 요인이 CHD에 기여하는 중요한 원천이라고 의심되며 엽산11,14 및 생리활성 지질 망막 산15,16과같은 식이 인자를 연구하여 연구한다. CHD 및 기타 심혈관 결함의 메커니즘 및 원인을 조사하는 것은 예방 전략 및 새로운 치료 옵션1,4,17,18,19를개발하는 것이 중요하다.
개발 마우스는 포유류에서 CHD를 공부하기위한 초석 모델입니다. 그러나, 심장 형태를 보존하는 해부, 발달 단계의 분석 및 CHD 관련 결함의 확인과 같은 채택된 방법 및 분석의 몇몇은, murine 심혼의 분석에 새로운 과학자를 위해 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 방법의 목표는 이러한 프로세스에 대한 정성적 및 정량적 지침을 제공하는 것입니다. 따라서, 이 프로토콜에서는 원하는 임신 단계의 배아를 생산하기 위해 시간 적 짝짓기를 수행하는 방법, 임신 한 여성을 그대로 심장 회복 (유출 관과 같은 관련 조직 포함), 심장 고정 및 준비에 대한 해부하는 방법을 설명합니다. 저온 절제, 기본 운동학 방법, 일반적인 심장 결함의 정량적 분석 및 심장 근육 다짐의 정성적 분석, CHD의 일부 유형에 대한 일반적인 전구체 표현형.
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Protocol
이 논문에서 언급된 실험에 사용된 모든 동물은 미시간 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 동물 관리 지침을 사용하여 처리되었습니다.
1. 배아 생산을 위한 C57BL6/J 마우스의 시간 적시 짝짓기
- 일단 마우스가 번식 연령 (6-8 주)에 도달하면 하렘 사육 형식 (즉, 한 남성 당 두 마리의 암컷)로 함께 넣습니다. 오후 나 저녁에 언젠가 번식을 위해 그들을 설정합니다.
참고: 마우스는 하우징 시설 내에서 조명이 꺼진 후 1시간 이내에 번식하는 경우가 많습니다. 암컷은 약 6-8 개월에 번식에서 은퇴해야하며 남성은 늦어도 12 개월 이상 사용해야합니다. - 계량 방법을 사용하여 수정을 결정하는 경우, 큰 그룹에서 마우스를 번식, 계량 방법은 시간 매립 결합이 copulation 플러그만 모니터링되는 방법보다 느린 속도로 진행하기 때문에.
- 다음날 아침, 오전 8시부터 오후 12시 사이에 교합 플러그를 확인하십시오. 플러그 분석이 오전 8시 이전에 수행되는 경우, 플러그가 질 운하에 너무 깊어 관찰될 위험이 있습니다. 플러그 분석이 오후 12시 이후에 수행되면 플러그가 떨어질 위험이 있습니다.
- 꼬리의 기지에 의해 여성을 잡고 마이크로 파이펫 팁의 사용으로 질 운하에 개방을 조사. 교합 플러그는 점막장벽(그림 1A)처럼보일 수 있으며, 어떤 경우에는 보기가 다소 어려울 수 있습니다. 갑각류는 또한 교합 플러그가 존재했거나 존재했음을 나타냅니다. 점막 장벽이 없는 경우(그림 1B)다음 여성 가능성이 짝짓기 하지 않은 또는 교합 플러그 이미 밖으로 떨어질 수 있습니다.
- 교화의 아침을 e0.5로 참조하십시오.
참고: C57BL6/J 마우스에서는 교합 플러그를 식별하기 어려울 수 있습니다. 따라서, 때로는 마우스가 짝짓기되지 않았음에도 불구하고 플러그가 관찰되지 않았다. 교합은 항상 임신으로 이끌어 내는 것은 아닙니다. 이것은 C57BL6/J 마우스에서 수시로 확률이 높습니다. 따라서 체중 진행을 모니터링하여 임신을 확인합니다(1.4단계 참조). 무게 인은 임신한 여성을 확인하고 플러그가 임신으로 이끌어 내다는 것을 확인하는 것을 도울 수 있습니다. 연속된 밤에 여성을 짝짓을 할 때주의하십시오. 특정 남성이 교합 플러그를 생산하는 데 능숙한 것으로 관찰되면, 그 남성은 동일한 여성과 연속적인 밤을 위해 짝짓기를 신뢰할 수 있다. - 임신의 기회는 성공적으로 전에 사육 된 바와 같이, 입증 된 브리더 인 마우스와 더 높다는 것을 명심하십시오. 입증 된 브리더의 기회를 높이기 위해, 사용되는 남성은 너무 오래되어서는 안됩니다.
- 플러그 분석에 따라, 여성의 무게. 이 계량은 7-10일 후에 따라야 합니다. 체중 증가가 1.73g을 초과하면 마우스가임신 20일 가능성이 높습니다. 체중 증가가 1.73 g 미만인 경우 임신과 관련이 없으며 마우스를 번식 인구에 다시 도입해야합니다.
참고 : C57BL6 / J 마우스는 작은 쓰레기를 생산 (평균 5 ~ 6 배아). 임신을 결정하는 방법에 무게는 대다수에 대한 정확합니다. 이 방법을 사용하면 12.8 %의 거짓 긍정률을 제공하며 실제로 임신한 20인 여성의 3 %를 제외합니다. 연구원이 원하는 임신 시간이 늦어질까 봐 걱정된다면 1.5단계로 진행하십시오. - 선택 사항 : 해부가 일어날 날, 임신이 신체 검사에 의해 진행되었는지 확인하십시오. 꼬리의 기지에 의해 여성을 잡고 몸을 스트레칭. 이것은 손목에 마우스를 놓고 꼬리의 베이스를 부드럽게 당겨서 가장 쉽습니다. 여성이 임신 한 경우, 가능성이 낮은 몸통에 특히 체중 증가가있을 것입니다, 그것은 작은 덩어리로 나타납니다.
참고: 임신은 e12.5로 일찍 만져질 수 있으며 대부분의 경우 e14.5로 만져볼 수 있습니다. C57BL6/J 마우스는 작은 쓰레기 크기를 가지고, 따라서 여성은 물리적 인 징후가없는 경우에도 임신 할 수 있습니다.
2. 심장 회복을위한 여성과 배아의 해부
- 해부를 시작하기 전에 실온에서 다음 솔루션을 준비하십시오.
- 0.5 mM 농도에서 인산완충식염수(PBS)에 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 용해시.
참고 : 일단 준비되면 용액을 얼음 위에 유지하고 4 °C에서만 사용하는 것이 좋습니다. 오염이 우려되는 경우 사용하기 전에 오토클레이브를 해야 합니다. - 파라포름알데히드(PFA)를 PBS에 4% 농도로 용해시.
참고 : 일단 준비되면 용액을 얼음 위에 유지하고 4 °C에서만 사용하는 것이 좋습니다. 장기간 보관할 수 있도록 4°C 또는 추운 거리에서 보관하십시오. PFA 용액의 농도는 조직 샘플의 하류 적용에 따라 달라질 수 있다. 이 백분율은 헤마톡실린 및 에오신 염색, 면역 히스토화학 및 면역 형광 염색에 사용됩니다.
- 0.5 mM 농도에서 인산완충식염수(PBS)에 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 용해시.
- 암컷이 원하는 임신 단계에 도달하면, 마우스는 동물 사용의 승인 된 지침에 따라 하루 중 올바른 시간에 안락사되어야한다. 반나절(예: e15.5)에 타이밍이 있는 경우 오후 12시 에 가깝게 희생해야 합니다. 타이밍이 일종일(예: e15.0)인 경우 오전 12시 에 가깝게 희생해야 합니다.
참고: 임신은 쥐가 짝을 이루는 밤 도중 자정 에 가까운 생기기 위하여 가정됩니다. 그러나 정확한 임신 시기를 결정하는 것은 어렵습니다. 이 로 인해 타이밍이 정확하지 않은 것으로 추정됩니다. - 네 개의 팔다리를 아래로 고정 한 후, 조심스럽게 흉골을 향해 요도 주위에서 시작하여 몸통을 따라 I 모양의 절개를합니다.
- 자궁은 가능성이 골반 지역 바로 위에 위치할 것입니다. 마우스 자궁은 Y자형입니다. 따라서 매우 길고 몸통을 감싸는 것입니다. 부드럽게 들어 올려 제거하십시오. 스푸핑 모션에서 미세 집게의 측면을 사용하여이 작업을 수행합니다. 자궁의 표면 조직은 처음에 자궁을 당길 때 미세 집게의 끝에 의해 매우 신중하게 잡을 수 있습니다. 가위를 사용하여 몸에서 자궁을 자른다.
참고 : 자궁의 특이한 Y 자형을 염두에 두고 자궁 전체를 제거하십시오. - 얼음 차가운 PBS에 자궁을 담그십시오. 자궁의 한쪽 끝을 아래로 고정하고 한 줄로 뻗어 나갑니다.
- 자궁을 별도의 배아를 포함하는 각 섹션으로 잘라냅니다. 미세한 집게로 배아를 부드럽게 벗겨냅니다. 이것은 각 손에 집게 한 쌍으로 할 수있는 가장 쉬운 방법입니다. 일단 제거되고, 4°C에서 PBS-EDTA 용액으로 채워진 새로운 페트리 접시에 즉시 배아를 놓습니다.
참고 : 일반 PBS 용액도 사용할 수 있지만 EDTA는 샘플의 응고를 방지합니다. - Theiler 스테이징21을사용하여 배아를 스테이지합니다. 발판은 단 하나 쓰레기 내의 태아 사이에서 변화할 수 있기 때문에, 각 개별 적인 태아를 단계.
참고: 이것은 또한 태아에 있는 가능한 선천적인 심혼 결점에 선견지명을 제공할 수 있습니다. 전형적으로, 선천성 심장 결함의 현상은 배아 형태학에서 관찰될 수 있습니다. 특정 심장 상태와 수시로 관련되었던 그밖 중요한 결점은 존재할 수 있습니다. - 심혼은 태아의 나이에 따라서 다양한 방법으로 제거될 수 있습니다.
참고 : 유출 관이 제거 하는 동안 그대로 유지 됩니다 여부 불분명 하는 경우, 심장 보다 더 많은 조직을 제거 (그대로 유출 관을 유지 하 고 심장과 집게 사이의 직접 접촉을 최소화) 또는 전체 배아를 분석.- 해부 범위와 두 쌍의 미세 집게를 사용하여 배아를 등에 놓고 가슴에 대한 접근을 안정화시다. 이것은 포셉으로 팔을 아래로 고정하거나 팔을 제거하고 몸통을 제 위치에 두면 수행 할 수 있습니다.
- 두 번째 쌍의 미세 집게의 날카로운 점을 사용하여 배아의 흉골을 따라 절개를하고 쇄골 사이를 배꼽까지 연장하십시오. 점차적으로 가슴 구멍의 안쪽으로 일하는 동안 아주 미세하고 표면적인 절개를 만드는 것으로 시작하십시오. 심장은 거의 보이지 않아야합니다. 이러한 피상절하는 동안 집게와 접촉하지 마십시오.
- 첫 번째 집게를 사용하여 열린 흉곽을 벗겨 배아의 몸통을 부드럽게 짜내고 흉곽에 약간 꼬리를 물었습니다. 심장이 튀어 나오거나 명백해져야 합니다. 심장이 나오기 위해서는 부드러운 동축 작용이 필요할 수 있습니다. 집게의 측면을 사용하여 집게의 점이 심장과 접촉하지 않도록하십시오. 작업 공간과 집게를 깨끗하게 유지하려면 보풀이 없는 물티슈를 근처에 보관하십시오.
- 집게의 측면으로 폐 혈관을 부드럽게 잡고 조직을 단절시키지 않도록하고 가슴 구멍에서 심장을 빼냅니다. 그런 다음, 마음을 청소합니다.
참고 : 배아 e13.5 이하의 경우 심장은 심낭으로 덮여 있습니다. 이것은 심장에 도달하기 위해 제거해야합니다.
- 스테레오스코프를 사용하여 나중에 참조할 수 있는 심장 사진을 찍습니다.
- PBS-EDTA 용액으로 1-2 분 동안 심장을 헹구고 약 45-60 분 동안 4 % PFA 용액에 넣습니다. 전체 배아의 분석이 필요한 경우, 하룻밤 담그십시오. PFA 용액의 부피는 고정되는 조직의 부피의 5-6배여야 한다.
참고: 이 배양 시간은 후기 연구에 따라 달라질 수 있습니다. 이 배양 시간은 헤마톡실린 및 에오신 염색, 면역 히스토화학 및 면역 형광 염색에 사용됩니다. - PBS-글리신 3x로 5-10분 간 씻고 다시 PBS에 놓습니다. 아지드 나트륨 또는 페니실린/스트렙토마이신은 세균 성장을 최소화하고 손상되지 않은 조직을 보존하기 위해 첨가될 수 있습니다. 이제 하트는 4 °C에서 단기적으로 저장할 수 있습니다.
3. 조직 준비
참고 : 조직은 OCT (최적의 절삭 온도) 포함 또는 파라핀 포함을 사용하여 제조 할 수 있습니다. 두 방법 중 하나에 장점과 단점이 있으며 어떤 포함 방법을 사용해야 하는지 결정할 때 분석의 목표를 고려해야 합니다.
- OCT 임베딩
참고 : 이 방법은 저온 절이 항원 반응을 보존하고, 여전히 헤마톡실린 및 에오신 염색에 사용될 수 있으며, 슬라이스를 더 빨리 생산할 수 있기 때문에 포르말린 /파라핀 포함하는 것이 바람직 할 수 있습니다.- 30% (v) 농도로 PBS에 용해된 자당의 용액을 준비합니다.
- 조직을 PBS-30% 자당을 함유하는 새로운 15 mL 원추형 튜브 또는 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 처음에는 조직이 떠있습니다.
- 냉장고에 4 °C에 놓습니다. 조직은 일반적으로 24-40 시간에서 튜브의 바닥에 가라 앉을 때 OCT 포함을위한 준비가될 것입니다.
참고: 근육 조직은 동결/해동 주기 동안 크게 고생하고 기본 형태를 잃습니다. 자당은 조직에 흡수되어 형태학의 보존을 개선 할 수있는 저온 보존 제로 작동합니다. 조직의 부동이 충분히 모니터링 될 수있는 튜브에 충분한 용액이 있는지 확인하십시오. PBS-수크로오스는 박테리아로 쉽게 오염되므로 곰팡이 또는 세균 과성장을 나타내는 흐림에 대한 해결책을 자주 확인하십시오. 오염의 위험을 최소화하기 위해 페니실린/스트렙토마이신 또는 아지드 나트륨을 PBS-수크로오스 용액에 첨가할 수 있습니다. - 파스퇴르 파이펫으로 하트를 제거하고 파이펫의 개구부가 조직을 찢어지지 않도록 충분히 넓어지도록하십시오. 필요한 경우 가위로 파이펫을 자른다. 전체 배아와 함께 작업하는 경우 집게를 사용하여 샘플을 검색합니다.
참고: 부드럽게 하십시오. 파이펫 개구부가 하트를 회수할 수 있을 만큼 넓더라도 파이펫의 가장자리는 여전히 조직을 찢을 수 있습니다. 집게는 너무 공격적으로 사용하는 경우 조직 샘플을 들여 쓰기 수 있습니다. - 보풀이 없는 물티슈로 티슈가 공기가 건조되도록 간단히 하십시오. 샘플을 절단을 위해 원하는 위치에 OCT 금형에 놓습니다(즉, 시상, 횡방향, 관상동맥). 샘플이 완전히 침수 될 때까지 OCT 화합물을 추가하여 조직과 접촉하는 거품이 없는지 확인하십시오.
- 금형을 하룻밤 또는 며칠 동안 -20°C에 놓고 금형을 -80°C로 옮습니다. 24 시간 후 금형은 냉동 절제에 대한 준비가되어 있습니다. 이 형식의 조직은 장기간 저장할 수 있습니다.
- 파라핀 임베딩
- 에탄올을 사용하여 조직을 연속적으로 탈수시: 10분 동안 50% 에탄올, 10분 동안 70% 에탄올, 10분 동안 80% 에탄올, 10분 동안 95% 에탄올, 10분 동안 100% 에탄올(이 3배).
- 이 연속적으로 일련의 에탄올/자일렌 용액에 조직을 담그십시오: 10-15분 동안 2:1 에탄올/자일렌 용액, 10-15분 동안 1:1 에탄올/자일렌 용액, 10-15분 동안 1:2 에탄올/자일렌 용액 10-15분, 10-15분 동안 10-100% 자일렌 용액(이 3x).
- 자일렌을 파라핀으로 대체하려면 이 연속적으로 진공 오븐 (54-58 °C 사이 로 설정)에 조직을 담그십시오 : 30 분 동안 2 : 1 자일렌 / 파라핀 용액, 30 분 동안 1 : 1 : 1 xylene / 파라핀 용액, 30 분 동안 1 : 2 자일렌 / 파라핀 용액, 1-2 시간 동안 100 % 파라핀 1-2 시간 또는 100 % 파라핀 1 00 % 파라핀을 담그십시오.
참고 : 장기간 60 °C를 초과하는 조직을 가열하면 파라핀 폴리머가 분해되고 조직이 부서지기 쉽습니다. - 신선한 파라핀을 사용하여 원하는 위치에 조직을 포함시킴.
4. OCT 임베디드 조직에 대한 저온 절제
- 저온 극저온에서, 샘플을 이전에 -80°C 냉동고에 보관한 경우 모든 샘플을 최소 1시간 동안 내부에 놓습니다. 모든 섹션이 수집될 때까지 그곳에 남아 있어야 합니다.
- 저온 설정이 올바른 온도 설정으로 설정되어 있는지 확인합니다. 저온 챔버 내부의 환경 온도는 약 -20 °C에 있어야하며 저온 상승의 팔은 약 -24 °C에 있어야합니다.
참고: 이 온도는 블록이 슬라이싱에 반응하는 방식에 따라 달라질 수 있습니다. 일관되지 않은 슬라이스가 문제가 되면 환경의 온도를 낮출 수 있습니다. - 금형의 열린 면의 가장자리를 잡아당겨 풀어서 금형이 좁아지는 닫힌 단부에서 블록을 꼬집어 OCT 블록을 몰드에서 제거합니다.
- OCT 블록을 장착하려면 중간에서 시작하여 가장자리까지 작업하여 실온 OCT를 척에 놓습니다. 전체 척을 덮을 필요는 없습니다.
- 금형에 OCT 블록(단계 3.1 참조)을 놓습니다. 금형의 닫힌 면에 맞든 블록의 가장자리가 척에서 위를 향해야 합니다. 척의 OCT가 불투명한 흰색이 될 때까지 약 5-10분 동안 얼어 붙을 수 있습니다.
- 블록이 팔 온도에 올 수 있도록 또 다른 5-10 분 동안 팔에 척을 놓습니다. 평행 슬라이스를 얻으려면 블록의 가장자리가 스테이지와 평행하고 블록의 스테이지와 하단 가장자리 사이의 거리가 블록의 스테이지 및 위쪽 가장자리와 동일할 때까지 팔을 조정합니다.
- 블레이드를 삽입하고 블레이드에서 블록의 거리를 조정하여 섹션을 가져 가십시오.
- 10 μm의 두께로 슬라이스를 가져 가라. 관심 지점에 수동으로 도달하거나 트림 기능을 사용할 때까지 슬라이스를 유지하십시오.
- 슬라이스를 수집하려면 작은 플랫 페인트 브러시와 디테일 브러시를 사용합니다. 금형이 절단되기 시작하면 플랫 브러시를 사용하여 스탠드에서 슬라이스를 부드럽게 당깁니다. 샘플을 절단할 때 속도는 샘플의 견고성에 따라 달라질 수 있지만 이동이 연속적이고 일시 정지 없이 이루어져야 합니다.
- 슬라이스하는 동안 플랫 브러쉬를 사용하여 슬라이스가 만들어질 때 부드럽게 슬라이스를 안내합니다. 슬라이스는이 시점에서 단계와 플러시 할 필요가 없으므로 눈물을 일으키거나 당기거나 역학에 영향을 미치지 않도록 불어 오도록하십시오.
참고: 전체 배아를 잘라내는 경우, 특히 조직 유형을 변경할 때 이 부분이 특히 어려울 수 있습니다. 슬라이스가 일시 정지 없이 만들어지고 브러시가 슬라이스를 너무 공격적으로 당기지 않도록 하십시오. 조직 유형이 바뀌면 슬라이스가 파손될 수 있으므로 온도를 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 파손이 문제가 되는 경우 온도를 줄이거나 샘플 두께를 늘립니다. - 샘플이 완전히 절단되면 블록의 움직임을 일시 중지하지만 슬라이스는 아직 블록에서 자유롭지 않습니다. 슬라이스에서 플랫 브러시를 이동하지 않고 세부 브러시를 사용하여 슬라이스를 아래로 두드려 평평하게 만들고 스테이지에 고정합니다.
- 세부 브러시를 제거하고 슬라이스를 마무리하기 전에 ~ 10 s에 대한 거기에 슬라이스를 개최합니다. 두 개의 페인트 브러시를 사용하여 스테이지에 슬라이스를 부드럽게 평평하게 하고, 롤링을 방지하고, ~20-30s의 스테이지에 고정시다.
- 슬라이스를 뒤집고 다시 스테이지에 평평하게 합니다. 슬라이드를 스테이지로 만지지 않고도 슬라이스가 끌릴 수 있을 만큼 정전기적으로 충전된 슬라이드를 충분히 가깝게 이동하고 슬라이드에 부착합니다. 슬라이드에 연필로 레이블을 지정합니다.
- 슬라이드를 밀폐 된 상자에 보관하여 보관 중에 얼음이 쌓이지 않도록 조직을 보호하십시오. 단기 보관의 경우, 슬라이드는 염색하기 전에 -20°C에서 보관해야 합니다. 장기 보관을 위해 -80 °C에서 보관하십시오.
5. 파라핀 내장 된 조직에 대한 마이크로 토메임 절제
- 샘플을 냉각하기 위해 절편하기 전에 얼음에 블록을 놓습니다. 식으면 파라핀슬라이스를 더 쉽게 슬라이스하고 더 얇은 슬라이스를 만들 수 있습니다.
- 초순수를 사용하여 40-45 °C의 수조를 준비합니다.
- 블레이드를 마이크로톤 내 홀더에 넣습니다. 안전한지 확인하고 간격 각도를 설정합니다. 클리어런스 각도가 올바른지 확인합니다. 제조업체의 지침에 따라 확인할 수 있습니다.
- 파라핀 블록을 마이크로토메에 넣습니다. 블레이드가 블록을 가로 질러 똑바로 잘리도록 올바르게 방향이 있는지 확인하십시오.
- 몇 개의 슬라이스를 만들어 블레이드가 블록과 올바르게 향하도록 합니다. 조정이 이루어질 수 있도록 주의 깊게 수행하십시오.
- 관심 지점에 도달할 때까지 블록을 잘라내립니다.
- 원하는 두께로 슬라이스를 만듭니다. 처음 몇 개의 조각이 삭제될 가능성이 높다는 점을 고려하십시오.
- 섹션을 선택하고 집게를 사용하여 수조로 이동합니다. 이렇게 하면 섹션이 평평해져야 합니다. 검게 그(것)들을 필요에 따라 조정하기 위하여 이용하십시오.
- 슬라이스가 끌리고 슬라이드에 부착될 수 있을 만큼 정전기충전된 슬라이드를 충분히 가깝게 이동합니다. 슬라이드에 연필로 레이블을 지정합니다.
- 수집된 모든 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓습니다. 슬라이드가 37°C에서 밤새 건조되도록 합니다.
6. 조직의 탈파화
- 다음 순서로 슬라이드를 세척 : 자일렌 (2x), 1 : 1 xylene / 100 % 에탄올 용액에 3 분, 100 % 에탄올 (2 x), 95 % 에탄올에서 3 분, 70 % 에탄올에서 3 분, 50 % 에탄올에서 3 분.
7. 헤마톡실린 및 에오신 염색
- 얼룩이 지을 수 있는 슬라이드를 준비합니다.
- OCT 준비 된 티슈를 사용하는 경우, OCT가 용해 될 때까지 ~ 4 분 동안 증류수에 담그고 말리십시오.
- 파라핀 내장 된 조직을 사용하는 경우, 그들은 분리해야합니다. 6.1단계를 참조하십시오.
- 슬라이드를 여과된 0.1% 헤마톡실린을 10분 동안 넣고 증류수에 넣고 즉시 물을 1배 변경한 다음 3분 후에 다시 바꿔 놓습니다.
- 슬라이드를 0.5% 에오신에 10초에 놓거나 12배 떨어급해 놓습니다. 에오신이 더 이상 줄무늬가 되지 않고 약 2-3딥이 될 때까지 증류수에 슬라이드를 담급강합니다.
- 10초 동안 50% 에탄올, 10초동안 75% 에탄올, 30초동안 95% 에탄올, 100% 에탄올을 1분간 담그고 자일렌이 부드러워질 때까지 자일렌에 담그면 5-7회 찍어 서 슬라이드를 탈수합니다.
- 유리에 가까운 굴절률을 가진 빠른 건조 장착 매체로 자일렌이 증발하고 장착되도록 하십시오.
8. 일반적인 심장 결함의 질적 분석
- 반전 또는 스테레오 현미경과 해당 카메라를 사용하여 모든 샘플의 이미지를 찍습니다. 분석되는 결함유형에 따라 거시적이고 현미경적인 이미지를 찍습니다. 매크로스코픽 이미지는 10배 미만의 배율로 촬영할 수 있습니다. 현미경 이미지는 40배 배율 이상으로 촬영해야 합니다. 이 논문에서 찍은 사진은 스테레오 현미경을 사용하여 5배 배율로 찍은 것이고, 40x 공기 대물(렌즈 N.A. 0.55)은 반전된 현미경을 사용하여 촬영하였다.
참고: 매크로 이미지는 전체 하트에 대한 보기를 제공하기 때문에 좋은출발점입니다(그림 3). 패턴이 확인되면 특정 영역에 초점을 맞추고 더 자세히 조사할 수 있습니다. - 컴퓨터 화면에서 모든 이미지를 나란히 정렬합니다. 화면 의 한쪽에 제어 샘플의 모든 이미지와 화면의 다른 쪽에 실험 샘플의 모든 이미지를 가지고있다. 한 번에 하나의 치료 그룹을 분석하는 것이 가장 좋습니다.
- 일반적인 심혼 결점이 일어나는 중요한 지역에서 시작되는 처리 단 사이 표현형에 있는 다름을 찾아내십시오. 이것은 심혼의 총 해부학을 묘사하는 거시적인, 또는 심혼 조직의 현미경 해부학을 묘사하는 현미경인지 에 따라 달라집니다.
- 심실 중격 결손(그림 2A),심방 중격 결함(그림 2B)및 특허 덕트 동맥과 같은 일반적인 거시적 심장 결함(그림 2C)에대한 검색을 시작합니다. 이러한 모든 결함은 심장의 가로 보기에서 가장 쉽게 볼 수 있습니다.
- 중격 결함을 식별하려면 여러 조각을 보는 것이 좋습니다.
참고 : 때로는 결함이 중격의 부족이 아니라 중격의 구멍입니다. 따라서 중격 결함에 대한 눈물을 착수하지 않도록주의하십시오. 특정 지역의 인근 슬라이스 간의 일관성을 찾고 있는 것은 이것이 실제로 슬라이스에서 결함이나 찢어짐인지 확인할 수 있습니다. - 특허 덕터스 동맥과 같은 유출 지역의 결함을 식별하려면 여러 조각을 사용하여 심장을 떠날 때 주요 혈관을 따르십시오. 서로 에 비해 주요 혈관의 이미지를 만듭니다. 그림 2C에있는 예제입니다.
참고 : 일부 불규칙성은 배아의 발달 단계 때문일 수 있습니다 (예를 들어, 특허 덕트 동맥 동맥은 출생 직후, 출생 직후에 닫힙니다. 심실 중격은 ~ e14.5까지 완전히 닫히지 않습니다). 수치에 포함되지 않은 몇 가지 일반적인 거시적 심장 결함은 e16.5 이상에서 가장 쉽게 검출 될 수있는 지속적인 truncus atereriosus를 포함; 이중 출구 우심실 (DORV), 이는 심장이 유출 관으로 들어가는 슬라이스에서 검출 될 수있다; 그리고 재정의 대오타22. 일반적인 현미경 심장 결함은 감소 된 근육 다짐을 포함한다(그림 4).
9. 헤마톡실린과 에오신 염색 조직을 이용한 심장 근육 다짐의 정량적 분석
- 염색된 조직 샘플의 거시적 뷰를사용하여(도 4A),40배 배율로 이미지에 관심 있는 영역을 식별한다(도4B). 이 논문에서는 좌심실의 벽을 사용했습니다. 원하는 형식으로 이미지를 저장합니다. 이 백서에서는 이미지가 .tif 파일로 저장되었습니다.
- ImageJ 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.
- 이미지를 8비트로 설정합니다. 이렇게 하면 이미지가 다음 단계23,24에서임계값 도구를 활용할 수 있습니다. 이렇게 하려면 "이미지 | 유형 | 8 비트".
- 사진의 임계값을 설정합니다. 이 단계의 목적은 조직을 나타내는 픽셀을 제외한 배경을 나타내는 픽셀만을 선택하는것이다(23,24).
참고: 이 표면적이 나중에 차감됩니다. 올바른 임계값은 연구원이 근육 조직 표면적에서 제외하려는 픽셀을 선택합니다. 따라서, 결말은 그레이스케일의 조직을 포함해야 하고 배경이 선택될 것이다.- "이미지J | 클릭 이미지 | 조정 | 임계값". 맨 위 막대를 이동하여 임계값을 조정합니다. 원하는 섹션이21을선택하면 다른 변경 없이 임계값 조정 창을 닫습니다.
- 다각형 선택 도구를 사용하여 조직이 차지하는 공간을 선택합니다. 느슨한 추적이 잘못된 측정을 제공하기 때문에 윤곽선이 조직 테두리를 추적하는지 주의 깊게 확인하십시오.
- ImageJ의 측정 설정을 조정하여 소프트웨어가 9.423단계의 임계값 도구를 사용하여 선택한 픽셀 영역만 측정할 수 있도록 합니다. "이미지J | 분석 | 측정 설정 | 영역 및 임계값으로 제한". 영역 및 임계값으로 제한만선택합니다.
- 강조 표시된 픽셀의 면적을 측정합니다. "이미지J | 분석 | 측정". 이 값은 음수 공간의 영역을 나타냅니다.
- 관심 영역 전체영역을 측정합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 선택한 영역입니다. "이미지 J | 분석 | 측정 설정 | 지역". 면적만 선택하고 임계값으로 제한을 선택 취소합니다. 그런 다음 측정, 선택 "이미지 J | 분석 | 측정".
- 실제 근육 조직이 관심 영역 내에서 차지하는 영역을 계산합니다. 관심 영역 전체 영역에서 음수 공간의 영역을 뺍니다. 이 값은 근육 조직의 영역입니다.
- 근육 다짐 지수(MCI)를 계산합니다. 근육 조직의 영역을 관심 영역으로 나눕니다.
MCI 값이 클수록 근육이 더 압축됩니다. 이러한 MCI 값은 치료 군 간의 근육 다짐에 대한 유의한 변화를 테스트하기 위해 통계 분석을 위해 사용될 수있다(도 4C).
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Representative Results
근육 다짐 지수는 두 개의 서로 다른 환경, 대조군 및 실험 군에서 발전하는 심장 사이에서 비교되었다. 이 프로토콜은 통계 분석을 허용하는 근육 조직의 압축을 정량적으로 분석하는 데 사용되었습니다. 근육 다짐은 비실험 조건에서 개발된 배아에 비해 실험심에서 현저히 감소되는 것으로 나타났다.
관찰 타이밍이 부정확해 보이는 경우 배아는 폐기되었습니다. 배아의 성장을 저해하는 것은 실험의 치료의 결과일 수 있고, 발달 진행의 범위가 있지만, 번식은 배아 발달의 타이밍을 보장하기에 충분히 간격을 두었다. 배아의 발판은 Theiler 스테이징21을사용하여 수행되었다. 샘플은 슬라이스가 일관성을 반영하지 않거나 명백한 눈물이나 주름이 있는 경우 제대로 슬라이스되지 않은 것으로 간주되었습니다. 염색은 조직 가장자리를 만들기에 충분한 대조를 제공하지만, 세포 특징을 구별 할 정도로 어둡지 않았다. 슬라이드는 40배 대한 목적을 가진 반전된 현미경으로 그 때 심상했습니다. MCI 값은 ImageJ 소프트웨어와 마이크로 소프트 엑셀을 사용하여 계산되었다. 이러한 MCI 값은 T-검정을 사용하여 분석되었다.
그림 1: C57BL6/J 마우스에서 플러그 분석 결과. (A)쉽게 식별 할 수있는 교합 플러그가있는 마우스. (B)교합 플러그가 없는 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일반적인 심장 결함. 선천성 심장 결함의 진정한 예상 형태도. (A)심실 중격 결함의 횡방향 보기. (B)심방 중격 결함의 횡방향 보기. (C)특허 덕터스 동맥 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: e15.5 하트의 헤마톡실린 및 에오신 얼룩. (A)정상적인 조건에서 발달한 스테인드 하트. 스케일 바 = 750 μm.(B)실험 조건하에서 개발된 염색된 심장. 배율 표시줄 = 750 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 필수 지방산 결핍 모계 식단하에서 개발된 정상적인 모계 식단과 심장 사이의 근육 다짐에 대한 정량적 분석. (A)헤마톡실린과 에오신스테인은 거시적(5배) 보기에서 하트를 염색하였다. 스케일 바 = 1,000 μm.(B)헤마톡실린 및 에오신 스테인 드 하트 (40x). 축척 막대 = 75 μm.(C)근육 다짐 지수 측정의 결과 데이터. 값을 T 검정(n=치료 군당 4)을 사용하여 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 배아 심장에서 심장 발달의 분석에 관련된 기술을 탐구합니다. 이 방법의 몇몇 제한은 현미경 화상 진찰을 가진 사례 및 기술, 필요로 할 수 있는 예비 기술에 필요한 물리적 손재주입니다. 저온 유지 작업에서 얻은 조각이 지저분하면 헤마톡실린 및 에오신 얼룩이 명확하지 않거나 현미경에서 찍은 이미지가 조명이 좋지 않은 경우 ImageJ와 함께 사용되는 방법이 작동하지 않습니다. ImageJ 소프트웨어의 임계값 피쳐의 한계는 픽셀 값에 의존하는 임계값의 한쪽 끝에 위치한 픽셀을 선택한다는 것입니다. 따라서 임계값의 잘못된 쪽에 있는 모든 픽셀이 계산에 잘못 포함되거나 제외됩니다. 궁극적으로, 문제 해결 연구에 사용 하기 위해 프로토콜의 채택에 필요한 것입니다.
심장 추출이 너무 어려운 경우 2.8 단계로 건너 뛰는 것이 좋습니다. 또한 흉강에서 심장과 폐 이상을 제거하는 것이 좋습니다. 그런 다음 대상이 더 크고 조작하기 쉬워지며 심장과 미세 집게 사이의 직접적인 접촉이 최소화됩니다. 저온 절편시, 실험 샘플은 항상 제어 샘플과 직접 비교됩니다. 이렇게 하면 모든 샘플에서 오류가 일관된 한 사용자 오류에 대한 일부 공간을 확보할 수 있습니다. 사용자 오류를 최소화하고 잘못된 결과를 방지하려면 두 치료 그룹 모두에서 비교 가능한 섹션을 얻을 수 있는지 확인하십시오. 예를 들어, 두 명 이상이 섹션을 생산하는 경우 한 개인이 하나의 하위 그룹이 아니라 컨트롤 및 모든 치료 그룹에 대해 짝수 의 섹션을 생성해야 합니다. 마지막으로 ImageJ에서 이미지를 임계값으로 설정하면 임계값 도구가 사용되어 조직과 그렇지 않은 픽셀을 나타내는 픽셀을 선택할 때 최대한의 자유도를 허용합니다. 필요한 경우 이미지의 대비를 조정하여 조직의 픽셀 값에서 배경의 픽셀 값을 더욱 강화합니다. 문제 해결 옵션이 있지만 이 기술에는 여전히 높은 수준의 기술이 필요합니다. 그러나 이 프로토콜을 수행하면 일반적으로 다른 심장 발달 연구 연구에서 측정되지 않는 데이터에 액세스할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜의 기능을 활용하면 과학적 조사에 상당한 기여를 할 수 있습니다.
심장학 연구에서 실험 적 치료의 영향을 식별하는 것은 종종 형태학 평가를 통해 조사됩니다. 이것은 특히 발달 생물학의 경우, 태반이 심장 발달의 생리적 특징을 측정하기가 어려워집니다. 따라서, 심장의 기능에 대한 통찰력을 허용하는 형태학적 분석은 발달 생물학 연구의 궤적을 극적으로 바꿔줍니다. 대부분의 논문은 심장의 강도를 결정하기 위해 심장 근육의 두께를 분석하지만, 근육 다짐의 직접 측정은 개발 포유류 심장의 생리학에 대한 추가 통찰력을 제공 할 수25,26,27.
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Disclosures
저자는 보고할 공개가 없습니다.
Acknowledgments
Aguirre Lab은 수상 번호 K01HL135464에 따라 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소와 수상 번호 19IPLOI34660342에 따라 미국 심장 협회에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
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