Summary
I denne protokollen beskriver vi prosedyrer for å kvalitativt og kvantitativt analysere utviklingsfenotyper hos mus forbundet med medfødte hjertefeil.
Abstract
Medfødte hjertefeil (CHD) er den vanligste typen fødselsdefekt hos mennesker, som påvirker opptil 1% av alle levende fødte. De underliggende årsakene til CHD er imidlertid fortsatt dårlig forstått. Den utviklende musen utgjør en verdifull modell for studiet av CHD, fordi hjerteutviklingsprogrammer mellom mus og mennesker er svært bevart. Protokollen beskriver i detalj hvordan man produserer museembryoer i ønsket svangerskapsstadium, metoder for å isolere og bevare hjertet for nedstrøms behandling, kvantitative metoder for å identifisere vanlige typer CHD ved histologi (f.eks. ventrikulær septal defekter, atrieseptale defekter, patentductus arteriosus), og kvantitative histomorfoometri metoder for å måle vanlige muskel komprimering fenotyper. Disse metodene artikulerer alle trinnene som er involvert i prøveforberedelse, innsamling og analyse, slik at forskere kan riktig og reproduserbart måle CHD.
Introduction
CHDs er den vanligste typen fødselsdefekt hos mennesker og er den ledende årsaken til fødselsdefektrelaterte dødsfall1,2,3,4,5,6. Selv om om lag 90% av nyfødte barn overlever CHD, er det ofte forbundet med betydelig sykelighet og medisinske inngrep gjennom årene, og pålegger en tung byrde på pasientenes liv og helsevesenet7,8,9,10. Utenfor rent genetiske faktorer er årsakene til CHD dårlig forstått4. Uidentifiserte årsaker står for ~ 56-66% av alle CHD-tilfeller i henhold til American Heart Association og andre kilder2,3,4,11. Kjente faktorer inkluderer genetiske mutasjoner, CNVs, de novo enkelt nukleotid varianter, og aneuploidy. Det er mistanke om at miljø- og kostholdsfaktorer også er viktige kilder som bidrar til CHD, som foreslått av epidemiologiske studier som knytter mors livsstil2,12, økonomisk deprivasjon og rase13, og ved forskning på diettfaktorer som folsyre11,14 og bioaktivt lipid retinosyre15,16. Undersøke mekanismer og årsaker til CHD og andre kardiovaskulære defekter er viktig for å utvikle forebyggende strategier og nye terapeutiske alternativer1,4,17,18,19.
Den utviklende musen er en hjørnesteinsmodell for å studere CHD hos pattedyr. Imidlertid kan noen av metodene og analysene som brukes, for eksempel desseksjoner som bevarer hjertemorfologi, analyse av utviklingsstadier og identifisering av CHD-tilknyttede defekter, være skremmende for forskere som er nye til analyse av murine hjerter. Målet med metodene som er beskrevet i denne protokollen er å tilby kvalitative og kvantitative retningslinjer for disse prosessene. Derfor forklarer vi i denne protokollen hvordan du utfører tidsdeparringer for å produsere embryoer i ønsket svangerskapsstadium, dissekere gravide kvinner for intakt hjertegjenoppretting (inkludert tilhørende vev som utstrømningskanalen), hjertefiksering og forberedelse til kryostat snitting, grunnleggende histologi metoder, kvantitative analyser av vanlige hjertefeil, og kvalitativ analyse av hjerte muskel komprimering, en vanlig forløper fenotype til noen typer CHD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr som brukes i forsøkene som det refereres til i dette papiret ble behandlet ved hjelp av dyrepleieretningslinjene til Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Tidsrettet parring av C57BL6/J-mus for embryoproduksjon
- Når mus har nådd avlsalder (6-8 uker), sette dem sammen i harem avl format (dvs. to kvinner per en mann). Sett dem opp for avl en gang på ettermiddagen eller kvelden.
MERK: Mus avler ofte innen 1 t etter at lysene er slått av i boliganlegget. Kvinner bør pensjoneres fra avl på ca 6-8 måneder og menn bør brukes senest 12 måneder. - Hvis du bruker veiemetoden for å bestemme befruktning, avle mus i store grupper, fordi veiemetoden fører til at tidsbestemt parring fortsetter i et langsommere tempo enn metoder der bare kopulasjonsplugger overvåkes.
- Neste morgen, se etter copulation plugger en gang mellom 8 AM-12 PM. Sørg for at dette er gjort på riktig tidspunkt. Hvis plugganalysen utføres tidligere enn 08.00, er det fare for at pluggen er for dyp i vaginalkanalen som skal observeres. Hvis plug-analysen utføres senere enn 12 pm, er det fare for at pluggen har falt ut.
- Ta tak i kvinnen ved foten av halen og undersøke åpningen til vaginalkanalen ved bruk av en mikropipettespiss. En copulation plugg vil se ut som en slimhinne barriere (Figur 1A), som kan være litt vanskelig å se i noen tilfeller. Crustiness er også en indikasjon på at en copulation plug er eller var tilstede. Hvis det ikke er noen slimhinnebarriere (Figur 1B) så har kvinnen sannsynligvis ikke parret eller copulation pluggen kan allerede ha falt ut.
- Se om morgenen med copulation som e0.5.
MERK: Med C57BL6/J-mus kan copulation plugs være vanskelig å identifisere. Derfor, noen ganger musene parret selv om ingen plugg ble observert. Copulation fører ikke alltid til unnfangelse. Dette er ofte mer sannsynlig i C57BL6/J mus. Overvåk derfor vektprogresjonen for å bekrefte graviditeten (se trinn 1.4). Veieinene kan bidra til å identifisere kvinner som er gravide og bekrefte at plugger førte til unnfangelse. Vær forsiktig når du parrer kvinner for påfølgende netter. Hvis en bestemt mann er observert å være god til å produsere en copulation plug, at mannen kan stole på å parre seg for påfølgende netter med samme kvinne. - Husk at sjansene for graviditet er høyere med mus som er bevist oppdrettere, som de har lykkes blitt avlet før. For å øke sjansene for å ha bevist oppdrettere, bør hannene som brukes ikke være for gamle.
- Etter plug-analysen, veie hunnene. Denne veiingen bør følges opp 7-10 dager senere. Hvis vektøkning overstiger 1,73 g, så musen er sannsynligvis gravid20. Hvis vektøkning er under 1,73 g, er det sannsynligvis ikke relatert til graviditet og musen bør gjeninnføres til avlspopulasjonen.
MERK: C57BL6/J-mus produserer små kull (i gjennomsnitt fem til seks embryoer). Veie inn metoder for å bestemme graviditet er nøyaktig for de fleste. Ved hjelp av denne metoden gir en 12,8% falsk positiv rate og vil utelukke 3% av kvinner som faktisk er gravide20. Hvis forskeren er bekymret for at ønsket svangerskapstid er senere, fortsett til trinn 1.5 - Valgfritt: Den dagen disseksjonen skal finne sted, sørg for at graviditeten har utviklet seg ved fysisk inspeksjon. Ta kvinnen ved foten av halen og strekk kroppen ut. Dette er lettest å gjøre ved å plassere musen på håndleddet og forsiktig trekke bunnen av halen. Hvis kvinnen er gravid, vil det sannsynligvis være vektøkning spesielt i nedre torso, og det vil vises som små klumper.
MERK: Graviditetkan være håndgripelig så tidlig som e12.5 og vil være håndgripelig av e14.5 i de fleste tilfeller. C57BL6/J mus har små kullstørrelser, derfor kan kvinnen være gravid selv om det ikke er fysiske tegn.
2. Disseksjon av kvinner og embryoer for hjertegjenoppretting
- Før disseksjonen starter, må du klargjøre følgende løsninger ved romtemperatur.
- Oppløs etylendiaminetalacetatsyre (EDTA) i fosfatbufret saltvann (PBS) ved en konsentrasjon på 0,5 mM.
MERK: Når den er klargjort, er det å foretrekke å holde løsningen på is og bare bruke den ved 4 °C. Hvis forurensning er en bekymring, bør det autoklaseres før bruk. - Oppløs paraformaldehyd (PFA) i PBS ved en 4% konsentrasjon.
MERK: Når den er klargjort, er det å foretrekke å holde løsningen på is og bare bruke den ved 4 °C. Oppbevares ved 4 °C eller kaldere for langtidslagring. Konsentrasjonen av PFA-løsningen kan variere avhengig av nedstrømsbruk av vevsprøvene. Denne prosentandelen brukes til hematoksylin og eosinfarging, immunohistokjemi og immunfluorescerende farging.
- Oppløs etylendiaminetalacetatsyre (EDTA) i fosfatbufret saltvann (PBS) ved en konsentrasjon på 0,5 mM.
- Når kvinnen har nådd ønsket svangerskapsstadium, bør musen euthanized på riktig tidspunkt på dagen i henhold til de godkjente retningslinjene for dyrebruk. Hvis timingen er på halvdag (f.eks. e15.5) bør de ofres nærmere 12:00. Hvis timingen er på hele dager (f.eks. e15.0) bør de ofres nærmere kl.
MERK: Unnfangelsen antas å skje nær midnatt om natten musene er paret. Det er imidlertid vanskelig å bestemme den nøyaktige tidspunktet for unnfangelsen. På grunn av dette er timing anslått, ikke nøyaktig. - Etter å ha festet de fire lemmer ned, forsiktig gjøre en I-formet snitt langs overkroppen, starter fra rundt urinrøret opp mot brystbenet.
- Livmoren vil trolig bli plassert like over bekkenregionen. Muslivmoren er Y-formet; derfor vil det trolig være veldig lang og pakket rundt torso. Fjern den ved å løfte den forsiktig. Gjør dette ved hjelp av sidene av fine tang i en scooping bevegelse. Det overfladiske vevet i livmoren kan gripes svært nøye av tuppene av de fine pinsettene når du først trekker livmoren ut. Bruk saks til å kutte livmoren fra kroppen.
MERK: Husk den uvanlige Y-formede livmoren, sørg for at hele livmoren fjernes. - Bløtlegg livmoren i iskald PBS. Pin den ene enden av livmoren ned og strekke den ut i en enkelt linje.
- Skjær livmoren i seksjoner, hver seksjon som inneholder et eget embryo. Fjern forsiktig ut embryoet med fine tang. Dette er lettest å gjøre med et par tang i hver hånd. Når det er fjernet, plasser embryoet umiddelbart i en ny petriskål fylt med PBS-EDTA-oppløsning ved 4 °C.
MERK: Normal PBS-løsning kan også brukes, men EDTA forhindrer koagulasjon i prøvene. - Stage embryoene ved hjelp av Theiler Staging21. Fordi iscenesettelse kan variere mellom embryoer i et enkelt kull, iscenesette hvert enkelt embryo.
MERK: Dette kan også gi fremsyn i mulige medfødte hjertefeil i embryoene. Vanligvis kan symptomer på en medfødt hjertefeil observeres i embryonalmorfologi. Andre store defekter ofte forbundet med visse hjertesykdommer kan være til stede. - Hjertet kan fjernes på en rekke måter avhengig av embryoets alder.
MERK: Hvis det er uklart om utstrømningskanalen vil forbli intakt under fjerning, fjerner du enten mer vev enn utelukkende hjertet (holde utstrømningskanalen intakt og minimere direkte kontakt mellom hjertet og tang) eller analysere hele embryoet.- Ved hjelp av et disseksjonsomfang og to par fine tang, plasser embryoet på ryggen og stabilisere tilgangen til brystet. Dette kan gjøres ved enten å feste armene ned med tang eller fjerne armene og holde overkroppen i posisjon.
- Bruk det skarpe punktet til et annet par fine tang for å gjøre et snitt langs brystbenet i embryoet og strekke seg mellom clavicles til navlen. Start med å lage veldig fine og overfladiske snitt mens du gradvis arbeider mot innsiden av brysthulen. Hjertet skal bare knapt bli synlig. Ikke kontakt med tang under disse overfladiske snittene.
- Skrell brystkassen åpen ved hjelp av det første paret med tang for å klemme forsiktig på embryoets overkropp, litt caudal til brystkassen. Hjertet skal sprette ut eller bli tydelig. Hjertet kan kreve litt mild coaxing å komme ut. Bruk siden av tang, og sørg for at poenget med tang aldri kommer i kontakt med hjertet. Hold en lofri serviett i nærheten for å holde arbeidsområdet og pinsettene rene.
- Ta forsiktig lungeblodkarene med sidene av tangene, sørg for å ikke bryte vevet, og trekk hjertet ut av brysthulen. Rengjør deretter hjertet.
MERK: For embryoer e13.5 og yngre er hjertet dekket av perikardiet. Dette må fjernes for å nå hjertet.
- Bruk et stereoskop til å ta et bilde av hjertet for senere referanse.
- Skyll hjertene i PBS-EDTA-oppløsning en 1-2 min, og legg dem deretter i 4% PFA-løsning i ca. 45-60 min for å fikse dem. Hvis analyse av hele embryoet er ønsket, suge over natten. Volumet av PFA-løsningen skal være 5-6x volumet av vevet som er fast.
MERK: Denne inkubasjonstiden kan variere avhengig av de senere studiene. Denne inkubasjonstiden brukes til hematoksylin og eosinfarging, immunohistokjemi og immunfluorescerende farging. - Vask 5-10 min med PBS-glycine 3x og plasser tilbake i PBS. Natriumazid eller penicillin/streptomycin kan også tilsettes for å minimere bakteriell vekst og bevare intakt vev. Hjertene kan nå lagres kortsiktig ved 4 °C.
3. Vevforberedelse
MERK: Vev kan enten tilberedes ved hjelp av OCT (optimal skjæretemperatur) innebygging eller parafininnebygging. Det er fordeler og ulemper med begge metodene, og målet med analysen bør vurderes når man bestemmer hvilken innebyggingsmetode som skal brukes.
- OKT innebygging
MERK: Denne metoden kan være å foretrekke fremfor formalin/parafin innebygging fordi kryoseksjoner bevarer antigenreaktivitet, kan fortsatt brukes til hematoksylin og eosinfarging, og produsere skiver raskere.- Forbered en løsning av sukrose oppløst i PBS ved en 30% (w / v) konsentrasjon.
- Overfør vevet til et nytt 15 ml konisk rør eller 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder PBS-30% sukrose. I utgangspunktet vil vevet flyte.
- Plasser den ved 4 °C i kjøleskapet. Vevet vil være klart for OCT innebygging når det synker til bunnen av røret, vanligvis i 24-40 timer.
MERK: Muskelvev lider betydelig under fryse/tine sykluser og miste sin innfødte morfologi. Sukrose absorberes av vevet og fungerer som et kryobevarende middel som gjør det mulig å bevare morfologien. Pass på at det er nok løsning i røret for at flytende vev skal overvåkes tilstrekkelig. PBS-sukrose er lett forurenset med bakterier, så sjekk løsningen ofte for skyet, noe som indikerer enten sopp eller bakteriell overvekst. For å minimere risikoen for kontaminering kan enten penicillin/streptomycin eller natriumazid tilsettes til PBS-sukroseoppløsningen. - Fjern hjertene med en Pasteur-pipette, sørg for at åpningen av pipetten er bred nok til ikke å rive vevet. Skjær pipetten med saks om nødvendig. Hvis du arbeider med hele embryoer, bruk tang for å hente prøven.
MERK: Gjør dette forsiktig. Selv om pipetteåpningen er bred nok til å hente hjertene, kan kantene på pipetten fortsatt rive vevet. Tang kan rykke inn vevsprøver hvis de brukes for aggressivt. - La kort vevet lufte tørt på en lofri klut. Plasser prøven i en OKT-form i ønsket posisjon for skjæring (dvs. sagittal, tverrgående, koronar). Legg til OCT-forbindelsen til prøven er helt nedsenket, og pass på at det ikke er bobler i kontakt med vevet.
- Plasser formen ved -20 °C over natten eller flere dager, og flytt deretter formen til -80 °C. Etter 24 timer er formen klar for kryoseksjon. Vev i dette formatet kan lagres på lang sikt.
- Parafin innebygging
- Ved hjelp av etanol, dehydrerve vevet i denne rekken: 50% etanol i 10 min, 70% etanol i 10 min, 80% etanol i 10 min, 95% etanol i 10 min, 100% etanol i 10 min (gjør dette 3x).
- Bløtlegg vevet i en serie etanol/xylenløsninger i denne rekken: 2:1 etanol/xylenløsning i 10-15 min, 1:1 etanol/xylenløsning i 10-15 min, 1:2 etanol/xylenløsning i 10-15 min, 100% xylen i 10-15 min (gjør dette 3x).
- For å erstatte xylen med parafin, suge vevet i en vakuumovn (satt mellom 54-58 °C) i denne rekkefølge: 2:1 xylen/parafinløsning i 30 min, 1:1 xylen/parafinoppløsning i 30 min, 1:2 xylen/parafinoppløsning i 30 min, 100 % parafin i 1-2 timer, 100 % parafin for 1-2 timer eller over natten.
MERK: Oppvarming av vevet utover 60 °C i lengre perioder vil føre til at parafinpolymerene forringes og vevet blir sprøtt. - Bruk fersk parafin til å bygge inn vevet i ønsket posisjon.
4. Kryostat snitting for OCT innebygd vev
- Ved kryostat, plasser alle prøver inne i minst 1 t hvis prøvene tidligere ble lagret i fryseren -80 °C. De bør forbli der til alle seksjonene er samlet inn.
- Kontroller at kryostaten er innstilt på riktig temperaturinnstillinger. Miljøtemperaturen inne i kryostatkammeret skal være på ca -20 °C og armen av kryostat bør være på ca -24 °C.
MERK: Denne temperaturen kan variere avhengig av hvordan blokken reagerer på kutting. Hvis inkonsekvent kutting er et problem, kan temperaturen i miljøet senkes. - Fjern OCT-blokken fra formen ved å trekke på kantene av den åpne siden av formen for å løsne den og deretter klemme blokken i den lukkede enden, hvor formen smalner.
- For å montere OCT-blokken, plasser romtemperaturen OCT på chucken, fra midten og arbeide til kanten. Hele chucken trenger ikke å dekkes.
- Plasser OCT-blokken (se trinn 3.1) på formen. Kanten av blokken som var mot den lukkede siden av formen skal være vendt opp på chucken. La OCT på chucken fryse til den er ugjennomsiktig hvit, ca 5-10 min.
- Plasser chucken på armen i ytterligere 5-10 min for at blokken skal komme til armtemperaturen. For å få en parallell skive, juster armen til kanten av blokken er parallelt med scenen, og det er en jevn avstand mellom scenen og den nederste kanten av blokken er den samme som scenen og den øverste kanten av blokken.
- Sett inn bladet og juster avstanden til blokken fra bladet for å ta seksjoner.
- Ta skiver med en tykkelse på 10 μm. Hold kuttingen til interessepunktet er nådd enten manuelt eller ved hjelp av trimfunksjonen.
- For å samle skiver, bruk en liten flat pensel og en detaljbørste. Når formen begynner å bli kuttet, bruk den flate børsten til å forsiktig trekke skiven mot stativet. Ved skjæring av prøven må bevegelsen være kontinuerlig og uten pause, selv om hastigheten kan avhenge av fastheten i prøven.
- Mens du kutter, bruk den flate børsten til å forsiktig lede skiven som den er laget. Skiven trenger ikke å være flush med scenen på dette punktet, så la den billow å ikke forårsake tårer eller trekker og påvirke histologi.
MERK: Når du kutter hele embryoer, kan denne delen være spesielt vanskelig, spesielt når du endrer vevstyper. Pass på at skivene er laget uten pauser og børsten trekker ikke på skivene for aggressivt. Når vevstyper endres, kan skiven brekke, så å holde temperaturen kald er nøkkelen. Hvis brudd er et problem, redusere temperaturen eller øke tykkelsen på prøven. - Sett bevegelsen på blokken på pause når prøven er helt gjennomskåret, men skiven er ikke fri fra blokken ennå. Uten å flytte den flate børsten fra skiven, bruk detaljbørsten til å klappe skiven ned for å gjøre den flat og fryse mot scenen.
- Hold skiven der i ~ 10 s før du fjerner detaljbørsten og etterbehandling skiven. Bruk de to penslene til å forsiktig flate skiven mot scenen, forhindre noen rullende, og hold den mot scenen for ~ 20-30 s.
- Vend skiven og flat mot scenen igjen. Flytt et elektrostatisk ladet lysbilde nær nok til at skiven kan tiltrukket og feste seg til lysbildet uten å måtte berøre lysbildet til scenen. Merk lysbildene med en blyant.
- Oppbevar lysbildene i en lufttett boks for å beskytte vevet mot isoppbygging under lagring. For korttidslagring skal det oppbevares sklier ved -20 °C før farging. For langtidslagring oppbevardem ved -80 °C.
5. Mikrotome snitting for parafin innebygdvev
- Plasser blokkene på is før snitting for å kjøle prøvene. Når det er kaldt, skjærer parafin lettere og kan produsere tynnere skiver.
- Forbered et 40-45 °C vannbad med ultrarent vann.
- Sett bladet i holderen i mikrotomen. Pass på at den er sikker og deretter stille inn klaringsvinkelen. Kontroller at klaringsvinkelen er riktig. Dette kan kontrolleres ved å følge produsentens instruksjoner.
- Plasser parafinblokken i mikrotomen. Pass på at det er riktig orientert slik at bladet vil skjære rett over blokken.
- Pass på at bladet er riktig orientert med blokken ved å lage et par skiver. Gjør dette nøye slik at justeringer kan gjøres.
- Trim blokken til interessepunktet er nådd.
- Lag skiver på ønsket tykkelse. Ta hensyn til at de første skivene sannsynligvis vil bli kassert.
- Plukk opp seksjonene og flytt dem inn i vannbadet ved hjelp av tang. Dette bør gjøre at seksjonene flate ut. Bruk tang for å justere dem etter behov.
- Flytt et elektrostatisk ladet lysbilde nær nok til at skiven kan tiltrukket og feste seg til lysbildet. Merk lysbildene med en blyant.
- Plasser alle innsamlede lysbilder i et lysbildestativ. La lysbildene tørke over natten ved 37 °C.
6. Deparaffinisering av vev
- Vask lysbildene i følgende rekkefølge: 3 min i xylen (2x), 3 min i en 1:1 xylen/100% etanolløsning, 3 min i 100% etanol (2x), 3 min i 95% etanol, 3 min i 70% etanol, 3 min i 50% etanol.
7. Hematoksylin og eosinfarging
- Klargjør lysbildene for farging.
- Hvis du bruker OCT forberedt vev, suge i destillert vann i ~ 4 min til OCT er oppløst og la tørke.
- Hvis du bruker parafin innebygdvev, må de deparaffiniseres. Se trinn 6.1.
- Plasser lysbildet i filtrert 0,1% hematoksylin i 10 min. Plasser lysbildet i destillert vann, endre vannet 1x umiddelbart og deretter igjen etter 3 min.
- Plasser lysbildet i 0,5% eosin for 10 s eller dip 12x. Dypp sklien i destillert vann til eosin ikke lenger striper, ca 2-3 dips.
- Dehydrer lysbildet ved å bløtlegge i 50% etanol i 10 s, 75% etanol for 10 s, 95% etanol for 30 s og 100% etanol i 1 min. Dypp i xylen til xylen kommer ut glatt, ~ 5-7 dips.
- La xylen fordampe og montere med et hurtigtørkende monteringsmedium som har en brytningsindeks nær glass.
8. Kvalitativ analyse av vanlige hjertefeil
- Ta bilder av alle prøver ved hjelp av et invertert eller stereomikroskop og det respektive kameraet. Ta makroskopiske og mikroskopiske bilder, avhengig av hvilke typer defekter som analyseres. Makroskopiske bilder kan tas med forstørrelse under 10x. Mikroskopiske bilder bør tas ved 40x forstørrelse eller høyere. Bildene tatt i dette papiret ble tatt med 5x forstørrelse ved hjelp av et stereomikroskop og et 40x luftmål (objektiv N.A. på 0,55) ved hjelp av et omvendt mikroskop.
MERK: Makroskopiske bilder er et godt utgangspunkt fordi de gir en visning til hele hjertet (Figur 3). Etter hvert som mønstre ne setter i seg, kan spesifikke områder fokuseres på og undersøkes videre. - Still opp alle bildene side ved side på en dataskjerm. Ha alle bildene av kontrollprøver på den ene siden av skjermen og alle bildene av eksperimentelle prøver på den andre siden av skjermen. Det er best å analysere en behandlingsgruppe om gangen.
- Se etter forskjeller i fenotyper mellom behandlingsgrupper, fra viktige områder der vanlige hjertefeil finner sted. Dette vil variere avhengig av om bildene er makroskopiske, som skildrer brutto anatomi i hjertet, eller mikroskopisk, som skildrer mikroskopisk anatomi av hjertevevet.
- Begynn å søke etter vanlige makroskopiske hjertefeil, for eksempel ventrikulære septaldefekter (Figur 2A), atrieseptale defekter (Figur 2B) og patentductus arteriosus (Figur 2C). Alle disse feilene er lettest sett i den tverrgående visningen av hjertet.
- For å identifisere septale defekter, bør du vurdere å se på flere skiver, fordi de kan observeres i ett plan av vevet og ikke et annet.
MERK: Noen ganger er en defekt ikke mangelen på septum, men et hull i septumet. Vær derfor forsiktig oppmerksom på ikke å forveksle en tåre for en septal defekt. Leter du etter konsistenser mellom nærliggende skiver i et bestemt område kan bekrefte om dette faktisk er en defekt eller en tåre fra kutting. - For å identifisere defekter i utstrømningskanalen, for eksempel patentductus arteriosus, bruk flere skiver for å følge de store blodkarene når de forlater hjertet. Lag et bilde av de store blodårene i forhold til hverandre. Et eksempel er omtalt i figur 2C.
MERK: Noen uregelmessigheter kan skyldes et embryos utviklingsstadium (f.eks. patentductus arteriosus lukkes postnatalt, kort tid etter fødselen; ventrikulær septum lukkes ikke helt før ~ e14.5). Noen andre vanlige makroskopiske hjertefeil som ikke er inkludert i tallene inkluderer vedvarende truncus ateriosus, som kan oppdages lettest på e16.5 og senere; dobbelt utløp høyre ventrikkel (DORV), som kan oppdages i skiver der hjertet kommer inn i utstrømningskanalen; og en overordnet aorta22. En vanlig mikroskopisk hjertefeil inkluderer redusert muskelkomprimering (Figur 4).
9. Kvantitativ analyse av hjertemuskelkomprimering ved hjelp av hematoksylin og eosinfarget vev
- Ved hjelp av makroskopisk visning av farget vevsprøver (Figur 4A), identifiserer du en interesseregion for bilde ved en 40x forstørrelse (figur 4B). For dette papiret ble veggen av venstre ventrikkel brukt. Lagre bildet i ønsket format. For dette papiret ble bilder lagret som TIF-filer.
- Åpne bildet i ImageJ-programvaren.
- Sett bildet til 8-biters. Dette gjør at bildet kan bruke terskelverktøyet i neste trinn23,24. Hvis du vil gjøre dette, velger du "Bilde | Type | 8-bit".
- Angi terskelen for bildet. Formålet med dette trinnet er å velge bare pikslene som representerer bakgrunnen, unntatt pikslene som representerer vevet23,24.
MERK: Dette overflatearealet trekkes fra senere. En riktig terskel vil velge piksler som forskeren ønsker å utelukke fra muskelvev overflateareal. Derfor bør sluttresultatet inkludere vevet i gråtoner og bakgrunnen vil bli valgt.- Klikk på "ImageJ | Bilde | Juster | Terskel". Flytt den øverste linjen for å foreta terskeljusteringer. Lukk terskeljusteringsvinduet uten å gjøre andre endringer når de ønskede delene er valgt21.
- Bruk polygonmarkeringsverktøyet til å velge plassen som vevet opptar. Sørg forsiktig for at konturene sporer vevsgrensene, fordi løse sporinger vil gi falske målinger.
- Juster måleinnstillingene på ImageJ slik at programvaren bare måler området med piksler som ble valgt ved hjelp av terskelverktøyet i trinn 9.423. "ImageJ | Analyser | Angi målinger | Område og Grense til terskel". Velg bare Område og Grense til terskel.
- Mål området for de uthevede pikslene. "ImageJ | Analyser | Mål". Denne verdien representerer området for det negative området.
- Mål området av hele regionen av interesse. Dette er området som ble valgt ved hjelp av verktøyet Polygon Selections. "Bilde J | Analyser | Angi målinger | Område". Velg bare Område, og fjern merket for Begrens til terskel. Mål deretter, velg "Bilde J | Analyser | Mål".
- Beregn området det faktiske muskelvevet opptar innenfor regionen av interesse. Trekk området av det negative rommet fra området av hele regionen av interesse. Denne verdien er muskelvevet.
- Beregn muskelkomprimeringsindeksen (MCI). Del området av muskelvevet ved området av regionen av interesse.
Jo større MCI-verdien er, desto mer komprimert er muskelen. Disse MCI-verdiene kan deretter brukes til statistisk analyse for å teste for signifikante endringer i muskelkomprimering mellom behandlingsgrupper (figur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muskelkomprimeringsindeksen ble sammenlignet mellom hjerter som utviklet seg under to forskjellige miljøer, en kontroll og en eksperimentell gruppe. Disse protokollene ble brukt til å analysere komprimering av muskelvev kvantitativt, som tillot statistisk analyse. Muskelkomprimering ble vist å være betydelig redusert i eksperimentelle hjerter i forhold til embryoene som utviklet seg under ikke-eksperimentelle forhold.
Embryoer ble kassert hvis observasjonstidspunktet virket unøyaktig. Selv om forkrøplet vekst av embryoer kan være et resultat av behandlingen av eksperimentet, og det er en rekke utviklingsmessige fremskritt, ble avl fordelt tilstrekkelig for å sikre tidspunktet for embryoutvikling. Iscenesettelse av embryoene ble gjort ved hjelp av Theiler Staging21. Prøvene ble ansett å være dårlig skiver hvis skivene ikke reflekterer konsistens eller om de hadde åpenbare tårer eller folder. Farging ga nok kontrast til å smake ut vevkantene, men var ikke så mørkt som å gjøre cellefunksjoner umulig å skille. Lysbilder ble deretter avbildet med et omvendt mikroskop med et mål på 40 x. MCI-verdier ble beregnet ved hjelp av ImageJ-programvare og Microsoft Excel. Disse MCI-verdiene ble analysert ved hjelp av en T-test.
Figur 1: Plug-analyse resulterer i C57BL6/J-mus. (A) En mus med en lett identifiserbar copulation plug. (B) En mus uten copulation plug. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vanlige hjertefeil. Skjemaer av den sanne forventede morfologien til en medfødt hjertefeil. (A) Tverrgående visning av en ventrikulær septaldefekt. (B) Tverrgående visning av en atrieseptell defekt. (C) Patent ductus arteriosus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hematoksylin og eosinflekk av e15,5 hjerter. (A) Et farget hjerte som utviklet seg under normale forhold. Skala bar = 750 μm. (B) Et farget hjerte som utviklet seg under eksperimentelle forhold. Skala bar = 750 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantitativ analyse av muskelkomprimering mellom hjerter som utviklet seg under normale mors dietter og hjerter som utviklet seg under essensielle fettsyremangel mors dietter. (A) Hematoksylin og eosin farget hjerter på en makroskopisk (5x) visning. Skala barer = 1000 μm. (B) Hematoxylin og eosin farget hjerter på mikroskopisk visning (40x). Skala stolper = 75 μm. (C) De resulterende dataene for Muscle Compaction Index målinger. Verdiene ble analysert ved hjelp av en T-test (n = 4 per behandlingsgruppe). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen utforsker teknikkene som er involvert i analysen av hjerteutvikling i embryonale hjerter. Noen begrensninger av denne metoden er den nødvendige fysiske fingerferdigheten for forberedende teknikker, som kan kreve praksis, og dyktighet med mikroskopavbildning. Hvis skivene oppnådd ved kryostat er rotete, vil hematoksylin og eosinfarging ikke være klare, eller hvis bildene tatt på mikroskopet har dårlig belysning, vil metoden som brukes med ImageJ ikke fungere. En begrensning av terskelfunksjonen i ImageJ-programvaren er at den velger piksler som ligger på den ene enden av en terskel som er avhengig av pikselverdien. Derfor vil eventuelle piksler som finnes på feil side av terskelen, bli feil inkludert eller ekskludert i beregningen. Til syvende og sist vil feilsøking være nødvendig for vedtaking av protokollene for bruk i en studie.
I tilfelle at hjerteutvinning er for vanskelig, bør du vurdere å hoppe til trinn 2.8. I tillegg bør du vurdere å fjerne mer enn bare hjertet og lungene fra brysthulen. Målet blir da større og lettere å manipulere, og direkte kontakt mellom hjertet og de fine pinsettene minimeres. Ved kryostatsnitting vil de eksperimentelle prøvene alltid være direkte sammenlignet med kontrollprøver. Dette gir litt rom for brukerfeil så lenge feilen er konsekvent i alle eksempler. For å minimere brukerfeil og unngå falske resultater, sørg for at sammenlignbare deler er hentet fra begge behandlingsgruppene. Hvis for eksempel mer enn én person produserer seksjoner, må du kontrollere at én person produserer et jevnt antall seksjoner for kontroller og alle behandlingsgrupper, og ikke bare én undergruppe. Til slutt, når du tersetter bilder på ImageJ, brukes terskelverktøyet til å gi maksimal frihet i å velge piksler som representerer vev og piksler som ikke gjør det. Juster om nødvendig kontrasten til bildene for å ytterligere intensivere pikselverdien av bakgrunnen fra pikselverdien av vevet. Selv om det finnes feilsøkingsalternativer, krever teknikkene fortsatt en høy grad av dyktighet. Imidlertid gir utførelse av denne protokollen tilgang til data som vanligvis ikke måles i andre hjerteutviklingsforskningsstudier. Dermed kan bruk av funksjoner i denne protokollen gi et betydelig bidrag til en vitenskapelig undersøkelse.
Identifisere virkningene av eksperimentelle behandlinger i kardiologi forskning ofte undersøkes gjennom morfologi vurdering. Dette er spesielt tilfelle i utviklingsbiologi, der morkaken gjør det vanskelig for fysiologiske egenskaper ved å utvikle hjerter å bli målt. Derfor, morfologisk analyse som gir innsikt i hjertets funksjon dramatisk skifter banen for utviklingsbiologi forskning. Selv om de fleste papirer analysere tykkelsen på hjertemuskelen for å bestemme styrken i hjertet, direkte måling av muskelkomprimering kan gi ytterligere innsikt i fysiologien til det utviklende pattedyrhjertet25,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer å rapportere.
Acknowledgments
Aguirre Lab støttes av National Heart, Lung, og Blood Institute of the National Institutes of Health under prisnummer K01HL135464 og av American Heart Association under prisnummer 19IPLOI34660342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D.
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al.
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E.
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).
- Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).
- Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).
- Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J.
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
