Summary
Bu protokolde, konjenital kalp defektleri ile ilişkili farelerde gelişimsel fenotipleri nitel ve nicel olarak analiz etme prosedürlerini açıklıyoruz.
Abstract
Konjenital kalp defektleri (KDE) insanlarda en sık görülen doğum kusuru türüdür ve tüm canlı doğumların %1'ini etkilemez. Ancak, CHD için altta yatan nedenler hala kötü anlaşılmaktadır. Gelişmekte olan fare CHD çalışması için değerli bir model oluşturmaktadır, fareler ve insanlar arasında kardiyak gelişim programları son derece korunur çünkü. Protokol, istenilen gebelik evresinde fare embriyolarının nasıl üretilebildiğini, kalbi aşağı işleme için izole etme ve koruma yöntemlerini, histoloji ile yaygın chd türlerini belirlemek için nicel yöntemlerin (örn. ventriküler septal) nasıl üretilmelerini ayrıntılı olarak açıklar. defektleri, atriyal septal defektler, patent ductus arteriosus) ve ortak kas sıkıştırma fenotiplerini ölçmek için kantitatif histomorfometri yöntemleri. Bu yöntemler, bilim adamlarının CHD'yi doğru ve tekrarlı bir şekilde ölçmelerine olanak tanıyan numune hazırlama, toplama ve analiz ile ilgili tüm adımları ifade edeyim.
Introduction
KDE'ler insanlarda en sık görülen doğum kusuru türüdür ve doğum kusuruna bağlı ölümlerin önde gelennedenidir 1,2,3,4,5,6. Yenidoğan çocukların yaklaşık% 90 ChD hayatta olmasına rağmen, sık sık hastalarınyaşamları ve sağlık sistemi7,8,9,10ağır bir yük empoze, yıllar içinde önemli morbidite ve tıbbi müdahaleler ile ilişkilidir. Tamamen genetik faktörlerin dışında, KCHD nedenleri kötü anlaşılmaktadır4. Tanımlanamayan nedenler Amerikan Kalp Derneği ve diğer kaynaklara göre tüm CHD olgularının ~ 56-66% için hesap2,3,4,11. Bilinen faktörler genetik mutasyonlar, CNVs, de novo tek nükleotid varyantları ve aneuploidi içerir. Bu çevresel ve diyet faktörleri de CHD katkıda önemli kaynaklar olduğundan şüphelenilmektedir, anne yaşam tarzı bağlayan epidemiyolojik çalışmalar tarafından önerilen2,12, ekonomik yoksunluk, ve ırk13, ve folik asit gibi diyet faktörleri içine araştırma tarafından11,14 ve biyoaktif lipid retinoik asit15,16. KCHD ve diğer kardiyovasküler defektlerin mekanizmaları ve nedenlerini araştırmak önleyici stratejiler ve yeni tedavi seçenekleri1,4,17,18,19geliştirmek için önemlidir.
Gelişmekte olan fare memelilerde CHD eğitimi için bir mihenk taşıdır modelidir. Ancak, kalp morfolojisini koruyan diseksiyonlar, gelişimevrelerinin analizi ve ChD ile ilişkili kusurların belirlenmesi gibi bazı yöntem ve analizler, murine kalpanalizinde yeni olan bilim adamları için yıldırıcı olabilir. Bu protokolde açıklanan yöntemlerin amacı, bu süreçler için nitel ve nicel yönergeler sunmaktır. Böylece, bu protokolde istenilen gebelik evresinde embriyo üretmek için zamanlanmış mikatların nasıl yapılacağını, sağlam kalp iyileşmesi için gebe leri nasıl inceleyeceğimizi (çıkış yolu gibi ilişkili dokular dahil), kalp fiksasyonu ve kriyostat kesit, temel histoloji yöntemleri, ortak kalp defektlerinin nicel analizleri ve kalp kası sıkıştırmasının nitel analizi, bazı KH türlerinin ortak öncüfenoti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu makalede atıfta bulunulan deneylerde kullanılan tüm hayvanlar Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) hayvan bakım yönergeleri kullanılarak tedavi edildi.
1. Embriyo üretimi için C57BL6/J farelerinin zamanlı kenetlemesi
- Fareler üreme yaşına (6-8 hafta) ulaştıktan sonra, onları harem üreme biçiminde (yani bir erkek başına iki dişi) bir araya getirin. Öğleden sonra ya da akşam ıslah ıslahı için ayarlayın.
NOT: Fareler genellikle 1 saat içinde ışıklar kendi konut tesisi içinde kapatıldıktan sonra içinde ürerler. Dişiler yaklaşık 6-8 aylıkken üremeden emekli olmalı ve erkekler en geç 12 aylıkta kullanılmalıdır. - Döllenmeyi belirlemek için tartma yöntemini kullanıyorsanız, fareleri büyük gruplar halinde üre, çünkü tartma yöntemi zamanlanmış çiftleşmenin sadece çiftleşme fişlerinin izlendiği yöntemlerden daha yavaş bir hızda ilerlemesine neden olur.
- Ertesi sabah, 8 AM-12 PM arasında bazen çiftleşme fişleri için kontrol edin. Fiş tonu sabah 8'den önce yapılırsa, fişin vajinal kanalda gözlemlenemeyecek kadar derin olma riski vardır. Fiş tonu 12:00'den sonra yapılırsa, fişin düşme riski vardır.
- Kuyruk tabanından kadın kapmak ve bir mikropipet ucu kullanımı ile vajinal kanala açılış araştırmak. Bir çiftleşme fişi mukozal bariyer gibi görünecektir(Şekil 1A),bazı durumlarda görmek biraz zor olabilir. Crustiness da bir çiftleşme fişi veya mevcut olduğunu bir göstergesidir. Mukozal bariyer yoksa(Şekil 1B)dişi büyük olasılıkla çiftleşmemiş sayılsa veya çiftleşme fişi çoktan düşmüş olabilir.
- Çiftleşme sabahıe e0.5 olarak bakın.
NOT: C57BL6/J farelerinde çiftleşme fişlerinin tanımlanması zor olabilir. Bu nedenle, bazen fareler hiçbir fiş gözlenmedi rağmen çiftleşti. Çiftleşme her zaman gebe liğe yol açmaz. Bu genellikle C57BL6/J farelerde daha olasıdır. Bu nedenle, gebeliği doğrulamak için kilo ilerlemesini izleyin (bkz. adım 1.4). TartMa ins hamile olan kadınların belirlenmesine yardımcı olabilir ve fişler gebe yol doğruladı. Ardışık geceler boyunca dişileri keneiken dikkatli olun. Belirli bir erkek bir çiftleşme fişi üretiminde iyi olduğu gözlenirse, bu erkek aynı kadın ile ardışık gece çiftleşmek için güvenilir olabilir. - Daha önce başarılı bir şekilde yetiştirilmiş olduğu gibi, yetiştiricileri kanıtlanmış farelerde gebelik şansının daha yüksek olduğunu unutmayın. Kanıtlanmış yetiştiricileri sahip şansını artırmak için, kullanılan erkekler çok yaşlı olmamalıdır.
- Fiş titresini takip ederek dişileri tartın. Bu tartım 7-10 gün sonra takip edilmelidir. Kilo alımı 1.73 g aşıyorsa, o zaman fare muhtemelen hamile20. Kilo alımı 1.73 g'ın altında ysa, gebelikle ilgisi yoktur ve fare üreme popülasyonuna yeniden tanıtılmalıdır.
NOT: C57BL6/J fareleri küçük çöpler üretir (ortalama beş ila altı embriyo). Gebelik belirlemek için yöntemler tartmak çoğunluğu için doğrudur. Bu yöntemi kullanarak% 12.8 yanlış pozitif oranı sağlar ve aslında hamile olan kadınların% 3 dışlayacaktır20. Araştırmacı istenilen gebelik süresinin daha geç olacağından endişe duyuyorsa, adım 1.5'e geçin - İsteğe bağlı: Diseksiyonun yapılacağı gün, fiziksel muayene ile gebeliğin ilerlediğinden emin olun. Kuyruğun tabanından dişi kapmak ve vücut dışarı germek. Bu bilek fare yerleştirerek ve yavaşça kuyruk tabanını çekerek yapmak en kolay. Kadın hamile ise, o zaman büyük olasılıkla alt gövde özellikle kilo alımı olacak, ve küçük topaklar olarak görünecektir.
NOT: Gebelik e12.5 kadar erken hissedilebilir ve çoğu durumda e14.5 ile hissedilir olacaktır. C57BL6/J farelerküçük çöp boyutlarına sahiptir, bu nedenle fiziksel belirti olmasa bile dişi hamile olabilir.
2. Kalp iyileşmesi için kadın ve embriyoların diseksiyonu
- Diseksiyonun başlamasından önce aşağıdaki çözeltileri oda sıcaklığında hazırlayın.
- Etilendimintetraasetik asit (EDTA) 0,5 mM konsantrasyonda fosfat tamponlu salin (PBS) içine çözünür.
NOT: Hazırlandıktan sonra çözeltiyi buzda tutmak ve sadece 4 °C'de kullanmak tercih edilir. Kontaminasyon bir sorun ise, kullanmadan önce otoklav olmalıdır. - Paraformaldehiti (PFA) %4 konsantrasyonla PBS'ye eritin.
NOT: Hazırlandıktan sonra çözeltiyi buzda tutmak ve sadece 4 °C'de kullanmak tercih edilir. Uzun süreli depolama için 4 °C veya daha soğuk ta saklayın. PFA çözeltisinin konsantrasyonu doku örneklerinin aşağı uygulamalarına bağlı olarak değişebilir. Bu yüzde hematoksilin ve eozin boyama, immünohistokimya ve immünofloresan boyama için kullanılır.
- Etilendimintetraasetik asit (EDTA) 0,5 mM konsantrasyonda fosfat tamponlu salin (PBS) içine çözünür.
- Dişi istenilen gebelik aşamasına ulaştıktan sonra, fare hayvan kullanımı nın onaylanan kurallarına göre günün doğru saatinde ötenazi yapılmalıdır. Zamanlamayarım gün ise (örneğin, e15.5) 12:00'ye yakın bir yerde kurban edilmelidir. Zamanlamalar tüm günlerdeyse (örn. e15.0) 12:00'ye yakın bir yerde feda edilmelidir.
NOT: Gebeliğin farelerin eşlenegeldiği gece yarısı nın yakınında meydana geldiği varsayılır. Ancak, tam olarak döllenme zamanını belirlemek zordur. Bu nedenle, zamanlama tam olarak değil tahmin edilmektedir. - Dört uzuvaşağı sabitleme sonra, dikkatle göğüs boyunca bir I şeklinde kesi yapmak, sternum doğru üretra etrafından başlayarak.
- Rahim büyük olasılıkla pelvik bölgenin hemen üzerinde yer alacak. Fare rahim Y şeklindedir; bu nedenle, büyük olasılıkla çok uzun olacak ve gövde etrafında sarılmış. Yavaşça kaldırarak çıkarın. Bunu bir kepçe hareketi ince forceps yanlarını kullanarak yapın. Rahim yüzeysel dokular çok dikkatli bir şekilde ince püf noktaları tarafından başlangıçta rahim çekerek kapmak olabilir. Vücuttan rahim kesmek için makas kullanın.
NOT: Rahimin alışılmadık Y şeklindeki olağandışı tutulması, tüm rahim kaldırılır emin olun. - Rahmi buz gibi PBS'de ıslatın. Rahmin bir ucunu aşağı sabitleyip tek bir çizgiye doğru uzatın.
- Ayrı bir embriyo içeren her bölüm, bölümler halinde rahim kesin. Yavaşça ince forceps ile embriyo soyma. Bu her elinde forseps bir çift ile yapmak en kolay. Çıkarıldıktan sonra, embriyoyu hemen 4 °C'de PBS-EDTA çözeltisi ile dolu yeni bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Normal PBS çözeltisi de kullanılabilir, ancak EDTA örneklerde pıhtılaşmayı önler. - Theiler Evreleme21kullanarak embriyolar Sahne . Evreleme tek bir çöp içinde embriyolar arasında değişebilir çünkü, sahne her bir embriyo.
NOT: Bu da embriyolarda olası konjenital kalp kusurları içine öngörü sağlayabilir. Tipik olarak, konjenital kalp defekti belirtileri embriyonik morfolojigörülebilir. Diğer büyük kusurları genellikle bazı kalp koşulları ile ilişkili mevcut olabilir. - Kalp embriyonun yaşına bağlı olarak çeşitli şekillerde kaldırılabilir.
NOT: Çıkış yolu kaldırma sırasında bozulmadan kalacak olup olmadığı belli değilse, ya sadece kalp daha fazla doku kaldırmak (çıkış yolu bozulmadan tutmak ve kalp ve forceps arasında doğrudan temas en aza indirmek) ya da tüm embriyo analiz.- Bir diseksiyon kapsamı ve ince forceps iki çift kullanarak, sırtında embriyo konumlandırmak ve göğüs erişimi stabilize. Bu ya forceps ile kolları aşağı sabitleme veya kollar kaldırarak ve pozisyonda gövde tutarak yapılabilir.
- Embriyonun göğüs boyunca bir kesi yapmak ve göbek köprücük kemiği arasında genişletmek için ince forceps ikinci bir çift keskin noktası kullanın. Yavaş yavaş göğüs boşluğunun içine doğru çalışırken çok ince ve yüzeysel kesiler yaparak başlayın. Kalp zar zor görünür hale gelmelidir. Bu yüzeysel kesiler sırasında forceps ile temas etmeyin.
- Yavaşça embriyonun gövde üzerinde sıkmak için forceps ilk çifti kullanarak açık göğüs kafesi soyma, göğüs kafesi için biraz kaudal. Kalp dışarı çıkmalı ya da belirgin hale gelmelidir. Kalbin dışarı çıkması için nazik bir ikna gerekebilir. Forceps tarafını kullanın, forceps noktası kalp ile temas asla emin olun. Çalışma alanını ve forceps temiz tutmak için, yakın bir tiftik ücretsiz silme tutun.
- Yavaşça forceps yanları ile pulmoner kan damarları kapmak, doku kesmek için emin olun, ve göğüs boşluğundan kalp çekin. O zaman kalbi temizle.
NOT: Embriyolar için e13.5 ve daha genç kalp perikard ile kaplıdır. Kalbe ulaşmak için bu çıkarılmalıdır.
- Stereoskop kullanarak, daha sonra referans için kalbin bir fotoğrafını çekmek.
- 1-2 dakika PBS-EDTA çözeltisi kalpleri durulayın ve sonra bunları düzeltmek için yaklaşık 45-60 dakika için% 4 PFA çözeltisi içine yerleştirin. Tüm embriyo analizi isteniyorsa, bir gecede ıslatın. PFA çözeltisinin hacmi, sabit olan dokunun hacminin 5-6kat olması gerekir.
NOT: Bu kuluçka süresi sonraki çalışmalara bağlı olarak değişebilir. Bu kuluçka süresi hematoksilin ve eozin boyama, immünohistokimya ve immünofloresan boyama için kullanılır. - 5-10 dk PBS-glisin 3x ile yıkayın ve PBS geri yerleştirin. Sodyum azit veya penisilin / streptomisin de bakteri büyümesini en aza indirmek ve bozulmamış dokuları korumak için eklenebilir. Kalpler artık 4 °C'de kısa süreli olarak saklanabilir.
3. Doku hazırlama
NOT: Dokular OCT (optimum kesme sıcaklığı) katıştırma veya parafin katıştırma kullanılarak hazırlanabilir. Her iki yöntemin de avantajları ve dezavantajları vardır ve hangi katıştırma yönteminin kullanılacağına karar verirken analizin amacı göz önünde bulundurulmalıdır.
- OCT gömme
NOT: Kriyosiyonlar antijen reaktivitesini koruduğu, hematoksilin ve eozin boyama için hala kullanılabildiği ve dilimleri daha hızlı ürettiği için bu yöntem formalin/parafin katıştırmaya tercih edilebilir.- % 30 (w / v) konsantrasyonda PBS içine çözünmüş sakaroz bir çözüm hazırlayın.
- Dokuları pbs-%30 sakaroz içeren yeni 15 mL konik tüpveya 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Başlangıçta, doku yüzer.
- Buzdolabında 4 °C'ye yerleştirin. Doku, genellikle 24-40 saat içinde, tüpün altına battığında EKIM gömme için hazır olacaktır.
NOT: Kas dokuları donma/çözülme döngüleri sırasında önemli ölçüde acı çeker ve doğal morfolojilerini kaybederler. Sakaroz doku tarafından emilir ve morfolojisinin daha iyi korunmasına olanak sağlayan bir kriyokoruma ajanı olarak çalışır. Tüplerde dokuların yüzer olması için yeterli çözümün yeterli olduğundan emin olun. PBS-sakaroz kolayca bakteri ile kontamine, bu yüzden bulanıklık için sık sık çözüm kontrol edin, hangi mantar veya bakteriyel büyüme gösterir. PBS-sakaroz çözeltisine penisilin/streptomisin veya sodyum azit kontaminasyon riskini en aza indirmek için eklenebilir. - Bir Pasteur pipet ile kalpleri çıkarın, pipet açılması doku yırtmak için yeterince geniş olduğundan emin olun. Gerekirse makas ile pipet kesin. Tüm embriyolarla çalışıyorsanız, örneği almak için forceps kullanın.
NOT: Bunu nazikçe yapın. Pipet açıklığı kalpleri alacak kadar geniş olsa bile, pipetin kenarları dokuları yırtabilir. Forceps çok agresif kullanıldığında doku örnekleri girintisi olabilir. - Kısaca doku bir tiftik içermeyen silme üzerinde hava izin verin. Numuneyi kesme için istenilen pozisyonda bir OCT kalıbına yerleştirin (yani, sagittal, enine, koronal). Örnek tamamen batırılmış kadar OCT bileşik ekleyin, doku ile temas hiçbir kabarcıklar olduğundan emin olun.
- Kalıbı gecede veya birkaç gün -20 °C'ye yerleştirin ve kalıbı -80 °C'ye taşıyın. 24 saat sonra kalıp kriyokesit için hazırdır. Bu formattaki dokular uzun süreli saklanabilir.
- Parafin Gömme
- Etanol kullanarak, bu ardışık dokuları dehydrate: 10 dakika için% 50 etanol, 10 dakika için% 70 etanol, 10 dakika için% 80 etanol, 10 dakika için% 95 etanol, 10 dakika için% 100 etanol (bu 3x yapmak).
- Bu arkaya etanol / ksilen çözeltisi bir dizi dokuları ıslatın: 2:1 etanol / ksilen çözeltisi için 10-15 dakika, 10-15 dakika için 1:1 etanol / ksilen çözeltisi, 10-15 dakika için 1:2 etanol / ksilen çözeltisi, 10-15 dakika için 100% ksilen (bu 3x yapın).
- Ksilenin yerine parafin bu arkaya bir vakum fırında (54-58 °C arasında ayarlanmış) dokuları ıslatın: 30 dakika için 2:1 ksilene/parafin çözeltisi, 30 dakika için 1:2 ksilene/parafin çözeltisi, 30 dk için 1:2 ksilene/parafin çözeltisi, 1-2 saat için %100 parafin, 1-2 saat veya bir gecede bir gecede %100 parafin.
NOT: Dokuların 60 °C'nin üzerinde uzun süre ısınması parafin polimerlerinin bozulmasına ve dokunun kırılganlaşmasına neden olur. - Taze parafin kullanarak, istediğiniz pozisyonda dokuları gömmek.
4. OCT gömülü dokular için cryostat kesit
- Kriyostatta, numuneler daha önce -80 °C'lik dondurucuda saklanıyorsa, tüm numuneleri en az 1 saat içeride yerleştirin. Tüm bölümler toplanana kadar orada kalmalılar.
- Kriyostat'ın doğru sıcaklık ayarlarında ayarlandıkdığından emin olun. Kriyostat odasının içindeki çevre sıcaklığı -20 °C, kriyostat'ın kolu ise -24 °C olmalıdır.
NOT: Bu sıcaklık, bloğun dilimlemeye nasıl tepki gösterdiğine bağlı olarak değişebilir. Tutarsız dilimleme bir sorun sayılsa, ortamın sıcaklığı düşürülebilir. - OkT bloğunu kalıbın açık tarafının kenarlarını çekerek gevşetin ve ardından kalıbın daraldığı kapalı uçtaki bloğu çimdikleyerek kalıbından çıkarın.
- OCT bloğunu monte etmek için, oda sıcaklığını kkık üzerine yerleştirin, ortasından başlayıp kenara doğru çalışarak. Tüm chuck kaplı olması gerekmez.
- OCT bloğunu (bkz. adım 3.1) kalıba yerleştirin. Kalıbın kapalı tarafına karşı olan bloğun kenarı aynaya dönük olmalıdır. Opak beyaz olana kadar opak, yaklaşık 5-10 dakika olana kadar chuck üzerinde OCT dondurmak için izin verin.
- Blok kol sıcaklığına gelmek için başka bir 5-10 dakika için kola chuck yerleştirin. Paralel bir dilim elde etmek için, bloğun kenarı sahneye paralel olana ve sahne ile bloğun alt kenarı arasında, sahne ve bloğun üst kenarı yla aynı olana kadar kolu ayarlayın.
- Bıçağı takın ve bloktaki mesafeyi kesitler alacak şekilde bıçakla ayarlayın.
- Dilimleri 10 μm kalınlığında alın. İlgi noktasına el ile veya kırpma işlevini kullanana kadar dilimleme devam edin.
- Dilimleri toplamak için küçük düz bir fırça ve detay fırçası kullanın. Kalıp kesilmeye başladığında, dilimi standa doğru yavaşça çekmek için düz fırçayı kullanın. Numuneyi keserken, hız numunenin sertliğine bağlı olsa da, hareket sürekli ve duraksamadan olmalıdır.
- Dilimleme sırasında, düz fırçayı kullanarak dilimi yapılırken hafifçe yönlendirin. Dilim bu noktada sahne ile floş olması gerekmez, bu yüzden gözyaşı veya çeker ve histoloji etkilemez billow izin verin.
NOT: Tüm embriyoları dilimlerken, bu kısım özellikle doku tiplerini değiştirirken zor olabilir. Dilimlerin duraksamadan yapıldığından ve fırçanın dilimleri çok agresif bir şekilde çekmediğinden emin olun. Doku tipleri değiştiğinde, dilim kırılabilir, bu nedenle sıcaklığı soğuk tutmak çok önemlidir. Kırılma bir sorunsa, sıcaklığı düşürün veya numunenin kalınlığını artırın. - Örnek tamamen kesildikten sonra bloğun hareketini duraklatın, ancak dilim henüz bloktan boş değil. Düz fırçayı dilimden hareket ettirmeden, dilimi düz yapmak ve sahneye karşı dondurmak için ayrıntı fırçasını kullanın.
- Detay fırçasını çıkarmadan ve dilimi bitirmeden önce dilimi ~10 s boyunca orada tutun. Dilimi yavaşça sahneye doğru düzleştirmek, herhangi bir yuvarlanmayı önlemek ve ~20-30 s için sahneye karşı tutmak için iki boya fırçası kullanın.
- Dilimi çevirin ve tekrar sahneye doğru düzleştirmek. Elektrostatik olarak yüklü bir slaydını dilimin çekilmesi için yeterince yakına taşıyın ve slayta sahneye dokunmak zorunda kalmadan slayta yapışın. Slaytları bir kalemle etiketleyin.
- Saklama sırasında dokuları buz birikmesinden korumak için slaytları hava geçirmez bir kutuda saklayın. Kısa süreli depolama için, slaytlar boyama dan önce -20 °C'de saklanmalıdır. Uzun süreli depolama için -80 °C'de tutun.
5. Parafin gömülü dokular için mikrotom kesit
- Örnekleri soğutmak için kesit ten önce blokları buz üzerine yerleştirin. Serin, parafin dilimleri daha kolay ve ince dilimler üretebilir.
- Ultra saf su kullanarak 40-45 °C su banyosu hazırlayın.
- Bıçağı mikrotomun içindeki tutucuya koyun. Güvenli olduğundan emin olun ve ardından açıklık açısını ayarlayın. Açıklık açısının doğru olduğundan emin olun. Bu, üreticinin talimatlarına göre kontrol edilebilir.
- Parafin bloğunu mikrotome yerleştirin. Bıçağın blok boyunca düz keseceği şekilde doğru şekilde yönlendirilmiş olduğundan emin olun.
- Birkaç dilim yaparak bıçağın blokla doğru şekilde yönlendirilmesini sağlayın. Ayarlamalar yapabilmek için bunu dikkatlice yapın.
- İlgi noktasına ulaşılına kadar bloğu kırpın.
- İstenilen kalınlıkta dilimler yapın. İlk birkaç dilimin büyük olasılıkla atılacağını göz önünde bulundurun.
- Bölümleri almak ve forceps kullanarak su banyosu içine taşıyın. Bu bölümlerin düzere yapar. Gerektiğinde ayarlamak için forceps kullanın.
- Dilimin çekilebilecek kadar elektrostatik yüklü bir slaydını yakına taşıyın ve slayta yapışın. Slaytları bir kalemle etiketleyin.
- Toplanan tüm slaytları slayt rafına yerleştirin. Slaytların bir gecede 37 °C'de kurumasını bekleyin.
6. Dokuların deparafinizasyonu
- Aşağıdaki sırayla slaytlar yıkayın: 3 dk ksilen (2x), 3 dk bir 1:1 xylene/100% etanol çözeltisi, 3 dk 100% etanol (2x), 3 dk% 95 etanol, 3 dk% 70 etanol, 3 dk% 50 etanol.
7. Hematoksilin ve eozin boyama
- Lekeler için slaytlar hazırlayın.
- OCT hazırlanmış dokular kullanıyorsanız, OCT çözülene kadar ~ 4 dk distile suda bekletin ve kurudu.
- Parafin gömülü dokular kullanıyorsanız, onlar deparafinized olmalıdır. Bkz. adım 6.1.
- 10 dakika boyunca filtrelenmiş% 0.1 hematoksilin slayt yerleştirin.
- 10 s veya 12x daldırma için% 0.5 eozin slayt yerleştirin. Eozin artık çizgiler kadar distile suda slayt daldırma, yaklaşık 2-3 dips.
- 10 s için% 50 etanol, 10 s için% 75 etanol, 30 s için% 95 etanol ve 1 dakika için% 100 etanol ıslatarak slayt dehydrate.
- Ksilenin buharlaşmasına ve cama yakın bir kırılma indisi olan hızlı bir kurutma montaj ortamıyla monte etmesine izin verin.
8. Ortak kalp defektlerinin nitel analizi
- Ters veya stereo mikroskop ve ilgili kamera kullanarak tüm örneklerin görüntülerini alın. Analiz edilen kusurların türlerine bağlı olarak makroskopik ve mikroskobik görüntüler alın. Makroskopik görüntüler 10x altında herhangi bir büyütme ile alınabilir. Mikroskobik görüntüler 40x büyütme veya daha yüksek alınmalıdır. Bu yazıda çekilen fotoğraflar, bir stereo mikroskop ve ters bir mikroskop kullanılarak 40x hava hedefi (0,55'lik lens N.A.) kullanılarak 5 x büyütme ile çekildi.
NOT: Makroskopik görüntüler iyi bir başlangıç noktasıdır, çünkü tüm kalbe bir görünüm sağlarlar (Şekil 3). Desenler belirlendikçe, belirli alanlar adedine odaklanılabilir ve daha fazla araştırılabilir. - Tüm görüntüleri bilgisayar ekranında yan yana hizala. Ekranın bir tarafında kontrol örneklerinin tüm görüntüleri ve ekranın diğer tarafında deneysel örneklerin tüm görüntüleri var. Bir tedavi grubunu aynı anda analiz etmek en iyisidir.
- Yaygın kalp kusurlarının meydana geldiği önemli alanlardan başlayarak tedavi grupları arasındaki fenotip farklılıklarına bakın. Bu görüntüler makroskopik olup olmadığına bağlı olarak değişir, hangi kalp brüt anatomisini tasvir, ya da mikroskobik, kalp dokusunun mikroskobik anatomisi tasvir.
- Ventriküler septal defektler (Şekil 2A), atriyal septal defektler (Şekil 2B), ve patent ductus arteriosus (Şekil 2C) gibi yaygın makroskopik kalp defektleri aramaya başlayın. Tüm bu kusurları en kolay kalbin enine görünümünde görülür.
- Septal kusurları tanımlamak için, birden fazla dilim bakarak düşünün, onlar doku bir düzlemde değil, başka bir gözlenebilir çünkü.
NOT: Bazen bir kusur bir septum eksikliği değil, septum bir delik. Bu nedenle, bir septal defekt için bir gözyaşı hata değil dikkat edin. Belirli bir bölgedeki yakındaki dilimler arasında tutarlılıklar arıyorsunuz bu aslında bir kusur veya dilimleme bir gözyaşı olup olmadığını teyit edebilirsiniz. - Patent ductus arteriosus gibi çıkış yolu kusurları tanımlamak için, onlar kalp terk gibi büyük kan damarları takip etmek için birden fazla dilim kullanın. Birbirine göre ana kan damarlarının bir görüntü oluşturun. Bir örnek Şekil 2C'deyer almaktadır.
NOT: Bazı düzensizlikler bir embriyonun gelişim evresine bağlı olabilir (örneğin, patent ductus arteriosus doğum sonrası kapanır, doğumdan hemen sonra; ventriküler septum ~e14.5'e kadar tamamen kapanmaz). Rakamlara dahil edilmeyen diğer bazı yaygın makroskopik kalp defektleri arasında e16.5 ve sonrası dönemde en kolay saptanabilen kalıcı truncus atereriosus; kalbin çıkış yoluna girdiği dilimlerde tespit edilebilen çift çıkışlı sağ ventrikül (DORV); ve bir geçersiz aort22. Yaygın bir mikroskobik kalp defekti azalmış kas sıkıştırma içerir(Şekil 4).
9. Hematoksilin ve eozin lekeli dokular kullanılarak kardiyak kas komponentititesinin kantitatif analizi
- Lekeli doku örneklerinin makroskopik görünümünü kullanarak(Şekil 4A),40x büyütmede görüntüye ilgi çeken bir bölgeyi tanımlar (Şekil 4B). Bu kağıt için, sol ventrikül duvarı kullanılmıştır. Görüntüyü istenilen biçimde kaydedin. Bu kağıt için görüntüler .tif dosyaları olarak kaydedildi.
- Görüntüyü ImageJ yazılımında açın.
- Görüntüyü 8 bit olarak ayarlayın. Bu görüntü sonrakiadım23,24eşik aracı nı kullanmanızı sağlar. Bunu yapmak için "Resim | Türü | 8-bit".
- Fotoğrafın eşiğini ayarlayın. Bu adımın amacı, dokuları temsil eden pikseller hariç, yalnızca arka planı temsil eden pikselleri seçmektir23,24.
NOT: Bu yüzey alanı daha sonra çıkarılır. Doğru bir eşik araştırmacı kas dokusu yüzey alanı hariç istediği piksel seçecektir. Bu nedenle, bitiş sonucu gri tonlama doku içermelidir ve arka plan seçilecektir.- Tıklayın "ImageJ | Resim | Ayarla | Eşik". Eşik ayarlamaları yapmak için üst çubuğu taşıyın. İstenilen bölümler seçildikten sonra başka bir değişiklik yapmadan eşik ayarlamaları penceresini kapatın21.
- Dokunun kapladığı alanı seçmek için çegon Seçimleri aracını kullanım. Gevşek izlemeler yanlış ölçümler sağlayacağından, ana hatların doku kenarlıklarını izlediğinden dikkatlice emin olun.
- ImageJ'deki ölçüm ayarlarını, yazılımın yalnızca 9,423adımdaki eşik aracını kullanarak seçilen piksellerin alanını ölçebilmeleri için ayarlayın. "ImageJ | Analiz Et | Ölçümleri Ayarla | Alan ve Eşik Sınırı". Yalnızca Alan'ı seçin ve Eşiğe Sınırı Belirleyin.
- Vurgulanan piksellerin alanını ölçün. "ImageJ | Analiz Et | Ölçü ". Bu değer negatif alanın alanını temsil eder.
- Tüm ilgi alanının alanını ölçün. Bu, Çokgen Seçimleri aracı kullanılarak seçilen alandır. "Görüntü J | Analiz Et | Ölçümleri Ayarla | Alan". Yalnızca Alan'ı seçin ve Eşiğe Sınır'ıseçin. Sonra ölçün, "Resim J | Analiz Et | Ölçü ".
- Gerçek kas dokusunun ilgi alanı içinde işgal olduğu alanı hesaplayın. Negatif alanın alanını tüm ilgi alanının bulunduğu bölgeden çıkarın. Bu değer kas dokusunun alanıdır.
- Kas Sıkıştırma İndeksi (MCI) hesaplayın. Kas dokusunun alanını ilgi alanına bölün.
MCI değeri ne kadar büyükse, kas o kadar sıkıştırılır. Bu MCI değerleri daha sonra tedavi grupları arasında kas sıkıştırma önemli değişiklikler için test etmek için istatistiksel analiz için kullanılabilir(Şekil 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kas sıkıştırma indeksi iki farklı ortam, bir kontrol ve deneysel bir grup altında gelişen kalpler arasında karşılaştırıldı. Bu protokoller, istatistiksel analize izin veren kas dokusunun sıkıştırmasını kantitatif olarak analiz etmek için kullanılmıştır. Kas sıkıştırma deneysel olmayan koşullarda geliştirilen embriyolara göre deneysel kalplerde önemli ölçüde azalmış olduğu gösterilmiştir.
Gözlem zamanlaması yanlış görünüyorsa embriyolar atılırdı. Embriyoların bodur büyüme denemenin tedavisinin bir sonucu olabilir rağmen, ve gelişimsel ilerleme bir dizi var, üreme yeterli embriyo gelişiminin zamanlaması sağlamak için aralıklı oldu. Embriyoların evreleme Theiler Evreleme21kullanılarak yapıldı. Örnekler, dilimler tutarlılığı yansıtmıyorsa veya belirgin yırtıkları veya kıvrımları varsa kötü dilimlenmiş olarak kabul edilir. Boyama doku kenarları yapmak için yeterli kontrast sağlanan, ancak hücre özellikleri ayırt edilemez hale getirmek için çok karanlık değildi. Slaytlar daha sonra 40x hedefi ile ters bir mikroskop ile görüntülendi. MCI değerleri ImageJ yazılımı ve Microsoft Excel kullanılarak hesaplandı. Bu MCI değerleri T-testi kullanılarak analiz edildi.
Şekil 1: C57BL6/J farelerde fiş tahkikat sonuçları. (A) Kolayca tanımlanabilir çiftleşme fişi olan bir fare. (B) Çiftleşme fişi olmayan bir fare. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yaygın kalp kusurları. Konjenital kalp defektinin gerçek beklenen morfolojisinin şemaları. (A) Ventriküler septal defektin enine görünümü. (B) Atriyal septal defektin enine görünümü. (C) Patent ductus arteriosus. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hematoksilin ve eozin lekesi e15.5 kalpleri. (A) Normal şartlar altında gelişen lekeli bir kalp. Ölçek çubuğu = 750 μm. (B) Deneysel koşullar altında gelişen lekeli bir kalp. Ölçek çubuğu = 750 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Normal anne diyetleri altında gelişen kalpler ile esansiyel yağ asidi eksikliği anne diyetleri altında gelişen kalpler arasındaki kas sıkıştırmasının kantitatif analizi. (A) Hematoksilin ve eozin lekeli kalpler makroskopik (5x) görünümünde. Ölçek çubukları = 1.000 μm. (B) Hematoksilin ve eozin mikroskobik görünümde kalpler lekeli (40x). Ölçek çubukları = 75 μm. (C) Kas Sıkıştırma İndeksi ölçümlerinin ortaya çıkan verileri. Değerler bir T-testi (tedavi grubu başına n = 4) kullanılarak analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, embriyonik kalplerde kardiyak gelişimanalizinde yer alan teknikleri inceler. Bu yöntemin bazı sınırlamaları, pratik gerektirebilir hazırlık teknikleri için gerekli fiziksel el becerisi ve mikroskop görüntüleme ile beceri vardır. Kriyostatta elde edilen dilimler dağınıksa, hematoksilin ve eozin boyama net olmayacaktır veya mikroskopta çekilen görüntülerde kötü Aydınlatma varsa, ImageJ ile kullanılan yöntem çalışmaz. ImageJ yazılımının eşik özelliğinin bir sınırlaması, piksel değerine bağlı bir eşiğin bir ucunda bulunan pikselleri seçmesidir. Bu nedenle, eşiğin yanlış tarafında bulunan pikseller hesaplamaya yanlış dahil edilir veya dışlanır. Sonuç olarak, bir çalışmada kullanılmak üzere protokollerin benimsenmesi için sorun giderme gerekli olacaktır.
Kalp çıkarma nın çok zor olması durumunda, adım 2.8'e atlamayı düşünün. Ayrıca, göğüs boşluğundan sadece kalp ve akciğerler daha fazla çıkarmadan düşünün. Hedef daha sonra daha büyük ve işlemek daha kolay hale gelir ve kalp ve ince forseps arasında doğrudan temas en aza indirilir. Kriyostat kesitler, deneysel numuneler her zaman doğrudan kontrol örnekleri ile karşılaştırılacaktır. Bu, hata tüm örneklerde tutarlı olduğu sürece kullanıcı hatası için bazı oda sağlar. Kullanıcı hatasını en aza indirmek ve yanlış sonuçları önlemek için, her iki tedavi grubundan da karşılaştırılabilir bölümler elde edildiklerinden emin olun. Örneğin, birden fazla kişi bölüm üretiyorsa, tek bir kişinin yalnızca bir alt grup değil, kontroller ve tüm tedavi grupları için eşit sayıda bölüm ürettiğinden emin olun. Son olarak, ImageJ'de görüntüleri eşiğibelirlerken, eşik aracı, doku ve olmayan pikselleri temsil eden pikselleri seçerken maksimum özgürlüğe izin vermek için kullanılır. Gerekirse, dokunun piksel değerinden arka planın piksel değerini daha da yoğunlaştırmak için görüntülerin karşıtlığını ayarlayın. Sorun giderme seçenekleri olmasına rağmen, teknikler hala yüksek derecede beceri gerektirir. Ancak, bu protokolün gerçekleştirilmesi, diğer kardiyak gelişimsel araştırma çalışmalarında genellikle ölçülmeyen verilere erişim sağlar. Bu nedenle, bu protokolün özelliklerinden yararlanarak bilimsel bir araştırmaya önemli bir katkı sağlayabilir.
Kardiyoloji araştırmalarında deneysel tedavilerin etkilerinin belirlenmesi genellikle morfoloji değerlendirmesi ile araştırılmaktadır. Bu özellikle gelişim biyolojisinde plasentanın gelişmekte olan kalplerin fizyolojik özelliklerinin ölçülmesini zorlaştırdığı durumdur. Bu nedenle, kalbin işlevine ışık veren morfolojik analiz, gelişimbiyolojisi araştırmalarının yörüngesini önemli ölçüde değiştirir. Çoğu kağıt kalbin gücünü belirlemek için kalp kasının kalınlığını analiz rağmen, kas sıkıştırma doğrudan ölçüm gelişmekte olan memeli kalp fizyolojisi içine daha fazla fikir sağlayabilir25,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bildirecek bir açıklamaları yok.
Acknowledgments
Aguirre Lab Ulusal Kalp tarafından desteklenir, Akciğer, ve Kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri ödül numarası K01HL135464 altında ve Amerikan Kalp Derneği tarafından ödül numarası 19IPLOI34660342 altında.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D.
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al.
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E.
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).
- Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).
- Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).
- Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J.
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
