Summary
هنا هو بروتوكول لاكتشاف جينات السائق المفرطة في التعبير عن الحفاظ على الخلايا الجذعية السرطان المنشأة المستمدة من خلايا HT29 القولون والمستقيم. تم تنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للتحقيق وفحص شبكات التعبير الجيني لتوضيح آلية محتملة تشارك في بقاء الخلايا السرطانية المستهدفة.
Abstract
تلعب الخلايا الجذعية السرطانية دورًا حيويًا ضد العلاجات السريرية، مما يساهم في انتكاس الورم. هناك العديد من الأونكوجينات المشاركة في ورمريجنيسيس وبدء خصائص الجذعية السرطان. وبما أن التعبير الجيني في تكوين أورام الخلايا القولونية المشتقة من سرطان القولون والمستقيم غير واضح، فإن اكتشاف الآليات التي تعمل على جين واحد في كل مرة يستغرق وقتاً. توضح هذه الدراسة طريقة لاكتشاف جينات السائق المشاركة في بقاء الخلايا الجذعية الشبيهة بسرطان القولون والمستقيم في المختبر. تم اختيار الخلايا السرطانية HT29 القولون والمستقيم التي تعبر عن LGR5 عندما مثقف كما spheroids ومرافقة زيادة علامات الجذعية CD133 واستخدامها في هذه الدراسة. يتم استخدام البروتوكول المقدم لتنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للكشف بسرعة عن جينات السائق المفرط في تشكيل HT29 مستقيم مشتقة من الأورام الجذعية مثل. ويمكن للمنهجية أن تفحص تكتشف بسرعة جينات السائق المحتمل في نماذج أمراض أخرى.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي للوفاة مع ارتفاع معدل انتشار ووفيات في جميع أنحاء العالم1,2. بسبب الطفرات الجينية والتضخيم، تنمو الخلايا السرطانية دون السيطرة التكاثرية، مما يساهم في بقاء الخلايا3، المضادة لتخثر الدم4، والسرطان stemness5،6،7. داخل نسيج الورم، يسمح عدم تجانس الورم للخلايا السرطانية بالتكيف والبقاء على قيد الحياة أثناء العلاجات العلاجية8. الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs), مع معدل أعلى من التجديد الذاتي و تعدد القدرات من أنواع السرطان التفاضلية, هي المسؤولة بشكل رئيسي عن تكرار الورم9,,10 و CRC11النقيلي . CSCs الحاضر أكثر مقاومة للأدوية12,13,,14 و خصائص مضادة لتخثر الدم15,16, وبالتالي نجاة الأورام العلاج الكيميائي.
هنا، من أجل التحقيق في الآلية المحتملة ل stemness في الخلايا الجذعية CRC مختارة، تم تنفيذ RNAseq لفحص الجينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي في spheroids الورم. الخلايا السرطانية يمكن أن تشكل spheroids (وتسمى أيضا أورامسفيرس) عندما تنمو في ظروف الالتزام المنخفضة وحفزت عوامل النمو المضافة إلى المتوسطة مثقف, بما في ذلك EGF, bFGF, HGF, وIL6. ولذلك، اخترنا CRC HT29 الخلايا السرطانية التي تقاوم العلاج الكيميائي مع زيادة في STAT3 الفوسفورية عندما تعامل مع oxaliplatin وirinotecon17. بالإضافة إلى ذلك، أعرب HT29 علامات الصلابة أعلى عندما مثقف في ظروف الثقافة الموصوفة. أعرب نموذج CSC المستمدة من HT29 كميات أعلى من تكرار الغنية بالليسين التي تحتوي على مستقبلات G-protein-coupled 5 (LGR5)18, علامة محددة من الخلايا الجذعية CRC19,20. وعلاوة على ذلك، CD133، تعتبر علامة حيوية عامة للخلايا الجذعية السرطانية، وأعرب أيضا عن ذلك بشدة في خط الخلية HT2921. الغرض من هذا البروتوكول هو اكتشاف مجموعات من جينات السائق في الأورام السرطانية المنشأة الشبيهة بـ stem استناداً إلى مجموعات البيانات المعلوماتية الحيوية بدلاً من التحقيق في أونكوجينيس الفردية22. وهو يحقق في الآليات الجزيئية المحتملة من خلال تحليل RNAseq متبوعاً بتحليلات المعلوماتية الحيوية المتاحة.
الجيل التالي هو عالية الإنتاجية ، متاحة بسهولة ، وموثوق بها الحمض النووي طريقة التسلسل على أساس المساعدة الحسابية ، وتستخدم لفرز شامل الجينات السائق لتوجيه علاجات الورم23. وتستخدم أيضا التكنولوجيا للكشف عن التعبير الجيني من النسخ العكسي لعينة معزولة RNA24. ومع ذلك، عند الفحص مع RNAseq، قد لا يكون للجينات الأكثر أهمية لاستهداف مع العلاج أعلى الفرق التعبير بين العينات التجريبية والسيطرة. لذلك ، تم تطوير بعض المعلوماتية الحيوية لتصنيف وتحديد الجينات على أساس مجموعات البيانات الحالية مثل KEGG25، GO26،27، أو PANTHER28، بما في ذلك تحليل مسار الإبداع (IPA)29 و NetworkAnalyst30. هذا البروتوكول يظهر التكامل بين RNAseq و NetworkAnalyst لاكتشاف مجموعة من الجينات بسرعة في spheroids HT29 المشتقة من HT29 مقارنة مع خلايا HT29 الأبوية. كما يقترح تطبيق هذه الطريقة على نماذج الأمراض الأخرى لاكتشاف الاختلافات في الجينات الهامة.
بالمقارنة مع التحقيق في التعبير الجيني الفردي ، فإن تقنية عالية الإنتاجية توفر مزايا للعثور على جينات السائق المحتملة بسهولة للطب الدقيق للورم. مع مجموعات البيانات المفيدة مثل KEGG أو GO أو PANTHER ، يمكن تحديد جينات محددة استنادًا إلى نماذج المرض ، أو مسارات الإشارة ، أو وظائف محددة ، وهذا يسمح بالتركيز بسرعة على جينات محددة ومهمة ، مما يوفر الوقت وتكاليف البحث. ويستخدم تطبيق مماثل في الدراسات السابقة14،18،31. على وجه الخصوص، الورم هو أكثر تعقيدا لأن أنواع مختلفة من الأورام تعبر عن الجينات التمييزية ومسارات البقاء على قيد الحياة والانتشار. لذلك، يمكن لهذا البروتوكول التقاط الجينات التي تميز أنواع الأورام المختلفة في ظل ظروف مختلفة. هناك إمكانية لإيجاد استراتيجيات فعالة لمكافحة السرطان من خلال فهم آلية التعبير الجيني المحدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلية ثقافة وأورام تشكيل
- ثقافة HT29 الخلايا في طبق 10 سم تحتوي على متوسط النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ البنسلين-الستربتوميسين المضادات الحيوية (P/ S).
- تنمو الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والرطوبة 95٪ في ظل الظروف المتعفنة، حتى تصل إلى 80٪ التقاء.
- تريبسينيز HT29 الخلايا مع 1 مل من 0.25٪ التربسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية وبالتالي تحييد التربسين بإضافة 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
- عد خلايا HT29 باستخدام مقياس الهيموسيت.
- إضافة 2000 خلية / جيدا إلى انخفاض المرفقة 6 لوحات جيدا مع 2 مل من DMEM خالية من المصل مع 1٪ P / S وتكملها مع 0.2٪ B27، 20 نانوغرام/مل من عامل نمو البشرة (EGF)، 20 نانوغرام/مل من عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF)، 20 نانوغرام/مل من معامل النمو الكبدي (HGF)، و 20 نانوغرام/مل من interleukin 6 (IL6).
- تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 95٪ الرطوبة تحت ظروف معقمة.
- إضافة 0.5 مل من السرطان الخلايا الجذعية المتوسطة كل 2 أيام حتى قياس الأورام > 100 ميكرومتر في القطر لمدة 7 أيام على الأقل.
- مراقبة وقياس قطر أورام غلاف الدماغ باستخدام مجهر مقلوب مع نظام التصوير الخلوي الرقمي.
- عندما تصل إلى > 100 ميكرومتر في القطر، التربسينيزي في أورام مع 0.25٪ التربسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية وتحييد التربسين بإضافة 2x حجم متوسط النمو. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت.
- جهاز طرد مركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة وإزالة فائقة.
- احتضان 5 × 104 خلايا مع 2 ميكرولتر من المضادة لLGR5- PE و 2 ميكرولتر من المضادة لـ CD133-PE في 100 ميكرولتر من DMEM بشكل فردي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تهتز عند 200 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: CD133 هو علامة بيولوجية الخلايا الجذعية السرطانية العامة التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في خلايا HT29. - إضافة 900 μL من برنامج تلفزيوني وتحليل التعبير LGR5 و CD133 باستخدام تدفق cytometry. يشير التغير في الفلورس في قناة FL2-H إلى التعبير الجيني.
2. RNA العزل
ملاحظة: استخدم مجموعة أدوات تجارية (انظر جدول المواد)مع عمود سريع لعزلة RNA باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- إضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني للخلايا المقطوعة (2 × 105 الخلايا) وإعادة الاعتماد عليها مع الأنابيب.
- إضافة 200 ميكرولتر من العازلة التحلل التي تحتوي على 2 ميكرولتر من بيتا-mercaptoethanol (β-ME). دوامة بسرعة واسمحوا الوقوف لمدة 5 دقائق.
- الطرد المركزي الحل في 16،000 س ز لمدة 10 دقيقة. جمع عظمى ومزيج مع 200 μL من 70٪ الإيثانول.
- استخدم العمود المرفق لإزالة المذيب عن طريق الطرد المركزي عند 14000 x غم لمدة دقيقة.
- غسل باستخدام محلول الغسيل 1 و 2 لإزالة تماما غير RNAs عن طريق الطرد المركزي في 14،000 × ز لمدة 1 دقيقة.
- مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 14000 س ز لمدة 2 دقيقة لإزالة الإيثانول المتبقية.
- إضافة 50 ميكرولتر من الماء المقطر، والطرد المركزي في 14،000 س ز لمدة 1 دقيقة، وجمع الحل.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام OD260 مع مقياس الطيف.
تركيز الحمض النووي الريبي (μg/mL) = (OD260)x (40 ميكروغرام RNA/mL) و OD260/OD280 > 2. يجب أن تحتوي عينات الحمض النووي الريبي على رقم نزاهة RNA (RIN) > 7.
3. RNAseq التنميط وتحليل المعلوماتية الحيوية
ملاحظة: تم إجراء تحليل RNAseq تجاريًا (انظر جدول المواد) للتحقيق في الجينات التفاضلية في أورام HT29 المشتقة مقارنةً بالخلايا HT29 الأبوية.
- استخدام الخدمات التجارية للخطوات RNAseq، بما في ذلك بناء المكتبة، ومراقبة جودة المكتبة، وتسلسل الحمض النووي.
- يجب أن يحتوي تقرير البيانات على معلومات هامة، بما في ذلك عدد القراءة وتغيير log2 fold وقيمة p. حدد الجينات التفاضلية وفقا للمعلمات التالية: الجينات مع > 1 log2 أضعاف التغيير مع عدد القراءة > 100 في مجموعة الأورام HT29، والجينات < -1 log2 أضعاف التغيير مع عدد القراءة > 100 في المجموعة الأبوية HT29. في هذه الحالة، تعتبر قيمة p < 0.05 مقبولة واستخدمت البيانات(الجدول 1).
ملاحظة: هنا، تم استخدام عدد الجينات >100 كعتبة لمواصلة دراسة جين معين والتحقق من صحة التعبير عنه. - استخدام برنامج التحليل الإحصائي (انظر جدول المواد)،لإظهار خريطة الحرارة وتحديد الجينات المفرطة > 1 والجينات المتراجعة < 1 في log2 أضعاف التغيير.
- استخدام R البرمجيات لرسم مؤامرة بركان مع x: log2 أضعاف التغيير; ص: -log10 (قيمة ف) لإظهار الجينات التفاضلية.
- تثبيت مكتبة R
install.packages(مكتبة(معايرة)) - قراءة البيانات في RStudio مع البرنامج التالي:
res <-read.csv("/المستخدمين/xxx.csv"، رأس = T)
رئيس (1)
مع (res، plot(log2FoldChange، -log10 (pvalue)، pch=19، main="HT29CSC مقابل HT29"، xlim=c (-6،6)، col="#C0C0C0"))
مع(مجموعة فرعية(res، pvalue
مع(مجموعة فرعية(res، pvalue
abline(h = 1.3، lty = 2)
abline(v = 1، lty =2)
abline(v=(-1)، lty =2) - تنفيذ المدى للحصول على مؤامرة بركان.
- تثبيت مكتبة R
4. اختيار جينات السائق
- حدد إدخال الجينات المفردة في NetworkAnalyst.
- نسخ ولصق الجينات المحددة overexed من الجدول 1 مع "الإنسان" المحدد ككائن حي و معرّف نوع رمز الجين الرسمي.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم Ensembl Gene ID للنسخ واللصق. - أدخل البيانات بالنقر فوق تحميل ومتابعة لتحليلها باستخدام التفاعل البروتيني البروتيني (PPI) بعد PPI الجينية.
- استخدام قاعدة بيانات تفاعل STRING مع قطع درجة الثقة من 900 لإظهار الجينات البذور عبر ربط الجينات التي تم تحميلها. تم اختيار جينات البذور المرتبطة بجينات أكثر فردية كجينات للسائق التي قد تشارك في الحفاظ على تكوين أورام مشتقة من HT29.
ملاحظة: هناك ثلاث مجموعات بيانات interactome للاستخدام: IMEx STRING و Rolland. يحتوي STRING على أدلة تجريبية ثقة أعلى. مع انخفاض أرقام الجينات التي تم تحميلها، يمكن اختيار IMEx للتنبؤ والتقاط جينات السائق في شبكات interactome. - حدد متابعة في نظرة عامة على التعيين.
- حدد الأبيض في الخلفية وافرض الأطلس في مقبض التخطيط.
- حدد PANTHER BP لتحليل مجموعة جينات رفع التنظيم.
ملاحظة: هذا يدل على أن HSPA5 كان مسؤولا عن مضادة لتخثر الدم في HT29-اشتقاق الأورام في هذه الدراسة (الشكل 3A). لتضييق المجال الوظيفي المحدد، يمكن استخدام تصنيف KEGG أو GO أو PANTHER بدلاً من ذلك لتحديد جينات السائق المحددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإنشاء نموذج للتحقيق في آلية في الخلايا الجذعية السرطانية، استخدمت خلايا HT29 القولون والمستقيم لثقافة الأورام السرطانية مثل الجذعية في المختبر في لوحة منخفضة المرفق تحتوي على B27، EGF، bFGF، HGF، وIL6. تشكلت أورام الفيرات > 100 ميكرومتر في القطر في 7 أيام (الشكل 1A). تم تبسينيف الفرُق لخلايا واحدة وتحليلها باستخدام تدفق الخلايا للكشف عن التعبير LGR5 و CD133. LGR5 زيادة في أورام HT29-يقودها من 1.1% إلى 11.4% وتم الكشف عن الخلايا باستخدام عملية استئصال الخلايا تدفق(الشكل 1B). علامة أخرى الجذعية، CD133، كما زادت من 61.8٪ إلى 81.1٪ في الخلايا HT29 المستزرعة المشتقة من الأورام مقارنة بالخلايا HT29 الأبوية (الشكل 1C). ثم، كانت أوراموسفيرس جاهزة للتحقيق RNAseq.
تم استخدام RNAseq للتحقيق في ملف تعريف التعبير الجيني في أورام HT29 المشتقة مقارنة بالخلايا HT29 الأبوية. وكان معدل الخطأ في قراءة النيوكليوتيدات 0.03٪ لكلا العينتين. وبلغ معدل رسم الخرائط الجينية الإجمالي 87.87% لـ HT29 و87.25% لـ HT29 من الخلايا السرطانية المشتقة. كانت شظايا لكل كيلوباست من النص لكل مليون (FPKM) ، وتطبيع التهم المخبرية للإشارة إلى التعبير (mRNA) النص ، الفاصل الزمني بين 0 و 1 75.87 ٪ لخلايا HT29 ، و 77.16 ٪ لـ HT29 - اشتقاق الأورام. وكانت النتائج مناسبة لتسلسلها. بعد قراءة تسلسل، تم اختيار الجينات مع تغيير log2 أضعاف > 1 في رفع الرقي و <-1 في downregulation مع قيمة p < 0.05 التي تظهرها خريطة الحرارة (الشكل 2A،الجدول 1،الجدول 2). كان هناك 79 الجينات المُرقَمَة و33 جينات مُنَتَهَلةً تمّ اختيارها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مؤامرة بركان باستخدام log2 أضعاف تغيير وقيمة ف (-log10 ف قيمة) تم استخدامها لتمييز الجينات الهامة بين الأورام HT29 المستمدة والخلايا HT29 الأبوية (الشكل 2B). استنادا إلى الاختيار الأولي، تم تحديد ثلاثة من الجينات التي يحتمل أن تكون أعلى تنظيما، بما في ذلك ACSS2، HMGCS1، وPCSK9، في HT29-اشتقاق الأورام (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، من أجل تحديد جينات السائق ليس فقط وفقا لتغيير log2 أضعاف، تم استخدام NetworkAnalyst. تم تحليل الجينات المُرقمة مع تغيير log2 Fold > 1 بقيمة P < 0.05 وأسفرت عن 10 جينات بذرة تربط الشبكات الجينية ، بما في ذلك HSPA5، HSP90AA1، BRCA1، SFN، E2F1، CYCS، CDC6، ALYREF، SQSTM1، و TOMM40 (الشكل 3A). لتحديد وظيفة وأهمية الجينات البذور، يمكن استخدام واجهة التصنيف لأداء PANTHER BP لتحديد الجينات المشاركة في مضادة لتخثر الدم في HT29- الأورام المشتقة. وأشارت النتائج إلى أن HSPA5 و SQSTM1 كانت مرتبطة مع التنظيم السلبي لتخثر الدم (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، تم بالتالي التحقق من صحة الجينات العشرة المختارة؛ زيادة التعبير في أورام HT29 المشتقة كما أكد باستخدام qPCR (الشكل 3B).
الشكل 1: إنشاء أورام تشبه الجذعية السرطانية في المختبر. ( أ) HT29 تم استخدامه لتشكيل أورام، و (B) تم الكشف عن LGR5 في أورام مشتقة HT29 (شريط مقياس = 100 ميكرومتر). (C) CD133 واستخدمت كعلامة أخرى لتحديد الأحرف stemness في أورامسفيرس المنشأة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تم استخدام خريطة الحرارة ومؤامرة بركان لتحديد الجينات التفاضلية في أورام HT29 المستمدة. Log2 أضعاف تغيير > 1 و <-1 مع عدد القراءة > 100، قيمة ف < 0.05 واستخدمت لاستبعاد الجينات غيرificين والتأكد من أن البيانات كانت دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: NetworkAnalyst تم استخدامها لتحديد الجينات السائق في HT29- اشتقاق الأورام. (أ)تم اختيار الجينات التي تم تنظيمها وتحليلها بناءً على ذلك، ووفرت واجهة التصنيف، PANTHER BP، الوظائف المحتملة لجينات السائق التفاضلي. (B) ثم، تم استخدام qPCR للتحقق من صحة الجينات 10 حتى تنظيمها في HT29-اشتقاق الأورام مقارنة مع خلايا HT29 الوالدين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: الجينات المُرقَبة في HT29-serived أورام مقارنة بالخلايا HT29 الأبوية التي حللتها RNAseq. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول 2: الجينات الهائِنة في HT29-serived أورام مقارنة بالخلايا HT29 الأبوية التي حللتها RNAseq. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، تم استخدام أورام مثل السرطان مثل السرطان المستزرع كنموذج في تحليل بيانات RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة. لنموذج المرض، تم استخدام أورام مشتقة من HT29. لأن الأورام لديها مقاومة للأدوية ضد علاجات الورم، يمكن استخدام النموذج المنشأة للتحقيق في الآليات التفصيلية للمقاومة من خلال التحقيق في الاختلافات في التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، فإن تكنولوجيا الجينوم التي تستخدم RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة توفر فهماً سريعاً لنموذج الدراسة بحيث يمكن التحقق من صحة الجينات المحتملة مع الثقة. أيضا، يمكن تحديد نوع الجينات المشاركة في تشكيل أورامpheres.
RNA الجودة أمر بالغ الأهمية لتحليل RNAseq32. تأكد من أن العينة تحتوي على RIN >7، لأنها تزيد من اليقين بين القراءة الخرائطية، والجينات الخرائطية، وFPKM. عند تحليل بيانات RNAseq ، كان IPA29 و NetworkAnalyst30 متاحين لتحديد الجينات المحتملة ومسارات الإشارة. ومع ذلك، من الضروري استبعاد الجينات غير الضرورية وفقًا للالمعلمات التالية: الجينات التي تظهر تغييرًا في 1 log2 مع عدد القراءة > 100 في المجموعة التجريبية، والجينات < -1 log2 fold change مع عدد القراءة > 100 في مجموعة التحكم. يعد عدد القراءة الأعلى أسهل للتحقق من الصحة اللاحق باستخدام qPCR أو البقع الغربية.
واستنادا إلى فهم الوظائف والعمليات البيولوجية، هناك العديد من أدوات المعلوماتية البيولوجية التي تسمح بالتحري السريع عن الآليات المحتملة للأمراض التي تهمنا. جنبا إلى جنب مع أداة عالية الإنتاجية لفحص التعبير الجيني مثل RNAseq، يمكن اقتراح الآليات المحتملة التي تنظم تطور الأمراض المدروسة والتحقيق فيها. هنا، كشفت طريقة التحقيق في تشكيل أورام CRC الشبيهة الجذعية المستمدة من HT29 أن SQSTM1 وHSPA5 كانت الجينات المستهدفة التي تم تنظيمها والمشاركة في مكافحة المبرمج في أورام. لذلك، يمكن تصميم المزيد من التجارب للتحقيق في الآلية التفصيلية لهذه الجينات، مما يؤدي إلى مزيد من الثقة والفعالية عند إجراء الدراسات البحثية.
هنا، تم تحليل الجينات التي تم تنظيمها في أورام الفيرات فقط لأن رفع التنظيم كان يعتبر مستحثاً بإضافة عوامل النمو. خلاف ذلك، إذا استخدمت التجربة ضرب الجينات في الخلايا السرطانية، فإن الجينات الهانائية سيعتبر أهدافا يمكن اختيارها للتحقيق باستخدام المعلوماتية الحيوية. وعلى الرغم من أن المنهجية سريعة ويمكن الاعتماد عليها، لا تزال هناك حاجة إلى التحقق اللاحق من الصحة عن طريق qPCR واللطخات الغربية. ويقترح أيضا أن المزيد من خطوط الخلايا التي يمكن استخدامها للتحقق من صحة التعبير الجيني، وخاصة بالنسبة للعينات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يملك أصحاب البلاغ إقرارات مالية ذات صلة.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون المختبر الأساسي لمختبرات البيولوجيا الإشعاعية التابع لمعهد البحوث الإشعاعية، مستشفى تشانغ جونج التذكاري، على الدعم التقني. وقد دعمت هذه الدراسة من المنح من مستشفى تشانغ جونج التذكاري (CMRPD1J0321), مستشفى تشنغ هسين العام (هرمون النمو 106-06), ومستشفى ماكاي التذكاري (MMH-CT-10605 وMMH-106-61). ولم يكن لهيئات التمويل أي تأثير في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها وتفسيرها أو في كتابة المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
