Summary
여기에 제시된 대장 HT29 세포로부터 유래된 확립된 암 줄기 유사 세포를 유지하는 과발현 드라이버 유전자를 발견하는 프로토콜이다. 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq는 표적 종양 세포의 생존에 관여하는 잠재적인 기계장치를 해명하기 위한 유전자 발현 네트워크를 조사하고 스크린하기 위하여 수행되었다.
Abstract
암 줄기 세포는 종양 재발에 기여하는 임상 치료에 대하여 중요한 역할을 합니다. 종양 발생 및 암 줄기 특성의 개시에 관여하는 많은 종양 유전자가 있습니다. 대장암 유래 종양구의 형성에 있는 유전자 발현은 불분명하기 때문에, 한 번에 한 유전자에 작동하는 기계장치를 발견하는 데 시간이 걸립니다. 이 연구는 체외에서 대장암 줄기와 같은 세포의 생존에 관여하는 운전자 유전자를 신속하게 발견하는 방법을 보여줍니다. 구체형으로 배양되고 CD133 줄기마커를 동반하여 LGR5를 발현하는 대장 HT29 암세포가 이 연구에서 선택되고 사용되었다. 제시된 프로토콜은 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq를 능력을 발휘하기 위하여 이용가능한 HT29 유래 줄기 같이 종양스피어의 대형에 있는 과발현된 드라이버 유전자를 빨리 밝히기 위하여 이용됩니다. 방법론은 다른 질병 모델에서 잠재적인 운전자 유전자를 신속하게 선별하고 발견할 수 있습니다.
Introduction
대장암(CRC)은 전 세계적으로 높은 유병률과 사망률을 가진 주요 사망 원인1,,2이다. 유전자 돌연변이 및 증폭으로 인해 암세포는 세포 생존 3, 항 세포멸4,4암 줄기5,,6,67에기여하는 증식 제어 없이 성장한다. 종양 조직 내에서 종양 이질성은 종양 세포가 치료 치료 중에 적응하고 생존할 수 있게 합니다8. 암 줄기세포(CSC)는 차동암 유형보다 자가재생 및 자발성율이 높은 것으로, 종양 재발9,10 및전이성 CRC11에주로 책임이 있다. CSC는 더 많은 약물내성(12,,13,,14 및 항세포증 속성15,16)을16제시하여 종양 화학요법을 생존시킨다.
여기서, 선택된 CRC 줄기 세포에서 줄기에 대한 잠재적기심을 조사하기 위해, RNAAeq는 종양 스페로이드에서 분화유전자를 선별하기 위해 수행되었다. 암세포는 낮은 준수 조건에서 성장하고 EGF, bFGF, HGF 및 IL6를 포함하여 배양 된 매체에 추가 된 성장 인자에 의해 자극 될 때 스페로이드 (또한 종양스피어라고도 함)를 형성 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 oxaliplatin 및 irinotecon17로취급될 때 인지질 STAT3의 증가와 화학요법저항하는 CRC HT29 종양 세포를 선택했습니다. 또한, HT29는 기재된 배양 조건에서 배양할 때 더 높은 줄기 마커를 표현하였다. HT29 유래 CSC 모델은 더 많은 양의 류신-리치 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 5(LGR5)18,CRC 줄기 세포의 특이적마커(19,,20)를발현하였다. 더욱이, CD133은암줄기세포를 위한 일반적인 바이오마커로 여겨지며, 또한 HT29세포주(21)에서도높게 발현된다. 이 프로토콜의 목적은 생물정보학 데이터 집합에 기초한 확립된 암 줄기 같이 종양권에 있는 드라이버 유전자의 단을 개별 종양발생(22)을조사하는 것과 는 반대로 발견하는 것입니다. 그것은 가능한 생물 정보학 분석 뒤에 RNAseq 분석을 통해 잠재적인 분자 기계장치를 조사합니다.
차세대 시퀀싱은 종양 치료 유도를 위한 드라이버 유전자를 포괄적으로 검사하는 데 사용되는 계산 적 도움을 기반으로 높은 처리량, 용이성 및 신뢰할 수있는 DNA 시퀀싱방법입니다(23). 이 기술은 또한 고립된 RNA샘플(24)의역전사로부터 유전자 발현을 검출하는 데 사용된다. 그러나, RNAseq로 검열할 때, 치료로 표적으로 하는 가장 중요한 유전자는 실험과 대조견본 사이 가장 높은 발현 차액이 없을 지도 모릅니다. 따라서, 일부 생물정보학은 KEGG 25, GO26,27,또는,표범(28)과같은 현재 데이터 집합을 기반으로 유전자를 분류하고 식별하기 위해 개발되었으며, 인네티웨이 분석(IPA)(IPA) (29) 및 NetworkAnalyst30을포함한다.25 이 프로토콜은 RNAseq및 NetworkAnalyst의 통합을 보여주며 부모 HT29 세포에 비해 선택된 HT29 유래 스페로이드에서 유전자 그룹을 신속하게 발견합니다. 다른 질병 모델에 이 방법의 응용 은 또한 중요한 유전자에 있는 다름을 발견하기 위한 건의됩니다.
개별 유전자 발현의 조사에 비해, 고처리량 기술은 종양 정밀 의학을 위한 잠재적인 드라이버 유전자를 쉽게 찾아내고 있는 이점을 제공합니다. KEGG, GO 또는 PantHER와 같은 유용한 데이터 세트를 사용하면 질병 모델, 신호 경로 또는 특정 기능에 따라 특정 유전자를 식별할 수 있으며, 이를 통해 구체적이고 중요한 유전자에 빠르게 초점을 맞추고 시간과 연구 비용을 절약할 수 있습니다. 이전 연구에서도 유사한 적용이 사용된다14,,18,,31. 특히, 종양의 다른 모형은 생존과 증식을 위한 구별되는 유전자 그리고 통로를 표현하기 때문에 종양은 더 복잡합니다. 따라서, 이 프로토콜은 상이한 상황에서 다른 종양 유형을 구별하는 유전자를 선택할 수 있다. 특정 유전자 발현의 메커니즘을 이해하여 암에 대한 효과적인 전략을 찾을 수있는 잠재력이 있습니다.
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Protocol
1. 세포 배양 및 종양권 형성
- 배양 HT29 세포는 덜벡코의 변형된 독수리 배지(DMEM)를 함유한 10cm 접시에 10%의 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-연쇄상구균 항생제(P/S)를 함유하고 있다.
- 37°C에서 인큐베이터에서 세포를 5% CO2 및 95% 습도로 성장하여 80%의 합류에 도달할 때까지 무균 조건에서 습도를 증가시면 됩니다.
- 37°C에서 5분 동안 0.25%의 트립신1mL로 HT29 세포를 트립시화하고, 결과적으로 10% FBS 및 1% P/S로 DMEM 2mL을 추가하여 트립신을 중화시한다.
- 혈전계를 사용하여 HT29 세포를 계산합니다.
- 2,000 개의 셀 /웰을 1 % P / S로 혈청이없는 DMEM 2 mL로 6 웰 플레이트에 추가하고 0.2 % B27로 보충하고, 표피 성장 인자 (EGF),20 ng/mL의 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 간세포 성장 인자 (HGF)의 20 ng/mL, 인터류키인 6 (IL6)의 20 ng/mL.
- 무균 조건하에서 5% CO2 및 95% 습도로 37°C에서 세포를 성장시하십시오.
- 종양권이 측정할 때까지 2일마다 0.5mL의 암 줄기세포 배지를 넣고 직경이 7일 이상 측정합니다.
- 디지털 세포 이미징 시스템을 사용하여 반전된 현미경을 사용하여 종양권 직경을 관찰하고 측정합니다.
- 종양권이 직경이 >100 μm에 도달하면 종양구를 0.25% 트립신으로 37°C에서 5분 동안 트립신을 시도하고 성장 배지의 2배 부피를 추가하여 트립신을 중화시한다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 1,200 rpm에서 10 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상체를 제거합니다.
- 5 x 104 세포를 반 LGR5-PE 2 μL, 실온에서 30 분 동안 DMEM의 100 μL에서 2 μL의 안티 CD133-PE2를 200 rpm에서 흔들어 배양합니다.
참고: CD133은 HT29 세포에서 높게 발현되는 일반적인 암 줄기세포 바이오마커이다. - PBS의 900 μL을 추가하고 유동 세포측정을 사용하여 LGR5 및 CD133 발현을 분석합니다. FL2-H 채널에서 형광의 변화는 유전자 발현을 나타낸다.
2. RNA 절연
참고: 제조업체의지침에 따라 RNA 격리를 위한 빠른 컬럼이 있는 상용 키트(재료 표 참조)를 사용합니다.
- 수확된 셀(2 x 105 셀)에 PBS 50 μL을 추가하고 파이펫팅으로 다시 중단합니다.
- 베타-메르카토에탄올(β-ME)의 2μL을 함유한 용해 버퍼 200 μL을 추가합니다. 소용돌이가 빠르게 5 분 동안 서보자.
- 10분 동안 16,000 x g의 원심분리제. 상체를 수집하고 70% 에탄올의 200 μL과 섞는다.
- 연결된 컬럼을 사용하여 1분 동안 14,000 x g에서 원심분리로 용매를 제거합니다.
- 워시 용액 1과 2를 사용하여 세척하여 1 분 동안 14,000 x g에서 원심 분리로 비 RNA를 완전히 제거하십시오.
- 잔류 에탄올을 제거하기 위해 2 분 동안 14,000 x g에서 다시 원심 분리기.
- 증류수 50μL, 원심분리기 14,000 x g를 1분 간 추가하고 용액을 수집합니다.
- 분광계로 OD260을 사용하여 RNA 농도를 측정합니다.
RNA 농도(μg/mL) = (OD260)x(40 μg RNA/mL) 및 OD260/OD280 > 2. RNA 샘플에는 RNA 무결성 번호(RIN) > 7이 있어야 합니다.
3. RNAseq 프로파일링 및 생물 정보학 분석
참고: RNAseq 분석은 부모 HT29 세포에 비해 HT29 유래 종양스피어에서 차동 유전자를 조사하기 위해 상업적으로 수행되었다(재료의 표참조).
- 도서관 건설, 도서관 품질 관리 및 DNA 시퀀싱을 포함한 RNAseq 단계에 상용 서비스를 사용합니다.
- 데이터 보고서에는 읽기 수, log2 접기 변경 및 p 값을 비롯한 중요한 정보가 포함되어야 합니다. HT29 종양권 그룹에서 읽기 카운트 >100을 가진 유전자및 HT29 부모 그룹에서 판독 수 >-100을 가진 유전자 > 1 log2 접기 변경: 다음 매개 변수에 따라 차동 유전자를 선택합니다. 이 경우 p 값 & 0.05는 허용 가능한 것으로 간주되고 데이터가 사용되었습니다(표1).
참고: 여기서, 유전자 수 >100은 특정 유전자의 연구를 계속하고 그것의 발현을 검증하기 위하여 임계값으로 이용되었습니다. - 통계 분석 소프트웨어(재료표참조)를 사용하여 히트맵을 표시하고 과발현 유전자를 식별하고, 과다 조절유전자를 식별하고, 1개의 로그2 접이식 변화를 확인한다.
- R 소프트웨어를 사용하여 화산 플롯을 x로 그립니다: log2 접기 변경; y: -log10(p 값)을 사용하여 차동 유전자를 표시합니다.
- R 라이브러리 설치
설치.패키지(라이브러리(보정)) - RStudio의 데이터를 다음과 같은 프로그램으로 읽어보십시오.
res &-read.csv ("/사용자/xxx.csv", 헤더=T)
헤드(res)
(res, 플롯 (log2FoldChange, -log10 (pvalue), pch = 19, 메인 = "HT29CSC 대 HT29", xlim=c (-6,6), 콜 = "#C0C0C0")))
와(하위 집합(리셋, pvalue<&.05 및 log2FoldChange>gt;1), 포인트(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red"))
와(하위 집합(리셋, pvalue<&.05 & log2FoldChange<&(-1)), 포인트(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="블루")))
(하위 집합(res, pvalue>.05), 포인트(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
아브라인(h=1.3, lty=2)
아블린(v=1, lty=2)
abline(v=(-1), lty=2) - 화산 플롯을 얻기 위해 실행을 실행합니다.
- R 라이브러리 설치
4. 드라이버 유전자 선택
- 네트워크 분석가에서 단일 유전자 입력을 선택합니다.
- 유기체 및 ID 형 공식 유전자 기호로 지정된 "인간"으로 표 1에서 선택된 과발현 유전자를 복사하고 붙여 넣습니다.
참고: 또는 복사 및 붙여넣기위해 Ensembl 진 ID를 사용합니다. - 업로드를 클릭하여 데이터를 삽입하고 유전자 PPI에 따른 단백질 단백질 상호작용(PPI)을 사용하여 분석합니다.
- 900의 신뢰점수 컷오프로 STRING 상호작용성 데이터베이스를 사용하여 업로드된 유전자를 교차 연결하는 종자 유전자를 표시한다. 더 개별적인 유전자와 연관된 종자 유전자는 HT29 유래 종양권의 형성을 유지하는 데 관여할 수 있는 드라이버 유전자로 선택되었다.
참고: 사용하기 위한 상호작용데이터 집합은 IMEx, STRING 및 Rolland의 세 가지가 있습니다. STRING에는 더 높은 신뢰도 실험 증거가 포함되어 있습니다. 업로드된 유전자 수가 낮을수록 IMEx를 선택하여 인터랙토메 네트워크에서 드라이버 유전자를 예측하고 선택할 수 있습니다. - 매핑 개요에서 진행을 선택합니다.
- 레이아웃 노브에서 배경에서 흰색을 선택하고 레이아웃 노브에서 힘 아틀라스를 선택합니다.
- 표범 BP를 선택하여 강화 조절 유전자 그룹을 분석합니다.
참고: 이것은 HSPA5가 이 연구 결과에서 HT29 유래 종양권에 있는 항 세포사멸에 책임 있었다는 것을 보여줍니다(그림 3A). 특정 기능 분야를 좁히기 위해, KEGG, GO 또는 표범 분류는 특정 동인 유전자를 선택하기 위해 대안적으로 사용될 수 있다.
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Representative Results
암 줄기세포에서 기전을 조사하기 위한 모델을 확립하기 위해, 대장 HT29 세포는 B27, EGF, bFGF, HGF 및 IL6를 포함하는 저부착 플레이트에서 체외에서 암 줄기와 같은 종양스피어를 배양하는 데 사용되었다. 종양스피어>100 μm직경은 7일(도1A)에형성되었다. 종양구는 단일 세포에 트립시화되고 LGR5 및 CD133 발현을 검출하기 위해 유동 세포측정을 사용하여 분석하였다. LGR5는 HT29 구동 종양스피어에서 1.1%에서 11.4%로 증가했으며 세포는 유동 세포측정(도1B)을사용하여 검출되었다. 또 다른 줄기 마커인 CD133도 부모 HT29세포(도 1C)에비해 배양된 HT29 유래 종양스피어에서 61.8%에서 81.1%로 증가하였다. 그런 다음 종양권은 RNAseq 조사를 위해 준비되었습니다.
RNAAseq는 부모 HT29 세포에 비해 HT29 유래 종양스피어에서 유전자 발현 프로파일을 조사하기 위해 사용되었다. 뉴클레오티드 판독오류율은 두 샘플 모두에 대해 0.03%였다. 총 유전자 매핑 비율은 HT29에 대한 87.87 %와 HT29 유래 종양 스피어의 87.25 %였다. 백만(FPKM)당 전사체당 단편은 성적증명서(mRNA) 발현을 나타내는 탐정 수를 정상화하고, 0과 1 사이의 간격은 HT29 세포의 경우 75.87%, HT29 유래 종양스피어의 경우 77.16%였다. 결과는 결과적으로 시퀀싱에 적합했다. 시퀀싱 후, log2 접이식 변경 및 gt;1을 가진 유전자가 상류 조절 및 &-1의 하향 조절에 있어서 p 값 & 0.05에 의해 도시된 히트맵(도2A,표 1, 표2)을선택하였다. 79개의 강화된 통제된 유전자 및 33의 다운규제 유전자가 선택되었습니다. 또한, log2 접기 변화와 p값(-log10 p 값)을 이용한 화산 플롯은 HT29 유래 종양스피어와 부모 HT29세포(도 2B)사이의중요한 유전자를 구별하기 위해 사용되었다. 예비 선택에 기초하여, HT29 유래 종양스피어(도2A)에서 ACSS2, HMGCS1및 PCSK9를포함한 3개의 잠재적으로 강화된 유전자가 확인되었다. 더욱이, 로그2 접이식 변화에 의해서만 이에 따라 드라이버 유전자를 식별하기 위해, NetworkAnalyst가 사용되었다. 로그2 폴드 체인지>1p값&0.05를 가진 강화된 유전자는 HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1및 TOMM40(3A)을 포함한 유전자 네트워크를 교차 연결하는 10개의 종자 유전자를 분석하였다.Figure 3A 종자 유전자의 기능 과 중요성을 확인하기 위해, 분류 인터페이스는 HT29 유래 종양 스피어에서 반 세포사멸에 관여하는 유전자를 결정하기 위해 PANTHER BP를 수행하는 데 사용될 수있다. 결과는 HSPA5와 SQSTM1이 apoptosis(그림 3A)의부정적인 조절과 연관되었다는 것을 표시했습니다. 더욱이, 선택된 10개의 유전자는 결과적으로 검증되었다; qPCR(도3B)을사용하여 확인된 바와 같이 HT29 유래 종양스피어에서 발현이 증가하였다.
그림 1: 체외에서 암 줄기와 같은 종양권의 확립. (A)HT29는 종양구체를 형성하는 데 사용되었고,(B)LGR5는 HT29 유래 종양스피어(Scale bar = 100 μm)에서 검출되었다. (C)CD133은 확립된 종양권에서 줄기 문자를 식별하는 또 다른 마커로 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 히트맵 및 화산 플롯은 HT29 유래 종양스피어에서 차동 유전자를 선택하는 데 사용되었다. Log2 접이식 변경 >1 및 &-1 읽기 수 >100, p 값 & 0.05는 중요하지 않은 유전자를 배제하고 데이터가 정확한지 확인하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: NetworkAnalyst는 HT29 유래 종양스피어에서 드라이버 유전자를 식별하는 데 사용되었습니다. (A)상과관계가 있는 유전자를 선택및 분석하여 결과적으로 분석하였으며, 분류 인터페이스인 PantHER BP는 차동유전자에 대한 잠재적 기능을 제공했다. (B)이어서, qPCR은 HT29 유래 종양스피어에서 10개의 유전자를 검증하기 위해 사용되었고, 이어서 HT29 세포에 비해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: RNAseq에 의해 분석된 부모 HT29 세포에 비해 HT29-세리식 종양권에 있는 강화된 유전자. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: RNAseq에 의해 분석된 부모 HT29 세포에 비해 HT29-세리식 종양권에 있는 다운규제 유전자. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는, 배양된 암 줄기 같이 종양스피어는 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq 데이터를 분석하는 모형으로 이용되었습니다. 질병 모델의 경우 HT29 유래 종양스피어가 사용되었습니다. 종양권은 종양 치료에 대한 약물 내성을 가지고 있기 때문에, 확립 된 모델은 유전자 발현의 차이를 조사하여 저항의 상세한 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq를 사용하여 게놈 기술은 잠재적으로 관련시킨 유전자가 더 높은 신뢰로 검증될 수 있도록 연구 모형의 급속한 이해를 제공합니다. 또한, 종양스피어의 형성에 관여하는 유전자의 종류를 확인할 수 있다.
RNA 품질은 RNA에 대한분석(32)에매우 중요하다. 매핑 읽기, 매핑 유전자 및 FPKM 사이의 확실성을 증가하기 때문에 샘플에 RIN >7이 있는지 확인하십시오. RNAeq 데이터를 분석할 때 IPA29 및 NetworkAnalyst30은 잠재적인 유전자 및 신호 경로를 식별할 수 있었습니다. 그러나, 다음 매개 변수에 따라 불필요한 유전자를 배제하는 것이 필수적이다: 실험군에서 읽기 수와 gt;100을 가진 >1 log2 접이식 변화를 보여주는 유전자, 및 유전자&-1 log2 접이식 판독 수 > 대조군에서 100. qPCR 또는 웨스턴 블롯을 사용하여 결과적으로 유효성 검사를 위해 읽기 수가 높을수록 더 쉽습니다.
생물학적 기능과 공정에 대한 이해를 바탕으로 관심 있는 질병의 잠재적 메커니즘에 대한 신속한 조사를 허용하는 많은 생물정보학 도구가 있습니다. RNAseq와 같은 유전자 발현을 선별하는 고처리량 도구와 결합하여 연구된 질병의 발달을 조절하는 잠재적 메커니즘을 제안하고 조사할 수 있습니다. 여기서HT29로부터 유래된 CRC 줄기형 종양스피어의 형성을 조사하는 방법은 SQSTM1과 HSPA5가 종양스피어내의 항세포증에 관여하고 있는 표적 유전자인 것으로 나타났다. 따라서, 더 많은 실험은 연구 결과를 실시할 때 더 많은 신뢰그리고 효험을 초래하는 이 유전자의 상세한 기계장치를 조사하기 위하여 디자인될 수 있습니다.
여기서, 종양권내의 상류조절유전자만이 성장인자의 첨가에 의해 유도되는 것으로 간주되었기 때문에 분석되었다. 그렇지 않으면, 실험이 종양 세포에서 유전자 녹다운을 사용하는 경우, 다운 규제 유전자는 생물 정보학을 사용하여 조사를 위해 선택할 수있는 대상으로 간주될 것이다. 방법론은 빠르고 신뢰할 수 있지만 qPCR 및 Western blots를 통해 후속 유효성 검사가 여전히 필요합니다. 그것은 또한 더 많은 세포주 유전자 발현 유효성 검사를 위해 사용 될 제안, 특히 임상 샘플에 대 한.
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Disclosures
저자는 관련 재무 공시가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 방사선 연구 연구소의 방사선 생물학 핵심 연구소, 장궁 기념 병원, 기술 지원을 감사드립니다. 이 연구는 장궁 기념 병원 (CMRPD1J0321), 청 신 종합 병원 (CHGH 106-06), 맥케이 메모리얼 병원 (MMH-CT-10605 및 MMH-106-61)의 보조금에 의해 지원되었다. 자금 조달 기관은 연구 및 데이터 수집, 분석 및 해석 또는 원고 작성에 영향을 미치지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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