Summary
Apresentado aqui é um protocolo para descobrir os genes condutores superexpressos mantendo as células-tronco de câncer estabelecidas derivadas de células HT29 colorretais. RNAseq com bioinformática disponível foi realizado para investigar e tela redes de expressão genética para elucidar um mecanismo potencial envolvido na sobrevivência de células tumorais direcionadas.
Abstract
As células-tronco cancerígenas desempenham um papel vital contra as terapias clínicas, contribuindo para a recaída do tumor. Há muitos oncogenes envolvidos na tumorigênese e no início das propriedades de câncer. Como a expressão genética na formação de tumores derivados do câncer colorretal não é clara, leva tempo para descobrir os mecanismos que trabalham em um gene de cada vez. Este estudo demonstra um método para descobrir rapidamente os genes condutores envolvidos na sobrevivência das células-tronco do câncer colorretal in vitro. Foram selecionadas e utilizadas neste estudo as células cancerígenas Colorretal HT29 que expressam o LGR5 quando cultivadas como esferoides e acompanham um aumento dos marcadores de caule CD133. O protocolo apresentado é usado para realizar o RNAseq com bioinformática disponível para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos na formação de tumores derivados de haste HT29 colorretais. A metodologia pode rapidamente rastrear e descobrir potenciais genes driver em outros modelos de doenças.
Introduction
O câncer colorretal (C CRC) é uma das principais causas de morte com alta prevalência e mortalidade em todo o mundo1,2. Devido a mutações genéticas e amplificações, as células cancerígenas crescem sem controle proliferativo, o que contribui para a sobrevivência celular3, anti-apoptose4e câncer5,,6,7. Dentro de um tecido tumoral, a heterogeneidade tumoral permite que as células tumorais se adaptem e sobrevivam durante os tratamentos terapêuticos8. As células-tronco cancerígenas (CSCs), com maior taxa de autoconexão e pluripotência do que os tipos diferenciais de câncer, são as principais responsáveis pela recidiva do tumor9,,10 e CRC metastática11. Os CSCs apresentam mais resistência a medicamentos12,,13,14 e propriedades anti-apoptose15,16, sobrevivendo assim às quimioterapias tumorais.
Aqui, a fim de investigar o mecanismo potencial de stemness nas células-tronco CRC selecionadas, rnAseq foi realizado para tela de genes expressos diferencialmente em esferoides tumorais. As células cancerígenas podem formar esferoides (também chamados de tumores) quando cultivadas em condições de baixa adesão e estimuladas por fatores de crescimento adicionados ao meio cultivado, incluindo EGF, bFGF, HGF e IL6. Por isso, selecionamos células tumorais CRC HT29 que resistem às quimioterapias com aumento do STAT3 fosforilado quando tratadas com oxaliplatina e irinotecon17. Além disso, o HT29 expressou marcadores de maior caule quando cultivado nas condições de cultura descritas. O modelo CSC derivado do HT29 expressou maiores quantidades de receptor g-proteína-acoplado à proteína G 5 (LGR5)18, um marcador específico das células-tronco CRC19,,20. Além disso, o CD133, considerado um biomarcador geral para células-tronco cancerosas, também é altamente expresso na linha21 celular HT29. O objetivo deste protocolo é descobrir grupos de genes condutores nos tumores semelhantes a câncer estabelecidos com base em conjuntos de dados bioinformáticas em vez de investigar oncogenes individuais22. Investiga potenciais mecanismos moleculares através da análise RNAseq seguida de análises bioinformática disponíveis.
O sequenciamento da próxima geração é um método de sequenciamento de DNA de alta produtividade, facilmente disponível e confiável baseado na ajuda computacional, usado para rastrear abrangentemente genes do driver para orientar as terapias tumorais23. A tecnologia também é usada para detectar expressão genética a partir da transcrição reversa de uma amostra isolada de RNA24. No entanto, ao fazer a triagem com RNAseq, os genes mais importantes para atingir a terapia podem não ter o maior diferencial de expressão entre amostras experimentais e de controle. Assim, algumas bioinformáticas foram desenvolvidas para classificar e identificar genes com base em conjuntos de dados atuais como KEGG25, GO26,27ou PANTHER28, incluindo Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 e NetworkAnalyst30. Este protocolo mostra a integração do RNAseq e do NetworkAnalyst para descobrir rapidamente um grupo de genes nos esferoides derivados de HT29 selecionados em comparação com as células HT29 parentais. A aplicação desse método a outros modelos de doenças também é sugerida para descobrir diferenças em genes importantes.
Em comparação com a investigação da expressão genética individual, uma técnica de alto rendimento fornece vantagens para encontrar genes potenciais driver facilmente para a medicina de precisão tumoral. Com conjuntos de dados úteis como KEGG, GO ou PANTHER, genes específicos podem ser identificados com base nos modelos de doença, caminhos de sinalização ou funções específicas, e isso permite focar rapidamente em genes específicos e importantes, economizando tempo e custos de pesquisa. Uma aplicação semelhante é usada em estudos anteriores14,,18,31. Particularmente, um tumor é mais complicado porque diferentes tipos de tumores expressam genes e caminhos distintos para sobrevivência e proliferação. Portanto, este protocolo pode captar genes que distinguem diferentes tipos de tumores em diferentes circunstâncias. Há o potencial de encontrar estratégias eficazes contra os cânceres, entendendo o mecanismo de expressão genética específica.
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Protocol
1. Cultura celular e formação da tumorfera
- Cultura HT29 células em um prato de 10 cm contendo o meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% antibiótico penicilina-estreptomicina (P/S).
- Cresça as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade em condições assépticas, até atingirem 80% de confluência.
- Trippsinize células HT29 com 1 mL de 0,25% de trippsina por 5 min a 37 °C e, consequentemente, neutralizar a trippsina adicionando 2 mL de DMEM com 10% de FBS e 1% P/S.
- Conte as células HT29 usando um hemótmetro.
- Adicione 2.000 células/bem a uma baixa fixação de 6 placas de poço com 2 mL de DMEM sem soro com 1% de P/S e suplementada com 0,2% de B27, 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), 20 ng/mL de fator de crescimento do fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL de fator de crescimento hepatócito (HGF) e 20 ng/mL de interleucina 6 (IL6).
- Cresça as células a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade em condições assépticas.
- Adicione 0,5 mL de câncer de células-tronco a cada 2 dias até que os tumores meçam >100 μm de diâmetro por pelo menos 7 dias.
- Observe e meça o diâmetro da tumorfera usando um microscópio invertido com um sistema de imagem celular digital.
- Quando os tumores atingirem >100 μm de diâmetro, tentepsinizar os tumores com 0,25% de trippsina por 5 min a 37 °C e neutralizar a trippsina adicionando 2x o volume do meio de crescimento. Conte as células usando um hemócito.
- Centrifugar a 1.200 rpm por 10 min e remover o supernaspe.
- Incubar 5 x 104 células com 2 μL de anti-LGR5-PE e 2 μL de anti-CD133-PE em 100 μL de DMEM individualmente por 30 minutos à temperatura ambiente, tremendo a 200 rpm.
NOTA: CD133 é um biomarcador geral de células-tronco de câncer que é altamente expresso em células HT29. - Adicione 900 μL de PBS e analise a expressão LGR5 e CD133 usando citometria de fluxo. Uma mudança na fluorescência no canal FL2-H indica expressão genética.
2. Isolamento do RNA
NOTA: Use um kit comercial (ver Tabela de Materiais) com uma coluna rápida para isolamento de RNA seguindo as instruções do fabricante.
- Adicione 50 μL de PBS às células colhidas (2 x 105 células) e resuspense-as com pipetação.
- Adicione 200 μL de tampão de lise contendo 2 μL de beta-mercaptoetanol (β-ME). Vórtice rapidamente e deixe ficar por 5 minutos.
- Centrifugar a solução a 16.000 x g por 10 min. Colete o supernascido e misture com 200 μL de 70% de etanol.
- Use a coluna anexada para remover o solvente por centrifugação a 14.000 x g por 1 min.
- Lave usando a solução de lavagem 1 e 2 para remover completamente os não-RNAs por centrifugação a 14.000 x g por 1 min.
- Centrífuga novamente a 14.000 x g por 2 min para remover etanol residual.
- Adicione 50 μL de água destilada, centrífuga a 14.000 x g por 1 min, e colete a solução.
- Meça a concentração de RNA usando OD260 com um espectrofotômetro.
Concentração de RNA (μg/mL) = (OD260) x (40 μg RNA/mL) e OD260/OD280 > 2. As amostras de RNA devem ter um número de integridade de RNA (RIN) > 7.
3. Análise de perfil e bioinformática da RNAseq
NOTA: A análise rnAseq foi realizada comercialmente (ver Tabela de Materiais) para investigar os genes diferenciais nas tumores derivadas de HT29 em comparação com as células HT29 parentais.
- Use serviços comerciais para etapas rnAseq, incluindo construção de biblioteca, controle de qualidade da biblioteca e sequenciamento de DNA.
- O relatório de dados deve conter informações importantes, incluindo as contagens de leitura, alteração de compartilhamento de log2 e valor p. Selecione os genes diferenciais de acordo com os seguintes parâmetros: genes com uma alteração de 1 2 dobras de log2 com contagem de leitura >100 no grupo tumorsphere HT29, e genes <-1 log2 dobra com contagem de leitura >100 no grupo parental HT29. Neste caso, foi considerado aceitável um valor p < 0,05 e utilizados os dados (Tabela 1).
NOTA: Aqui, uma contagem genética >100 foi usada como limiar para continuar o estudo de um determinado gene e validar sua expressão. - Use software de análise estatística (ver Tabela de Materiais),para mostrar um mapa de calor e identificar genes superexpressos >1 e genes regulados e downregulated < 1 em alteração de dobra de log2.
- Use o software R para desenhar o Gráfico do Vulcão com x: log2 fold change; y: -log10 (valor p) para mostrar os genes diferenciais.
- Instalar biblioteca R
install.packages (biblioteca(calibrar)) - Leia os dados no RStudio com o seguinte programa:
res <-read.csv("/Users/xxx.csv", header=T)
cabeça(res)
com(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))
com(subconjunto(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), pontos(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="vermelho"))
com (subconjunto(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), pontos (log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="azul"))
com(subconjunto(res, pvalue>.05), pontos (log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
abline(h=1,3, lty=2)
abline (v=1, lty=2)
abline(v=(-1), lty=2) - Execute a corrida para obter o Enredo do Vulcão.
- Instalar biblioteca R
4. Seleção de genes de motorista
- Selecione Entrada de gene único no NetworkAnalyst.
- Copie e cole os genes superexpressos selecionados da Tabela 1 com "humano" especificado como o organismo e o tipo de ID Official Gene Symbol.
NOTA: Alternativamente, use o Ensembl Gene ID para copiar e colar. - Insira os dados clicando em Upload e Proceder para analisá-los usando interação proteína-proteína (PPI) seguindo o PPI genético.
- Use o banco de dados interactome STRING com um corte de pontuação de confiança de 900 para mostrar os genes de sementes que cruzam os genes carregados. Os genes de sementes que se associam a mais genes individuais foram selecionados como genes condutores que podem estar envolvidos na manutenção da formação de tumores derivados de HT29.
NOTA: Existem três conjuntos de dados interactome para uso: IMEx, STRING e Rolland. String contém evidências experimentais de maior confiança. Com números de genes mais baixos, o IMEx pode ser selecionado para prever e captar os genes do driver nas redes interactome. - Selecione Prosseguir na visão geral do mapeamento.
- Selecione Branco no Plano de Fundo e Atlas de Força no botão Layout.
- Selecione PANTHER BP para analisar o grupo genético de regulação.
NOTA: Isso mostra que o HSPA5 foi responsável pela antipoptose nas tumores derivados do HT29 neste estudo(Figura 3A). Para reduzir a classificação de campo funcional específico, a classificação KEGG, GO ou PANTHER pode ser usada alternativamente para selecionar os genes específicos do driver.
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Representative Results
Para estabelecer o modelo de investigação do mecanismo em células-tronco cancerosas, as células colorretais HT29 foram usadas para cultivar tumores semelhantes a troncos de câncer in vitro em uma placa de baixa fixação contendo B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Os tumores >100 μm de diâmetro foram formados em 7 dias(Figura 1A). Os tumores foram tentados em células únicas e analisados usando citometria de fluxo para detectar a expressão LGR5 e CD133. O LGR5 aumentou nos tumores HT29-drived de 1,1% para 11,4% e as células foram detectadas por meio de citometria de fluxo (Figura 1B). Outro marcador de caule, CD133, também aumentou de 61,8% para 81,1% nas tumores cultivadas derivadas de HT29 em comparação com as células HT29 parentais(Figura 1C). Então, os tumores estavam prontos para a investigação da RNAseq.
RNAseq foi usado para investigar o perfil de expressão genética nas tumores derivados de HT29 em comparação com as células HT29 parentais. A taxa de erro na leitura de nucleotídeos foi de 0,03% para ambas as amostras. A taxa total de mapeamento genético foi de 87,87% para HT29 e 87,25% para tumores derivados de HT29. Os fragmentos por quilobase de transcrição por milhão (FPKM), normalizando a contagem de detetives para indicar a expressão de transcrição (mRNA), intervalo entre 0 e 1 foi de 75,87% para células HT29 e 77,16% para tumores derivados de HT29. Os resultados foram adequados para consequente sequência. Após leituras de sequenciamento, foram selecionados os genes com alteração de dobra log2 >1 em regulação de upregulation e <-1 em regulação de baixa com valor p < 0,05 mostrados pelo mapa de calor (Figura 2A,Tabela 1,Tabela 2) Havia 79 genes regulados e 33 genes regulados selecionados. Além disso, o enredo volcano usando a alteração do fold log2 e o valor p (valor de p log10 p) foi usado para distinguir os genes significativos entre tumores derivados de HT29 e células HT29 parentais(Figura 2B). Com base na seleção preliminar, foram identificados três genes potencialmente regulados, incluindo ACSS2, HMGCS1e PCSK9,nas tumores derivados do HT29(Figura 2A). Além disso, para identificar os genes do driver não apenas de acordo com a alteração do registro2, foi utilizado o NetworkAnalyst. Os genes regulados com variação de dobra log2 >1 com valor p <0,05 foram analisados e resultaram em 10 genes de sementes que cruzam as redes genéticas, incluindo HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1e TOMM40 (Figura 3A). Para identificar a função e o significado dos genes de sementes, a interface de classificação poderia ser usada para executar a BP PANTERA para determinar os genes envolvidos na anti-apoptose em tumores derivados de HT29. Os resultados indicaram que o HSPA5 e o SQSTM1 estavam associados à regulação negativa da apoptose (Figura 3A). Além disso, os 10 genes selecionados foram, consequentemente, validados; expressão aumentada nas tumores derivadas de HT29 como confirmado por meio de qPCR (Figura 3B).
Figura 1: Estabelecimento de tumores semelhantes a câncer in vitro. (A) HT29 foi utilizado para formar tumores, e(B)LGR5 foi detectado nas tumores derivados de HT29 (Barra de escala = 100 μm). (C) CD133 foi utilizado como outro marcador para identificar os caracteres de caule nas tumores estabelecidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mapa de calor e enredo vulcão foram usados para selecionar os genes diferenciais nas tumores derivadas de HT29. Log2 fold change >1 e <-1 com contagem de leitura >100, p value < 0.05 foram usados para excluir genes não significativos e certificar-se de que os dados eram precisos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: NetworkAnalyst foi usado para identificar os genes do driver nas tumores derivadas de HT29. (A) Os genes regulados foram selecionados e analisados consequentemente, e uma interface de classificação, PANTHER BP, forneceu as funções potenciais para os genes de driver diferencial. (B) Em seguida, o qPCR foi usado para validar os 10 genes regulados em tumores derivados de HT29 em comparação com as células HT29 parentais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Os genes regulados nas tumores derivados de HT29 em comparação com as células HT29 parentais analisadas pela RNAseq. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Os genes regulados em tumores derivados de HT29 em comparação com as células HT29 parentais analisadas pela RNAseq. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Neste estudo, tumores semelhantes a câncer cultivados foram utilizados como modelo na análise dos dados rnAseq com bioinformática disponível. Para um modelo de doença, foram utilizadas tumores derivados de HT29. Como os tumores têm resistência a medicamentos contra terapias tumorais, o modelo estabelecido pode ser usado para investigar os mecanismos detalhados de resistência, investigando diferenças na expressão genética. Além disso, a tecnologia genômica usando rnAseq com bioinformática disponível fornece uma compreensão rápida do modelo de estudo para que os genes potencialmente envolvidos possam ser validados com maior confiança. Além disso, o tipo de genes envolvidos na formação de tumores pode ser identificado.
A qualidade do RNA é fundamental para a análise RNAseq32. Certifique-se de que a amostra tenha RIN >7, pois aumenta a certeza entre leituras de mapeamento, mapeamento de genes e FPKM. Ao analisar os dados rnaseq, iPA29 e NetworkAnalyst30 estavam disponíveis para identificar genes potenciais e caminhos de sinalização. No entanto, é essencial excluir os genes desnecessários de acordo com os seguintes parâmetros: genes mostrando uma alteração de 2vezes de 2008 com contagem de leitura >100 no grupo experimental, e genes <-1 log2 fold change com contagem de leitura > 100 no grupo controle. As contagens de leitura mais altas são mais fáceis para a consequente validação usando qPCR ou manchas ocidentais.
Com base na compreensão das funções e processos biológicos, existem muitas ferramentas de bioinformática que permitem a rápida investigação dos potenciais mecanismos de doenças de interesse. Combinados com uma ferramenta de alto rendimento para a triagem da expressão genética como a RNAseq, mecanismos potenciais que regulam o desenvolvimento das doenças estudadas podem ser propostos e investigados. Aqui, o método para investigar a formação de tumores semelhantes a crc derivados de HT29 revelou que SQSTM1 e HSPA5 foram os genes alvo regulados e envolvidos na anti-apoptose nas tumoresferas. Portanto, mais experimentos podem ser projetados para investigar o mecanismo detalhado desses genes, o que resulta em mais confiança e eficácia na realização de estudos de pesquisa.
Aqui, apenas os genes regulados nas tumores foram analisados porque a regulação foi considerada induzida pela adição dos fatores de crescimento. Caso contrário, se o experimento utilizasse knockdown genético nas células tumorais, os genes regulados seriam considerados alvos que podem ser selecionados para investigação usando a bioinformática. Embora a metodologia seja rápida e confiável, a validação subsequente ainda é necessária através de qPCR e manchas ocidentais. Sugere-se também que mais linhas celulares sejam usadas para validação da expressão genética, especialmente para amostras clínicas.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Laboratório Central de Biologia da Radiação do Instituto de Pesquisa Radiológica, Chang Gung Memorial Hospital, pelo apoio técnico. Este estudo foi apoiado por subsídios do Hospital Memorial Chang Gung (CMRPD1J0321), Do Hospital Geral cheng Hsin (CHGH 106-06) e do Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Os órgãos financiadores não influenciaram na concepção do estudo e coleta de dados, análise e interpretação dos dados ou na redação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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