Summary
Diese Technik ermöglicht die schnelle und einfache Herstellung von Vollkornharzabschnitten für die Beobachtung und Analyse von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Bereichen des Saatguts.
Abstract
Die Morphologie, Größe und Quantität der Zellen, Stärkegranulate und Proteinkörper im Saatgut bestimmen das Gewicht und die Qualität des Saatguts. Sie unterscheiden sich zwischen den verschiedenen Saatgutregionen erheblich. Um die Morphologien von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern klar zu betrachten und ihre Morphologieparameter quantitativ genau zu analysieren, wird der Abschnitt in vollwertiger Größe benötigt. Obwohl die Paraffin-Sektion in vollsamen Größe die Ansammlung von Lagermaterialien in Samen untersuchen kann, ist es aufgrund der geringen Auflösung des dicken Abschnitts sehr schwierig, die morphologischen Parameter von Zellen und Speichermaterialien quantitativ zu analysieren. Der dünne Harzabschnitt hat eine hohe Auflösung, aber die routinemäßige Harzschnittmethode ist nicht geeignet, den vollwertigen Abschnitt aus reifen Samen mit einem großen Volumen und hohem Stärkegehalt vorzubereiten. In dieser Studie stellen wir eine einfache Trockenschnittmethode zur Vorbereitung des gesamten Harzabschnitts vor. Die Technik kann die kreuz- und längsförmigen Ganzkernabschnitte von sich entwickelnden, reifen, gekeimten und gekochten Samen, die in LR White Harz eingebettet sind, auch für große Samen mit hohem Stärkegehalt vorbereiten. Der ganzaggroße Abschnitt kann mit fluoreszierendem Aufheller 28, Jod und Coomassie brillantblaur R250 gefärbt werden, um speziell die Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern deutlich zu zeigen. Das erhaltene Bild kann auch quantitativ analysiert werden, um die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen zu zeigen.
Introduction
Pflanzensamen enthalten Lagermaterialien wie Stärke und Protein und liefern Energie und Nahrung für die Menschen. Form, Größe und Menge der Zell- und Lagermaterialien bestimmen das Gewicht und die Qualität des Saatguts. Die Zellen und Speichermaterialien in verschiedenen Samenregionen haben signifikant unterschiedliche Morphologien, insbesondere für einige hochamylose Getreidepflanzen mit Hemmung des Stärkeverzweigungsenzyms IIb1,2,3. Daher ist es sehr wichtig, die Morphologien von Zellen und Lagermaterialien in verschiedenen Samenregionen zu untersuchen.
Paraffinschnitt ist eine gute Methode, um den ganzwertigen Abschnitt vorzubereiten und kann die Gewebestruktur des Saatguts und die Ansammlung von Lagermaterial in verschiedenen Regionen des Saatguts4,5,6aufweisen. Die Paraffinabschnitte haben jedoch in der Regel eine Dicke von 6-8 m mit geringer Auflösung; Daher ist es sehr schwierig, die Morphologie von Zell- und Speichermaterialien klar zu beobachten und quantitativ zu analysieren. Die Harzprofile haben in der Regel eine Dicke von 1-2 m und eine hohe Auflösung und eignen sich sehr gut, um die Morphologie von Zell- und Lagermaterialien zu beobachten und zu analysieren7. Die routinemäßige Harzschnittmethode hat jedoch Schwierigkeiten bei der Vorbereitung des Abschnitts in voller Saatgröße, insbesondere für Samen mit einem großen Volumen und hohem Stärkegehalt; somit gibt es keine Möglichkeit, die Morphologie von Zellen und Lagermaterialien in verschiedenen Bereichen des Saatguts zu beobachten und zu analysieren. LR White Harz ist ein Acrylharz und weist eine geringe Viskosität und starke Durchlässigkeit auf, was zu seinen guten Anwendungen bei der Herstellung des Harzabschnitts von Samen führt, insbesondere für Getreidereife Kerne mit großem Volumen und hohem Stärkegehalt. Darüber hinaus kann die in LR White Resin eingebettete Probe leicht mit vielen chemischen Farbstoffen gefärbt werden, um die Morphologie von Zellen und Speichermaterialien unter Licht- oder Fluoreszenzmikroskop deutlich zu zeigen7. In unserem vorherigen Papier haben wir über eine Trockenschnittmethode zur Herstellung der in LR White Harz eingebetteten Abschnitte von reifen Getreidekernen berichtet. Die Methode kann auch den vollwertigen Abschnitt des entwickelnden, gekeimten und gekochten Getreidekerns8vorbereiten. Der erhaltene Abschnitt im Ganzensaathat hat viele Anwendungen in der Mikromorphologiebeobachtung und -analyse, insbesondere zur übersichtlichen Betrachtung und quantitativen Analyse der morphologischen Unterschiede von Zell- und Speichermaterialien in verschiedenen Samenregionen8,9.
Diese Technik eignet sich für Forscher, die die Mikrostruktur des Gewebes und die Form und Größe von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen mit Hilfe des Lichtmikroskops beobachten möchten. Die Bilder von Abschnitten in Vollkorngröße, die speziell für die Ausstellung von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern gebeizt wurden, können mit einer Morphologie-Analysesoftware analysiert werden, um die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen quantitativ zu messen. Um die technische Anwendbarkeit und die Anwendung von Ganzsaat-Abschnitten zu demonstrieren, haben wir in dieser Studie die reifen Samen von Mais und Ölraps sowie die sich entwickelnden, gekeimten und gekochten Reiskerne untersucht. Das Protokoll enthält vier Prozesse. Hier verwenden wir reifen Maiskern, der aufgrund des großen Volumens und des hohen Stärkegehalts am schwierigsten bei der Vorbereitung der ganzaatigen Abschnitte ist, als Beispiel, um die Prozesse Schritt für Schritt auszustellen.
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Protocol
1. Herstellung von harzeingebettetem Saatgut (Abbildung 1)
- Fix sechs Mais reife Kerne in 10 ml von 2,5% Phosphat-gepuffertem Glutaraldehyd (0,1 M, pH7,2) bei 4 °C für 48 h. Die Forscher können andere fixative Mischungen, fixative Konzentrationen und Fixierungsbedingungen nach ihren Forschungszielen und Gewebetypen wählen.
- Nehmen Sie die Kerne heraus und schneiden Sie sie längs oder quer auf 2-3 mm Dicke mit einer scharfen doppelseitigen Klinge, und fixieren Sie sie in 10 ml von 2,5% phosphatgepuffertem Glutaraldehyd (0,1 M, pH 7,2) wieder für 48 h.
- Waschen Sie die Proben dreimal mit 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) jeweils 30 min lang.
- Dehydrieren Sie die Proben in zunehmenden Qualitäten von ethanolwäriger Lösung (10 ml) von 30% bis 50%, 70%, 90% einmal und 100% dreimal für 30 min jedes Mal.
- Infiltrieren Sie die Proben in 10 ml erhöhenden Qualitäten der LR White Harzlösung, die mit Ethanol von 25% auf 50%, 75% einmal verdünnt wird, und 100% zweimal bei 4 °C für 12 h jedes Mal.
- Bereiten Sie die Sockel für Proben vor dem Einbetten vor. 0,25 ml 100% LR Weißharz in ein 2-ml-Zentrifugenrohr geben und bei 60 °C für 48 h polymerisieren.
- Nacheinander das reine LR White Harz (0,5 ml) und die infiltrierte Probe in das Zentrifugenrohr mit einem Sockel geben. Richten Sie die Proben mit der anatomischen Nadel aus und polymerisieren Sie sie bei 60 °C im Ofen für 48 h.
2. Trockenschnitt zur Vorbereitung eines Abschnitts in voller Saatgröße (Abbildung 1)
- Nehmen Sie die eingebetteten Kerne aus dem Zentrifugenrohr heraus und schneiden Sie das überschüssige Harz um die Probe mit einer scharfen Klinge aus.
- Klemmen Sie den Harzblock im Probenhalter von Ultramikrotom (EM UC7), und schneiden Sie das überflüssige Harz auf der Oberfläche der Probe und um die Probe herum mit einer Klinge ab.
- Die Oberfläche der Probe fein mit einem Glasmesser polieren, bis ein vollständiger Abschnitt gebildet werden kann.
- Legen Sie vor dem Schneiden einen kleinen Kupferhaken etwa 2 mm über der Klingenkante und schneiden Sie die Probe in einen 2 m Abschnitt. Die Rolle des Hakens ist es, das Curling nach oben des Abschnitts zu vermeiden.
- Setzen Sie den Haken unter den Abschnitt, um ihn zu unterstützen, wenn der Abschnitt lang wird.
- Fügen Sie 100 l Wasser auf einer unvorbehandelten Rutsche hinzu und übertragen Sie den kompletten und ungebrochenen Abschnitt vorsichtig mit der Pinzette ins Wasser.
- Um den faltigen Abschnitt zu glätten, die Probe auf dem Abflachungstisch bei 50 °C über Nacht erhitzen und trocknen.
- Wenn der Abschnitt bröckelt oder reißt, verlängern Sie die Zeit für jede Harzinfiltration der Probe von 12 h auf 24 h oder 48 h.
- Wenn der Abschnitt einige Linien parallel zum Messer hat, klemmen Sie den Probenblock fest. Wenn der Abschnitt einige Linien vertikal zum Messer hat, verwenden Sie bitte ein neues Messer.
3. Färbung und Beobachtung des Abschnitts
HINWEIS: Um die Gewebestruktur und Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern zu beobachten, färben Sie die Abschnitte entsprechend dem Forschungszweck mit spezifischen Flecken. Hier verwenden wir den fluoreszierenden Aufheller 28, Jodlösung und Coomassie brillant blau R250, um die Zellwände, Stärkegranulate bzw. Proteinkörper zu färben.
- Zur Beobachtung der Morphologie der Zellen den Abschnitt mit 40 ml 0,1% (w/v) fluoreszierender Aufheller 28 wässrige Lösung in einem 70 ml kompakten Glas-Färbeglas glas bei 45 °C für 10 min färben, und dann mit fließendem Wasser für 5 min abspülen. Beobachten und fotografieren Sie den Abschnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.
- Zur Beobachtung der Morphologie von Stärkegranulat den Abschnitt mit 40 l Jodlösung (0,07% (w/v) I2 und 0,14% (w/v) KI in 25% (v/v) Glycerin) 1 min färben und die Mitprobe, die Jodlösung enthält, mit einem Deckzettel bedecken. Sehen und fotografieren Sie die Probe unter einem Lichtmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.
- Zur Beobachtung der Morphologie von Proteinkörpern Tauchen Sie den Abschnitt mit 40 ml 10% (v/v) Essigsäure in ein 70 ml kompaktes Glas-Färbeglasglas für 10 min bei 45 °C ein und färben Sie ihn dann in 40 ml von 1% (w/v) Coomassie brilliant blue R250 in 25% (v/v) Isopropanol und 10% (v/v) Essigsäure für 15 min bei 45 °C. Die gebeizten Abschnitte mit fließendem Wasser 5 min waschen und trocknen. Beobachten und fotografieren Sie den Abschnitt unter einem Lichtmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.
4. Quantitative Analyse von Morphologieparametern
- Prozess und quantitativ analysieren die fotografierten Bilder für Fläche, Lang-/Kurzachse und Rundheit von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen mit Morphologie-Analysesoftware (Image-Pro Plus 6.0 Software) nach den Verfahren von Zhao et al.9 genau.
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Representative Results
Einfache Trockenschnittmethode zur Gewinnung eines Ganzaatschnitts
Wir etablieren ein einfaches Trockenschnittverfahren zur Herstellung eines in LR-Weißharz eingebetteten Samenabschnitts in voller Saatgröße (Abbildung 1). Das Verfahren kann transversale und längsförmige Vollsaatschnitte mit einer Dicke von 2 m vorbereiten(Abbildung 2-5, Ergänzende Abbildung 1-4). Zum Beispiel kann der ausgereifte Samen von Ölraps quer und längs geschnitten werden (Abbildung 2). Bei Getreidepflanzen sind ihre reifen Kerne voll von Stärkegranulat, was dazu führt, dass es sehr schwierig ist, den Abschnitt in voller Saatgröße vorzubereiten. Mit der vorliegenden Technik könnten auch die transversalen und längsförmigen Vollkornabschnitte von reifen Mais mit großem Volumen hergestellt werden (Abbildung 4, Ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus können der sich entwickelnde Kern (Ergänzende Abbildung 2), der keimende Kern (Ergänzende Abbildung 3) und der gekochte Kern (Ergänzende Abbildung 4) von Reis mit der Methode untersucht werden.
Anwendungen des Ganzkorn-Abschnitts
Beobachtung der Gewebestruktur von Saatgut
Der Abschnitt in vollwertiger Größe kann verwendet werden, um die Gewebestruktur von Samen zu beobachten. Zum Beispiel besteht der Embryo von Ölraps aus Radicle, Hypocotyl, Plumule und zwei Cotyledons. Die inneren und äußeren Kotyledonen sind halbgebogen, wickeln das Hypocotyl und Radikel und machen den Embryo kugelförmig (Abbildung 2A, C). Die längs- und transversalen, mit Safranin befleckten Abschnitte in ganz embryonaler Größe zeigten deutlich den Radikel, Hypocotyl, inneres Kotyledon und äußeres Cotyledon (Abbildung 2B,D). Der längsförmige ganzembryongroße Abschnitt von Ölraps wird schwieriger zubereitet als der Transversalabschnitt. Daher sind die transversalen Abschnitte von Embryonen weit verbreitet, um die Mikromorphologie von Embryonen in Referenzen5,10zu untersuchen.
Morphologie und Analyse von Zellen in verschiedenen Samenregionen
Der Abschnitt in voller Samengröße kann verwendet werden, um die Morphologie von Zellen in verschiedenen Samenregionen zu beobachten und zu analysieren. Zum Beispiel wurden die transversalen ganzembryonalen Abschnitte von Ölraps mit fluoreszierendem Aufheller 28 befleckt, und die Zellwände wurden spezifisch gefärbt (Abbildung 3A). Die Mikromorphologie von Zellen in allen Regionen des Embryos könnte bei hoher Vergrößerung deutlich dargestellt werden (Abbildung 3B,C). Der Heizkörper besteht aus Epiderm, Kortex und Gefäßgewebe. Die epidermalen Zellen, die sich in der äußersten Radikelschicht befinden, waren rechteckig und radial angeordnet. Die kortikalen Parenchymzellen waren rund und groß. Zwischen kortikalen Zellen wurden einige unterschiedliche Räume beobachtet. Die kortikalen Zellen waren in Schichten von innen nach außen angeordnet (Abbildung 3B). Die epidermalen Zellen von Cotyledon waren quadratisch und hatten ein geringes Volumen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in Form und Größe der epidermalen Zellen zwischen äußeren und inneren Oberflächen von inneren und äußeren Cotyledonen. Einige Gefäßzylinder wurden in der Mitte von Mesophyllgeweben von inneren und äußeren Kotyledonen verstreut. Die mesophyllparenchymzellen waren signifikant größer als die epidermalen Zellen und Gefäßzylinderzellen im Kotyledon. Die mesophyll parenchym-Zellen zeigten eine typische Palisadenanordnung im inneren Bereich des äußeren Cotyledons und im äußeren Bereich des inneren Kotyledons (Abbildung 3C). Die Parenchymzellen hatten signifikant unterschiedliche Morphologien in verschiedenen Regionen des Embryos. Um ihre Unterschiede in der Morphologie aufzuzeigen, wurden die Regionen 1, 2, 3, 4 und 5 im Radikelkortikum, im inneren Bereich des inneren Kotyledons, im äußeren Bereich des inneren Kotyledons, im inneren Bereich des äußeren Kotyledons bzw. im äußeren Kotyledon gewählt (Abbildung 3B, C). Die Morphologieparameter der Parenchymzellen in den oben genannten 5 Regionen wurden mit Hilfe einer Morphologieanalysesoftware quantitativ analysiert (Ergänzende Tabelle 1). Die Fläche, die lange Achsenlänge, die kurze Achslänge und die Rundheit der Parenchymzellen zeigten einige Unterschiede in verschiedenen Regionen von Embryonen.
Die Zellen in Endosperm waren voll von Stärke und Speicherprotein. Mit dem Vollkorn-Harzabschnitt ist es einfach, die Zellen in verschiedenen Endosperm-Regionen zu beobachten und zu analysieren. Beispielsweise konnte die Morphologie von Zellen in allen Regionen des Maisendosperms deutlich betrachtet werden, nachdem die transversalen Vollkornabschnitte mit fluoreszierendem Aufheller 28 befleckt wurden. Die peripheren, mittleren und zentralen Endospermen im selben Kernel wiesen signifikant unterschiedliche Formen und Größen von Zellen auf (Ergänzende Abbildung 1). Um die morphologischen Parameter von Zellen in verschiedenen Endospermregionen quantitativ zu analysieren, wurden die Bilder von Regionen mit Hilfe einer Morphologie-Analysesoftware analysiert; Die Morphologieparameter von Zellen sind in Der Ergänzungstabelle 2dargestellt. Die Endospermzellen in Region 1 hatten die kleinste Fläche unter vier Regionen, die in Region 2 waren größer als die in Region 3, aber kleiner als die in Region 4.
Morphologie und Analyse von Stärkegranulat in verschiedenen Saatgutregionen
Die ausgereiften Samen aus den meisten Pflanzenressourcen, insbesondere für Getreidepflanzen, enthalten einen hohen Stärkegehalt. Die Granulatmorphologie und die Stärkegröße haben wichtige Auswirkungen auf die Stärkeeigenschaften und spielen eine Rolle bei der Qualität des Saatguts. Der Harzabschnitt des Saatguts kann mit Jodlösung gebeizt werden, um die Morphologie von Stärkegranulat in verschiedenen Samenregionen zu zeigen. So wurden beispielsweise die transversalen und längsförmigen Vollkornabschnitte von Mais erfolgreich vorbereitet. Die mit Jod befleckten Abschnitte zeigten die Morphologie der Stärke (Abbildung 4). Um die Morphologie des Stärkegranulats in verschiedenen Endospermregionen zu zeigen, wurden die vier Regionen und neun Regionen in den transversalen bzw. längsförmigen Vollsaatabschnitten ausgewählt (Abbildung 4). Das Stärkegranulat in verschiedenen Regionen zeigte signifikant unterschiedliche Morphologie, Größe und Menge in Endospermzellen. Für den querschnittsförmigen Abschnitt hatte Region 1 kugelförmige Stärkegranulate, Region 2 polygonale Granulate und Stärkegranulat in beiden Regionen 3 und 4 waren kugelförmig. Bei Längsschnitten waren Stärkegranulate mit polygonaler Form in den Regionen 1, 4, 5 und 8 größer als die mit sphärischer Form in den Regionen 3, 7 und 9, und einige zusammengesetzte Stärkegranulate wurden in den Regionen 2 und 6 beobachtet.
Die quantitative Analyse morphologischer Parameter von Stärkegranulat in vier Regionen des Querschnitts wurde in der ergänzenden Tabelle 3dargestellt. Stärkegranulat ein Region 1 hatte die kleinste Größe, die in Region 2 die größte Größe und die in Region 3 waren größer als in Region 4.
Mikromorphologie und Analyse von Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen
Der vollwertige Abschnitt mit speicherhohem Protein kann verwendet werden, um die Morphologie von Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen zu vernachlqueren und zu analysieren. Zum Beispiel wurde der transversale Abschnitt des Embryos von Ölraps mit Coomassie brillant blau R250 gefärbt, und das Speicherprotein war blau gebeizt(Abbildung 5). Die räumliche Verteilung des Speicherproteins im Embryo konnte bei geringer Vergrößerung deutlich beobachtet werden (Abbildung 5A). Speicherprotein ist in Proteinkörpern vorhanden. Bei hoher Vergrößerung zeigte der Proteinkörper eine heterogene Matrix mit einigen schwarzen Granulaten und einer ungefärbten transparenten Struktur (Abbildung 5B). Die Proteinkörper im Samen haben drei Arten: Der erste Typ besteht aus einer homogenen Proteinmatrix und hat keine Einschlüsse, der zweite Typ enthält Kugelkristalle und der dritte Typ enthält Kugelkristalle und Pseudokristalle11. Die Kugelkristalle im Eiweißkörper bestehen aus Phytat und anderen anorganischen Salzen, die nicht gefärbt sind. Diese Kugelkristalle sind schwarz, da das Licht nicht unter dem Mikroskop durch sie hindurchgehen kann. Darüber hinaus ist der kugelförmige Kristall zerbrechlich und schwer durch das Fixiermittel und das Einbettmittel durchdrungen werden kann. Bei der Herstellung des Abschnitts platzen die kugelförmigen Kristalle manchmal aus, was zu einem transparenten Hohlraum im Inneren des Proteinkörpers11führt. Der Proteinkörper des Raps-Embryos enthielt sphäroidale Kristalle gemäß seiner Mikromorphologie (Abbildung 5B). Um die räumliche Verteilung der Proteinkörper im Embryo zu untersuchen, wurden fünf Regionen im gesamten embryogroßen Abschnitt ausgewählt, um das Radikelkortikum, den inneren Bereich des inneren Kotyledons, den äußeren Bereich des inneren Kotyledons, den inneren Bereich des äußeren Kotyledons und den äußeren Bereich des äußeren Kotyledons darzustellen (Abbildung 5A,C-G). Die Proteinkörper in allen Regionen des Embryos waren kugelförmig, ellipsoidenförmig und unregelmäßig in der Form(Abbildung 5C-G).
Die quantitative Analyse von Proteinkörpern in der ersten und zweiten legierenden Parenchymzellen in der Nähe der Epidermis in den oben ausgewählten fünf Regionen ist in der Ergänzenden Tabelle 4dargestellt. Der Bereich des Proteinkörpers hatte einen leichten Unterschied zwischen den ausgewählten fünf Regionen. Die Rundheit des Proteinkörpers war im äußeren Bereich des äußeren Kotyledons signifikant geringer als in den anderen vier Regionen, was darauf hindeutet, dass der Proteinkörper im äußeren Kotyledon in der Nähe der Kugel war. Die Anzahl und der Flächenindex des Proteinkörpers in der Zelle waren in der Radikelparenchymzelle signifikant höher als in der Cotyledonparenchymzelle (Zusatztabelle 4).
Abbildung 1:Herstellung eines Halbdünnen Abschnitts in Vollkorngröße mit Trockenschnittverfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gewebestruktur des Embryos in reifen Samen der Rapssorte Huashuang 5. (A) Morphologie des Embryos. (B) Gewebestruktur des Längs-Vollembryon-großen Abschnitts. (C) Morphologie des transversalen Ganzembryon-großen Abschnitts. (D) Gewebestruktur eines transversalen ganzembryonalen Abschnitts. Die Abschnitte waren mit Safranin befleckt. H, Hypocotyl; IC, inneres Kotyledon; OC, äußeres Kotyledon; R, Radikel. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Morphologie von Zellen im Embryo der Rapssorte Huashuang 5. (A) Transversaler Ganzembryon-großer Abschnitt mit fluoreszierendem Aufheller 28 gefärbt. (B) Verstärkung der Region B in (A), die die Zellmorphologie und Gewebestruktur des Radikels zeigt. (C) Verstärkung der Region C in (A), die die Zellmorphologie und Gewebestruktur des inneren und äußeren Kotyledons zeigt. Skalenstange = 500 m für (A) und 100 m für (B,C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Morphologie von Stärkegranulat enden im reifen Kern der Maissorte Zheng 58. Die transversalen (A) und längs (B) Vollkornabschnitte wurden mit Jodlösung befleckt, und ihre regionalen Amplifikationen zeigen die Morphologie von Stärkegranulat in verschiedenen Endospermregionen. Maßstabsstange = 1 mm für Dener in Vollkorngröße und 20 mm für regionale Amplifikationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Morphologie von Proteinkörpern im Embryo der Rapssorte Huashuang 5. (A) Transversaler ganzembryonaler Abschnitt mit Coomassie brillantblaur R250 gefärbt. (B) Verstärkung der Proteinkörper unter Aufzeigen ihrer Mikrostruktur. (C-G) Verstärkung der Region C-G in (A), zeigt die Morphologie des Proteinkörpers in Radikel (C), innere Region des inneren Kotyledons (D), äußerer Bereich des inneren Kotyledons (E), innere Region des äußeren Cotyledons (F), äußerer Bereich des inneren Kotyledons (G). Skalenstange = 500 m für (A), 5 m für (B) und 50 m für (C-G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzend Abbildung1: Morphologie von Zellen im reifen Kern der Maissorte Zheng 58. Der transversale Ganzsaat-große Abschnitt wurde mit fluoreszierendem Aufheller 28 befleckt, und seine regionalen Amplifikationen (1-4) zeigen die Morphologie von Endospermzellen in verschiedenen Endospermenregionen. Maßstabsstange = 1 mm für Dener in Vollkorngröße und 100 mm für regionale Amplifikationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzend Abbildung 2: Morphologie der Entwicklung des Kerns der Reissorte 9311. Die transversalen Ganzkernabschnitte an verschiedenen Tagen nach der Blüte (DAF) wurden mit Safranin O und Jodlösung gegengefärbt. Maßstabsleiste = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Morphologie des gekeimten Kerns der Reissorte Te-qing. Der Längsschnitt in vollsamen Größe 8 Tage nach imbibition wurde mit periodischen Säure-Schiffs und Toluidinblau O gegengefärbt, und seine regionalen Amplifikationen zeigen die morphologischen Veränderungen des Endosperms in verschiedenen Samenregionen. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzend Abbildung4: Die Morphologie des gekochten Kerns der Reissorte Te-qing. Der transversale Vollkornabschnitt wurde mit Jodlösung befleckt, und seine äußeren, mittleren und inneren Bereichsverstärkungen zeigen die morphologischen Veränderungen von Stärkegranulat im Samen während des Kochprozesses für 0, 10, 20 und 30 min. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Morphologie-Parameter von Zellen in verschiedenen Regionen von Ölraps-Embryoa Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
a Die Daten sind mittels ± Standardabweichungen (n = 3), und die Werte in derselben Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben sind signifikant unterschiedlich (p < 0.05).
b Die Regionen sind in Abbildung 3B, Cdargestellt.
c LAL: lange Achsenlänge; SAL: kurze Achslänge; Rundheit: (Perimeter 2)/(4×π×Bereich).
Ergänzende Tabelle 2: Morphologie Parameter von Zellen in verschiedenen Regionen von Mais Endosperma Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
a Daten sind mittels ± Standardabweichungen (n = 3). Die Werte in derselben Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich erheblich(p < 0,05).
b Die Regionen sind im Querschnitt des Maiskerns in der ergänzenden Abbildung 1dargestellt.
c LAL: lange Achsenlänge; SAL: kurze Achslänge; Rundheit: (Perimeter 2)/(4×π×Bereich).
Ergänzende Tabelle 3: Morphologie Parameter von Stärkegranulat in verschiedenen Regionen von Mais endosperma Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
a Daten sind mittels ± Standardabweichungen (n = 3). Die Werte in derselben Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich erheblich(p < 0,05).
b Die Regionen sind in Abbildung 4Aim Querschnitt des Maiskerns dargestellt.
c LAL: lange Achsenlänge; SAL: kurze Achslänge; Rundheit: (Perimeter 2)/(4×π×Bereich).
Ergänzende Tabelle 4: Morphologie-Parameter von Proteinkörpern in verschiedenen Regionen von Ölraps-Embryoa Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
a Die Daten sind mittels ± Standardabweichungen (n = 3), und die Werte in derselben Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben sind signifikant unterschiedlich (p < 0.05).
b Die Regionen sind in Abbildung 5dargestellt.
c Rundheit: (Perimeter 2)/(4×π×Bereich); Flächenindex ist das Flächenverhältnis von Proteinkörper zu Zelle.
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Discussion
Die Samen sind die wichtigste erneuerbare Ressource für Lebensmittel, Futter und industrielle Rohstoffe und sind reich an Lagermaterialien wie Stärke und Protein. Die Morphologie und Quantität der Zellen sowie der Inhalt und die Konfiguration der Lagermaterialien beeinflussen das Gewicht und die Qualität der Samen7,12. Obwohl die Stereologie- und Bildanalysetechnologie die Größe und Quantität der Zellen in einer Geweberegion messen kann, fehlen sie in vielen Laboratorien. Die Paraffin- und Harzabschnitte ergeben ein zweidimensionales (2D) Bild, das keine Möglichkeit zur Analyse der tatsächlichen Größe und Menge der Zellen führt. Die Zellen werden jedoch zufällig auf ihren beliebigen Ebenen geschnitten, die mittlere Größe vieler Zellen (über 100) aus mindestens drei verschiedenen Abschnitten des Gewebebereichs kann die 2D-Morphologieparameter (Länge, Breite und Fläche) von Zellen widerspiegeln, und das Verhältnis der gewählten Regionsfläche zu der mittleren Zellfläche kann die Menge der Zellen widerspiegeln. Daher ist es sehr wichtig für die In-situ-Betrachtung und Analyse der Morphologie von Zellen und Speichermaterialien in verschiedenen Regionen des Saatguts. Der Paraffinabschnitt eignet sich am besten zur Vorbereitung des ganzwertigen Abschnitts, insbesondere für großformatige Samen7. Die Zellen sind jedoch voll von Lagermaterialien mit Samenentwicklung, was dazu führt, dass es sehr schwierig ist, den guten Vollkorn-Großen Abschnitt aus spät entwickelnden Samen und reifen Samen zu erhalten. Darüber hinaus ist der Paraffinabschnitt zu dick, um die Morphologie deutlich zu zeigen, und eignet sich nur zur Untersuchung der Gewebestruktur von Samen7.
Der Harzabschnitt ist dünn und kann die Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörperndeutlich7 aufweisen. Das Routineharz ist jedoch nicht für den Ganzensaatbereich geeignet. Die hier vorgestellte Technik stellt einen schnellen, einfachen und scharfen Ansatz zur Vorbereitung von transversalen und längsförmigen Vollkornabschnitten von reifen Samen dar, die in Harz eingebettet sind, um die Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen mithilfe der Lichtmikroskopie zu betrachten (Abbildung 2-5, Ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus kann die Technik auch den Abschnitt der Entwicklung, keimen und gekochte Samen vorbereiten, um in situ die morphologischen Veränderungen von Zell-, Stärke- und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen zu untersuchen.
Ein weiterer deutlicher Vorteil, den diese Technik bietet, ist die Anwendung von Abschnitten in vollwertiger Größe. In der neuen Ära der Phänomik und Metabolomik ist es wichtig, die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulat enthäuten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen quantitativ zu messen. Die neue Technik, in Verbindung mit Morphologie-Analyse-Software, ermöglicht es dem Forscher, die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulat und Proteinkörpern in verschiedenen Regionen des Saatguts quantitativ zu analysieren (Ergänzende Tabelle 1-4).
Obwohl die derzeitige Trockenschnittmethode den gesamten Harzabschnitt erfolgreich vorbereiten kann, hat es einige Einschränkungen und Mängel. Für den Paraffinabschnitt kann das Paraffin leicht aus dem Abschnitt entfernt werden; für den Harzabschnitt kann das Harz jedoch nicht aus dem Abschnitt entfernt werden, was zur in Harz eingebetteten Pflanzenprobe führt. Daher ist die derzeitige Vollkornharzsektion im Vergleich zum Paraffinabschnitt nicht für die Histochemie und Immunhistochemie geeignet. Darüber hinaus kann das routinemäßige Harzschnittverfahren aufgrund des Probenblocks mit geringem Volumen Proben in 0,5-2 m glatte Abschnitte schneiden. Die derzeitige Trockenschnittmethode ist jedoch schwierig, die glatten Abschnitte mit einer Dicke von weniger als 2 m vorzubereiten, insbesondere für reife Samen mit großem Volumen und hohem Stärkegehalt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Finanzierung wurde von der National Natural Science Foundation of China (32071927), dem TalentProjekt der Yangzhou University und dem Priority Academic Program Development der Jiangsu Higher Education Institutions bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
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