Summary
이 기술은 종자의 다른 지구에 있는 세포, 전분 과립 및 단백질 바디의 관측 그리고 분석을 위한 전체 종자 크기의 수지 단면도의 빠르고 간단한 준비를 허용합니다.
Abstract
종자에 있는 세포의 형태, 크기 및 양, 전분 과립 및 단백질 바디는 종자의 무게 그리고 질을 결정합니다. 그들은 씨앗의 다른 영역 중 크게 다릅니다. 세포, 전분 과립 및 단백질 신체의 형태를 명확하게 보고 형태 매개 변수를 정확하게 정량적으로 분석하기 위해서는 전체 종자 크기의 섹션이 필요합니다. 전체 종자 크기의 파라핀 섹션은 종자에서 저장 재료의 축적을 조사 할 수 있지만, 두꺼운 섹션의 낮은 해상도로 인해 세포 및 저장 재료의 형태 매개 변수를 정량적으로 분석하기가 매우 어렵습니다. 얇은 수지 섹션은 고해상도를 가지고 있지만, 일상적인 수지 단면 방법은 큰 부피 및 높은 전분 함량으로 성숙한 씨앗의 전체 종자 크기의 섹션을 준비하는 데 적합하지 않습니다. 이 연구에서는 종자 크기의 수지 섹션을 준비하기위한 간단한 건조 단면 방법을 제시합니다. 이 기술은 LR White 수지에 내장된 개발, 성숙, 발아 및 조리된 씨앗의 교차 및 세로 전체 종자 크기의 섹션을 준비할 수 있으며, 심지어 높은 전분 함량이 높은 큰 씨앗에도 사용할 수 있습니다. 전체 종자 크기의 섹션은 형광 브라이트너(28, 요오드 및 쿠마시)로 염색할 수 있으며, 특히 세포, 전분 과립 및 단백질 체의 형태를 명확하게 나타낼 수 있다. 얻어진 이미지는 또한 종자의 상이한 지역에서 세포, 전분 과립 및 단백질 체의 형태 파라미터를 보여주기 위해 정량적으로 분석될 수 있다.
Introduction
식물 씨앗은 전분과 단백질과 같은 저장 물질을 포함하고 사람들에게 에너지와 영양을 제공합니다. 셀 및 저장 재료의 모양, 크기 및 양은 종자의 무게와 품질을 결정합니다. 종자의 다른 영역에서 세포 및 저장 물질은 전분 분지 효소 IIb1의억제와 일부 높은 아밀로오스 시리얼 작물에 대한 크게 다른 형태를 가지고1,2,3. 따라서, 종자의 다른 영역에서 세포 및 저장 물질의 형태를 조사하는 것이 매우 중요하다.
파라핀 단면은 종자 크기의 전체 섹션을 제조하는 좋은 방법이며 종자4,5,6의다른 영역에서 종자의 조직 구조 및 저장 물질의축적을나타낼 수 있다. 그러나 파라핀 섹션은 일반적으로 낮은 해상도로 6-8 μm 두께를 가지며; 따라서, 세포 및 저장 물질의 형태를 명확하게 관찰하고 정량적으로 분석하는 것은 매우 어렵다. 수지 섹션은 일반적으로 1-2 μm 두께와 고해상도를 가지며 세포 및 저장 재료7의형태를 관찰하고 분석하는 데 매우 적합합니다. 그러나, 일상적인 수지 단면 방법은 전체 종자 크기의 섹션을 준비하는 데 어려움이 있다, 특히 큰 볼륨과 높은 전분 함량을 가진 씨앗; 따라서, 종자의 상이한 영역에서 세포 및 저장 물질의 형태를 관찰하고 분석할 수 있는 방법은 없다. LR 화이트 수지는 아크릴 수지이며 낮은 점도와 강한 투과성을 나타내며, 특히 대량및 높은 전분 함량의 시리얼 성숙한 커널을 위해 씨앗의 수지 섹션을 준비하는 데 좋은 응용 프로그램으로 이어집니다. 또한, LR 백색 수지에 내장된 시료는 많은 화학염료로 쉽게 염색되어 빛 또는 형광 현미경7하에서 세포 및 저장 물질의 형태를 명확하게 나타낼 수 있다. 이전 논문에서, 우리는 LR 화이트 수지에 내장 된 성숙한 시리얼 커널의 전체 종자 크기의 섹션을 준비하기위한 건조 단면 방법을보고했습니다. 이 방법은 또한 개발, 발아 및 조리 된 시리얼 커널 8의 전체 종자 크기의 섹션을 준비 할 수있습니다. 획득된 전종자 크기의 섹션은 특히 종자8,9의다른 영역에서 세포 및 저장 물질의 형태 차이를 명확하게 보고 정량적으로 분석하기 위해 미세 형태학 관찰 및 분석에서 많은 응용 을 가지고 있다.
이 기술은 빛의 현미경을 사용하여 종자의 다른 지구에 있는 조직의 미세 구조 및 세포의 모양 그리고 크기, 전분 과립 및 단백질 바디를 관찰하고 싶은 연구원을 위해 적당합니다. 세포, 전분 과립 및 단백질 바디를 전시하기 위해 특별히 염색된 전체 종자 크기의 섹션의 이미지는 형태 분석 소프트웨어에 의해 분석되어 종자의 다른 영역에서 세포, 전분 과립 및 단백질 체의 형태 학적 매개 변수를 정량적으로 측정할 수 있습니다. 기술적 적용가능성과 종자 크기의 섹션 응용 을 입증하기 위해, 우리는 옥수수와 오일 시드 강간의 성숙한 씨앗과 이 연구에서 쌀의 개발, 발아 및 조리 된 커널을 조사했습니다. 프로토콜에는 네 개의 프로세스가 포함되어 있습니다. 여기서는 대형 부피와 높은 전분 함량으로 인해 전체 종자 크기의 섹션을 준비하는 데 가장 어려운 성숙한 옥수수 커널을 단계별로 공정을 전시하는 샘플로 사용합니다.
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Protocol
1. 수지 임베디드 씨앗의 준비 (그림 1)
- 48h4°C에서 2.5%의 인산염 완충 글루타랄데히드(0.1M, pH7.2)의 10mL에서 6개의 옥수수 성숙한 커널을 수정한다. 연구원은 다른 고정 혼합물을 선택할 수 있습니다., 고정 농도, 그리고 그들의 연구 목표 및 조직 유형에 따라 고정 조건.
- 커널을 꺼내 날카로운 양면 블레이드를 사용하여 2-3mm 두께로 세로 또는 반경적으로 슬라이스하고 48h에 대해 다시 2.5 % 인산염 버퍼링 글루타랄데히드 (0.1 M, pH 7.2)의 10 mL로 고정하십시오.
- 매번 30분 동안 0.1M 인산염 버퍼(pH 7.2)의 10mL로 시료를 3회 세척한다.
- 에탄올 수성 용액(10mL)의 등급이 30%에서 50%, 70%, 90%, 1회, 매번 30분 동안 100% 3회 씩 샘플을 탈수합니다.
- 10mL에 샘플을 침투하여 에탄올로 희석된 LR 화이트 수지 용액의 등급을 25%에서 50%, 75%, 1회 100% 4°C에서 100% 2회 12시간 동안 침투한다.
- 포함하기 전에 샘플을 위해 받침대를 준비합니다. 2mL 원심분리기 튜브에 100% LR 화이트 수지의 0.25 mL을 추가하고 48h에 대해 60°C로 중합합니다.
- 순LR 화이트 수지(0.5mL)와 침투된 샘플을 받침대가 있는 원심분리기 튜브에 연속적으로 추가합니다. 해부학 바늘로 샘플을 곧게 펴고 48 h의 오븐에서 60 °C로 중합하십시오.
2. 전체 종자 크기의 섹션을 준비하기위한 건식 단면(그림 1)
- 원심분리기 튜브에서 임베디드 커널을 꺼내 날카로운 블레이드를 사용하여 샘플 주위의 과잉 수지를 잘라냅니다.
- 초미세토메(EM UC7)의 샘플 홀더에서 수지 블록을 고정하고, 샘플 표면과 블레이드로 시료 주변의 불필요한 수지에서 트림한다.
- 완전한 단면이 형성될 때까지 유리 칼로 시료표면을 미세하게 연마한다.
- 절단하기 전에 블레이드 가장자리 위에 약 2mm 작은 구리 후크를 넣고 샘플을 2 μm 섹션으로 자른다. 후크의 역할은 섹션의 위쪽으로 컬링을 피하는 것입니다.
- 섹션이 길어질 때 이를 지원하기 위해 후크를 섹션 아래에 놓습니다.
- 처리되지 않은 슬라이드에 100μL의 물을 추가하고 완전하고 부서지지 않은 부분을 핀셋으로 물로 조심스럽게 옮겼습니다.
- 주름진 부분을 부드럽게 하기 위해 밤새 50°C의 평탄식 테이블의 샘플을 가열하고 건조시합니다.
- 단면이 무너지거나 찢어지는 경우, 샘플의 각 수지 침투에 대한 시간을 12h에서 24h 또는 48h로 연장한다.
- 단면에 칼과 평행한 선이 있는 경우 샘플 블록을 단단히 고정합니다. 단면에 칼에 수직으로 된 선이 있는 경우, 새 칼을 사용해 주세요.
3. 섹션의 염색 및 관찰
참고: 세포, 전분 과립 및 단백질 신체의 조직 구조 및 형태를 관찰하기 위해 연구의 목적에 따라 특정 얼룩으로 섹션을 얼룩지게합니다. 여기서, 우리는 형광 브라이트너(28), 요오드 용액, 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 사용하여 세포벽, 전분 과립 및 단백질 바디를 각각 염색합니다.
- 세포의 형태를 관찰하기 위해, 40mL의 0.1% (w/v) 형광 브라이트너 28 수성 용액으로 45°C에서 45°C에서 염색한 다음, 5분 동안 흐르는 물로 헹구는 다. CCD 카메라가 장착된 형광 현미경으로 섹션을 관찰하고 촬영합니다.
- 전분 과립의 형태를 관찰하기 위해, 요오드 용액 40 μL (0.07 % (w /v) I2 및 0.14 % (w / v) KI를 1 분 동안 염색하고, 커버 슬립으로 요오드 용액을 포함하는 샘플을 커버한다. CCD 카메라가 장착된 가벼운 현미경으로 샘플을 보고 촬영합니다.
- 단백질 바디의 형태를 관찰하기 위해, 40mL의 10% (v/v) 아세트산으로 40mL의 아세트산을 70mL 컴팩트 유리 스테인딩 용기에 넣고 45°C에서 10분 동안 염색한 다음, 40mL에서 1%(w/v) 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 25%(v/v) 이프로포탄올과 10%(v/v)로 10%(v/v)로 담급니다. 스테인드 섹션을 흐르는 물로 5분 동안 씻고 말리십시오. CCD 카메라가 장착된 가벼운 현미경으로 섹션을 관찰하고 촬영합니다.
4. 형태 매개 변수의 정량적 분석
- Zhao 외9의 절차에 따라 형태 분석 소프트웨어(Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어)를 사용하여 종자의 다양한 영역에서 영역, 긴/짧은 축 및 세포의 원도, 전분 과립 및 단백질 체에 대한 촬영된 이미지를 정확하게 분석하고 정량적으로 분석한다.
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Representative Results
전체 종자 크기의 섹션을 얻기위한 간단한 건조 단면 방법
LR-화이트 수지(도1)에내장된 종자의 전체 종자 크기의 부분을 준비하기 위한 간단한 건식 단면 방법을 수립합니다. 이 방법은 2 μm의 두께를 가진 횡단 및 세로 전종 종자 크기의 섹션을 준비할 수있습니다(도 2-5,보충도 1-4). 예를 들어, 오일시드 강간의 성숙한 씨앗은 반경적으로 그리고 세로로 단면될 수있다(도 2). 시리얼 작물의 경우, 성숙한 커널은 전분 과립으로 가득차 있어 종자 크기의 전체 섹션을 준비하는 것이 매우 어렵습니다. 본 기술을 이용하여, 대용량으로 성숙한 옥수수의 트랜스버및 세로 전종종크기 섹션도 제조될 수있다(도 4,보충도 1). 또한, 개발커널(보충도 2),발아커널(보충도3),및 조리된 커널(보충도4)을이 방법으로 조사할 수 있다.
전체 종자 크기의 섹션의 응용 프로그램
종자의 조직 구조 관찰
전체 종자 크기의 섹션은 씨앗의 조직 구조를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 오일시드 강간의 배아는 래디클, 하이코틸, 플럼, 두 개의 코틸레돈으로 구성됩니다. 내부 및 외부 코틸레돈은 반으로 구부러져 hypocotyl 및 radicle을 감싸고 배아 구형(도2A,C)을만듭니다. 사프란으로 염색된 세로 및 트랜스버럴 전체 배아 크기의 부분은 래디클, 하이코틸, 내부 코틸레돈 및 외부 코틸레돈(도2B,D)을명확하게 나타냈다. 오일시드 강간의 세로 전체 배아 크기의 부분은 트랜스버라클 섹션보다 더 어렵게 준비됩니다. 따라서, 배아의 변형 부분은 참조5,10에서배아의 미세 형태를 조사하기 위해 널리 사용된다.
종자의 다른 지구에 있는 세포의 형태 그리고 분석
전체 종자 크기의 단면은 종자의 다른 영역에서 세포의 형태를 관찰하고 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 유종자 강간의 전배식 크기의 부분은 형광 브라이트너(28)로 염색되었고, 세포벽은 구체적으로 염색하였다(도3A). 배아의 어떤 지구에 있는 세포의 미세 형태학은 높은 배율에서 명확하게 표시될 수 있었습니다(도 3B,C). 방사형은 표피, 피질 및 혈관 조직으로 구성됩니다. 방사형의 가장 바깥층에 위치한 표피 세포는 직사각형과 복사배열하였다. 피질 빈충종 세포는 모양이 둥글고 크기가 컸다. 피질 세포 사이에 는 몇 가지 뚜렷한 공간이 관찰되었다. 피질 세포는 안쪽에서외부(도 3B)로층으로 배열하였다. 코틸레돈의 표피 세포는 정사각형이었고 작은 부피를 가졌다. 내부 및 외부 코틸레돈의 외부 표면과 내부 표면 중 표피 세포의 모양과 크기에는 큰 차이가 없었습니다. 일부 혈관 실린더는 내외부 코틸레돈의 중피 조직 중간에 흩어져 있었다. 메소필 parenchyma 세포는 코틸레던에 있는 표피 세포 및 혈관 실린더 세포 보다는 상당히 더 컸습니다. 메소필 parenchyma 세포는 외부 코틸레돈의 내부 영역과 내부 코틸레돈의 외부 영역에서 전형적인 palisading 배열을 보였다(도 3C). 당면증 세포는 태아의 다른 지구에 있는 현저하게 다른 형태를 가졌습니다. 형태학의 차이를 밝히기 위해, 영역 1, 2, 3, 4 및 5는 방사형 피질 조직, 내부 코틸레돈의 내부 영역, 내부 코틸레돈의 외부 영역, 외부 코틸레돈의 내부 영역 및 외부 코틸레돈의 외부 영역에서 각각 선택되었다(도3B,C). 상기 5개 영역에서 의 당내 세포의 형태학적 파라미터는 형태 분석소프트웨어(보충표 1)를사용하여 정량적으로 분석하였다. 영역, 긴 축 길이, 짧은 축 길이 및 빈혈세포의 원도는 배아의 다른 지역에 있는 몇몇 다름을 보여주었습니다.
내정자의 세포는 전분과 저장 단백질로 가득 찼습니다. 전체 종자 크기의 수지 섹션을 사용하여, 내정자의 다른 영역에서 세포를 관찰하고 분석하기 쉽다. 예를 들어, 옥수수 내정자의 임의의 영역에서 세포의 형태는 형광 브라이트너(28)로 전종전종구형 섹션이 염색된 후 명확하게 볼 수 있었다. 동일한 커널의 주변, 중간 및 중앙 내정자는 세포의 모양과 크기가 현저히 상이한 것으로나타냈다(보충도 1). 내정자의 상이한 영역에서 세포의 형태 학적 매개 변수를 정량적으로 분석하기 위해, 영역의 이미지는 형태 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었다; 세포의 형태 매개 변수는 보충 표 2에제시된다. 지역 1의 내정자 세포는 4개의 지역 중 가장 작은 지역을 가지고 있었고, 지역 2에 있는 세포는 지역 3에 있는 그 보다는 더 컸습니다, 그러나 지역 4에 있는 그 보다는 더 작습니다.
종자의 다른 지역에서 전분 과립의 형태학 및 분석
대부분의 식물 자원에서 성숙한 씨앗, 특히 시리얼 작물에 대 한, 높은 전분 콘텐츠를 포함. 전분의 과립 형태와 크기는 전분 속성에 중요한 영향을 미칠 씨드의 품질에 역할을한다. 종자의 수지 섹션은 종자의 다른 영역에서 전분 과립의 형태를 나타내기 위해 요오드 용액으로 얼룩질 수 있습니다. 예를 들어, 옥수수의 종자 및 종자 크기의 횡단 및 종자 크기의 섹션이 성공적으로 준비되었다. 요오드로 얼룩진 부분은 전분의 형태를 나타내었다(도4). 내정자의 상이한 영역에서 전분 과립의 형태를 나타내기 위해, 4개의 영역과 9개의 지역은 각각 트랜스버및 세로 전종구 형 섹션에서 선택되었다(도4). 다른 지구에 있는 전분 과립은 내정자 세포에 있는 현저하게 다른 형태, 크기 및 양을 보여주었습니다. 횡단 구간의 경우, 지역 1은 구형 전분 과립이 있고, 지역 2에는 다각형 과립이 있었고, 양 지역에서 전분 과립은 구형이었다. 경도 구간의 경우, 1, 4, 5, 8지역에서 다각형 형상을 가진 전분 과립은 3, 7, 9 지역에서 구형 형상을 가진 분과립과, 일부 복합 전분 과립은 2및 6 지역에서 관찰되었다.
전분 과립의 형태학적 매개변수의 정량적 분석은 제4개의 트랜스버라이섹션에서 3개의 보충표에나타났다. 지역 1의 전분 과립은 크기가 가장 작고, 지역 2의 과립은 가장 큰 크기였으며, 3지역은 지역 4보다 더 컸다.
종자의 다른 지구에 있는 단백질 바디의 미세 형성 학 그리고 분석
높은 저장 단백질을 가진 전체 종자 크기의 단면은 종자의 다른 지구에 있는 단백질 바디의 형태를 왜곡하고 분석하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 오일시드 강간의 배아의 트랜스버셜 부분은 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색되었고, 저장 단백질은파란색(도 5)으로염색되었다. 배아내 저장 단백질의 공간 분포는 낮은 배율(도5A)에서명확하게 관찰될 수 있다. 저장 단백질은 단백질 본체에 존재합니다. 높은 배율에서, 단백질 본체는 일부 검은 과립과 일부 얼룩지지 않은 투명 구조(도 5B)와이질성 매트릭스를 나타냈다. 종자에 있는 단백질 바디는 3개의 모형이 있습니다: 제 1 모형은 균일한 단백질 매트릭스로 이루어져 있고 아무 포함도 없고, 두 번째 모형은 구형 결정을 포함하고, 제 3 모형은 구형 결정 및 의사 결정(11)를포함합니다. 단백질 본문에 있는 구형 결정은 염색되지 않는 파이테이트 및 그밖 무기 염으로 이루어질 것입니다. 이 구형 결정은 빛이 현미경의 밑에 그(것)들을 통과할 수 없기 때문에 검은 색입니다. 또한 구형 결정은 고착 및 임베딩 제에 의해 침투하기 어렵고 깨지기 쉽습니다. 단면을 만들 때 구형 결정이 파열되어 단백질본체(11)의내부의 투명한 캐비티가 생긴다. 유화유배아의 단백질 본체는 그 마이크로모프론에 따른 구체성 결정을 함유하였다(도5B). 배아에서 단백질 체의 공간 분포를 조사하기 위해, 전체 배아 크기의 섹션에서 5개의 영역이 방사형 피질 조직, 내부 코틸레돈의 내부 영역, 내부 코틸레돈의 외부 영역, 외부 코틸레돈의 내부 영역, 및 외부 코틸레돈(그림5A,C-G)의외부 영역을 나타내도록 선택되었다. 배아의 모든 영역에서 단백질 바디는 구형, 타원, 및 모양불규칙하였다(도5C-G).
상기 선택된 5개 부위에서 표피에 가까운 제1 및 제2 평상피세포에서 단백질 체의 정량적 분석은 보충표 4에제시된다. 단백질 본체의 영역은 선택된 5개 지역 중 약간의 차이가 있었다. 단백질 본체의 둥글림은 다른 4개 부위보다 외부 코틸레돈의 외측 영역에서 현저히 낮았으며, 외부 코틸레돈의 단백질 본체가 구체에 가까웠음을 나타낸다. 세포내 단백질 본체의 수와 면적 지수는 코틸레돈 내당파세포(보충표 4)보다래디클 파렌치마 세포에서 상당히 높았다.
그림 1: 건식 단면법을 사용하여 전체 종자 크기의 수지 반박 섹션의 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 오일시드 유채품종 화상5의 성숙한 종자에서 배아의 조직 구조. (a)배아의 형태. (B)경도 전체 배아 크기의 섹션의 조직 구조. (C)트랜스버사 전체 배아 크기의 섹션의 형태. (D)트랜스버 전체 배아 크기의 섹션의 조직 구조. 섹션은 사프란으로 얼룩졌다. H, hypocotyl; IC, 내부 코틸레던; OC, 외부 코틸레던; R, 래디클. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유화의 배아에서 세포의 형태학 다양한 화상 5. (A)형광 브라이트너(28)로 염색된 트랜스버사 전신 배아 크기의 단면. (B)영역 B의 증폭(A),방사형의 세포 형태 및 조직 구조를 보여주는. (C)내외부 코틸레돈의 세포 형태 및 조직 구조를 보여주는(A)에서영역 C의 증폭. 스케일 바 = 500 μm(A)및 100 μm(B, C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 옥수수 품종 정(58)의 성숙한 커널에서 전분 과립의 형태. 트랜스버사(A) 및 종로(B) 전종자 크기의 섹션은 요오드 용액으로 염색되었고, 이들의 지역 증폭은 내정자의 다른 영역에서 전분 과립의 형태를 나타낸다. 스케일 바 = 전체 종자 크기의 섹션의 경우 1mm, 지역 증폭을 위한 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 오일시드 유채품종 화상 5의 배아에서 단백질 체의 형태학. (A)쿠마시 화려한 블루 R250으로 염색된 트랜스버사 전신 배아 크기의 섹션. (B)단백질 바디의 증폭, 그들의 미세 구조를 보여주는. (C-G) 영역 C-G in(A),의증폭은, 방사형(C), 내부코틸레돈(D),외부 코틸레돈의 외부영역(E),외부 코틸레돈(F), 외부 코틸레돈의 외부영역(G)에서단백질 체체의 형태를 보여준다. 스케일 바 = 500 μm(A),5 μm(B)및 50 μm(C-G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 옥수수 품종 정(58)의 성숙한 커널에서 세포의 형태학. 전종종전형 단면은 형광브라이트너(28)로 염색되었고, 지역 증폭(1-4)은 내정자의 다른 영역에서 내정자 세포의 형태를 나타낸다. 스케일 바 = 전체 종자 크기의 섹션의 경우 1mm, 지역 증폭을 위한 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 쌀 품종 의 커널 개발의 형태 9311. 꽃 후 다른 일에 트랜스 버사 전종 크기의 섹션 (DAF) 사프란 O와 요오드 용액으로 대응했다. 스케일 바 = 0.5mm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 쌀 품종 Te-qing의 발아 커널의 형태. imbibition 후 8 일에서 종로 전체 종자 크기의 섹션은 정기적 인 산 - 쉬프및 톨루이딘 블루 O로 대응되었으며, 지역 증폭은 종자의 다른 영역에서 내정자의 형태 변화를 나타낸다. 스케일 바 = 20 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 쌀 품종 Te-qing의 조리 커널의 형태. 전종종전형 구간은 요오드 용액으로 염색되었고, 외측, 중간 및 내부 영역 증폭은 0, 10, 20 및 30분 동안 조리 과정에서 종자에서 전분의 형태 변화를 나타낸다. 스케일 바 = 20 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 유씨 유채 배아의 다른 영역에서 세포의 형태 매개변수는이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
a 데이터는 표준 편차(n = 3)± 의미하며, 서로 다른 문자를 가진 동일한 열의 값은 상당히 다르다(p&05).
b 영역은 그림 3B,C에표시됩니다.
c LAL: 긴 축 길이; SAL: 짧은 축 길이; 원등도: (경계 2)/(4×π×area).
보충 표 2: 옥수수 내정자의 다른 영역에서 세포의 형태 매개변수는이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
a 데이터는 표준 편차(n = 3)± 의미합니다. 문자가 다른 동일한 열의 값은 크게 다릅니다(p< 0.05).
b 영역은 보충 도 1에서옥수수 커널의 횡단 섹션에 표시됩니다.
c LAL: 긴 축 길이; SAL: 짧은 축 길이; 원등도: (경계 2)/(4×π×area).
보충 표 3: 옥수수 내정자의 다른 지역에서 전분 과립의 형태 매개변수는이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
a 데이터는 표준 편차(n = 3)± 의미합니다. 문자가 다른 동일한 열의 값은 크게 다릅니다(p< 0.05).
b 영역은 그림 4A에서옥수수 커널의 횡단 섹션에 표시됩니다.
c LAL: 긴 축 길이; SAL: 짧은 축 길이; 원등도: (경계 2)/(4×π×area).
보충 표 4: 오일시드 강간 배아의 다른 영역에서 단백질 신체의 형태 매개변수는이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
a 데이터는 표준 편차(n = 3)± 의미하며, 서로 다른 문자를 가진 동일한 열의 값은 상당히 다르다(p&05).
b 영역은 그림 5에표시됩니다.
c 원등도: (경계 2)/(4×π×지역); 면적 지수는 단백질 체내세포에 대한 면적 비율이다.
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Discussion
씨앗은 식품, 사료 및 산업 원료에 가장 중요한 재생 가능한 자원이며 전분 및 단백질과 같은 저장 재료가 풍부합니다. 세포의 형태와 수량 및 저장 재료의 함량 및 구성은 종자7,12의무게와 품질에 영향을 미친다. 입체 및 이미지 분석 기술은 조직 지구에 있는 세포의 규모 그리고 양을 측정할 수 있더라도, 많은 실험실에서 부족합니다. 파라핀 과 수지 섹션은 2차원 (2D) 그림을 제공하여 세포의 실제 크기와 양을 분석할 방법이 없습니다. 그러나, 세포는 임의의 평면에서 무작위로 절단되며, 조직 영역의 적어도 3개의 상이한 섹션에서 많은 세포(100 이상)의 평균 크기는 세포의 2D 형태 매개변수(길이, 폭 및 면적)를 반영할 수 있으며, 선택된 영역 영역의 비율은 세포 영역을 의미하는 세포의 양을 반영할 수 있다. 따라서, 종자의 상이한 영역에서 세포 및 저장 물질의 형태를 관찰하고 분석하는 것이 매우 중요하다. 파라핀 섹션은 전체 종자 크기의 섹션을 준비하는 데 가장 적합하며, 특히 큰 크기의 씨앗7에적합합니다. 그러나, 세포는 종자 발달을 가진 저장 재료로 가득차 있어, 후기 개발 종자와 성숙한 씨앗으로부터 좋은 전체 종자 크기의 섹션을 얻는 것이 매우 어렵다는 것을 이끌어 냅니다. 또한, 파라핀 섹션은 형태학을 명확하게 나타내기에는 너무 두껍고 종자7의조직 구조를 조사하기에만 적합합니다.
수지 섹션은 얇고 세포, 전분 과립 및 단백질 체의 형태를 명확하게7을나타낼 수 있다. 그러나, 일상적인 수지는 전체 종자 크기의 섹션에 적합하지 않습니다. 여기에 제시된 기술은 광 현미경을 사용하여 종자의 다른 영역에서 세포의 형태, 전분 과립 및 단백질 체의 형태를 보기 위한 수지에 내장된 성숙한 씨앗의 트랜스버및 세로 전종 크기의 섹션을 준비하는 것으로 빠르고 간단하며 예리한 접근법을나타낸다(그림 2-5,보충도 1). 또한, 이 기술은 또한 종자의 다른 지역에서 세포, 전분 및 단백질 체의 형태 변화를 조사하기 위해 개발, 발아 및 조리된 씨앗의 섹션을 준비할 수 있다.
이 기술이 제공하는 또 다른 뚜렷한 장점은 전체 종자 크기의 섹션의 적용입니다. 현상전증과 메타볼로믹스의 새로운 시대에, 종자의 다른 지구에 있는 세포, 전분 과립 및 단백질 바디의 형태 매개변수를 정량적으로 측정하는 것이 중요합니다. 새로운 기술은 형태 분석 소프트웨어와 함께, 연구원이 종자의 다른 지역에서 세포, 전분 과립 및 단백질 바디의 형태 학적 매개 변수를 정량적으로 분석 할 수 있습니다(보충 표 1-4).
현재의 건식 단면화 방법은 전체 종자 크기의 수지 섹션을 성공적으로 준비할 수 있지만 몇 가지 제한 사항과 단점이 있습니다. 파라핀 섹션의 경우 파라핀을 섹션에서 쉽게 제거할 수 있습니다. 그러나 수지 섹션의 경우 수지 섹션에서 수지를 제거 할 수 없으므로 수지에 내장 된 식물 샘플로 이어집니다. 따라서, 파라핀 섹션과 비교하여, 현재의 전체 종자 크기의 수지 섹션은 히스토케미및 면역히스토케를 수행하기에 적합하지 않다. 또한, 일상적인 수지 단면화 방법은 소량의 시료 블록으로 인해 샘플을 0.5-2 μm 의 매끄러운 섹션으로 절단할 수 있다. 그러나 현재의 건식 단면 방법은 두께가 2 μm 미만인 매끄러운 단면을 준비하기가 어렵고, 특히 큰 부피와 높은 전분 함량을 가진 성숙한 씨앗을 위해.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
기금은 중국 국립 자연과학 재단(32071927), 양주대학교 인재프로젝트, 장쑤고등교육기관의 우선학술프로그램 개발등을 통해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
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