Summary
هذه التقنية تسمح لإعداد سريع وبسيط من قسم الراتنج كامل الحجم البذور لمراقبة وتحليل الخلايا، وحبيبات النشا، والهيئات البروتين في مناطق مختلفة من البذور.
Abstract
المورفولوجيا، وحجم وكمية من الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في البذور تحديد وزن ونوعية البذور. وهي تختلف اختلافا كبيرا بين مناطق مختلفة من البذور. من أجل عرض morphologies من الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتين بوضوح ، وتحليل كميا المعلمات المورفولوجيا بدقة ، وهناك حاجة إلى قسم البذور كلها الحجم. على الرغم من أن قسم البارافين بالبذور الكاملة يمكن أن يحقق في تراكم مواد التخزين في البذور ، إلا أنه من الصعب جدًا تحليل بارامترات المورفولوجيا للخلايا ومواد التخزين نظرًا لدقة منخفضة للقطعة السميكة. يحتوي قسم الراتنج الرقيق على دقة عالية ، ولكن طريقة تقسيم الراتنج الروتينية ليست مناسبة لإعداد القسم الكامل بحجم البذور من البذور الناضجة مع حجم كبير ومحتوى كبير من النشا. في هذه الدراسة، نقدم طريقة بسيطة للقطع الجاف لإعداد قسم الراتنج الكامل بحجم البذور. يمكن لهذه التقنية إعداد المقاطع الشاملة الحجمة للبذور الكاملة المتقاطعة والطولية من البذور النامية والناضجة والمبتوتة والمضمروسة في راتنج LR White ، حتى بالنسبة للبذور الكبيرة ذات المحتوى العالي من النشا. يمكن أن يكون مقطع كامل بحجم البذور ملطخة مع الفلورسنت 28، اليود، وCoomassie الأزرق الرائع R250 ليعرض على وجه التحديد مورفولوجيا الخلايا وحبيبات النشا، والهيئات البروتين بوضوح، على التوالي. ويمكن أيضا أن يتم تحليل الصورة التي تم الحصول عليها كميا لإظهار المعلمات مورفولوجيا الخلايا، وحبيبات النشا، والهيئات البروتين في مناطق مختلفة من البذور.
Introduction
تحتوي البذور النباتية على مواد تخزين مثل النشا والبروتين وتوفر الطاقة والتغذية للناس. يحدد شكل وحجم وكمية الخلايا ومواد التخزين وزن ونوعية البذور. الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور لها morphologies مختلفة بشكل ملحوظ، وخاصة بالنسبة لبعض المحاصيل الحبوب عالية amylose مع تثبيط النشا المتفرعة إنزيم IIb1،2،3. لذلك ، من المهم جدًا التحقق من الصفات المورفورة للخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور.
البارافين هو طريقة جيدة لإعداد الجزء الكامل البذور الحجم ويمكن أن يعرض هيكل الأنسجة من البذور وتراكم مواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور4،5،6. ومع ذلك، فإن أقسام البارافين عادة ما يكون 6-8 μm سمك مع دقة منخفضة؛ وبالتالي ، فمن الصعب جدا أن نلاحظ بوضوح وتحليل كمي مورفولوجيا من المواد الخلية والتخزين. أقسام الراتنج وعادة ما يكون 1-2 μm سمك ودقة عالية ومناسبة جدا لمراقبة وتحليل مورفولوجيا من مواد الخلية والتخزين7. ومع ذلك، فإن طريقة تقسيم الراتنجات الروتينية تواجه صعوبة في إعداد القسم الكامل بحجم البذور، وخاصة بالنسبة للبذور ذات الحجم الكبير والمحتوى العالي من النشا؛ وهكذا، لا توجد طريقة لمراقبة وتحليل مورفولوجيا الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور. LR الراتنج الأبيض هو راتنج الاكريليك والمعارض اللزوجة المنخفضة والنفاذية القوية، مما يؤدي إلى تطبيقاته جيدة في إعداد قسم الراتنج من البذور، وخاصة بالنسبة الحبوب الحبوب ناضجة حبات مع حجم كبير وارتفاع محتوى النشا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون ملطخة العينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج الأبيض LR بسهولة مع العديد من الأصباغ الكيميائية لعرض بوضوح مورفولوجيا من الخلايا ومواد التخزين تحت ضوء أو المجهر الفلورسنت7. في ورقتنا السابقة، أبلغنا عن طريقة اقسام جافة لإعداد الأجزاء الكاملة بحجم البذور من حبات الحبوب الناضجة المضمنة في راتنج LR White. ويمكن لهذه الطريقة أيضا إعداد الجزء الكامل من البذور الحجم من تطوير، والنباتة والمطبوخة نواة الحبوب8. تم الحصول على كامل البذور الحجم القسم لديها العديد من التطبيقات في مجال الرصد والتحليل micromorphology ، وخاصة بالنسبة للعرض بوضوح وتحليل كمي الاختلافات في مورفولوجيا الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور8،9.
هذه التقنية مناسبة للباحثين الذين يرغبون في مراقبة البنية المجهرية للأنسجة وشكل وحجم الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور باستخدام المجهر الخفيف. يمكن تحليل صور الأجزاء الكاملة بحجم البذور الملطخة خصيصًا لثناء الخلايا المعرضة وحبيبات النشا والهيئات البروتينية بواسطة برنامج تحليل المورفولوجيا لقياس المعلمات المورفولوجية للخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور. من أجل إظهار التطبيق التقني وتطبيقات القسم الكامل الحجم بالبذور ، قمنا بالتحقيق في البذور الناضجة من الذرة والبذور النباتية والاغتصاب وزراعة ، والنبات ، والحبوب من الأرز المطبوخ في هذه الدراسة. يحتوي البروتوكول على أربع عمليات. هنا، ونحن نستخدم نواة الذرة الناضجة، والتي هي الأكثر صعوبة في إعداد أقسام البذور الحجم كله بسبب حجم كبير وارتفاع محتوى النشا، كعينة لعرض العمليات خطوة بخطوة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- إعداد بذور الراتنج المضمّنة (الشكل 1)
- إصلاح ست حبات ناضجة الذرة في 10 مل من 2.5٪ من الغلوتارالدهيد الفوسفات المخزنة (0.1 M، pH7.2) في 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. يمكن للباحثين اختيار الخلائط تثبيت أخرى، وتركيزات التثبيت، وظروف التثبيت وفقا لأهداف أبحاثهم وأنواع الأنسجة.
- أخرج حبات وشريحة لهم طوليا أو عرضية إلى 2-3 ملم سمك باستخدام شفرة حادة مزدوجة الجانب، وإصلاحها في 10 مل من 2.5٪ من الغلوتارالدهيد الفوسفات المخزنة (0.1 M، pH 7.2) مرة أخرى لمدة 48 ساعة.
- غسل العينات ثلاث مرات مع 10 مل من 0.1 M العازلة الفوسفات (pH 7.2) لمدة 30 دقيقة في كل مرة.
- يجفف العينات في زيادة درجات من محلول الإيثانول مائي (10 مل) من 30% إلى 50%, 70%, 90% مرة واحدة, و 100% ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في كل مرة.
- التسلل إلى العينات في 10 مل زيادة درجات من LR الأبيض راتنج حل المخفف مع الإيثانول من 25٪ إلى 50٪، 75٪ مرة واحدة، و 100٪ مرتين في 4 درجة مئوية ل12 ح في كل مرة.
- إعداد الرواد للعينات قبل التضمين. إضافة 0.25 مل من 100٪ LR الراتنج الأبيض في أنبوب الطرد المركزي 2-مل، وبلمرة عليه في 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- على التوالي إضافة نقية LR الراتنج الأبيض (0.5 مل) والعينة تسللت إلى أنبوب الطرد المركزي مع قاعدة. قم بتقويم العينات باستخدام الإبرة التشريحية، وإضفاء البلمرة عليها عند 60 درجة مئوية في الفرن لمدة 48 ساعة.
2. القطاعات الجافة لإعداد كامل البذور الحجم القسم (الشكل 1)
- أخرج حبات مدمجة من أنبوب الطرد المركزي وقطع الراتنج الزائد حول العينة باستخدام شفرة حادة.
- المشبك كتلة الراتنج في حامل العينة من ultramicrotome (م UC7)، وتقليم قبالة الراتنج زائدة عن الحاجة على سطح العينة وحول العينة مع شفرة.
- البولندية سطح العينة بدقة مع سكين الزجاج حتى يمكن تشكيل مقطع كامل.
- وضع خطاف نحاسي صغير حوالي 2 مم فوق حافة النصل قبل قطع العينة وقطعها إلى قسم 2 ميكرومتر. دور هوك هو تجنب الشباك صعودا من القسم.
- وضع ربط تحت المقطع لدعمه عندما يصبح المقطع طويل.
- أضف 100 ميكرولتر من الماء على شريحة غير مُهدّمة، ونقل بعناية القسم الكامل وغير المنقطع إلى الماء مع الملاقط.
- من أجل تخفيف القسم التجاعيد، والحرارة وتجفيف العينة على طاولة التسوية في 50 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إذا انهار القسم أو الدموع، تمديد الوقت لكل تسلل الراتنج من العينة من 12 ح إلى 24 ساعة أو 48 ساعة.
- إذا كان القسم لديه بعض خطوط موازية للسكين، المشبك كتلة عينة بإحكام. إذا كان القسم يحتوي على بعض الخطوط العمودية إلى السكين، يرجى استخدام سكين جديدة.
3- تلطيخ القسم ومراقبته
ملاحظة: من أجل مراقبة بنية الأنسجة ومورفولوجيا الخلايا وحبيبات النشا، والهيئات البروتينية، وصمة عار المقاطع مع بقع محددة وفقا لغرض البحث. هنا، ونحن نستخدم الفلورسنت 28، محلول اليود، وCoomassie الأزرق الرائع R250 لطخة جدران الخلية، حبيبات النشا، والهيئات البروتين، على التوالي.
- لمراقبة مورفولوجيا الخلايا، وصمة عار القسم مع 40 مل من 0.1٪ (ث / الخامس) الفلورسنت المضيء 28 محلول مائي في 70 مل الزجاج المضغوط تلطيخ جرة في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ومن ثم شطفه بالماء الجاري لمدة 5 دقائق. مراقبة وتصوير القسم تحت مجهر الفلوريسكين مجهز بكاميرا CCD.
- لمراقبة مورفولوجيا حبيبات النشا، وصمة عار القسم مع 40 ميكرولتر من محلول اليود (0.07٪ (ث / الخامس) أنا2 و 0.14٪ (ث / الخامس) KI في 25٪ (الخامس / الخامس) الجلسرين) لمدة 1 دقيقة، وتغطي العينة التي تحتوي على محلول اليود مع يغطي. عرض وتصوير العينة تحت مجهر خفيف مزود بكاميرا CCD.
- لمراقبة مورفولوجيا أجسام البروتين، غمر القسم مع 40 مل من 10٪ (v/v) حمض الخليك في 70 مل من الزجاج المضغوط تلطيخ جرة لمدة 10 دقيقة في 45 درجة مئوية، ثم وصمة عار في 40 مل من 1٪ (ث / الخامس) Coomassie الأزرق الرائع R250 في 25٪ (V/ الخامس) ايزوبروبانول و 10٪ (الخامس / الخامس) حمض الخليك لمدة 15 دقيقة في 45 درجة مئوية. غسل المقاطع الملطخة بالماء الجاري لمدة 5 دقائق، وتجفيفه. مراقبة وتصوير القسم تحت مجهر خفيف مزود بكاميرا CCD.
4- التحليل الكمي لبارامترات المورفولوجيا
- عملية وتحليل كمي للصور التي تم تصويرها للمنطقة، والمحور الطويل / القصير، و roundness من الخلايا، وحبيبات النشا، والهيئات البروتين في مناطق مختلفة من البذور باستخدام برنامج تحليل مورفولوجيا (صورة برو زائد 6.0 البرمجيات) بعد إجراءات تشاو وآخرون9 بالضبط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طريقة بسيطة للقطع الجاف للحصول على قسم بذرة كاملة الحجم
نحن ننشئ طريقة بسيطة للقطع الجافة لإعداد قسم بذرة كاملة الحجم من البذور المضمنة في راتنج LR-أبيض (الشكل 1). ويمكن أن الطريقة إعداد المقاطع عرضية وطولانية كاملة البذور الحجم مع سمك 2 μm(الشكل 2-5، الشكل التكميلي 1-4). على سبيل المثال، يمكن تقسيم البذور الناضجة من الاغتصاب بذرة زيتية عرضية وطولية(الشكل 2). بالنسبة لمحاصيل الحبوب، فإن حباتها الناضجة مليئة حبيبات النشا، مما يؤدي إلى أنه من الصعب جداً في إعداد القسم الكامل بحجم البذور. وباستخدام التقنية الحالية، يمكن أيضاً إعداد الأجزاء المُستعرضة والطولية الكاملة الحجم من الذرة الناضجة ذات الحجم الكبير(الشكل 4،الشكل التكميلي 1). وبالإضافة إلى ذلك، فإن النواة النامية(الشكل التكميلي 2)،والنواة المبتغى(الشكل التكميلي 3)،والنواةالمطبوخة (الشكل التكميلي 4)من الأرز يمكن التحقيق باستخدام الطريقة.
تطبيقات القسم الكامل الحجم بالبذور
مراقبة بنية الأنسجة من البذور
يمكن استخدام القسم الكامل بحجم البذور لمراقبة بنية الأنسجة من البذور. على سبيل المثال، يتكون جنين الاغتصاب ببذور زيتية من الشعاع، والهويدوليتل، والبلومول، واثنين من كوتيليدون. وcoyledons الداخلية والخارجية عازمة في النصف، والتفاف هيموكوتيل وشعاع وجعل الجنين كروية (الشكل 2A، C). عرضت المقاطع الطولية والمستعرضة كاملة الجنين الحجم الملطخة مع صفراnin بوضوح الشعاع، hypocotyl، كوتيليدون الداخلية، وكوتيليدون الخارجي(الشكل 2B،D). يتم إعداد القسم الطولي الكامل للجنين من اغتصاب ببذورة الزيت أكثر صعوبة من القسم العرضي. ولذلك ، فإن الأجزاء العرضية من الأجنة تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في ميكرومورفولوجيا الأجنة في المراجع5،10.
مورفولوجيا وتحليل الخلايا في مناطق مختلفة من البذور
يمكن استخدام القسم الكامل بحجم البذور لمراقبة وتحليل مورفولوجيا الخلايا في مناطق مختلفة من البذور. على سبيل المثال، كانت الأجزاء المُعَرَرة كاملة الحجم من زراعة الحبوب الزيتية ملطخة بـ 28 من الفلورسنت، وكانت جدران الزنزانات ملطخة على وجه التحديد(الشكل 3A). يمكن عرض المجهرية للخلايا في أي مناطق من الجنين بوضوح في التكبير عالية(الشكل 3B،C). يتكون الشعاع من البشرة والقشرة والأنسجة الوعائية. كانت الخلايا البشرة الموجودة في الطبقة الخارجية من الشعاع مستطيلة ومرتبة شعاعياً. كانت خلايا البارينشيما القشرية مستديرة الشكل وكبيرة في الحجم. لوحظت بعض المسافات المميزة بين الخلايا القشرية. تم ترتيب الخلايا القشرية في طبقات من الداخل إلى الخارج(الشكل 3B). كانت خلايا البشرة من كوتيليدون مربعة وكان حجم صغير. لم تكن هناك اختلافات كبيرة في شكل وحجم الخلايا البشرة بين الأسطح الخارجية والداخلية من كوتيليدونات الداخلية والخارجية. وتناثرت بعض اسطوانات الأوعية الدموية في وسط أنسجة ميسوفيلي من كوتيليدونات الداخلية والخارجية. كانت خلايا ثنائي التكافؤ أكبر بكثير من خلايا البشرة وخلايا أسطوانة الأوعية الدموية في كوتيليدون. وأظهرت خلايا الـ mesophyll parenchyma ترتيب باليسادينج نموذجي في المنطقة الداخلية من كوتيليدون الخارجي والمنطقة الخارجية من كوتيليدون الداخلية (الشكل 3C). كان لخلايا البارينتشيما عقائد مختلفة بشكل كبير في مناطق مختلفة من الجنين. من أجل الكشف عن الاختلافات في مورفولوجيا، تم اختيار المناطق 1، 2، 3، 4، و 5 في الأنسجة القشرية radicle، المنطقة الداخلية من كوتيليدون الداخلية، والمنطقة الخارجية من كوتيليدون الداخلية، والمنطقة الداخلية من كوتيليدون الخارجي، والمنطقة الخارجية من كوتيليدون الخارجي، على التوالي (الشكل 3B،C). تم تحليل المعلمات مورفولوجيا خلايا parenchyma في المناطق 5 أعلاه كميا باستخدام برمجيات تحليل مورفولوجيا (الجدول التكميلي 1). وأظهرت المنطقة، وطول المحور الطويل، وطول المحور القصير، و استدارة خلايا البارينشيما بعض الاختلافات في مناطق مختلفة من الأجنة.
كانت الخلايا في إندوسبيرم مليئة بالنشاء والبروتين التخزيني. باستخدام قسم الراتنج بذرة كاملة الحجم، فمن السهل في مراقبة وتحليل الخلايا في مناطق مختلفة من endosperm. على سبيل المثال، يمكن رؤية مورفولوجيا الخلايا في أي مناطق من إندوسبيرم الذرة بوضوح بعد أن كانت الأجزاء المُعَدَّرة كاملة الحجم ملطخة بالمشرق الفلوري 28. عرضت endosperms الطرفية والوسطى والمركزية في نفس النواة أشكال وأحجام مختلفة بشكل ملحوظ من الخلايا(الشكل التكميلي 1). من أجل تحليل كمي المعلمات مورفولوجية الخلايا في مناطق مختلفة من endosperm، تم تحليل الصور من المناطق باستخدام برمجيات تحليل مورفولوجيا. يتم عرض معلمات مورفولوجيا الخلايا في الجدول التكميلي 2. وكانت خلايا إندوسبيرم في المنطقة 1 أصغر منطقة بين أربع مناطق، وكانت تلك الموجودة في المنطقة 2 أكبر من تلك الموجودة في المنطقة 3، ولكنها أصغر من تلك الموجودة في المنطقة 4.
مورفولوجيا وتحليل حبيبات النشا في مناطق مختلفة من البذور
تحتوي البذور الناضجة من معظم الموارد النباتية، وخاصة بالنسبة لمحاصيل الحبوب، على نسبة عالية من النشا. مورفولوجيا الحبيبات وحجم النشا لها آثار هامة على خصائص النشا وتلعب دورا في نوعية البذور. يمكن أن يكون مقطع الراتنج من البذور ملطخة مع محلول اليود ليعرض مورفولوجيا حبيبات النشا في مناطق مختلفة من البذور. فعلى سبيل المثال، تم إعداد الأجزاء المُناَعَرة والطولية الكاملة الحجم من الذرة. عرضت المقاطع الملطخة باليود مورفولوجيا النشا (الشكل 4). من أجل إظهار مورفولوجيا حبيبة النشا في مناطق مختلفة من إندوسبيرم، تم اختيار المناطق الأربع والمناطق التسع في المقاطع العرضية والطولية كاملة الحجم البذور، على التوالي (الشكل 4). وأظهرت حبيبات النشا في مناطق مختلفة بشكل كبير مورفولوجيا مختلفة، وحجم وكمية في خلايا إندوسبيرم. أما بالنسبة للقسم المتناظر، فإن المنطقة 1 كانت بها حبيبات نشا كروية، وكان في المنطقة 2 حبيبات مضلعة، وحبيبات النشا في المنطقتين 3 و4 كروية. بالنسبة للقسم الطولي، كانت حبيبات النشا ذات الشكل المضلع في المناطق 1 و4 و5 و8 أكبر من تلك التي لها شكل كروي في المناطق 3 و7 و9، ولوحظت بعض حبيبات النشا المركبة في المناطق 2 و6.
وقد تم عرض التحليل الكمي للبارامترات المورفولوجية حبيبات النشا في أربع مناطق من القسم العرضي في الجدول التكميلي 3. وكانت حبيبات النشا في المنطقة 1 أصغر حجماً، أما حبيبات المنطقة 2 فأكبر حجم لها، أما في المنطقة 3 فأكبر منها في المنطقة 4.
المجهرية وتحليل أجسام البروتين في مناطق مختلفة من البذور
يمكن استخدام القسم الكامل بحجم البذور مع بروتين تخزين عال لـ اغد وتحليل مورفولوجيا أجسام البروتين في مناطق مختلفة من البذور. على سبيل المثال، كان مقطع عرضية من الجنين من اغتصاب ببذرة زيتية ملطخة مع Coomassie الأزرق الرائع R250، وكان البروتين تخزين ملطخة الأزرق(الشكل 5). ويمكن ملاحظة التوزيع المكاني للبروتين التخزين في الجنين بوضوح في التكبير منخفضة (الشكل 5A). يوجد بروتين تخزيني في أجسام البروتين. في التكبير عالية، وعرض الجسم البروتين مصفوفة غير متجانسة مع بعض حبيبات سوداء وبعض بنية شفافة غير ملوثة(الشكل 5B). تحتوي أجسام البروتين في البذور على ثلاثة أنواع: النوع الأول يتكون من مصفوفة بروتينية متجانسة وليس له شوائب، والنوع الثاني يحتوي على بلورات كروية، والنوع الثالث يحتوي على بلورات كروية وبلورات11. تتكون البلورات البلورية في الجسم البروتيني من فيتات وأملاح غير عضوية أخرى ، وهي ليست ملطخة. هذه البلورات كروية سوداء بسبب أن الضوء لا يمكن أن تمر من خلالهم تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكريستال الكروية هشة ويصعب اختراقها من قبل عامل التثبيت والتضمين. عند جعل القسم، بلورات كروية انفجرت في بعض الأحيان، مما أدى إلى تجويف شفاف داخل الجسم البروتين11. يحتوي الجسم البروتين من جنين الاغتصاب بذرة زيتية على بلورات كروية وفقًا لعلمها المجهري(الشكل 5B). من أجل التحقيق في التوزيع المكاني للأجسام البروتينية في الجنين ، تم اختيار خمس مناطق في القسم الكامل بحجم الجنين لتمثيل الأنسجة القشرية radicle ، والمنطقة الداخلية من كوتيليدون الداخلية ، والمنطقة الخارجية من كوتيليدون الداخلية ، والمنطقة الداخلية من كوتيليدون الخارجي ، والمنطقة الخارجية من كوتيليدون الخارجي (الشكل 5A، C - G). كانت أجسام البروتين في جميع مناطق الجنين كروية، إثلبية، وغير منتظمة الشكل(الشكل 5C-G).
يتم عرض التحليل الكمي للأجسام البروتينية في خلايا parenchyma الأولى والثانية على مقربة من البشرة في المناطق الخمس المختارة أعلاه في الجدول التكميلي 4. وكان مجال الجسم البروتين فرق طفيف بين المناطق الخمس المختارة. وكان استدارة الجسم البروتين أقل بكثير في المنطقة الخارجية من كوتيليدون الخارجي مما كانت عليه في المناطق الأربع الأخرى، مما يشير إلى أن الجسم البروتيني في كوتيليدون الخارجي كان قريبا من المجال. وكان عدد ومؤشر المنطقة من الجسم البروتين في الخلية أعلى بكثير في خلية parenchyma radicle مما كانت عليه في خلية كوتيليدون parenchyma(الجدول التكميلي 4).
الشكل 1: إعداد قسم الراتنج نصفين بالبذور الكاملة باستخدام طريقة اقسام جافة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بنية الأنسجة من الجنين في البذور ناضجة من البذورالزيتية الاغتصاب متنوعة هواشوانغ 5. (أ) مورفولوجيا الجنين. (ب)هيكل الأنسجة من مقطع طولي كامل الجنين الحجم. (C) مورفولوجيا المقطع الشامل لكامل الجنين الحجم. (D)هيكل الأنسجة من المقطع الشامل كامل الجنين الحجم. كانت المقاطع ملطخة بـ(سافرانين) H, hypocotyl; IC, كوتيليدون الداخلية; OC، كوتيليدون الخارجي؛ آر، شعاع. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مورفولوجيا الخلايا في جنين من زراعة زيتية الاغتصاب متنوعة هواشوانغ 5. (أ)مقطع كامل الجنين الحجم الملطخة مع الفلورسنت براينر 28. (B) تضخيم المنطقة ب في (A) ، تظهر مورفولوجيا الخلية وهيكل الأنسجة من الشعاع. (C) تضخيم المنطقة C في (A) ، تظهر مورفولوجيا الخلية وبنية الأنسجة من كوتيليدون الداخلية والخارجية. شريط مقياس = 500 ميكرومتر لـ (A) و 100 ميكرومتر لـ (B, C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مورفولوجيا حبيبات النشا في نواة ناضجة من الذرة متنوعة تشنغ 58. كانت المقاطع العرضية(A)والطولية (ب) كاملة الحجم من البذور ملطخة بمحلول اليود ، وتظهر تضخيماتها الإقليمية مورفولوجيا حبيبات النشا في مناطق مختلفة من إندوسبيرم. شريط مقياس = 1 مم لقسم بذرة كاملة و 20 ميكرومتر للتضخيمات الإقليمية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مورفولوجيا من أجسام البروتين في جنين من زيتية الاغتصاب متنوعة هواشوانغ 5. (أ)مقطع كامل الجنين الحجم مُعَلَّم بـ Coomassie الأزرق اللامع R250. (B) تضخيم أجسام البروتين، تبين المجهرية. (C-G) تضخيم المنطقة C-G في (A) ، تبين مورفولوجيا البروتين في الجسم في شعاع (C) ، المنطقة الداخلية من كوتيليدون الداخلية (D) ، المنطقة الخارجية من كوتيليدون الداخلية (E) ، المنطقة الداخلية من كوتيليدون الخارجي (F) ، المنطقة الخارجية من كوتيليدون الداخلية (G). شريط مقياس = 500 ميكرومتر لـ (A)، 5 ميكرومتر لـ (B) و 50 ميكرومتر لـ (C-G). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تكميلية الشكل 1: مورفولوجيا الخلايا في نواة ناضجة من الذرة متنوعة تشنغ 58. كان المقطع الشامل بحجم البذور بالكامل ملطخًا بالمشرق الفلوري 28 ، ويعرض تضخيماته الإقليمية (1-4) مورفولوجيا خلايا إندوسبيرم في مناطق مختلفة من إندوسبيرم. شريط مقياس = 1 مم للقسم الكامل الحجم البذور و 100 ميكرومتر للتضخيم الإقليمية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الشكل 2: مورفولوجيا تطوير نواة الأرز متنوعة 9311. تم وضع المقاطع العرضية بحجم البذور بالكامل في أيام مختلفة بعد المزهرة (DAF) مع محلول Safranin O واليود. شريط مقياس = 0.5 مم. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: مورفولوجيا النواة المبتغى من الأرز متنوعة تي تشينغ. تم عرض القسم الطولي الكامل بحجم البذور في 8 أيام بعد الإمبير مع حمض شيف الدوري والأزرق التولويدي ، ويعرض تضخيماته الإقليمية التغيرات المورفولوجية للاندورف في مناطق مختلفة من البذور. شريط مقياس = 20 μm. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الشكل4 : مورفولوجيا نواة مطبوخة من الأرز متنوعة تي تشينغ. كان مقطع الحجم الكامل للبذرة ملطّخًا بمحلول اليود ، ويحمل تضخيم المنطقة الخارجية والوسطى والداخلية تغيرات مورفولوجيا حبيبات النشا في البذور أثناء عملية الطهي لمدة 0 و 10 و 20 و 30 دقيقة. شريط مقياس = 20 μm. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: المعلمات مورفولوجيا من الخلايا في مناطق مختلفة من الجنين اغتصاب بزائدالزيتية يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
(أ) البيانات تعني ± الانحرافات المعيارية(n = 3)، والقيم في نفس العمود بأحرف مختلفة مختلفة بشكل ملحوظ(p < 0.05).
(ب) وتظهر المناطق في الشكل 3B، C.
(ج) LAL: طول المحور الطويل؛ SAL: طول المحور القصير؛ استدارة: (محيط 2)/(4×π×ا المنطقة).
الجدول التكميلي 2: المعلمات مورفولوجيا من الخلايا في مناطق مختلفةمن endosperm الذرةيرجى انقر هنا لتحميل هذا الجدول.
(أ) البيانات تعني ± الانحرافات المعيارية (n = 3). تختلف القيم في نفس العمود بأحرف مختلفة اختلافاً كبيراً(p < 0.05).
(ب) وتظهر المناطق في المقطع العرضي من نواة الذرة في الشكل التكميلي 1.
(ج) LAL: طول المحور الطويل؛ SAL: طول المحور القصير؛ استدارة: (محيط 2)/(4×π×ا المنطقة).
الجدول التكميلي 3: المعلمات مورفولوجيا حبيبات النشا في مختلف المناطق من الذرة endospermيرجى انقر هنا لتحميل هذا الجدول.
(أ) البيانات تعني ± الانحرافات المعيارية (n = 3). تختلف القيم في نفس العمود بأحرف مختلفة اختلافاً كبيراً(p < 0.05).
(ب) وتظهر المناطق في مقطع مستعرض من نواة الذرة في الشكل 4A.
(ج) LAL: طول المحور الطويل؛ SAL: طول المحور القصير؛ استدارة: (محيط 2)/(4×π×ا المنطقة).
الجدول التكميلي 4: المعلمات مورفولوجيا من أجسام البروتين في مناطق مختلفة من جنين الاغتصاب ببذوسةزيتية يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
(أ) البيانات تعني ± الانحرافات المعيارية(n = 3)، والقيم في نفس العمود بأحرف مختلفة مختلفة بشكل ملحوظ(p < 0.05).
(ب) وتظهر المناطق في الشكل 5.
(ج) استدارة: (محيط 2)/(4×π×ا المنطقة)؛ مؤشر المنطقة هو نسبة منطقة الجسم البروتين إلى الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والبذور هي أهم مورد متجدد للأغذية والأعلاف والمواد الخام الصناعية، وهي غنية بمواد التخزين مثل النشا والبروتين. المورفولوجيا وكمية الخلايا ومحتوى وتكوين مواد التخزين تؤثر على وزن ونوعية البذور7،12. على الرغم من أن تكنولوجيا علم المجسمات وتحليل الصور يمكن قياس حجم وكمية الخلايا في منطقة الأنسجة ، إلا أنها تفتقر إلى العديد من المختبرات. تعطي أقسام البارافين والراتنج صورة ثنائية الأبعاد ، مما يؤدي إلى عدم وجود طريقة في تحليل الحجم الحقيقي وكميات الخلايا. ومع ذلك، يتم قطع الخلايا عشوائيا في أي المستويات الخاصة بهم، وحجم متوسط العديد من الخلايا (أكثر من 100) من ما لا يقل عن ثلاثة أقسام مختلفة من منطقة الأنسجة يمكن أن تعكس المعلمات مورفولوجيا 2D (الطول والعرض والمساحة) من الخلايا، ونسبة المنطقة المختارة إلى منطقة الخلية يعني يمكن أن تعكس كمية الخلايا. ولذلك، فمن المهم جدا للعرض في الموقع وتحليل مورفولوجيا الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور. قسم البارافين هو الأنسب لإعداد القسم الكامل بحجم البذور ، خاصة بالنسبة للبذور الكبيرة الحجم7. ومع ذلك ، فإن الخلايا مليئة بمواد التخزين مع تطوير البذور ، مما يؤدي إلى أنه من الصعب للغاية الحصول على القسم الجيد الكامل الحجم من البذور المتأخرة النامية والبذور الناضجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن قسم البارافين سميك جدا ليظهر المورفولوجيا بوضوح، ومناسبة فقط للتحقيق في بنية الأنسجة من البذور7.
المقطع الراتنج رقيقة، ويمكن أن يحمل مورفولوجيا الخلايا، حبيبات النشا، والهيئات البروتين بوضوح7. ومع ذلك، فإن الراتنج الروتيني غير مناسب لقسم الحجم الكامل للبذر. وتمثل التقنية المعروضة هنا مقاربة سريعة وبسيطة وحريصة نحو إعداد أقسام عرضية وطولانية كاملة الحجم من البذور الناضجة المضمّنة في الراتنج لعرض مورفولوجيا الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور باستخدام المجهر الخفيف(الشكل 2-5،الشكل التكميلي1). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية أيضًا إعداد قسم من البذور النامية والمخلومة والمطبوخة للتحقيق في التغيرات المورفولوجية للخلايا والنشا و أجسام البروتين في مناطق مختلفة من البذور.
ميزة أخرى متميزة أن توفر هذه التقنية هو تطبيق أجزاء كاملة الحجم البذور. في العصر الجديد من الفينومات والميتولومات، من المهم قياس كميا المعلمات مورفولوجيا الخلايا، حبيبات النشا، والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور. تسمح التقنية الجديدة ، بالاقتران مع برامج تحليل المورفولوجيا ، للباحث بتحليل كمي لبارامترات مورفولوجيا الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور(الجدول التكميلي 1-4).
على الرغم من أن طريقة القسم الجاف الحالي يمكن أن تعد بنجاح قسم الراتنج الكامل بحجم البذور ، إلا أنه يحتوي على بعض القيود وأوجه القصور. بالنسبة لقسم البارافين ، يمكن إزالة البارافين بسهولة من القسم ؛ ولكن بالنسبة لقسم الراتنج، لا يمكن إزالة الراتنج من القسم، مما يؤدي إلى عينة النبات جزءا لا يتجزأ من الراتنج. لذلك ، بالمقارنة مع قسم البارافين ، فإن قسم الراتنج الحالي بحجم البذور الكاملة ليس مناسبًا لتنفيذ الكيمياء الهستوكيميائية والكيمياء المناعية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لطريقة الراتنج الروتينية قسمة قطع العينات إلى 0.5-2 μm أقسام ناعمة بسبب كتلة العينة مع حجم صغير. ولكن طريقة القسم الجاف الحالي من الصعب إعداد المقاطع على نحو سلس بسماكة أقل من 2 ميكرومتر ، خاصة بالنسبة للبذور الناضجة ذات الحجم الكبير ومحتوى النشا العالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم توفير التمويل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية الصينية (32071927)، ومشروع المواهب في جامعة يانغتشو وتطوير البرنامج الأكاديمي ذات الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A.
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
