Summary
Questa tecnica consente la preparazione rapida e semplice di una sezione di resina delle dimensioni di semi interi per l'osservazione e l'analisi di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni del seme.
Abstract
La morfologia, le dimensioni e la quantità di cellule, granuli di amido e corpi proteici nei semi determinano il peso e la qualità dei semi. Sono significativamente diversi tra le diverse regioni di seme. Per visualizzare chiaramente le morfologie delle cellule, dei granuli di amido e dei corpi proteici e analizzare quantitativamente i loro parametri morfologici con precisione, è necessaria la sezione delle dimensioni di un seme intero. Sebbene la sezione di paraffina delle dimensioni di un seme intero possa studiare l'accumulo di materiali di stoccaggio nei semi, è molto difficile analizzare quantitativamente i parametri morfologici delle cellule e dei materiali di stoccaggio a causa della bassa risoluzione della sezione spessa. La sottile sezione in resina ha un'alta risoluzione, ma il metodo di sessatura della resina di routine non è adatto a preparare l'intera sezione di semi maturi delle dimensioni di semi con un grande volume e un alto contenuto di amido. In questo studio, presentiamo un semplice metodo di sessatura a secco per preparare l'intera sezione di resina delle dimensioni di un seme. La tecnica può preparare le sezioni trasversali e longitudinali di semi interi di semi in via di sviluppo, maturi, germinati e cotti incorporati nella resina LR White, anche per semi di grandi dimensioni ad alto contenuto di amido. La sezione di dimensioni di semi interi può essere macchiata con illuminante fluorescente 28, iodio e Coomassie blu brillante R250 per mostrare specificamente la morfologia di cellule, granuli di amido e corpi proteici chiaramente, rispettivamente. L'immagine ottenuta può anche essere analizzata quantitativamente per mostrare i parametri morfologici di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni di seme.
Introduction
I semi vegetali contengono materiali di stoccaggio come amido e proteine e forniscono energia e nutrizione alle persone. La forma, le dimensioni e la quantità di materiali cellulari e di stoccaggio determinano il peso e la qualità dei semi. Le cellule e i materiali di stoccaggio in diverse regioni di seme hanno morfologie significativamente diverse, specialmente per alcune colture di cereali ad alto amilosio con inibizione dell'enzima di ramificazionedell'amidoIIb 1,2,3. Pertanto, è molto importante indagare le morfologie delle cellule e dei materiali di stoccaggio in diverse regioni di seme.
La sessatura della paraffina è un buon metodo per preparare la sezione di dimensioni di semi interi e può mostrare la struttura tissutale del seme e l'accumulo di materiale di stoccaggio indiverse regioni di seme 4,5,6. Tuttavia, le sezioni di paraffina di solito hanno uno spessore di 6-8 μm con bassa risoluzione; pertanto, è molto difficile osservare e analizzare quantitativamente la morfologia delle cellule e dei materiali di stoccaggio. Le sezioni in resina hanno solitamente uno spessore di 1-2 μm e un'alta risoluzione e sono molto adatte ad osservare e analizzare la morfologia dei materiali cellulari e distoccaggio 7. Tuttavia, il metodo di sessatura della resina di routine ha difficoltà a preparare l'intera sezione delle dimensioni di un seme, specialmente per i semi con un grande volume e un alto contenuto di amido; pertanto, non c'è modo di osservare e analizzare la morfologia delle cellule e dei materiali di stoccaggio in diverse regioni del seme. La resina LR White è una resina acrilica e presenta bassa viscosità e forte permeabilità, portando alle sue buone applicazioni nella preparazione della sezione di resina dei semi, in particolare per chicchi maturi di cereali ad alto volume e alto contenuto di amido. Inoltre, il campione incorporato nella resina LR White può essere colorato facilmente con molti coloranti chimici per mostrare chiaramente la morfologia delle cellule e dei materiali di stoccaggio al microscopio leggero o fluorescente7. Nel nostro precedente articolo, abbiamo segnalato un metodo di sessatura a secco per preparare le sezioni di cereali maturi delle dimensioni di semi interi incorporate nella resina LR White. Il metodo può anche preparare l'intera sezione delle dimensioni di semi di nocciolo di cereali in via di sviluppo, germinato e cotto8. La sezione ottenuta di dimensioni intere di semi ha molte applicazioni nell'osservazione e nell'analisi della micromorfologia, specialmente per visualizzare e analizzare quantitativamente chiaramente le differenze morfologiche delle cellule e dei materiali di stoccaggio in diverseregioni del seme 8,9.
Questa tecnica è appropriata per i ricercatori che vogliono osservare la microstruttura del tessuto e la forma e le dimensioni delle cellule, dei granuli di amido e dei corpi proteici in diverse regioni del seme utilizzando il microscopio leggero. Le immagini di sezioni di dimensioni intere macchiate appositamente per l'esposizione di cellule, granuli di amido e corpi proteici possono essere analizzate da software di analisi morfologica per misurare quantitativamente i parametri morfologici di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni di seme. Al fine di dimostrare l'applicabilità tecnica e le applicazioni di sezioni di dimensioni intere, abbiamo studiato i semi maturi di mais e colza e i chicchi di riso in via di sviluppo, germinati e cotti in questo studio. Il protocollo contiene quattro processi. Qui, usiamo il chicchi di mais maturo, che è il più difficile nella preparazione delle sezioni di dimensioni di semi interi a causa del grande volume e dell'alto contenuto di amido, come campione per mostrare i processi passo dopo passo.
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Protocol
1. Preparazione di sementi incorporate in resina (figura 1)
- Fissare sei chicchi maturi di mais in 10 mL del 2,5% di glutaraldeide tamponata da fosfati (0,1 M, pH7,2) a 4 °C per 48 h. I ricercatori possono scegliere altre miscele fissive, concentrazioni fissive e condizioni di fissazione in base ai loro obiettivi di ricerca e tipi di tessuto.
- Esettare i chicchi e tagliarli longitudinalmente o trasversalmente a 2-3 mm di spessore utilizzando una lama affilata a doppia lato, e fissarli in 10 mL di glutaraldeide tamponata da fosfati al 2,5% (0,1 M, pH 7,2) di nuovo per 48 ore.
- Lavare i campioni tre volte con 10 mL di tampone fosfato da 0,1 M (pH 7,2) per 30 minuti ogni volta.
- Disidratare i campioni in gradi crescenti di soluzione acquosa di etanolo (10 mL) dal 30% al 50%, 70%, 90% una volta e 100% tre volte per 30 minuti ogni volta.
- Infiltrarsi nei campioni in gradi crescenti di 10 mL di soluzione di resina bianca LR diluita con etanolo dal 25% al 50%, 75% una volta e 100% due volte a 4 °C per 12 h ogni volta.
- Preparare i piedistalli per i campioni prima dell'incorporamento. Aggiungere 0,25 ml di resina bianca 100% LR in un tubo di centrifuga da 2 ml e polimerizzarlo a 60 °C per 48 ore.
- Aggiungere successivamente la resina LR White pura (0,5 mL) e il campione infiltrato nel tubo di centrifuga con un piedistallo. Raddrizzare i campioni con l'ago anatomico e polimerizzarli a 60 °C in forno per 48 ore.
2. Sessatura a secco per la preparazione di una sezione di dimensioni intere(figura 1)
- Eserti i chicchi incorporati dal tubo di centrifuga e tagliare la resina in eccesso intorno al campione usando una lama affilata.
- Bloccare il blocco di resina nel portacampioni dell'ultramicrotoma (EM UC7) e tagliare la resina superflua sulla superficie del campione e intorno al campione con una lama.
- Lucidare finemente la superficie del campione con un coltello di vetro fino a formare una sezione completa.
- Mettere un piccolo gancio di rame circa 2 mm sopra il bordo della lama prima di tagliare e tagliare il campione in una sezione di 2 μm. Il ruolo del gancio è quello di evitare il curling verso l'alto della sezione.
- Metti il gancio sotto la sezione per sostenerlo quando la sezione diventa lunga.
- Aggiungere 100 μL di acqua su uno scivolo non pretrattato e trasferire con cura la sezione completa e ininterrotta nell'acqua con le pinzette.
- Per levigare la sezione rugosa, scaldare e asciugare il campione sul tavolo appiattito a 50 °C durante la notte.
- Se la sezione si sbriciola o si strappa, prolungare il tempo per ogni infiltrazione di resina del campione da 12 h a 24 h o 48 h.
- Se la sezione ha alcune linee parallele al coltello, bloccare saldamente il blocco del campione. Se la sezione ha alcune linee verticali al coltello, si prega di utilizzare un nuovo coltello.
3. Colorazione e osservazione della sezione
NOTA: Al fine di osservare la struttura tissutale e la morfologia di cellule, granuli di amido e corpi proteici, macchiare le sezioni con macchie specifiche in base allo scopo della ricerca. Qui, usiamo il illuminante fluorescente 28, soluzione di iodio e Coomassie blu brillante R250 per macchiare le pareti cellulari, i granuli di amido e i corpi proteici, rispettivamente.
- Per osservare la morfologia delle cellule, dentare la sezione con 40 mL dello 0,1% (w/v) illuminante fluorescente 28 soluzione acquosa in un barattolo di colorazione in vetro compatto da 70 mL a 45 °C per 10 minuti, quindi sciacquarlo con acqua corrente per 5 minuti. Osservare e fotografare la sezione al microscopio a fluorescenza dotato di telecamera CCD.
- Per osservare la morfologia dei granuli di amido, macchiare la sezione con 40 μL di soluzione di iodio (0,07% (w/v) I2 e 0,14% (w/v) KI nel 25% (v/v) glicerolo) per 1 min e coprire il campione contenente soluzione di iodio con un coverslip. Visualizza e fotografa il campione al microscopio luminoso dotato di una fotocamera CCD.
- Per osservare la morfologia dei corpi proteici, immergere la sezione con 40 mL di acido acetico 10% (v/v) in un barattolo di colorazione in vetro compatto da 70 mL per 10 min a 45 °C, e poi macchiarlo in 40 mL di 1% (w/v) Coomassie blu brillante R250 nel 25% (v/v) isopropanolo e 10% (v/v) acido acetico per 15 min a 45 °C. Lavare le sezioni macchiate con acqua corrente per 5 minuti e asciugarla. Osservare e fotografare la sezione al microscopio luminoso dotato di una telecamera CCD.
4. Analisi quantitativa dei parametri morfologici
- Elaborare e analizzare quantitativamente le immagini fotografate per area, asse lungo /corto e rotondità di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni di seme utilizzando software di analisi morfologica (software Image-Pro Plus 6.0) seguendo esattamente le procedure di Zhao etal.
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Representative Results
Semplice metodo di sessatura a secco per ottenere una sezione di dimensioni di semi interi
Stabiliamo un semplice metodo di sessatura a secco per preparare una sezione di semi di dimensioni intere incorporata nella resina LR-bianca (Figura 1). Il metodo è in grado di preparare sezioni trasversali e longitudinali di dimensioni intere con spessore di 2 μm(Figura 2-5, Figura supplementare 1-4). Ad esempio, le sementi mature di colza possono essere sesate in modo trasversale e longitudinale (figura 2). Per le colture cerealicole, i loro chicchi maturi sono pieni di granuli di amido, il che significa che è molto difficile preparare l'intera sezione delle dimensioni di un seme. Utilizzando la tecnica attuale, potrebbero essere preparate anche le sezioni trasversali e longitudinali di granturco maturo di granturco maturo di grande volume (Figura 4, Figura complementare 1). Inoltre, il nocciolo in via di sviluppo (Figura complementare 2), il nocciolo germinato (Figura complementare 3) e il nocciolo cotto (Figura complementare 4) di riso possono essere studiati utilizzando il metodo .
Applicazioni della sezione intera delle dimensioni di un seme
Osservazione della struttura tissutale delle sementi
La sezione di dimensioni di semi interi può essere utilizzata per osservare la struttura tissutale dei semi. Ad esempio, l'embrione di colza è costituito da radicolo, ipocotile, plumule e due cotiledoni. I cotiledoni interni ed esterni sono piegati a metà, avvolgendo l'ipocotile e il radicolo e rendendo l'embrione sferico (Figura 2A, C). Le sezioni longitudinali e trasversali di dimensioni embrionale intere macchiate di safranina mostravano chiaramente il radicolo, l'ipocotile, il cotiledone interno e il cotiledone esterno (Figura 2B, D). La sezione longitudinale interamente embrionale della colza viene preparata in modo più difficile rispetto alla sezione trasversale. Pertanto, le sezioni trasversali degli embrioni sono ampiamente utilizzate per indagare la micromorfologia degli embrioni neiriferimenti 5,10.
Morfologia e analisi delle cellule in diverse regioni di seme
L'intera sezione delle dimensioni di un seme può essere utilizzata per osservare e analizzare la morfologia delle cellule in diverse regioni di seme. Ad esempio, le sezioni trasversali di colza di dimensioni embrionale intere sono state macchiate con illuminante fluorescente 28 e le pareti cellulari sono state macchiate specificamente(Figura 3A). La micromorfologia delle cellule in qualsiasi regione dell'embrione potrebbe essere chiaramente visualizzata ad alto ingrandimento (Figura 3B, C). Il radicolo è costituito da epiderma, corteccia e tessuti vascolari. Le cellule epidermiche situate nello strato più esterno di radicolo erano rettangolari e disposte radialmente. Le cellule corticali del parenchima erano di forma rotonda e di grandi dimensioni. Alcuni spazi distinti sono stati osservati tra le cellule corticali. Le cellule corticali erano disposte a strati dall'interno verso l'esterno (Figura 3B). Le cellule epidermiche del cotiledone erano quadrate e avevano un piccolo volume. Non c'erano differenze significative nella forma e nelle dimensioni delle cellule epidermiche tra le superfici esterne ed interne dei cotyledon interni ed esterni. Alcuni cilindri vascolari erano sparsi nel mezzo dei tessuti mesofille dei cotyledon interni ed esterni. Le cellule del parenchima mesofilla erano significativamente più grandi delle cellule epidermiche e delle cellule cilindriche vascolari nel cotiledone. Le cellule di parenchima della mesofilla mostravano una tipica disposizione palizzata nella regione interna del cotiledone esterno e nella regione esterna del cotiledone interno (Figura 3C). Le cellule parenchima avevano morfologie significativamente diverse in diverse regioni dell'embrione. Per rivelare le loro differenze morfologiche, le regioni 1, 2, 3, 4 e 5 sono state scelte rispettivamente nel tessuto corticale del radicolo, nella regione interna del cotiledone interno, nella regione esterna del cotiledone interno, nella regione interna del cotiledone esterno e nella regione esterna del cotiledone esterno (figura 3B, C). I parametri morfologici delle cellule parenchima nelle 5 regioni di cui sopra sono stati analizzati quantitativamente utilizzando un software di analisi morfologica(tabella complementare 1). L'area, la lunghezza dell'asse lungo, la lunghezza dell'asse corto e la rotondità delle cellule parenchima mostravano alcune differenze nelle diverse regioni degli embrioni.
Le cellule dell'endosperma erano piene di amido e proteine di stoccaggio. Utilizzando la sezione di resina delle dimensioni di un seme intero, è facile osservare e analizzare le cellule in diverse regioni di endosperma. Ad esempio, la morfologia delle cellule in qualsiasi regione dell'endosperma di mais potrebbe essere vista chiaramente dopo che le sezioni trasversali delle dimensioni di semi interi sono state macchiate con illuminante fluorescente 28. Gli endospermi periferici, medi e centrali nello stesso kernel presentavano forme e dimensioni delle celle significativamente diverse (Figura complementare 1). Al fine di analizzare quantitativamente i parametri morfologici delle cellule in diverse regioni dell'endosperma, le immagini delle regioni sono state analizzate utilizzando software di analisi morfologica; i parametri morfologici delle cellule sono presentati nella tabella complementare 2. Le cellule dell'endosperma nella regione 1 avevano l'area più piccola tra quattro regioni, quelle della regione 2 erano più grandi di quelle della regione 3, ma più piccole di quelle della regione 4.
Morfologia e analisi dei granuli di amido in diverse regioni di sementi
I semi maturi della maggior parte delle risorse vegetali, specialmente per le colture cerealicole, contengono un alto contenuto di amido. La morfologia del granulo e le dimensioni dell'amido hanno effetti importanti sulle proprietà dell'amido e svolgono un ruolo nella qualità delle sementi. La sezione di resina del seme può essere macchiata con soluzione di iodio per mostrare la morfologia dei granuli di amido in diverse regioni di seme. Ad esempio, le sezioni trasversali e longitudinali di granturco intero sono state preparate con successo. Le sezioni macchiate di iodio presentavano la morfologia dell'amido(figura 4). Per mostrare la morfologia del granulo di amido nelle diverse regioni dell'endosperma, le quattro regioni e le nove regioni sono state scelte rispettivamente nelle sezioni trasversali e longitudinali delle dimensioni di semi interi(figura 4). I granuli di amido in diverse regioni hanno mostrato morfologia, dimensioni e quantità significativamente diverse nelle cellule dell'endosperma. Per la sezione trasversale, la regione 1 aveva granuli di amido sferico, la regione 2 aveva granuli poligonali e granuli di amido in entrambe le regioni 3 e 4 erano sferici. Per la sezione longitudinale, i granuli di amido a forma poligonale nelle regioni 1, 4, 5 e 8 erano più grandi di quelli a forma sferica nelle regioni 3, 7 e 9, e alcuni granuli di amido composto sono stati osservati nelle regioni 2 e 6.
L'analisi quantitativa dei parametri morfologici dei granuli di amido in quattro regioni della sezione trasversale è stata illustrata nella tabella complementare 3. I granuli di amido nella regione 1 avevano le dimensioni più piccole, quelli della regione 2 avevano le dimensioni più grandi e quelli della regione 3 erano più grandi che nella regione 4.
Micromorfologia e analisi dei corpi proteici in diverse regioni di seme
L'intera sezione delle dimensioni di un seme con proteine ad alto stoccaggio può essere utilizzata per dritto e analizzare la morfologia dei corpi proteici in diverse regioni di seme. Ad esempio, la sezione trasversale dell'embrione di colza è stata macchiata con Coomassie blu brillante R250 e la proteina di stoccaggio è stata macchiata di blu(Figura 5). La distribuzione spaziale delle proteine di immagazzinamento nell'embrione potrebbe essere chiaramente osservata a basso ingrandimento (Figura 5A). La proteina di conservazione è presente nei corpi proteici. Ad alto ingrandimento, il corpo proteico presentava una matrice eterogenea con alcuni granuli neri e una struttura trasparente non macchiata (Figura 5B). I corpi proteici nei semi hanno tre tipi: il primo tipo è costituito da una matrice proteica omogenea e non ha inclusioni, il secondo tipo contiene cristalli globulari e il terzo tipo contiene cristalli globulari e pseudocristalli11. I cristalli globulari nel corpo proteico sono composti da fitato e altri sali inorganici, che non sono macchiati. Questi cristalli globulari sono neri a causa del fatto che la luce non può passare attraverso di loro al microscopio. Inoltre, il cristallo sferico è fragile e difficile da penetrare dal fissatore e dall'agente incorporante. Quando si effettua la sezione, i cristalli sferici a volte esplodono, risultando in una cavità trasparente all'interno del corpoproteico 11. Il corpo proteico dell'embrione di colza conteneva cristalli sferoidali secondo la sua micromorfologia (Figura 5B). Al fine di studiare la distribuzione spaziale dei corpi proteici nell'embrione, sono state scelte cinque regioni nell'intera sezione delle dimensioni di un embrione per rappresentare il tessuto corticale radicolare, la regione interna del cotiledone interno, la regione esterna del cotiledone esterno e la regione esterna del cotiledone esterno(figura 5A,C-G). I corpi proteici in tutte le regioni dell'embrione erano di forma sferica, ellissoidale e irregolare (Figura 5C-G).
L'analisi quantitativa dei corpi proteici nella prima e nella seconda cella parenchima laico vicino all'epidermide nelle cinque regioni sopra scelte è presentata nella tabella complementare 4. L'area del corpo proteico aveva una leggera differenza tra le cinque regioni scelte. La rotondità del corpo proteico era significativamente più bassa nella regione esterna del cotiledone esterno che nelle altre quattro regioni, indicando che il corpo proteico nel cotiledone esterno era vicino alla sfera. Il numero e l'indice di area del corpo proteico nella cellula erano significativamente più elevati nella cellula del parenchima del radicolo che nella cellula del parenchima cotiledon(tabella complementare 4).
Figura 1: Preparazione di semilavora di resina di dimensioni intere con metodo di sessatura a secco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Struttura tissutale dell'embrione nei semi maturi della varietà di colza Huashuang 5. (A) Morfologia dell'embrione. (B) Struttura tissutale della sezione longitudinale di dimensioni embrionale intere. (C) Morfologia della sezione trasversale di dimensioni embrionale intere. (D) Struttura tissutale della sezione trasversale di dimensioni embrionale intere. Le sezioni erano macchiate di safranin. H, ipocotile; IC, cotiledone interno; OC, cotiledone esterno; R, radicolo. Barra di scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Morfologia delle cellule in embrione di varietà di colza Huashuang 5. (A) Sezione trasversale di dimensioni embrionale intera macchiata di illuminante fluorescente 28. (B) Amplificazione della regione B in ( A ),chemostra la morfologia cellulare e la struttura tissutale del radicolo. (C) Amplificazione della regione C in (A), che mostra la morfologia cellulare e la struttura tissutale del cotiledone interno ed esterno. Barra di scala = 500 μm per (A) e 100 μm per (B,C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Morfologia dei granuli di amido nel nocciolo maturo della varietà di mais Zheng 58. Le sezioni trasversali (A) e longitudinali(B)di dimensioni intere dei semi sono state macchiate con soluzione di iodio e le loro amplificazioni regionali mostrano la morfologia dei granuli di amido in diverse regioni dell'endosperma. Barra di scala = 1 mm per la sezione di dimensioni di semi interi e 20 μm per le amplificazioni regionali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Morfologia dei corpi proteici nell'embrione della varietà di colza Huashuang 5. (A) Sezione trasversale di dimensioni embrionale intera macchiata di Coomassie blu brillante R250. (B) Amplificazione dei corpi proteici, mostrando la loro microstruttura. (C-G) Amplificazione della regione C-G in (A), che mostra la morfologia del corpo proteico nel radicolo (C), regione interna del cotiledone interno (D), regione esterna del cotiledone interno (E), regione interna del cotiledone esterno (F), regione esterna del cotiledone interno (G). Barra di scala = 500 μm per (A), 5 μm per (B) e 50 μm per (C-G). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Domanda complementare Figura 1: Morfologia delle cellule nel nocciolo maturo della varietà di mais Zheng 58. La sezione trasversale delle dimensioni di semi interi è stata macchiata con illuminante fluorescente 28 e le sue amplificazioni regionali (1-4) mostrano la morfologia delle cellule dell'endosperma in diverse regioni dell'endosperma. Barra di scala = 1 mm per la sezione di dimensioni di semi interi e 100 μm per le amplificazioni regionali. Clicca qui per scaricare questo file.
Domanda complementare Figura 2: Morfologia dello sviluppo del nocciolo della varietà di riso 9311. Le sezioni trasversali di dimensioni intere dei semi in diversi giorni dopo la fioritura (DAF) sono state contrososteniate con soluzione di safranina O e iodio. Barra di scala = 0,5 mm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura complementare 3: Morfologia del nocciolo germinato della varietà di riso Te-qing. La sezione longitudinale delle dimensioni di semi interi a 8 giorni dall'imbibizione è stata controsostenibile con O blu acido-schiff e toluidina periodica, e le sue amplificazioni regionali mostrano i cambiamenti morfologici dell'endosperma in diverse regioni di seme. Scale bar = 20 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Domanda complementare Figura 4: Morfologia del nocciolo cotto della varietà di riso Te-qing. La sezione trasversale delle dimensioni di semi interi è stata macchiata con soluzione di iodio e le sue amplificazioni esterne, centrali e interne della regione mostrano i cambiamenti morfologici dei granuli di amido nei semi durante il processo di cottura per 0, 10, 20 e 30 minuti. Scale bar = 20 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella complementare 1: Parametri morfologici delle cellule in diverse regioni dell'embrione di colzaa Clicca qui per scaricare questa tabella.
A I dati sono ± deviazioni standard (n = 3) e i valori nella stessa colonna con lettere diverse sono significativamente diversi (p < 0,05).
b Le regioni sono indicate nella figura 3B, C.
c LAL: lunghezza asse lungo; SAL: lunghezza dell'asse corto; Rotondità: (perimetro 2)/(4×π×area).
Tabella complementare 2: Parametri morfologici delle cellule in diverse regioni dell'endosperma di maisa Clicca qui per scaricare questa tabella.
A I dati sono ± deviazioni standard (n = 3). I valori nella stessa colonna con lettere diverse sono significativamente diversi (p < 0.05).
b Le regioni sono indicate nella sezione trasversale del nocciolo di granturco nella figura complementare 1.
c LAL: lunghezza asse lungo; SAL: lunghezza dell'asse corto; Rotondità: (perimetro 2)/(4×π×area).
Tabella complementare 3: Parametri morfologici dei granuli di amido in diverse regioni dell'endosperma di maisa Clicca qui per scaricare questa tabella.
A I dati sono ± deviazioni standard (n = 3). I valori nella stessa colonna con lettere diverse sono significativamente diversi (p < 0.05).
b Le regioni sono indicate nella sezione trasversale del nocciolo di mais nella figura 4A.
c LAL: lunghezza asse lungo; SAL: lunghezza dell'asse corto; Rotondità: (perimetro 2)/(4×π×area).
Tabella complementare 4: Parametri morfologici dei corpi proteici in diverse regioni dell'embrione di colzaa Clicca qui per scaricare questa tabella.
A I dati sono ± deviazioni standard (n = 3) e i valori nella stessa colonna con lettere diverse sono significativamente diversi (p < 0,05).
b Le regioni sono indicate nella figura 5.
c Rotondità: (perimetro 2)/(4×π×area); L'indice di area è il rapporto area tra corpo proteico e cellula.
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Discussion
Le sementi sono la risorsa rinnovabile più importante per alimenti, foraggi e materie prime industriali e sono ricche di materiali di stoccaggio come amido e proteine. La morfologia e la quantità delle cellule e il contenuto e la configurazione dei materiali di stoccaggio influiscono sul peso e sulla qualità deisemi 7,12. Sebbene la tecnologia di stereologia e analisi delle immagini possa misurare le dimensioni e la quantità delle cellule in una regione tissutale, mancano in molti laboratori. Le sezioni di paraffina e resina danno un'immagine bidimensionale (2D), che non porta in alcun modo ad analizzare le dimensioni e la quantità reale delle cellule. Tuttavia, le cellule vengono tagliate casualmente su qualsiasi piani, la dimensione media di molte cellule (oltre 100) da almeno tre diverse sezioni della regione tissutale può riflettere i parametri di morfologia 2D (lunghezza, larghezza e area) delle cellule e il rapporto tra l'area della regione scelta e l'area cellulare media può riflettere la quantità di cellule. Pertanto, è molto importante per la visualizzazione in situ e l'analisi della morfologia delle cellule e dei materiali di stoccaggio in diverse regioni di seme. La sezione di paraffina è la più adatta per preparare la sezione di dimensioni di semi interi, soprattutto per semi di grandi dimensioni7. Tuttavia, le cellule sono piene di materiali di stoccaggio con sviluppo di semi, il che porta a che è molto difficile ottenere la buona sezione delle dimensioni di semi interi da semi in ritardo di sviluppo e semi maturi. Inoltre, la sezione di paraffina è troppo spessa per mostrare chiaramente la morfologia ed è adatta solo per indagare la struttura tissutale del seme7.
La sezione di resina è sottile e può mostrare chiaramente la morfologia di cellule, granuli di amido e corpi proteici7. Tuttavia, la resina di routine non è adatta per sezioni di dimensioni intere. La tecnica qui presentata rappresenta un approccio rapido, semplice e appassionato alla preparazione di sezioni trasversali e longitudinali di semi maturi delle dimensioni di semi interi incorporati nella resina per la visualizzazione della morfologia di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni di semi utilizzando la microscopia leggera(Figura 2-5,Figura complementare 1). Inoltre, la tecnica può anche preparare la sezione di semi in via di sviluppo, germinati e cotti per indagare in situ i cambiamenti morfologici dei corpi cellulari, amido e proteici in diverse regioni del seme.
Un altro netto vantaggio fornito da questa tecnica è l'applicazione di sezioni di dimensioni intere. Nella nuova era della fenomica e della metabolomica, è importante misurare quantitativamente i parametri morfologici delle cellule, dei granuli di amido e dei corpi proteici in diverse regioni dei semi. La nuova tecnica, in combinazione con il software di analisi morfologica, consente al ricercatore di analizzare quantitativamente i parametri morfologici di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni di seme(Tabella supplementare 1-4).
Sebbene l'attuale metodo di sessatura a secco possa preparare con successo l'intera sezione di resina delle dimensioni di un seme, presenta alcune limitazioni e carenze. Per la sezione di paraffina, la paraffina può essere rimossa facilmente dalla sezione; ma per la sezione resina, la resina non può essere rimossa dalla sezione, portando al campione vegetale incorporato nella resina. Pertanto, rispetto alla sezione di paraffina, l'attuale sezione di resina delle dimensioni di un seme intero non è adatta a eseguire l'istochimica e l'immunoistochimica. Inoltre, il metodo di sessatura della resina di routine può tagliare i campioni in sezioni lisce da 0,5-2 μm a causa del blocco del campione con un volume ridotto. Ma l'attuale metodo di sessatura a secco è difficile da preparare le sezioni lisce con spessore inferiore a 2 μm, specialmente per semi maturi con grande volume e alto contenuto di amido.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
I finanziamenti sono stati forniti dalla National Natural Science Foundation of China (32071927), dal Talent Project dell'Università di Yangzhou e dallo sviluppo del programma accademico prioritario degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
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