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Biochemistry

Mutagenesi PCR, clonazione, espressione, protocolli di purificazione rapida delle proteine e cristallizzazione del tipo selvatico e delle forme mutanti di triptofano sintasi

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61839
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Summary

Questo articolo presenta una serie di metodi consecutivi per l'espressione e la purificazione della Salmonella typhimurium triptofano sintasi compo questo protocollo un sistema rapido per purificare il complesso proteico in un giorno. I metodi trattati sono la mutagenesi diretta al sito, l'espressione proteica in Escherichia coli,la cromatografia di affinità, la cromatografia di filtrazione su gel e la cristallizzazione.

Abstract

Sono stati condotti studi strutturali con il complesso bienzimatico triptofano sintasi (TS) (α2β2 TS) da Salmonella typhimurium per comprendere meglio il suo meccanismo catalitico, il comportamento allosterico e i dettagli della trasformazione enzimatica del substrato in prodotto in enzimi PLP-dipendenti. In questo lavoro, un nuovo sistema di espressione per produrre la subunità β isolata α e isolata ha permesso la purificazione di elevate quantità di subunità pure e α complessoTS 2β2Stdalle subunità isolate entro 2 giorni. La purificazione è stata effettuata mediante cromatografia di affinità seguita da scissione del tag di affinità, precipitazione del solfato di ammonio e cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Per comprendere meglio il ruolo dei residui chiave nell'enzima β-sito, la mutagenesi diretta del sito è stata eseguita in precedenti studi strutturali. Un altro protocollo è stato creato per purificare il tipo selvatico e i complessi mutanti α2β2StTS. Un protocollo semplice, veloce ed efficiente che utilizza il frazionamento del solfato di ammonio e SEC ha permesso la purificazione di α2β2StTS complesso in un solo giorno. Entrambi i protocolli di purificazione descritti in questo lavoro hanno notevoli vantaggi rispetto ai protocolli precedenti per purificare lo stesso complesso utilizzando PEG 8000 e spermina per cristallizzare il complesso α2β2StTS lungo il protocollo di purificazione. La cristallizzazione del tipo selvatico e di alcune forme mutanti avviene in condizioni leggermente diverse, compromettendo la purificazione di alcuni mutanti utilizzando PEG 8000 e spermina. Per preparare cristalli adatti agli studi cristallografici a raggi X sono stati fatti diversi sforzi per ottimizzare la cristallizzazione, la qualità dei cristalli e la crioprotezione. I metodi qui presentati dovrebbero essere generalmente applicabili per la purificazione delle subunità della triptofano sintasi e dei complessi wild type e mutanti α2β2StTS.

Introduction

Il complesso bienzimatico della triptofano sintasi (TS) (α2β2)è un enzima allosterico, catalizzando gli ultimi due passaggi nella biosintesi dell'amminoacido L-triptofano in batteri, piante e funghi1,2,3. Bacterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) provoca una grave infezione gastrointestinale nell'uomo e in altri animali. Poiché gli esseri umani e gli animali superiori non hanno TS (EC 4.2.1.20), l'inibizione del complesso S. typhimurium α2β2 TS (α2β2StTS) è stata esplorata come potenziale bersaglio farmacologico per il trattamento della criptosporidiosi e della tubercolosi4, genitali e infezioni oculari5e per il potenziale utilizzo di erbicidi in agricoltura6. La α-subunità catalizza la scissione aldolitica dell'indolo-3-glicerolo-fosfato (IGP) a gliceraldeide-3-fosfato (GAP) e indolo, attraverso la formazione di un intermedio tautomero indolenino e successivamente scissione del legame carbonio-carbonio per produrre GAP e indolo3,6. Il sito β-catalitico contiene una molecola cofattore piridossiale 5′-fosfato (PLP) legata a β-Lys87 tramite una base di Schiff, che funziona come un dissipatore di elettroni nel corso delle reazioni all'enzima β-subunità3,7. Il sito β catalizza la sostituzione dell'idrossile della catena laterale L-Serina con l'indolo per dare L-triptofano e una molecola d'acqua in una reazione PLP-dipendente. St TS funge da modello di lunga data per lo studio della canalizzazione del substrato e della comunicazione allosterica all'interno di complessi multienzimatici2,3. La comunicazione allosterica bidirezionale tra le subunità α e β di TS è necessaria per sincronizzare le fasi catalitiche e prevenire il rilascio di indolo durante la sintesi di L-triptofano3. Per estendere questo sforzo, abbiamo preparato diversi mutanti (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr e β-Ser377Ala) per mutazione a punto singolo da utilizzare in ulteriori esplorazioni della relazione tra struttura enzimatica, meccanismo e funzione nel sito catalitico della subunità β StTS.

Una ricerca dettagliata sul meccanismo catalitico di α2β2StTS è stata avviata dal gruppo di ricerca di Edith W. Miles. I primi studi con il complesso nativo di Escherichia coli α2β2 TS si sono concentrati sulla purificazione e caratterizzazione della α-subunitàisolata 8,9,isolata β-subunità10,11 e sulla ricostituzione del complesso TS α 2β2 dalle subunitàisolate 12. La purificazione è stata effettuata mediante precipitazione del solfato di ammonio, dialisi del campione, cromatografia DEAE-Sephadex, dialisi e un secondo round cromatografico su una colonna DEAE-Sephadex12. In un altro protocollo, la purificazione dello stesso complesso è stata migliorata caricando il lisato cellulare chiarificato su una colonna DEAE-Sephadex seguita da una fase cromatografica su una colonna Sepharose 4B, precipitazione del solfato di ammonio e dialisi13. Entrambi i protocolli di purificazione durano 4-5 giorni. Escherichia coli αcomplesso TS 2β2 cristallizzato, ma i cristalli non erano adatti per la diffrazione a raggi X in quel momento.

In un nuovo studio, le forme ricombinanti e selvatiche di S. typhimurium α2β2 TS complesso sono state purificate e cristallizzate14,15. Il complesso α2β2StTS ricombinante è stato sovraespresso nel ceppo CB149 di E. coli che trasporta il vettore di espressione pEBA-10. Sono stati riportati dati iniziali di cristallizzazione e diffrazione a raggi X e analisi del complesso α2β2StTS14. Tuttavia, l'ago lungo e sottile come α2β2StTS cristalli ha compromesso gli studi strutturali. Nel tentativo di raccogliere migliori dati di diffrazione a raggi X, è stato descritto un altro protocollo di purificazione per purificare il tipo selvatico e le forme mutanti del complesso α2β2StTS15. La purificazione è stata effettuata con una precipitazione iniziale utilizzando spermina e PEG 8.000 nel lisato cellulare chiarificato e un grande precipitato voluminoso è stato rimosso mediante centrifugazione. La frazione surnatante contenente elevate quantità di α2β2StTS è stata conservata per 16-48 ore a 4 °C fino a quando i cristalli gialli non sono precipitati. I cristalli sono stati lavati e ampiamente dializzati contro diversi buffer. Il complesso proteico è stato ricristallizzato in tampone contenente solfato di ammonio e dializzato15. Sebbene la cristallizzazione delle proteine dipenda dalle concentrazioni di proteine e precipitanti in soluzione, è difficile monitorare, prevedere e riprodurre la purificazione per altre forme mutanti di αcomplesso TS 2β2Stin soluzione. Questo protocollo ha il vantaggio di non utilizzare alcun metodo cromatografico; tuttavia, gli svantaggi sono il lungo tempo di purificazione necessario per cristallizzare, dializzare e ricristallizzare, in genere richiedendo 5-7 giorni. Per ottenere cristalli adatti alla raccolta di dati a raggi X, sono state valutate più di 600 condizioni di cristallizzazione utilizzando una combinazione e variazione di concentrazione proteica, temperatura, precipitanti (PEG 4.000, 6.000 e 8.000) e additivi (CaCl2,MnCl2,ZnCl 2,cadaverina, putrescina, spermina o spermidina)15. I cristalli avevano una forma cristallina migliore e crescevano più velocemente in condizioni contenenti il 12% di PEG 8.000 e 2 mM di spermina. La cristallizzazione era più favorevole a 25 °C piuttosto che a 4, 30 o 42 °C e cresceva fino alle dimensioni massime entro 3 giornie 15. Diverse strutture cristalline α2β2StTS sono state segnalate in quel momento (1996-1999)16,17,18,19,20,21 e molte altre strutture sono state pubblicate fino ad oggi.

Qui, lo scopo principale è quello di presentare protocolli alternativi per purificare la triptofano sintasi e ottimizzare la cristallizzazione delle proteine. Il presente lavoro mostra miglioramenti significativi per purificare la subunità α isolata di tipo selvatico (αStTS), la subunità β isolata (βStTS), ricostituita α complessoTS 2β2Stdalle subunità isolate e forme wild type e mutanti del complesso α2β2StTS. I vantaggi rispetto ai protocolli passati sono considerevoli poiché il tempo di purificazione è stato ridotto in modo significativo e la cristallizzazione e la crioprotezione sono state ottimizzate. Le forme mutanti del complesso α 2 β2StTS progettate in questo lavoro si sono cristallizzate vicino allastessacondizione utilizzata per la forma wild type. Tuttavia, l'ottimizzazione della cristallizzazione fine era necessaria per ottenere grandi cristalli singoli di qualità sufficiente per la determinazione della struttura a risoluzione quasi atomica. Ad oggi, ci sono 134 strutture cristalline di triptofano sintasi depositate nella Protein Data Bank (PDB), che rappresentano rispettivamente 101, 31 e 2 strutture cristalline per batteri, archaea ed eucarioti. Piacevolmente, 73 strutture appartengono a S. enterica serovar typhimurium e 5 strutture cristalline del complesso α2β2StTS hanno limiti di risoluzione superiori a 1,50 Angstrom. Non sorprende che 4 su 5 siano stati preparati nel nostro gruppo di ricerca (PDB IDs: 5CGQ a 1,18 Å, 4HT3 a 1,30 Å, 4HPJ a 1,45 Å, 6DZ4 a 1,45 Å risoluzione). Si prevede che le raffinate strutture cristalline della forma mutante del complesso α 2β2StTS forniranno nuove informazioni sul meccanismo e sui ruoli svolti dai residui di aminoacidi essenziali coinvolti nella sintesi di L-triptofano.

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Protocol

1. Protocollo veloce per purificare la subunità α e β e il complesso TS α2β2Stricombinato

  1. Subclonazione del DNA nel vettore di espressione pETSUMO
    1. Ottenere il gene di accoppiamento traslazionale (trpA e trpB) che codifica per le subunità α- e β- del triptofano sintasi dal batterio Salmonella enterica sierovar typhimurium clonato nel vettore di espressione pEBA-1022. Usa il vettore pEBA-10 come modello di DNA.
      NOTA: In alternativa, i primer elencati di seguito possono essere utilizzati per amplificare entrambi i geni dal genoma del sierotipo typhimurium di Salmonella enterica. Tutte le fasi della biologia molecolare sono state seguite come descritto in Molecular Cloning: A Laboratory Manual23.
    2. Utilizzare la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare individualmente la sequenza polinucleotidica a lunghezza intera della subunitàα (αStTS) con primer αStTS-FW-Bam e αStTS-Rev-Eco e la sequenza a lunghezza intera di β-subunità(βStTS) con primer βStTS-FW-Bam e βStTS-Rev-Hind. Utilizzare una temperatura di fusione di circa 55 °C e un tempo di estensione della polimerasi di 2 min.
      1. Utilizzare dna polimerasi ad alta fedeltà (ad esempio, Phusion) e il protocollo del produttore per amplificare le sequenze di DNA. Per una reazione PCR da 50 μL aggiungere 34 μL di acqua priva di nucleasi, 10 μL di tampone di reazione 5x, 1 μL di 10 mM dNTPs, 1 μL di primer avanzato da 10 μM, 1 μL di primer inverso da 10 μM, 1 μL di DNA Template (200 ng), 1,5 μL di DMSO, 0,5 μL di Phusion DNA polimerasi.
      2. Per il programma PCR, utilizzare un avviamento a caldo (180 secondi a 98 °C) seguito da 30 cicli di amplificazione (30 secondi a 98 °C, 30 secondi a 55 °C e 120 secondi a 72 °C) e un'estensione finale (300 secondi a 72 °C).
        NOTA: le sequenze in corsivo corrispondono rispettivamente ai siti di restrizione BamHI, EcoRI, BamHI e HindIII. L'efficienza di scissione enzimatica vicino ai termini dei frammenti PCR è stata migliorata aggiungendo basi extra (sequenze minuscole).
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. Caricare il prodotto PCR su gel di agarose allo 0,8% in 1x tampone TAE (40 mM Tris, 20 mM acido acetico e 1 mM EDTA) a 6 V / cm, estrarre il gel la banda di DNA di interesse e purificare il gel il frammento PCR utilizzando un kit di perle di silice seguendo le istruzioni del produttore.
      1. Digerire almeno 200 ng di ciascun frammento di DNA con opportuni enzimi di restrizione e condizioni raccomandate dal produttore per 2 ore a 37 °C.
      2. Per impostare una reazione di digestione di restrizione da 50 μL aggiungere 34 μL di acqua priva di nucleasi, 10 μL di DNA (200 ng), 5 μL di tampone di reazione 10x, 0,5 μL di enzima di restrizione 1 e 0,5 μL di enzima di restrizione 2.
      3. Caricare il prodotto di digestione su gel di acarosio allo 0,8% su 1x TAE a 6 V / cm, estratto di gel e gel purificare il frammento digerito utilizzando un kit commerciale.
    4. Subclonare singolarmente ogni frammento nel vettore modificato di espressione di E. coli pET SUMO, precedentemente digerito con opportuni enzimi e gel purificato.
      NOTA: questo vettore è una versione modificata del pET SUMO commerciale. Questo vettore è stato ottimizzato per la clonazione enzimatica di restrizione. Il sito di clonazione multiplo (MCS) del vettore pET28b(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI e XhoI) è stato inserito nel sito di clonazione pET SUMO. Questo vettore contiene un tag N-terminale 6x-istidina nel frame con la proteina Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) e più siti di clonazione.
    5. Ligate 100 ng di pET SUMO modificato e 50 ng di frammento di PCR con T4 DNA ligasi per 2 ore a 25 °C.
    6. Trasformare il plasmide costruito in cellule competenti di cellule α del ceppo dh10B di E. coli. Cellule a piastre su piastre lb agar contenenti 35 μg/mL kanamicina. Incubare la piastra invertita durante la notte a 37 °C.
    7. Seleziona una singola colonia da ogni trasformazione, prepara DNA plasmidico ultra-puro ed esegui il sequenziamento del DNA per verificare che αStTS o βStTS siano stati clonati nel frame con il tag N-terminale His6-SUMO.
      NOTA: Preparare le scorte di glicerolo di coltura cellulare (trasformare la sospensione cellulare in concentrazione finale del 16% di glicerolo sterile) e conservarle a lungo termine a -80 °C.
    8. Trasformare l'espressione plasmide SUMO-αStTS o SUMO-βStTS individualmente in cellule competenti del ceppo di espressione di E. coli Rosetta (DE3) pLysS con un sistema basato sul promotore T7. Placcare le cellule ricombinanti su piastre di agar Luria Bertani (LB) contenenti 35 μg/mL di kanamicina e cloramfenicolo. Incubare la piastra invertita durante la notte a 37 °C.
    9. Dopo aver avuto successo nella formazione della colonia, scegliere una singola colonia (senza colonie satelliti) e disperderla in 5 ml di terreno LB con entrambi gli antibiotici. Celle di coltura durante la notte con agitazione a 200 giri/min a 37 °C.
      NOTA: Preparare le scorte di glicerolo di coltura cellulare, conservare a lungo termine a -80 °C o utilizzare immediatamente per l'espressione proteica ricombinante.
  2. Espressione delle subunità SUMO-αStTS e SUMO-βStTS
    1. Inoculare cellule fresche di E. coli ceppo Rosetta (DE3) pLysS che ospitano SUMO-αStTS o SUMO-βStTS costruisce o raschia parte del brodo di glicerolo congelato in una coltura di 50 ml di LB contenente 35 μg / mL kanamicina e cloramfenicolo. Coltiva le cellule durante la notte con agitazione a 200 giri/min a 37 °C.
    2. La mattina successiva, inoculare 5 mL della coltura cellulare notturna in un 2x 1000 mL fresco e sterile di LB contenente il 2% di glicerolo più kanamicina e cloramfenicolo (2,8 L Fernbach flask). Coltivare colture cellulari con agitazione a 200 giri/min a 37 °C.
      NOTA: L'espressione di SUMO-αStTS o SUMO-βStTS nel brodo LB produce 125-150 mg di proteine marcate per litro. Prendi in considerazione la possibilità di scalare il protocollo verso l'alto o verso il basso per soddisfare esigenze specifiche.
    3. Indurre l'espressione proteica ricombinante quando l'OD600 raggiunge 0,6-0,8 mediante aggiunta di tiogalattotopiranoside isopropile β-D-1 (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,4 mM seguita da incubazione a 30 °C durante la notte con agitazione a 200 giri/min.
    4. Raccogliere le cellule centrifugando a 4.000 x g a 4 °C per 20 min. Rimuovere il surnatante e sospendere di frequente i pellet cellulari con tampone di lisi fredda 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, contenente 500 mM NaCl, 5% glicerolo, 10 mM 2-mercaptoetanolo e 40 mM imidazolo-Cl) per un volume finale di 60 ml.
      NOTA: le cellule possono essere conservate a lungo termine a -80 °C o utilizzate immediatamente per la purificazione delle proteine. Per conservare le cellule, dividere la sospensione cellulare in 2 tubi conici centrifughi monouso da 50 mL e mantenere i pellet cellulari a -80 °C fino alla fase di purificazione delle proteine.
  3. Purificazione del α- e β-subunità di triptofano sintasi
    NOTA: Tutte le procedure devono essere condotte a 4 °C, salvo diversa indicazione. Per ridurre i tempi di purificazione, equilibrare le colonne di affinità cariche di nichel di agarose Ni-NTA e la colonna di esclusione dimensionale nel tampone prima della purificazione delle proteine o durante l'espressione proteica ricombinante.
    1. Interrompere il pellet cellulare mediante sonicazione utilizzando un sonificatore digitale con sonda Horn da 1/2 "(o un'apparecchiatura simile). Eseguire 20 cicli all'80% di ampiezza del ciclo di lavoro a bagnomaria utilizzando 10 s di impulso e 20 s di riposo o fino alla completa interruzione della cella.
    2. Centrifugare il llisi cellulare a 30.000 x g per 30 min. Aspirare il surnatante, assicurando che il pellet non si sposti dal tubo. Filtrare il surnatante con un'unità filtrante da 0,45 μm su ghiaccio e farlo scorrere attraverso una colonna di affinità carica di nichel ni-NTA ni-NTA da 15 mL preequiliblato nel tampone di lisi 1.
      NOTA: Ogni colonna di agarose Ni-NTA verrà utilizzata per purificare la proteina ricombinante SUMO-αStTS o SUMO-βStTS. La purificazione può essere eseguita in una colonna Ni-NiTA da 2x 5 mL collegata a un sistema di cromatografia liquida proteica veloce. Purificare una proteina alla volta.
    3. Lavare la colonna di agarose Ni-NTA in 100 mL di tampone di lisi 1.
    4. Procedere con un'eluizione one-step da 80 mL con tampone E1 (tampone Tris-Cl da 25 mM, pH 7,8, contenente 200 mM NaCl, 5% glicerolo e 400 mM imidazolo-Cl).
      NOTA: SUMO-proteasi tollera fino a 300 mM di imidazolo e la membrana dei dispositivi di filtraggio centrifugo tollera fino a 100 mM di imidazolo. Si consiglia di eseguire una precipitazione del solfato di ammonio per rimuovere elevate quantità di imidazolo e ridurre il tempo di purificazione invece di diluire il campione proteico e perdere tempo con la concentrazione proteica.
    5. Valutare il volume iniziale della frazione surnatante. Aggiungere lentamente piccole quantità di solfato di ammonio alla volta, fino a raggiungere una saturazione del 60% (39,48 g/ 100 ml) a 25 °C. Mescolare delicatamente la soluzione per 30 minuti ed evitare bolle. Centrifuga a 10.000 x g per 15 min.
    6. Aspirare ed eliminare attentamente la frazione surnatante. Spese di sospensione della frazione del pellet in 20 mL di tampone campione (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCl e 5% di glicerolo).
    7. Per la scissione His-SUMO-tag con SUMO-proteasi, aggiungere il frammento ricombinante di proteasi 1 specifica di Ubl di Saccharomyces cerevisiae in un rapporto 1:1000 e incubare la miscela per 2 ore a 4 °C.
    8. Centrifugare il prodotto di digestione a 10.000 x g a 25 °C per 20 minuti per rimuovere gli aggregati proteici prima di caricare il campione attraverso una colonna di cromatografia di affinità.
    9. Rimuovere le tracce del tag His6-SUMO che passa il campione 20 mL riaspenato su una colonna di acarosio Ni-NTA da 15 mL, precedentemente bilanciata nel tampone di lisi 1.
    10. Raccogliere il campione pass-through contenente il αStTS non contrassegnato o βStTS.
    11. Lavare la colonna Ni-NTA in 20 ml di buffer 1 per raccogliere gli avanzi di αStTS o βStTS non etichettati.
    12. Concentrare ciascuna subunità separatamente con un'unità filtrante centrifuga da 15 mL 10 kDa ruotando a 3.000 x g a 4 °C. Trasferire la proteina concentrata in un tubo fresco da 2,0 ml e microcentrifuga (10.000 x g, 10 min, 4 °C) per rimuovere gli aggregati. Determinare la concentrazione proteica24, preparare aliquote da 1 mL a 20-25 mg mL-1, etichettare, congelare in azoto liquido e conservarle a -80 °C.
      NOTA: i campioni di proteine pre-purificati possono essere conservati a lungo termine a -80 °C o utilizzati immediatamente per la purificazione delle proteine su una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC).
    13. Prendi un'aliquota proteica (20 mg) e microcentrifuga a 10.000 x g per 10 minuti per rimuovere gli aggregati precedenti sec.
    14. Caricare il campione su una colonna cromatografica ad esclusione dimensionale (ad esempio, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) collegata a una cromatografia liquida proteica veloce ad una portata di 0,5 mL min-1, precedentemente bilanciata in tampone SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glicerolo, 0,1 mM piridossale fosfato).
      NOTA: per purificare quantità più elevate di subunitàisolataα St TS o βStTS e ridurre il numero di cicli SEC, caricare un campione da 5 mL a 20-25 mg mL-1 su una colonna cromatografica di esclusione dimensionale ad una portata di 1,5 mL min-1.
    15. Valutare la qualità di αStTS o βStTS nella frazione di picco utilizzando un'elettroforesi al 12% o al 15% di sodio dodecil solfato-gel (SDS-PAGE), rispettivamente, colorata con la colorazione blu brillante coomassie25.
    16. Concentrare le proteine con unità filtranti centrifughe fresche da 15 mL 10 kDa, determinare la concentrazione proteica24,preparare aliquote da 0,5 mL a 20-25 mg mL-1,etichettare, congelare in azoto liquido e conservarle a -80 °C.
  4. Purificazione del complesso α2β2StTS dalle subunità α e β
    NOTA: Equilibrare la colonna cromatografica di esclusione dimensionale (Sephadex S-200 HR o Superdex 200 pg) in tampone SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glicerolo, 0,1 mM piridossal fosfato).
    1. Per purificare il complesso wild-type α2β2StTS dalle subunità α e β, scongelare campioni concentrati di αstTS e βstTS a 4 °C.
    2. Aliquote combinate (1,2 αStTS: rapporto molare 1,0 βStTS) e incubate a 4 °C per 1 ora.
      NOTA: l'eccesso di αStTS è necessario per garantire che β maggior parte diStTS venga incorporata nel complesso α2β2StTS.
    3. Rimuovere gli aggregati proteici mediante microcentrifugazione (10.000 x g, 10 min, 4 °C).
    4. Caricare il surnatante chiarito nella colonna di esclusione delle dimensioni.
    5. Valutare la qualità di αStTS o βStTS nella frazione di picco utilizzando un'elettroforesi al 12% o al 15% di sodio dodecil solfato-gel (SDS-PAGE), rispettivamente, colorata con la colorazione blu brillante coomassie25.
    6. Determinare la concentrazione proteica24, preparare aliquote da 250-1000 μL a 15-20 mg mL-1, congelamento flash in azoto liquido e conservare a -80 °C.

2. Purificazione del tipo selvatico o della forma mutante del complesso α2β2StTS

  1. Mutagenesi sito-diretta per preparare β mutantiStTS
    1. Utilizzare il vettore di espressione pEBA-1022 come modello di DNA durante due fasi della reazione a catena della polimerasi per introdurre specifiche mutazioni puntiformi nella sequenza polinucleotidica TS a catena β.
      NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato per introdurre una singola mutazione puntiforme in α o β subunità da Salmonella typhimurium triptofano sintasi. Inoltre, devono essere opportunamente progettati nuovi primer oligonucleotidici contenenti la mutazione desiderabile. In questo lavoro, sono elencate le mutazioni βQ114A, βK167T βS377A.
    2. Eseguire reazioni PCR utilizzando coppie di primer nucleotidici TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev e TS-FW-NcoI/S377A-Rev per generare rispettivamente frammenti A1, B1 e C1.
      NOTA: Oligonucleotide TS-NcoI-FW e TS-SacI-Rev, rispettivamente, ricotture a monte e a valle della sequenza polinucleotidica αβ StTS clonata nel vettore pEBA-10.
      1. Utilizzare dna polimerasi ad alta fedeltà (ad esempio, Phusion) e il protocollo del produttore per amplificare le sequenze di DNA. Per una reazione PCR da 50 μL, aggiungere 34 μL di acqua priva di nucleasi, 10 μL di tampone di reazione 5x, 1 μL di 10 mM dNTPs, 1 μL di primer avanzato da 10 μM, 1 μL di primer inverso da 10 μM, 1 μL di DNA Template (200 ng), 1,5 μL di DMSO, 0,5 μL di DNA polimerasi.
      2. Per il programma PCR, utilizzare un avviamento a caldo (180 secondi a 98 °C) seguito da 30 cicli di amplificazione (30 secondi a 98 °C, 30 secondi a 55 °C e 120 secondi a 72 °C) e un'estensione finale (300 secondi a 72 °C).
        NOTA: Tutte le fasi della biologia molecolare sono state seguite come descritto in Clonazione molecolare: un manuale di laboratorio23. Mentre una sequenza minuscola corrisponde a un sito di restrizione, una sequenza in grassetto e corsivo corrisponde a una mutazione.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Eseguire reazioni PCR utilizzando coppie di primer nucleotidici TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF e TS-Rev-SacI/S377A-FF per generare rispettivamente frammenti A2, B2 e C2.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Utilizzare la reazione a catena della polimerasi per amplificare individualmente i frammenti parziali. Utilizzare una temperatura di fusione di 55 °C e un tempo di estensione della polimerasi di 2 min.
    5. Per eseguire il secondo ciclo di reazioni PCR, caricare il prodotto PCR sopra su gel di agarose allo 0,8% su 1x TAE a 6 V/cm e l'estratto di gel e il gel purificano i frammenti di interesse.
      1. Mescolare separatamente i frammenti A1/A2, B1/B2 e C1/C2 in quantità equimolari, denaturare termicamente la miscela per 10 minuti a 96 °C e ricottura a 25 °C. Estendere i fili ricombinanti con una polimerasi ad alta fedeltà e desossiribonucleotidi secondo il protocollo del produttore.
    6. Per generare un elevato numero di copie del frammento di DNA mutante a lunghezza intera, aggiungere oligo primer TS-FW-NcoI e TS-Rev-SacI per eseguire una seconda PCR.
    7. Caricare il prodotto PCR su acarosio allo 0,8% in 1x tampone TAE a 6 V/cm, estrarre in gel la banda di DNA di interesse, purificare il frammento di PCR e procedere con un'appropriata digestione di restrizione per 2 ore a 37 °C seguendo il tampone appropriato e le condizioni raccomandate dal produttore.
      1. Digerire almeno 200 ng di ciascun frammento di DNA con opportuni enzimi di restrizione e condizioni raccomandate dal produttore per 2 ore a 37 °C. Per impostare una reazione di digestione di restrizione da 50 μL aggiungere 34 μL di acqua priva di nucleasi, 10 μL di DNA (200 ng), 5 μL di tampone di reazione 10x, 0,5 μL di enzima di restrizione 1 e 0,5 μL di enzima di restrizione 2. Caricare il prodotto di digestione su acarosio allo 0,8% in 1 tampone TAE a 6 V/cm e purificare il frammento di PCR digerito.
    8. Digerire 200 ng del costrutto pEBA-10 con gli enzimi di restrizione NcoI e SacI seguendo la raccomandazione del produttore. Caricare il prodotto digestivo su gel di acarosio allo 0,8% in 1 tampone TAE a 6 V / cm, asportare la banda corrispondente al vettore e purificare il gel il vettore digerito.
    9. Ligate 100 ng di vettore con 50 ng di frammento di PCR, precedentemente digerito e purificato, con T4 DNA ligasi per 2 ore a 25 °C. Trasformare il plasmide costruito in cellule competenti E. coli ceppo DH10B. Cellule a piastre su piastre lb agar contenenti 50 μg/mL diampicillina. Incubare la piastra invertita durante la notte a 37 °C.
    10. Scegli una singola colonia (senza colonie satelliti) da ogni trasformazione cellulare e disperdila in 5 ml di terreno LB contenente ampicillina. Coltiva le cellule durante la notte con agitazione a 200 giri/min a 37 °C. Preparare 10 μg di DNA plasmidico ultrapuro da ogni costrutto ingegnerizzato. Preparare le scorte di glicerolo di coltura cellulare (trasformare la sospensione cellulare in concentrazione finale del 16% di glicerolo sterile) e conservare a lungo termine a -80 °C.
    11. Eseguire il sequenziamento del DNA per confermare la sequenza a lunghezza intera che codifica le subunità α e β del triptofano sintasi. Confermare ogni singola mutazione ed eliminare qualsiasi costrutto plasmidici contenente mutazioni casuali indesiderate. I primer oligonucleotidici utilizzati in questo studio sono elencati di seguito.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
      NOTA: Primer oligonucleotidici TS-1F, TS-1R, TS-2F e TS-3F ricotto sulla sequenza polinucleotidica della subunità β (codice di adesione GenBank: CP051286.1). Primer TS-4F e TS-5F ricotto sulla sequenza polinucleotidica della subunità α (codice di adesione GenBank: CP053865.1).
    12. Utilizzare 200 ng di ciascun costrutto plasmidico (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T e pEBA-10-βS377A) per trasformare le cellule competenti del ceppo di espressione di E. coli CB149, prive dell'operone trp 26. Dopo aver avuto successo nella formazione della colonia, scegliere una singola colonia e far crescere le cellule in 5 mL di terreno LB contenente 50 μg / mL di ampicillina. Coltura nell'incubatrice batterica a 37 °C durante la notte. Preparare le scorte di glicerolo di coltura cellulare, conservare a lungo termine a -80 °C o utilizzare immediatamente per l'espressione proteica ricombinante.
      NOTA: Una singola mutazione puntiforme in α o β subunità da Salmonella typhimurium triptofano sintasi può compromettere la funzione enzimatica o una minore sintesi di L-triptofano nel ceppo CB149 di E. coli. Si prega di prendere in considerazione l'utilizzo di E. coli ceppo BL21(DE)pLys-S o Rosetta (DE3)pLys-S se in un gel SDS-PAGE non viene rilevata alcuna espressione o quantità inferiori di complesso α 2β2StTS.
  2. Espressione del tipo selvatico e della forma mutante del complesso α2β2StTS in E. coli
    1. Coltivare il ceppo di espressione di E. coli che ospita il costrutto desiderabile in un mezzo LB fresco e sterile da 50 ml contenente ampicillina da 50 μg/mL. Coltiva le cellule durante la notte con agitazione a 200 giri/min a 37 °C.
    2. Aggiungere 5 mL di coltura cellulare durante la notte in un 2x 1000 mL fresco e sterile di LB contenente il 2% di glicerolo più ampicillina (pallone fernbach da 2,8 L). Coltivare colture cellulari con agitazione a 200 giri/min a 37 °C.
    3. Indurre l'espressione proteica ricombinante quando l'OD600 raggiunge 0,6-0,8 mediante aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 0,4 mM seguita da incubazione a 30 °C durante la notte con agitazione a 200 rpm.
    4. Raccogliere le cellule centrifugando a 4.000 x g a 4 °C per 20 min. Rimuovere il surnatante e sospendere di riconsenni il pellet cellulare con tampone di lisi fredda 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, contenente 100 mM NaCl, 5 mM ditiotricilo, 1 mM EDTA e 1 mM PMSF) per un volume finale di 50 mL tampone.
      NOTA: le cellule possono essere conservate a lungo termine a -80 °C o utilizzate immediatamente per la purificazione delle proteine. Per conservare le cellule, dividere la sospensione cellulare in 2 tubi conici centrifughi monouso da 50 mL e mantenere i pellet cellulari a -80 °C fino alla fase di purificazione delle proteine. L'espressione della forma mutante e wild type di α2β2StTS in brodo LB produce 125-150 mg di proteine per litro. Prendi in considerazione la possibilità di scalare il protocollo verso l'alto o verso il basso per soddisfare esigenze specifiche.
  3. Purificazione di specie selvatiche o mutanti del complesso α2β2StTS
    NOTA: il seguente protocollo ha lo scopo di purificare il tipo selvatico ricombinante non etichettato o la forma mutante del α2β2StComplesso TS entro 1 giorno, a seconda del set di abilità e degli sforzi. Per ridurre i tempi di purificazione, equilibrare la colonna di esclusione delle dimensioni nel tampone prima della purificazione/espressione delle proteine. Purificazione di α selvatiche o mutanti2β2StIl complesso TS viene effettuato mediante una purificazione in due fasi comprendente il frazionamento del solfato di ammonio e una cromatografia di esclusione dimensionale. Questo protocollo produce 60-100 mg di complesso puro da 1 L di lb medio.
    1. Interrompere il pellet cellulare mediante sonicazione utilizzando un sonificatore digitale con sonda Horn da 1/2 "(o un'apparecchiatura simile). Eseguire 20 cicli all'80% di ampiezza del ciclo di lavoro a bagnomaria utilizzando 10 s di impulso e 20 s di riposo o fino alla completa interruzione della cella.
    2. Centrifugare il l'allesato cellulare a 30.000 x g per 30 min a 25 °C. Aspirare il surnatante, assicurando che il pellet non si sposti dal tubo. Filtrare la frazione surnatante chiarificata con un filtro da 0,45 μm a temperatura ambiente.
    3. Valutare il volume iniziale della frazione surnatante chiarita. Aggiungere lentamente piccole quantità di solfato di ammonio alla volta, fino a raggiungere una saturazione del 20% (11,51 g / 100 ml). Effettuare il frazionamento del solfato di ammonio a 25 °C. Mescolare delicatamente la soluzione per 10 minuti ed evitare bolle.
    4. Centrifugare a 30.000 x g per 10 min a 25 °C. Trasferire la frazione surnatante al 20% in un matraccio pulito. Risospenare delicatamente la frazione di pellet al 20% in 20 mL di tampone campione 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, contenente 100 mM NaCl, 1 mM EDTA e 2 mM di ditiotricilo) e preparare un campione per eseguire il gel SDS-PAGE. Scartare la frazione di pellet al 20%.
    5. Valutare il volume iniziale della frazione surnatante al 20%. Aggiungere solfato di ammonio al 30% di saturazione raggiunta (5,94 g / 100 ml), mescolare la soluzione, evitare bolle e centrifugare come prima. Trasferire la frazione surnatante al 30% in un matraccio pulito. Rispensare delicatamente il 30% della frazione di pellet in 20 mL di tampone campione 2 e preparare un campione per eseguire il gel SDS-PAGE. Scartare la frazione di pellet al 30%.
    6. Valutare il volume iniziale della frazione surnatante al 30%. Aggiungere solfato di ammonio a una saturazione del 40% (6,14 g / 100 ml), mescolare la soluzione, evitare bolle e centrifugare come prima. Trasferire la frazione surnatante al 40% in un matraccio pulito. Rispensare delicatamente il 40% della frazione di pellet in 10 ml di tampone campione 2 e preparare un campione per eseguire il gel SDS-PAGE. Scartare la frazione surnatante al 40%.
      NOTA: Valutare la qualità del complesso αβStTS utilizzando campioni delle frazioni di surnatante e pellet al 30% e 40% in un gel SDS-PAGE al 12%25. Se si verifica che qualsiasi altro complesso mutante αβStTS sia nella frazione surnatante al 40%, procedere con una saturazione del 60% del solfato di ammonio (13,0 g / 100 ml). Le aliquote proteiche pre-purificate del complesso pre-purificato α2β2 StTS possono essere conservate a lungo termine a -80 °C o utilizzate immediatamente per la purificazione delle proteine su una colonna cromatografica di esclusione dimensionale (SEC).
    7. Microcentrifugare il campione proteico a 10.000 x g,20 min, 4 °C e caricare la frazione surnatante su una colonna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR collegata a una cromatografia liquida proteica veloce ad una portata di 0,5 mL min-1, precedentemente bilanciata in tampone SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glicerolo, 0,1 mM piridossal fosfato).
      NOTA: Per purificare grandi quantità di complesso, caricare un campione da 5 mL a 20-25 mg mL-1 su una colonna HiLoad 26/600 Superdex 200 pg ad una portata di 1,5 mL min-1.
    8. Valutare i campioni raccolti lungo il frazionamento del solfato di ammonio e le frazioni di picco dalla colonna SEC su un gel SDS-PAGE al 12% colorato con colorazione blu brillante Coomassie25.
    9. Concentrare il tipo selvatico o mutante αcomplesso TS2 β2Stcon un'unità filtrante centrifuga cutoff da 15 mL 100 kDa ruotando a 3.000 x g a 4 °C. Trasferire la proteina concentrata in un tubo fresco da 2,0 ml e microcentrifuga (10.000 x g, 10 min, 4 °C) per rimuovere gli aggregati.
    10. Determinare la concentrazione proteica24, preparare aliquote da 0,5 ml a 20-25 mg mL-1, etichettare, congelare in azoto liquido e conservarle a -80 °C.

3. Cristallizzazione ottimizzata per wild type e forma mutante del complesso α2β2StTS

NOTA: La condizione di cristallizzazione iniziale per il complesso α2β2StTS è stata precedentemente riportata in condizioni contenenti il 12% di PEG 8.000 e 2 mM di spermina22.

  1. Preparare soluzioni di riserva prima dei saggi di cristallizzazione per ottenere una migliore riproducibilità della cristallizzazione. Per eseguire studi strutturali con TS, cristallizzare la proteina con lo ione Na+ o Cs+ nel sito di coordinazione metallica del complesso bienzimatico.
    1. Preparare 5 mL di soluzione stock di 200 mM di spermina in acqua e mantenere aliquote da 500 μL a -20 °C.
    2. Preparare in acqua una soluzione madre da 50 mL di PEG 8000 al 30% (p/v) e conservare 25 mL di aliquote in un pallone conico centrifugo monouso da 50 mL a 25 °C.
    3. Preparare una soluzione stock da 25 ml da 1 M CsCl in acqua e conservare a 25 °C.
    4. Preparare 25 mL di soluzione stock da 1 M NaCl in acqua e conservare a 25 °C.
    5. Preparare 3 soluzioni stock da 50 mL di bicine da 1 M e titolare con CsOH o NaOH per ottenere soluzioni tamponate a pH 7,6, 7,8 e 8,0. Mantenere 25 mL di aliquote a 4 °C.
  2. Scongelare un campione di α2β2StTS complex (20-25 mg mL-1) in un bagno di ghiaccio.
  3. Microcentrifugare il campione a 10.000 x g per 10 minuti a 25 °C per rimuovere gli aggregati proteici.
  4. Trasferire la frazione surnatante eliminata in un tubo microcentrifuga pulito.
  5. Concentrazione proteica stimata24 e aliquote proteiche diluite (150-200 μL) a 15 mg mL-1 con 50 mM bicine-CsOH o -NaOH, pH 7,8 contenente 50 mM CsCl o NaCl. Conservare il campione proteico a 25 °C.
  6. Preparare le soluzioni di serbatoio da 500 μL per 3 piastre di caduta da 24 pozzi in tubi microcentrifuga sterili da 1,5 mL etichettati. La soluzione del serbatoio contiene 50 mM bicine-CsOH o -NaOH, 50 mM CsCl o NaCl e PEG 8000. Variare la concentrazione di PEG 8000 (6-11%) sulle colonne della piastra e la concentrazione di spermina (2-8 mM) sulle file di piastre. Modificare il pH del tampone (pH 7,6, 7,8 e 8,0) per ogni set.
  7. Tappare i tubi e il vortice vigorosamente di almeno 10 secondi. Centrifugare tubi a 10.000 x g per 10 min a 25 °C per rimuovere lebolle. Erogare 500 μL di soluzione tamponata in ciascun serbatoio etichettato.
  8. Utilizzare una micropipetta P-10 ed erogare 5 μL di soluzione proteica a 15 mg mL-1 per ogni goccia seduta. Evita le bolle. Aggiungere 5 μL di ogni soluzione di serbatoio corrispondente alla goccia proteica. Evitare le bolle durante la miscelazione e non pipettare su e giù per omogeneizzare la miscela.
  9. Fissare la piastra con un nastro adesivo trasparente e conservare la piastra a 25 °C. I cristalli appaiono in 2-5 giorni e crescono fino alle loro dimensioni complete entro due settimane.

4. Raccolta dei dati di diffrazione a raggi X e soluzione di struttura complessa α2β2StTS

NOTA: Prima della raccolta dei dati di diffrazione a raggi X, preparare in anticipo la soluzione crioprotettiva per ciascun cristallo. Utilizzare la soluzione di riserva specifica per preparare 3 aliquote contenenti concentrazioni crescenti di dsolfossido di d metile in soluzione (10, 20 e 30% v/v) e ligando (s) specifico(i). Il dimetilsolfossido è risultato essere un crioprotente migliore del glicerolo, del glicole etilenico e del PEG 200-300.

  1. Raccogli un grande cristallo singolo usando un crioloop al microscopio stereoscopico.
  2. Pipettare 2 μL di ciascuna soluzione crioprotettiva contenente la soluzione di precipitazione più concentrazioni più concentrazioni più elevate di dmetilsolfossido e ligando (s) su un nuovo vetrino di copertura.
  3. Sequenzialmente, immergere il crystal in ogni goccia e lasciare che il cristallo si equilibra per 30 s nella soluzione crioprotettiva.
  4. Raffreddamento lampo del cristallo crioprotetto utilizzando un flusso di azoto gassoso a -173 °C (100 K) o immersione in azoto liquido per la conservazione a lungo termine in pucks.
    NOTA: Riempire una schiuma Dewar con azoto liquido, pre-raffreddare un disco di cristallo, conservare i cristalli nello stoccaggio criogenico Dewar e spedire i cristalli al sincrotrone usando uno spedizioniere a secco.
  5. Procedere con la raccolta dei dati di diffrazione a raggi X a -173°C. Registra i dati di diffrazione a raggi X utilizzando un tempo di esposizione di 0,5-4,0 s e oscillazioni di 0,5°. Ruotare il cristallo di 180-360°.
  6. Elabora le immagini di diffrazione a raggi X con iMosflm27 per generare un file di riflessione nel gruppo di spazio appropriato. Generalmente, α2β2StTS appartengono al gruppo spaziale C 121 (C2).
  7. Scala insieme più osservazioni di riflessioni con Scala28, implementato nel pacchetto CCP429.
  8. Risolvi la struttura del complesso α2β2StTS ad alta risoluzione mediante sostituzione molecolare utilizzando MolRep30 e un modello di ricerca appropriato. Ispezionare il modello e la mappa della densità elettronica in Coot31 dopo una soluzione di struttura di successo.
    NOTA: Ci sono molte strutture di cristalli TS depositate nella Banca Dati delle Proteine con diversi ligandi. Per una migliore fase di sostituzione molecolare e un tempo ridotto per adattarsi alla nuova struttura cristallina, utilizzare il miglior modello di ricerca contenente ligando (s) di interesse. Procedere con l'affinamento della struttura cristallina in CCP429,30 o Phenix31.
  9. Effettuare regolazioni manuali al modello utilizzando Coot32, seguito da raffinamento automatico con Refmac29,33 o phenix.refine31,34. Creare e perfezionare il modello finale eseguendo cicli iterativi di costruzione del modello in Coot32 e perfezionamento automatizzato.
  10. Procedere con la deposizione dei fattori di coordinate e struttura nel sito web della Protein Data Bank.

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Representative Results

Purificazione delle subunità α-e β-del triptofano sintasi
La α-subunità (αStTS) e la β-subunità (βStTS) della Salmonella typhimurium triptofano sintasi sono state subclonate nel vettore PET SUMO modificato. La Figura 1A mostra i risultati rappresentativi SDS-PAGE di due bande forti corrispondenti alla proteina di fusione His6-SUMO-αStTS (corsia αON) e His6-SUMO-βStTS (corsia βON). Il protocollo di purificazione descritto in questo lavoro ha permesso la purificazione di entrambe le subunità individualmente entro 2 giorni. Il primo giorno è stato utilizzato per purificare ogni proteina mediante cromatografia di affinità Ni-NTA, precipitazione del solfato di ammonio seguita da scissione His-SUMO-tag, rimozione delle tracce di His-SUMO-tag e concentrazione proteica. Le figure 1B e 1C mostrano i risultati SDS-PAGE rappresentativi della α-subunità e della purificazione β-subunità, rispettivamente. Il secondo giorno, la subunità α concentrata, la subunità β e il complesso TS α2β2Stdalle subunità α e β sono stati caricati su una colonna cromatografica di esclusione dimensionale. La Figura 1D mostra un tipico profilo di eluizione di αStTS, βStTS e α complessiTS 2β2Stsu una colonna di esclusione delle dimensioni hr S-200. La Figura 1E mostra un risultato SDS-PAGE rappresentativo delle frazioni di picco raccolte. Le frazioni di picco più pure sono state raggruppate, concentrate e il complesso α2β2StTS è stato utilizzato per studi di cristallizzazione delle proteine.

Purificazione del tipo selvatico e del complesso mutante α2β2StTS
Un altro protocollo rapido ed efficiente per purificare il tipo selvatico e la forma mutante del complesso di α 2β2S. typhimurium triptofano sintasi è descritto in questo lavoro. La Figura 2 mostra una rappresentazione del costrutto pEBA-10 contenente il gene di accoppiamento traslazionale wild type (trpA e trpB) che codifica per le subunità α- e β-22. Il protocollo di mutagenesi PCR in due fasi per generare forme mutanti del complesso TS α2β2Stè illustrato nella Figura 3.

Le regioni codificanti del complesso mutante α2β2StTS in pEBA10 sono state confermate dal sequenziamento del DNA e utilizzate per trasformare le cellule CB149 del ceppo E. coli 26. Il tipo selvatico e la forma mutante del complesso α2β2StTS sono stati sovraespressi e le proteine ricombinanti sono state purificate con successo entro 1-2 giorni. Il frazionamento del solfato di ammonio a temperatura ambiente ha prontamente rimosso la maggior parte delle proteine contaminanti dal sistema di espressione eterologa ( Figura4A, corsie 20P, 30P e 40S). Un profilo di eluizione rappresentativo con posizione di eluizione relativa di α 2β2StTS (143,06 kDa) su una colonna di cromatografia di esclusione delle dimensioni HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR è mostrato nella Figura 4B. La purezza delle frazioni di picco escluse è stata analizzata SDS-PAGE prima del pooling (Figura 4C).

Ottimizzazione dellacristallizzazionedel complesso ditriptofano sintasi wild type e mutanteα2 β 2
Aliquote di tipo selvatico e mutante α2β2StTScomplex a 15 mg ml-1 sono state utilizzate per impostare piastre a goccia da 24 pozzi. Tipicamente, le goccioline costituite da 5 μL di soluzione proteica e il volume equivalente di soluzione di serbatoio sono state bilanciate contro 500 μL di soluzione di serbatoio (Figura 5). La spermina è necessaria per cristallizzare il tipo selvatico e mutante α2β2StTS complesso22. Mentre la concentrazione finale di spermina per cristallizzare il tipo selvatico è di 2 mM, la concentrazione di spermina per cristallizzare il complesso mutante in questo lavoro ha mostrato di essere leggermente più alta (4-8 mM).

Grandi cristalli singoli sono stati ottenuti attraverso una fine ottimizzazione della cristallizzazione, variando PEG 8000 (6-11%) e il pH tampone bicine. Cristalli con morfologie diverse sono apparsi in 2-5 giorni e i cristalli sono cresciuti a grandezza naturale entro due settimane (Figura 6). Prima della raccolta dei dati di diffrazione a raggi X, i cristalli venivano immersi in una soluzione crioprotettiva (tampone serbatoio contenente fino al 30% di dimetilsolfossido). Il processo ottimizzato ha portato a cristalli di qualità adatti per misure di diffrazione a raggi X a risoluzione quasi atomica.

Analisi dei dati di diffrazione a raggi X
Una struttura cristallina del complesso wild type α2β2StTS è stata preparata con i metodi descritti in questo articolo e i dati di diffrazione a raggi X sono stati raccolti a risoluzione quasi atomica. Il cristallo è stato imbevuto di soluzione crioprotettiva contenente inibitore F9 (2- ({[4- (Trifluorometossidi)Fenil]Sulfonil}Ammino)Etil Diidrogeno Fosfato) e L-Triptofano.

Un set completo di dati di diffrazione a raggi X è stato raccolto sulla linea di fascio di sincrotrone SIBYLS 12.3.1 presso l'Advanced Light Source (Berkeley-CA) ruotando il cristallo di 360° con incrementi di 0,5°. Le intensità di diffrazione dei raggi X sono state elaborate e le statistiche di raccolta dei dati sono riassunte nella Tabella 1. L'analisi di simmetria indica che il cristallo apparteneva al gruppo spaziale monoclino C2. I parametri unità-cella sono a = 182,55, b = 59,30, c = 67,37Å, α = 90,00, β = 94,82, γ = 90,00°. Il valore calcolato del coefficiente di Matthews (Vm = 2,57 Å3 Da-1) suggerisce la presenza di una molecola eterodimero TS (αβ StTS) nell'unità asimmetrica del cristallo con un contenuto di solvente del 52,08%35,36. Tutti i dati a raggi X sono stati raccolti a basse temperature (100 K) per migliorare la qualità della diffrazione e diminuire il decadimento della radiazione. La struttura cristallina α2β2StTS in complesso è stata risolta con il metodo di sostituzione molecolare utilizzando il modello wild type αβ StTS in complesso con l'inibitore F9 nel sito di α e lo ione cesio nel sito di coordinazione del metallo (codice ID PDB: 4HT3). Il file di coordinate finale e i fattori di struttura sono stati depositati nel PPB con codice di adesione 5CGQ (Figura 7A). La struttura cristallina del complesso wild type α2β2StTS con inibitore F9 nel sito di α enzimatico (Figura 7B), ione cesio nel sito di coordinazione del metallo (Figura 7C), il cofattore piridossale 5'-fosfato legato covalentemente a βLys87 (Figura 7D), e il prodotto L-triptofano nel sito di β enzimatico ( Figura7E) è stato risolto con una risoluzione di Angstrom di 1,18. Il modello 5CGQ è la struttura cristallina TS α2β2Stpiù alta risoluzione depositata nel PDB fino ad oggi.

Figure 1
Figura 1: Purificazione delle subunità α e β e delcomplesso α2β2StTS. (A) Espressione proteica ricombinante. 12% di gel SDS-PAGE del profilo di espressione notturna di SUMO-αStTS (αON) e SUMO-βStTS (βON) dopo induzione IPTG a 30 °C (α/β0 precedente induzione IPTG). (B, C) Cromatografia di affinità Ni-NTA seguita da precipitazione del solfato di ammonio (saturazione al 60%), (S) estratto grezzo chiarificato (FT1) colonna Ni-NTA passaggio attraverso campione (W) campione di lavaggio della colonna (E) campione di eluato (60S) e (60P) surnatante e frazioni precipitate dopo centrifugazione ad alta velocità, rispettivamente (D) prodotto di digestione SUMO-proteasi (FT2) Colonna Ni-NTA passare attraverso il campione contenente la subunitàα StTS o βStTS. (D) profilo di eluizione della subunitàStTS α (28,67 kDa), della subunitàβ StTS (42,86 kDa) e del complesso α2β2StTS (143,06 kDa) con una colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. Ogni esecuzione è stata eseguita separatamente. (E) Gel SDS-PAGE delle frazioni di picco escluse da ogni singola cromatografia. Mentre il 15% dei gel SDS-PAGE è stato preparato per analizzare α complesso2β2StTS e α subunitàStTS, è stato preparato un gel SDS-PAGE al 12% per analizzare la subunitàstTS β. Lane MW, marcatori di peso molecolare in kDa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rappresentazione del costrutto pEBA-10. (A) Rappresentazione del gene di accoppiamento traslazionale wild type (trpA e trpB) che codifica per le subunità α- e β- del triptofano sintasi dal batterio Salmonella enterica serovar typhimurium (Yang, Ahmed et al. 1996). (B) Il vettore contiene un gene di resistenza all'ampicillina (amp), un'origine di replicazione (ori), un gene lacIq per arrestare meglio un promotore lac in assenza di induttore IPTG e il promotore represso LacI. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rappresentazione complessiva del protocollo di mutagenesi PCR in due fasi. Il vettore pEBA-10 è stato utilizzato come modello di DNA. Il primo ciclo di PCR è stato preparato con primer TS-FW-NcoI e MUT-REV (un primer inverso contenente una mutazione) per generare il primo frammento e primer TS-Rev-SacI e MUT-FW (un primer in avanti contenente una mutazione) per generare il secondo frammento). I frammenti sono stati purificati in gel e combinati equimolari, denaturati a caldo e ricotti. I filamenti ricombinanti sono stati estesi con polimerasi e desossiribonucleotidi. Il secondo ciclo di PCR è stato preparato con primer TS-FW-NcoI e TS-Rev-SacI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Purificazione del tipo selvatico e della forma mutante del complesso α2β2StTS. (A) Gel SDS-PAGE al 12% di campioni raccolti lungo la precipitazione del solfato di ammonio utilizzando il 20, 30, 40 e 50% di saturazione di solfato di ammonio a temperatura ambiente: (CE) estratto grezzo (S) e (P) frazioni surnanti e precipitate dopo centrifugazione ad alta velocità. (B) Profilo di eluizione del complesso α2β2StTS (143,06 kDa) con una colonna cromatografica di esclusione dimensionale HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. (C) 12% SDS-PAGE gel picture delle frazioni di picco escluse. Lane MW, marcatori a peso molecolare in kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Ottimizzazione della cristallizzazione per wild type e forma mutante delcomplesso TS α2β2St. I cristalli sono stati coltivati in un tampone Bicine-CsOH da 50 mM contenente 50 mM CsCl2. La concentrazione di polietilenglicole 8000 (6-11%) e spermina (2-8 mM) è stata variata per ottenere singole forme di cristalli di grandi dimensioni per eseguire studi strutturali mediante cristallografia proteica a raggi X. (A) Bicine-CsOH, pH 7.6. (B) Bicine-CsOH, pH 7,8. (C) Bicine-CsOH, pH 8.0. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Fotomicrografia di cristalli di tipo selvatico e forma mutante del complesso α2β2StTS. I cristalli differiscono nella morfologia, ma appartengono al gruppo spaziale C2. I cristalli sono cresciuti fino alla loro piena dimensione nelle condizioni finali dopo due settimane. Cristalli di circa 0,20 x 0,15 x 0,10 mm. (A-D) Olocristalli PLP in complesso con ione cesio nel sito di coordinazione metallica della forma wild type (colonna A), forma mutante α2β2 βQ114A (colonna B), α2β2 βK167T (colonna C) e α2β2 βS377A (colonna D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Visualizzazione complessiva della struttura cristallina e validazione delle mappe di densità elettronica ottenute dopo il perfezionamento della struttura cristallina. (A) struttura cristallina del tipo selvatico α2β2StTS complesso con inibitore F9 al sito di α enzimatico (colore giallo), ione cesio nel sito di coordinazione del metallo (colore blu), il cofattore piridossale 5'-fosfato covalente legato a βLys87 (di colore verde) e il prodotto L-triptofano al sito β dell'enzima (colore ciano) a risoluzione di Angstrom 1,18. Mentre la subunità α è colorata in azzurro, la subunità β è colorata in salmone. (B-E) Mappe di densità elettronica sagomati a livello di 1,0 r.m.s. intorno a (B) inibitore F9 (C) ione cesio (D) piridossal-5′-fosfato e (E) L-triptofano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Raccolta ed elaborazione dei dati
Sorgente di raggi X / Linea di fascio ALS Beamline 12.3.1
Lunghezza d'onda (Å) 10,000
Risoluzione (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
Numero totale di riflessioni 2151280 (252941)
Numero totale di riflessi unici 231646 (32187)
Gruppo di spazi per l'indicizzazione, il ridimensionamento e l'unione C 1 2 1
Dimensioni della cella
a, b, c (Å) 182.55, 59.30, 67.37
α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
Mosaicità 0.61
Matthews volume VM (Å3 Da-1) 2.57
Rmeas (%) 8.6 (93.0)
14.7 (3.0)
CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
Completezza (%) 98.6 (94.2)
Molteplicità 9.3 (7.9)
Statistiche di perfezionamento
Rwork/Rfree (%) 14.04 / 16.05
Lunghezza del legame RMSD (Å) 0.0120
Angolo di legame RMSD (°) 14,059
Ramachandran favorito 515 (96.44%)
Ramachandran ha permesso 16 (3.00%)
Ramachandran non è stato permesso 3 (0.56%)

Tabella 1: Raccolta ed elaborazione dei dati. I valori tra parentesi sono per il guscio esterno.

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Discussion

Abbiamo progettato con successo forme mutanti α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T e complessi α2β2 βS377A StTS per studi di correlazione struttura-funzione. Inizialmente, abbiamo cercato di purificare i mutanti utilizzando un precedente protocollo di purificazione22, che richiede α2β2StTS complesso cristallizzazione con PEG 8000 e spermina durante la purificazione. Sebbene il tasso di cristallizzazione dipenda dalla forma mutante e dalla concentrazione del complesso in soluzione, essendo difficile prevedere quando i cristalli appaiono in un grande volume di soluzione. La cristallizzazione potrebbe essere ottenuta dopo lunghi periodi (48-96 h) o essendo necessaria l'aggiunta di quantità extra di PEG 8000 dopo l'inizio dellacristallizzazione 15.

Sfortunatamente, le forme mutanti di α2β2StTS complesso presentate in questo lavoro non sono state purificate con successo utilizzando questo protocollo poiché non sono riuscite a cristallizzare durante le fasi iniziali del protocollo, compromettendo gli studi cristallografici. Pertanto, abbiamo creato un protocollo di purificazione semplice ed efficiente che comprende il frazionamento del solfato di ammonio e la cromatografia di esclusione dimensionale, che danno alte rese di tipo selvatico e forma mutante di α2β2StTS. Questo protocollo è più veloce (1-2 giorni) e riproducibile rispetto al protocollo precedente (5-7 giorni)15,22,poiché non vi sono requisiti di cristallizzazione e risoluzione dei problemi del protocollo durante la purificazione. Inoltre, abbiamo creato nuovi costrutti di espressione e protocollo per purificare elevate quantità di α-subunità, β-subunità e ricostituire α complesso TS2β2Stdagli isolati.

L'applicazione futura include la ricombinazione di sotto-unità wild type e mutanti per eseguire studi funzionali e strutturali. I αmutanti 2β2 βQ114A, α2β2 βK167T e α2β2 βS377A complessi cristallizzati in condizioni contenenti concentrazioni più elevate di spermina (4-8 mM) rispetto alla forma wild type (2 mM). Pertanto, vale la pena dedicare del tempo a migliorare la qualità dei cristalli proteici variando la concentrazione di precipitanti e il pH tampone. Singole forme cristalline di grandi dimensioni sono cresciute casualmente in soluzione tamponata bicine (pH 7,6-8,0) contenente il 6-11% di PEG 8.000. I metodi descritti in questo lavoro saranno utilizzati per preparare strutture cristalline del tipo selvatico e forme mutanti del complesso α2β2 con diversi ligandi all'interno dei siti α e β attivi, imitando diversi intermedi e stati di transizione coinvolti nella conversione di indolo e serina in triptofano. Si prevede che le strutture cristalline di questi mutanti forniranno nuove informazioni sul meccanismo e sui ruoli svolti dai residui chiave nella sintesi di L-triptofano.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health degli Stati Uniti (GM097569).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL 10 kDa filter MilliporeSigma UFC901024 centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter MilliporeSigma UFC910024 centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials Corning CLS430489 Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-141 microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate Hampton Research HR3-158 24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100 Chemical
50 mL centrifuge conical tubes Thermo Scientific 12-565-270 centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic Fisher Scientific 13-636-AB15 pH meter
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 Agarose gel
ammonium sulfate Fisher Scientific A702-500 Chemical
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5 Antibiotic
Bacterial incubator Fisher Scientific S35836 incubator.
BamHI New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
bicine Fisher Scientific BP2646100 Chemical
Branson 450 Digital Sonifier Brason B450 Cell disruptor
Cesium chloride Fisher Scientific BP210-100 Chemical
Cesium hydroxide Acros Organics AC213601000 Chemical
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 Antibiotic
dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D1391 Chemical
dithiothreitol Fisher Scientific BP172-5 Chemical
DNA Polymerase Thermo Scientific F530S HF polymerase
dNTP Set Invitrogen 10-297-018 dNTPs set
EcoRI New England Biolabs R0101S Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chemical
Excella E25R Orbital Shaker Eppendorf New Brunswick M1353-0004 Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus GE Healthcare 8149-30-0004 FPLC
Gel Extraction Kit Invitrogen K210012 DNA purification kit
Glycerol Fisher Scientific G33-500 Chemical
HindIII New England Biolabs R0104S Restriction enzyme
His-Trap columns GE Healthcare GE17-5255-01 5 mL Histrap column
imidazole Fisher Scientific O3196-500 Chemical
IPTG Thermo Fisher Scientific R0392 Inducer
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Antibiotic
Kelvinator Series-100 Kelvinator discontinued Ultra low freezer
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Liquid broth
Luria Bertani agar Fisher Scientific BP1425-2 Solid broth
NaCl Fisher Scientific S271-500 Chemical
NcoI New England Biolabs R0193S Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads Thermo Fisher Scientific R90115 Ni-NTA agarose beads
PEG 8000 Fisher Scientific BP233-100 Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific 44-865-0 Chemical
pyridoxal phosphate Acros Organics AC228170010 Chemical
S-200 HR Cytiva 45-000-196 Size exclusion column
SacI New England Biolabs R0156S Restriction enzyme
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge Sorvall 8327-30-1004 Floor cetrifuge
Spermine Acros Organics AC132750010 Chemical
Superdex 200 prep grade Cytiva 45-002-491 Size exclusion column
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S DNA liagse
Tris Fisher Scientific BP152-500 Chemical
Ubl-specific protease 1 Thermo Scientific 12588018 SUMO Protease

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