Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttrykk, Rask Protein Rensing Protokoller og Krystallisering av Wild Type og Mutant Former for Tryptophan Synthase

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61839
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Summary

Denne artikkelen presenterer en rekke påfølgende metoder for uttrykk og rensing av Salmonella typhimurium tryptofan synthase comp denne protokollen et raskt system for å rense proteinkomplekset på en dag. Dekkede metoder er stedsstyrt mutagenese, proteinuttrykk i Escherichia coli, affinitetskromatografi, gelfiltreringskromatografi og krystallisering.

Abstract

Strukturelle studier med tryptofan synthase (TS) bienzymekompleks (α2β2 TS) fra Salmonella typhimurium har blitt utført for å bedre forstå sin katalytiske mekanisme, allosterisk oppførsel og detaljer om den enzymatiske transformasjonen av substrat til produkt i PLP-avhengige enzymer. I dette arbeidet tillot et nytt uttrykkssystem for å produsere de isolerte α- og isolerte β-underenhet rensing av høye mengder rene underenheter og α2β2StTS-komplekset fra de isolerte underenhetene innen 2 dager. Rensing ble utført av affinitetskromatografi etterfulgt av spalting av affinitetstaggen, ammoniumsulfatutfelling og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). For bedre å forstå rollen som viktige rester ved enzymet β stedet, ble steds-direkte mutagenese utført i tidligere strukturelle studier. En annen protokoll ble opprettet for å rense den ville typen og mutanten α2β2StTS-komplekser. En enkel, rask og effektiv protokoll ved hjelp av ammoniumsulfatfraksjonering og SEC tillot rensing av α2β2StTS-kompleks på en enkelt dag. Begge renseprotokollene beskrevet i dette arbeidet har betydelige fordeler sammenlignet med tidligere protokoller for å rense det samme komplekset ved hjelp av PEG 8000 og spermin for å krystallisere α2β2StTS-komplekset langs renselsesprotokollen. Krystallisering av vill type og noen mutante former skjer under litt forskjellige forhold, svekker rensingen av noen mutanter ved hjelp av PEG 8000 og spermin. For å forberede krystaller egnet for røntgenkrystallografiske studier ble det gjort flere anstrengelser for å optimalisere krystallisering, krystallkvalitet og kryoproteksjon. Metodene som presenteres her bør generelt gjelde for rensing av tryptofan synthase underenheter og vill type og mutant α2β2StTS komplekser.

Introduction

Tryptofan syntase (TS) bienzymekomplekset (α2β2) er et allosterisk enzym, katalyserer de to siste trinnene i biosyntesen av aminosyren L-Tryptofan i bakterier, planter og sopp1,2,3. Bakterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) forårsaker en alvorlig gastrointestinal infeksjon hos mennesker og andre dyr. Siden mennesker og høyere dyr ikke har TS (EC 4.2.1.20), hemming av S. typhimurium α2β2 TS-kompleks (α2β2StTS) har blitt utforsket som et potensielt legemiddelmål for behandling av kryptosporidiose og tuberkulose4, kjønns- og okulære infeksjoner5, og for potensiell herbicidutnyttelse ilandbruket 6. Den α-subenhet katalyserer den aldolytiske spaltingen av indole-3-glyserol-fosfat (IGP) til glyseraldehyd-3-fosfat (GAP) og indole, gjennom dannelsen av en indolenin tautomer mellomliggende og deretter karbonkarbonbinding spalting for å produsere GAP og indole3,6. Det β-katalytiske stedet inneholder et pyridoksalt 5′-fosfat (PLP) kofaktormolekyl bundet til β-Lys87 via en Schiff-base, som fungerer som en elektron vask i løpet av reaksjonene ved enzymet β-subenhet3,7. Det β stedet katalyserer utskifting av L-Serine sidekjedehydroksyl med indole for å gi L-Tryptophan og et vannmolekyl i en PLP-avhengig reaksjon. St TS fungerer som en langvarig modell for undersøkelse av substratkanal og allosterisk kommunikasjon innen multienzymkomplekser2,3. Toveis allosterisk kommunikasjon mellom α- og β-underenheter av TS er nødvendig for å synkronisere katalytiske trinn og forhindre indole-frigjøring under L-Tryptophan syntese3. For å utvide denne innsatsen har vi forberedt flere mutanter (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr og β-Ser377Ala) ved enkeltpunktmutasjon som skal brukes i videre undersøkelser av forholdet mellom enzymstruktur, mekanisme og funksjon på det katalytiske stedet til StTS-β-underenheten.

Detaljert forskning på den katalytiske mekanismen til α2β2StTS ble initiert av forskningsgruppen Edith W. Miles. Tidlige studier med innfødt Escherichia coli α2β2 TS-komplekset har fokusert på rensing og karakterisering av den isolerte α-subenhet8,9, isolert β-subenhet10,11 og rekonstituering av α2β2 TS-komplekset fra de isolerte underenhetene12. Rensing ble utført av ammoniumsulfatutfelling, prøvedialyse, DEAE-Sephadex-kromatografi, dialyse og en andre kromatografisk runde på en DEAE-Sephadex kolonne12. I en annen protokoll ble rensingen av det samme komplekset forbedret ved å laste inn det avklarte cellelysatet på en DEAE-Sephadex-kolonne etterfulgt av et kromatografisk trinn på en Sepharose 4B-kolonne, ammoniumsulfatutfelling og dialyse13. Begge renseprotokollene varer i 4-5 dager. Escherichia coli α2β2 TS kompleks krystallisert, men krystaller var ikke egnet for røntgendiffraksjon på den tiden.

I en ny studie ble rekombinante og ville type former for S. typhimurium α2β2 TS-komplekset renset og krystallisert14,15. Det rekombinante α2β2StTS-komplekset ble overekspressert i E. coli-stammen CB149 med pEBA-10-uttrykksvektoren. Innledende krystallisering og røntgendiffraksjonsdatainnsamling og analyse av α2β2StTS-komplekset ble rapportert14. Men lang og tynn nål som α2β2StTS krystaller svekket strukturelle studier. I et forsøk på å samle inn bedre røntgendiffraksjonsdata, ble en annen renselsesprotokoll beskrevet for å rense den ville typen og mutantformene til α2β2StTS-komplekset15. Rensing ble utført med en innledende nedbør ved hjelp av spermin og PEG 8000 i den avklarte cellelysen og et stort klumpete bunnfall ble fjernet ved sentrifugering. Den supernatante fraksjonen som inneholder høye mengder α2β2StTS-komplekset ble lagret i 16-48 timer ved 4 °C til gule krystaller ble utfelt. Krystaller ble vasket og omfattende dialysert mot forskjellige buffere. Proteinkomplekset ble rekrystallisert i buffer som inneholder ammoniumsulfat og dialysert15. Selv om proteinkrystallisering avhenger av protein- og utfellingskonsentrasjoner i oppløsning, er det vanskelig å overvåke, forutsi og reprodusere rensing for andre mutante former for α2β2StTS-kompleks i løsningen. Denne protokollen har fordelen at den ikke bruker noen kromatografiske metoder; Ulempene er imidlertid den lange rensetiden som er nødvendig for å krystallisere, dialyze og rekrystallisere, som vanligvis krever 5-7 dager. For å få krystaller som er egnet for innsamling av røntgendata, mer enn 600 krystalliseringsbetingelser ble evaluert ved hjelp av en kombinasjon og variasjon av proteinkonsentrasjon, temperatur, utfellingsmidler (PEG 4000, 6000 og 8000) og tilsetningsstoffer (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, kadaverin, putrescin, spermin eller spermidin)15. Krystaller hadde en bedre krystallinsk form og vokste raskere under forhold som inneholder 12% PEG 8000 og 2 mM spermin. Krystallisering var gunstigere ved 25 °C i stedet for ved 4, 30 eller 42 °C og vokste til maksimale dimensjoner innen 3 dager15. Flere α2β2StTS krystallstrukturer ble rapportert på den tiden (1996-1999)16,17,18,19,20,21 og mange andre strukturer har blitt publisert til dags dato.

Her er hovedformålet å presentere alternative protokoller for å rense tryptofan syntase og optimalisere proteinkrystallisering. Det nåværende arbeidet viser betydelige forbedringer for å rense den ville typen isolert α-subenhet (αStTS), isolert β-underenhet (βStTS), rekonstituert α2β2StTS-kompleks fra de isolerte underenhetene, og villtype og mutantformer av α2β2StTS-komplekset. Fordelene i forhold til tidligere protokoller er betydelige siden rensetiden ble redusert betydelig og krystallisering og kryobeskyttelse ble optimalisert. Mutante former for α2β2StTS-kompleks konstruert i dette arbeidet har krystallisert nær samme tilstand som brukes til villtypeformen. Imidlertid var fin krystalliseringsoptimalisering nødvendig for å oppnå store enkeltkrystaller av tilstrekkelig kvalitet for strukturbestemmelse ved nær atomoppløsning. Til dags dato er det 134 tryptofan synthase krystallstrukturer deponert i Protein Data Bank (PDB), regnskap 101, 31 og 2 krystallstrukturer, henholdsvis for bakterier, arkaea og eukaryote. Pent tilhører 73 strukturer S. enterica serovar typhimurium og 5 krystallstrukturer av α2β2StTS-komplekset har oppløsningsgrenser høyere enn 1,50 Angstroms. Ikke overraskende ble det utarbeidet 4 av 5 i vår forskningsgruppe (PDB IDs:5CGQ at 1.18 Å, 4HT3 at 1.30 Å, 4HPJ at 1.45 Å, 6DZ4 at 1.45 Å resolution). De raffinerte krystallstrukturene til mutantformen av α2β2StTS-komplekset forventes å gi ny innsikt i mekanismen og rollene som spilles av essensielle aminosyrerester involvert i L-Tryptofan syntese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rask protokoll for å rense α- og β-underenhet og rekombinert α2β2StTS-komplekset

  1. DNA-subkluering i pETSUMO-uttrykksvektor
    1. Få oversettelsesbindende gen (trpA og trpB) som koder α- og β-underenheter av tryptofansyntase fra bakterien Salmonella enterica serovar typhimurium klonet i pEBA-10 uttrykksvektor22. Bruk pEBA-10 vektor som en DNA-mal.
      MERK: Alternativt kan de oppførte primerne nedenfor brukes til å forsterke begge genene fra Salmonella enterica serovar typhimurium genomet. Alle molekylærbiologiske trinn ble fulgt som beskrevet i Molekylær kloning: En laboratoriehåndbok23.
    2. Bruk polymerasekjedereaksjon (PCR) for å forsterke polynukleotidsekvensen i full lengde av α-subenheten(αStTS) med primere αStTS-FW-Bam og αStTS-Rev-Eco og full lengde sekvens av β-subenhet (βStTS) med primere βStTS-FW-Bam og βStTS-Rev-Hind. Bruk en smeltetemperatur på ca. 55 °C og en polymeraseforlengelsestid på 2 min.
      1. Bruk høygjengivelses-DNA-polymerase (f.eks. phusion) og produsentens protokoll for å forsterke DNA-sekvensene. For en 50 μL PCR-reaksjon tilsett 34 μL nukleasefritt vann, 10 μL 5x reaksjonsbuffer, 1 μL 10 mM dNTPer, 1 μL 10 μM foroverprimer, 1 μL 10 μM reversprimer, 1 μL mal-DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL Phusion DNAasepolymer.
      2. For PCR-programmet, bruk en varmstart (180 sekunder ved 98 °C) etterfulgt av 30 forsterkningssykluser (30 sekunder ved 98 °C, 30 sekunder ved 55 °C og 120 sekunder ved 72 °C), og en endelig forlengelse (300 sekunder ved 72 °C).
        MERK: De kursiverte sekvensene tilsvarer henholdsvis begrensningsområdene BamHI, EcoRI, BamHI og HindIII. Enzym spalting effektivitet nær termini av PCR fragmenter ble forbedret ved å legge til ekstra baser (små sekvenser).
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. Last PCR-produktet på 0,8% agarose gel i 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM eddiksyre og 1 mM EDTA) ved 6 V / cm, gel ekstrakt DNA-båndet av interesse, og gel rense PCR-fragmentet ved hjelp av et silikaperlesett etter instruksjonene fra produsenten.
      1. Fordøye minst 200 ng av hvert DNA-fragment med passende begrensningsenzymer og forhold anbefalt av produsenten i 2 timer ved 37 °C.
      2. For å sette opp en 50 μL begrensning fordøyelsesreaksjon legge til 34 μL nukleasefritt vann, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL av 10x reaksjonsbuffer, 0,5 μL begrensningsenzym 1 og 0,5 μL begrensningsenzym 2.
      3. Last fordøyelsesproduktet på 0,8% agarose gel på 1x TAE ved 6 V / cm, gelekstrakt og gel rense det fordøyde fragmentet ved hjelp av et kommersielt sett.
    4. Subclone individuelt hvert fragment inn i E. coli uttrykk modifisert vektor pET SUMO, tidligere fordøyd med passende enzymer og gel renset.
      MERK: Denne vektoren er en modifisert versjon av den kommersielle pET SUMO. Denne vektoren er optimalisert for begrensning av enzym kloning. Multi kloning området (MCS) av pET28b vektor (BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI, og XhoI) ble satt inn i pET SUMO kloning området. Denne vektoren inneholder en N-terminal 6x-Histidine-tag i ramme med det lille Ubiquitin-lignende Modifier-proteinet (SUMO) og flere kloningssteder.
    5. Ligate 100 ng modifisert pET SUMO og 50 ng PCR fragment med T4 DNA ligase i 2 timer ved 25 °C.
    6. Forvandle den konstruerte plasmiden til kompetente celler av E. coli-stamme DH10Bα celler. Plateceller på LB agarplater som inneholder 35 μg/ml kanamycin. Inkuber platen invertert over natten ved 37 °C.
    7. Velg en enkelt koloni fra hver transformasjon, forbered ultra-ren plasmid DNA, og utfør DNA-sekvensering for å bekrefte at αStTS eller βStTS ble klonet i ramme med N-terminal His6-SUMO-taggen.
      MERK: Forbered glyserolbestander av cellekultur (snu cellefjæring i 16% endelig konsentrasjon av steril glyserol) og oppbevar dem langsiktig ved -80 °C.
    8. Forvandle uttrykket plasmid SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS individuelt til kompetente celler av E. coli uttrykk belastning Rosetta (DE3) pLysS med en T7 promotorbasert system. Plate rekombinante celler på Luria Bertani (LB) agarplater som inneholder 35 μg/ ml kanamycin og kloramfenikol. Inkuber platen invertert over natten ved 37 °C.
    9. Etter vellykket kolonidannelse, velg en enkelt koloni (uten satellittkolonier) og spre den i 5 ml LB-medium med begge antibiotika. Kulturceller over natten med risting ved 200 o/min ved 37 °C.
      MERK: Forbered glyserollagre av cellekultur, oppbevar langsiktig ved -80 °C eller bruk umiddelbart til rekombinant proteinuttrykk.
  2. Uttrykk for SUMO-αStTS og SUMO-βStTS underenheter
    1. Inokuler ferske E. coli-stamme Rosetta (DE3) pLysS-celler som huser SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS konstruerer eller skraper noe av det frosne glyserollageret i en 50 ml kultur av LB som inneholder 35 μg/ml kanamycin og kloramfenikol. Vokse celler over natten med risting ved 200 rpm ved 37 °C.
    2. Neste morgen inokulerer du 5 ml av nattcellekulturen i en frisk og steril 2x 1000 ml LB som inneholder 2 % glyserol pluss kanamycin og kloramfenikol (2,8 L Fernbach-kolbe). Voks cellekulturen med risting ved 200 o/min ved 37 °C.
      MERK: Uttrykket av SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS i LB buljong gir 125-150 mg merket protein per liter. Vurder å skalere protokollen opp eller ned for å oppfylle spesifikke krav.
    3. Induser rekombinant proteinuttrykk når OD600 når 0,6-0,8 ved tilsetning av isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) ved en endelig konsentrasjon på 0,4 mM etterfulgt av inkubasjon ved 30 °C over natten med risting ved 200 o/min.
    4. Høst cellene ved sentrifugering ved 4000 x g ved 4 °C i 20 minutter. Fjern supernatanten og re-suspender cellepellets med kald lysisbuffer 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, som inneholder 500 mM NaCl, 5% glyserol, 10 mM 2-mercaptoethanol og 40 mM imidazole-Cl) til et endelig volum på 60 ml.
      MERK: Celler kan lagres på lang sikt ved -80 °C eller brukes umiddelbart til proteinrensing. For å lagre celler, del cellefjæringen i 2 x 50 ml engangs sentrifugeringskoiske rør og hold cellepellets ved -80 °C til proteinrensingstrinnet.
  3. Rensing av α- og β-underenheter av tryptofan syntase
    MERK: Alle prosedyrer skal utføres ved 4 °C med mindre annet er oppgitt. For å redusere rensetiden, salibrere Ni-NTA agarose nikkelladede affinitetskolonner og størrelsesekskluderingskolonne i buffer før proteinrensing eller under rekombinant proteinuttrykk.
    1. Forstyrre cellepellet ved sonikering ved hjelp av en digital sonifikator med 1/2" Horn-sonde (eller lignende utstyr). Utfør 20 sykluser ved 80% amplitude driftssyklus på isvannbad ved hjelp av 10 s puls og 20 s hvile eller til fullstendig celleforstyrrelse.
    2. Sentrifuger cellelyset ved 30.000 x g i 30 min. Aspirer supernatant, og sørg for at pellet ikke løsner fra røret. Filtrer supernatanten med en 0,45 μm filterenhet på is og strømning den gjennom en 15 ml Ni-NTA agarose nikkelladet affinitetskolonne forhåndsoverveid i lysisbuffer 1.
      MERK: Hver Ni-NTA agarose kolonne vil bli brukt til å rense enten SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS rekombinant protein. Rensing kan utføres i en 2x 5 ml Ni-NiTA-kolonne festet til et raskt proteinvæskekromatografisystem. Rens ett protein om gangen.
    3. Vask Ni-NTA agarose kolonne i 100 ml lysisbuffer 1.
    4. Fortsett med en 80 ml ett-trinns elution med buffer E1 (25 mM Tris-Cl buffer, pH 7,8, som inneholder 200 mM NaCl, 5% glyserol og 400 mM imidazole-Cl).
      MERK: SUMO-protease tåler opptil 300 mM imidazol og membranen til sentrifugalfilterenheter tåler opptil 100 mM imidazol. Vi anbefaler å utføre en ammoniumsulfatutfelling for å fjerne høye mengder imidazol og redusere rensetiden i stedet fortynne proteinprøven og kaste bort tid med proteinkonsentrasjon.
    5. Vurder det første volumet av den supernatante brøkdelen. Tilsett sakte små mengder ammoniumsulfat om gangen, til en 60% metning (39,48 g / 100 ml) ved 25 °C nås. Rør forsiktig løsningen i 30 min og unngå bobler. Sentrifuge ved 10.000 x g i 15 min.
    6. Aspirer og kast den supernatante fraksjonen forsiktig. Resuspend pelletsfraksjonen i 20 ml prøvebuffer (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCl og 5% glyserol).
    7. For His-SUMO-tag spalting med SUMO-protease, legg til det rekombinante fragmentet av Ubl-spesifikk protease 1 fra Saccharomyces cerevisiae i et 1:1000-forhold og inkuber blandingen i 2 timer ved 4 °C.
    8. Sentrifuger fordøyelsesproduktet ved 10 000 x g i 25 °C i 20 minutter for å fjerne proteinmengder før du laster prøven gjennom en affinitetskromatografikolonne.
    9. Fjern spor av His6-SUMO-taggen som passerer den 20 ml resuspenderte prøven på en 15 ml Ni-NTA agarose-kolonne, tidligere likevektet i lysisbuffer 1.
    10. Samle pass-through prøven som inneholder ikke-merket αStTS eller βStTS.
    11. Vask Ni-NTA-kolonnen i 20 ml buffer 1 for å samle rester av ikke-merkede αStTS eller βStTS.
    12. Konsentrer hver underenhet separat med en 15 ml 10 kDa avskåret sentrifugalfilterenhet ved å spinne ved 3000 x g ved 4 °C. Overfør det konsentrerte proteinet til et friskt 2,0 ml rør og mikrosenter (10 000 x g, 10 min, 4 °C) for å fjerne aggregater. Bestem proteinkonsentrasjon24, lag 1 ml aliquots ved 20-25 mg ml-1, etikett, blitsfrysing i flytende nitrogen, og lagre dem ved -80 °C.
      MERK: Pre-rensede proteinprøver kan lagres langsiktig ved -80 °C eller brukes umiddelbart til proteinrensing på en størrelseseksklusjonskromatografikolonne (SEC).
    13. Ta et protein aliquot (20 mg) og mikrocentrifuge ved 10.000 x g i 10 min for å fjerne aggregater før SEC.
    14. Lastprøve på en størrelseseksklusjonskromatografikolonne (f.eks. HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) festet til en rask proteinvæskekromatografi med en strømningshastighet på 0,5 ml min-1, tidligere likevektet i SEC-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glyserol, 0,1 mM pyridoksalt fosfat).
      MERK: For å rense høyere mengder isolerte αStTS eller βStTS-underenhet og redusere antall SEC-runder, last en 5 ml prøve ved 20-25 mg ml-1 på en størrelsesekskluderingskromatografikolonne med en strømningshastighet på 1,5 ml min-1.
    15. Vurder kvaliteten på αStTS eller βStTS i toppfraksjonen ved hjelp av en 12% eller en 15% natrium dodecyl sulfat-gel elektroforese (SDS-PAGE), henholdsvis farget med Coomassie strålende blåflekk 25.
    16. Konsentratprotein med friske 15 ml 10 kDa cutoff sentrifugalfilterenheter, bestem proteinkonsentrasjon24, lag 0,5 ml aliquots ved 20-25 mg ml-1, etikett, blitsfrysing i flytende nitrogen og lagre dem ved -80 °C.
  4. Rensing av α2β2StTS-komplekset fra α- og β-underenheter
    MERK: Likevekt størrelse eksklusjon kromatografi kolonne (Sephadex S-200 HR eller Superdex 200 pg) i SEC buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, 5% glyserol, 0,1 mM pyridoksal fosfat).
    1. For å rense den ville α2β2StTS-komplekset fra α- og β-underenheter, tine konsentratprøver av αStTS og βStTS-underenheter ved 4 °C.
    2. Kombiner aliquots (1,2 αStTS: 1,0 βStTS molar ratio) og inkubert ved 4 °C i 1 time.
      MERK: Overskudd av αStTS er nødvendig for å sikre at det meste av βStTS vil bli innlemmet i α2β2StTS-komplekset.
    3. Fjern proteinaggregater ved mikrosentrifugering (10 000 x g, 10 min, 4 °C).
    4. Last inn den klargjorte supernatanten på kolonnen for utelatelse av størrelse.
    5. Vurder kvaliteten på αStTS eller βStTS i toppfraksjonen ved hjelp av en 12% eller en 15% natrium dodecyl sulfat-gel elektroforese (SDS-PAGE), henholdsvis farget med Coomassie strålende blåflekk 25.
    6. Bestem proteinkonsentrasjon24, lag 250-1000 μL aliquots ved 15-20 mg ml-1, blitsfrysing i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C.

2. Rensing av vill type eller mutant form av α2β2StTS kompleks

  1. Stedsstyrt mutagenese for å forberede mutant βStTS
    1. Bruk konstruksjon pEBA-10 uttrykksvektor22 som DNA-mal under to trinn av polymerasekjedereaksjon for å introdusere spesifikke punktmutasjoner i β-kjedeTS polynukleotidsekvens.
      MERK: Denne protokollen kan brukes til å introdusere en enkeltpunktmutasjon i enten α- eller β-underenhet fra Salmonella typhimurium tryptofan syntase. For ytterligere må nye oligonukleotidprimere som inneholder den ønskelige mutasjonen, være riktig utformet. I dette arbeidet er mutasjoner βQ114A, βK167T, βS377A oppført.
    2. Utfør PCR-reaksjoner ved hjelp av par nukleotidprimere TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev og TS-FW-NcoI/S377A-Rev for å generere fragmenter henholdsvis A1, B1 og C1.
      MERK: Oligonukleotid TS-NcoI-FW og TS-SacI-Rev, henholdsvis annealer oppstrøms og nedstrøms for αβ StTS polynukleotidsekvens klonet i pEBA-10-vektoren.
      1. Bruk høygjengivelses-DNA-polymerase (f.eks. phusion) og produsentens protokoll for å forsterke DNA-sekvensene. For en 50 μL PCR-reaksjon, tilsett 34 μL nukleasefritt vann, 10 μL 5x reaksjonsbuffer, 1 μL 10 mM dNTPer, 1 μL 10 μM foroverprimer, 1 μL 10 μM reversprimer, 1 μL mal-DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL DNA-polymerase.
      2. For PCR-programmet bruker du en varmstart (180 sekunder ved 98 °C) etterfulgt av 30 forsterkningssykluser (30 sekunder ved 98 °C, 30 sekunder ved 55 °C og 120 sekunder ved 72 °C), og en endelig forlengelse (300 sekunder ved 72 °C).
        MERK: Alle molekylærbiologiske trinn ble fulgt som beskrevet i Molekylær kloning: En laboratoriehåndbok23. Mens en sekvens med små bokstaver tilsvarer et begrensningsområde, tilsvarer en fet og kursiv sekvens en mutasjon.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Utfør PCR-reaksjoner ved hjelp av par nukleotidprimere TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF og TS-Rev-SacI/S377A-FF for å generere fragmenter henholdsvis A2, B2 og C2.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GKT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Bruk polymerasekjedereaksjon for å forsterke de delvise fragmentene individuelt. Bruk en smeltetemperatur på 55 °C og en polymeraseforlengelsestid på 2 min.
    5. For å utføre den andre runden med PCR-reaksjoner, last PCR-produktet ovenfor på 0,8% agarose gel på 1x TAE ved 6 V / cm og gelekstrakt og gel rense fragmentene av interesse.
      1. Bland fragmentene A1/A2, B1/B2 og C1/C2 separat i likemolarmengder, varm protese blandingen i 10 min ved 96 °C og anneal ved 25 °C. Utvid de rekombinante trådene med en high-fidelity polymerase og deoxyribonucleotides i henhold til produsentens protokoll.
    6. For å generere et høyt kopinummer av mutant DNA-fragmentet i full lengde, legg til oligoprimere TS-FW-NcoI og TS-Rev-SacI for å utføre en annen PCR.
    7. Last PCR-produktet på 0,8% agarose i 1x TAE buffer ved 6 V / cm, gel ekstrakt DNA-båndet av interesse, gel rense PCR fragment, og fortsett med passende begrensning fordøyelse i 2 timer ved 37 °C etter riktig buffer og forhold anbefalt av produsenten.
      1. Fordøye minst 200 ng av hvert DNA-fragment med passende begrensningsenzymer og forhold anbefalt av produsenten i 2 timer ved 37 °C. For å sette opp en 50 μL begrensning fordøyelsesreaksjon legge til 34 μL nukleasefritt vann, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL av 10x reaksjonsbuffer, 0,5 μL begrensningsenzym 1 og 0,5 μL begrensningsenzym 2. Last fordøyelsesproduktet på 0,8% agarose i 1x TAE buffer ved 6 V / cm og rense det fordøyde PCR-fragmentet.
    8. Fordøye 200 ng pEBA-10 konstruere med begrensning enzymer NcoI og SacI etter produsentens anbefaling. Last fordøyelsesproduktet på 0,8% agarose gel i 1x TAE buffer ved 6 V / cm, sluk bandkorrespondenten til vektoren, og gel rense den fordøyde vektoren.
    9. Ligate 100 ng vektor med 50 ng PCR fragment, tidligere fordøyd og renset, med T4 DNA ligase i 2 timer ved 25 °C. Forvandle den konstruerte plasmiden til kompetente celler E. coli stamme DH10B celler. Plateceller på LB agarplater som inneholder 50 μg/ml ampicillin. Inkuber platen invertert over natten ved 37 °C.
    10. Velg en enkelt koloni (uten satellittkolonier) fra hver celletransformasjon og spre den i 5 ml LB-medium som inneholder ampicillin. Vokse celler over natten med risting ved 200 rpm ved 37 °C. Forbered 10 μg ultra-ren plasmid DNA fra hver konstruert konstruksjon. Forbered glyserolbestander av cellekultur (snu cellefjæring i 16% endelig konsentrasjon av steril glyserol) og lagre langsiktig ved -80 °C.
    11. Utfør DNA-sekvensering for å bekrefte sekvensen i full lengde som koder α- og β-underenheter av tryptofansyntase. Bekreft hver enkelt mutasjon og kast bort enhver plasmidkonstruksjon som inneholder uønsket tilfeldig mutasjon. Oligonukleotidprimerne som brukes i denne studien er listet opp nedenfor.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
      MERK: Oligonukleotidprimere TS-1F, TS-1R, TS-2F og TS-3F anneal på polynukleotidsekvensen til β-underenheten (GenBank-tiltredelseskode: CP051286.1). Primere TS-4F og TS-5F anneal på polynukleotidsekvensen til α-underenheten (GenBank-tiltredelseskode: CP053865.1).
    12. Bruk 200 ng av hver plasmidkonstruksjon (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T og pEBA-10-βS377A) for å transformere kompetente celler av E. coli uttrykk belastning CB149, mangler trp operon26. Etter vellykket kolonidannelse, velg en enkelt koloni og vokse cellene i 5 ml LB medium som inneholder 50 μg / ml ampicillin. Kultur i bakteriell inkubator ved 37 °C over natten. Forbered glyserollagre av cellekultur, lagre langsiktig ved -80 °C eller bruk umiddelbart for rekombinant proteinuttrykk.
      MERK: En enkelt enkelt punktmutasjon i enten α- eller β-underenhet fra Salmonella typhimurium tryptofan syntase kan svekke enzymfunksjonen eller lavere syntese av L-Tryptofan i E. coli-stammen CB149. Vurder å bruke enten E. coli-stammen BL21(DE)pLys-S eller Rosetta (DE3)pLys-S hvis det ikke oppdages noe uttrykk eller lavere mengder rekombinant α2β2StTS-kompleks i en SDS-PAGE gel.
  2. Uttrykk for vill type og mutant form av α2β2StTS kompleks i E. coli
    1. Vokse E. coli uttrykk belastning som huser den ønskelige konstruksjonen i en frisk og steril 50 ml LB medium som inneholder 50 μg / ml ampicillin. Vokse celler over natten med risting ved 200 rpm ved 37 °C.
    2. Tilsett 5 ml av nattcellekulturen i en frisk og steril 2x 1000 ml LB som inneholder 2 % glyserol pluss ampicillin (2,8 L Fernbach-kolbe). Voks cellekulturen med risting ved 200 o/min ved 37 °C.
    3. Induser rekombinant proteinuttrykk når OD600 når 0,6-0,8 ved tilsetning av IPTG ved en endelig konsentrasjon på 0,4 mM etterfulgt av inkubasjon ved 30 °C over natten med risting ved 200 o/min.
    4. Høst cellene ved sentrifugering ved 4000 x g i 4 °C i 20 minutter. Fjern supernatanten og re-suspender cellepellets med kald lysisbuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, som inneholder 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA og 1 mM PMSF) til et endelig volum på 50 ml buffer.
      MERK: Celler kan lagres på lang sikt ved -80 °C eller brukes umiddelbart til proteinrensing. For å lagre celler, del cellefjæringen i 2 x 50 ml engangs sentrifugeringskoiske rør og hold cellepellets ved -80 °C til proteinrensingstrinnet. Uttrykket av mutant og vill type form av α2β2StTS kompleks i LB buljong gir 125-150 mg protein per liter. Vurder å skalere protokollen opp eller ned for å oppfylle bestemte krav.
  3. Rensing av villtype eller mutant form for α2β2StTS-kompleks
    MERK: Følgende protokoll er ment å rense den ikke-kodede rekombinante villtypen eller mutantformen til det rekombinante α2β2StTS-kompleks innen 1 dag, avhengig av ferdighetssett og innsats. For å redusere rensetiden, likevekt størrelse eksklusjon kolonne i buffer tidligere protein rensing / uttrykk. Rensing av villtype eller mutant α2β2StTS-komplekset utføres ved en to-trinns rensing som består av ammoniumsulfatfraksjonering og en størrelseseksklusjonskromatografi. Denne protokollen gir 60-100 mg rent kompleks fra 1 L LB medium.
    1. Forstyrre cellepellet ved sonikering ved hjelp av en digital sonifikator med 1/2" Horn-sonde (eller lignende utstyr). Utfør 20 sykluser ved 80% amplitude driftssyklus på isvannbad ved hjelp av 10 s puls og 20 s hvile eller til fullstendig celleforstyrrelse.
    2. Sentrifuger cellelyset ved 30 000 x g i 30 min ved 25 °C. Aspirer supernatant, og sørg for at pellet ikke løsner fra røret. Filtrer den klargjorte supernatante fraksjonen med et 0,45 μm filter ved romtemperatur.
    3. Vurder det første volumet av den avklarte supernatante fraksjonen. Tilsett sakte små mengder ammoniumsulfat om gangen, til en 20% metning er nådd (11,51 g / 100 ml). Utfør ammoniumsulfatfraksjonering ved 25 °C. Rør forsiktig løsningen i 10 min og unngå bobler.
    4. Sentrifuge ved 30.000 x g i 10 min ved 25 °C. Overfør den 20% supernatante brøkdelen til en ren kolbe. Resuspend 20% pelletsfraksjon i 20 ml prøvebuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, som inneholder 100 mM NaCl, 1 mM EDTA og 2 mM dithiothreitol) og lag en prøve for å kjøre SDS-PAGE gel. Kast 20% pelletsfraksjonen.
    5. Vurder det første volumet av den 20% supernatante fraksjonen. Tilsett ammoniumsulfat til 30% metning nås (5,94 g / 100 ml), rør løsning, unngå bobler og sentrifuge som før. Overfør den 30% supernatante brøkdelen til en ren kolbe. Resuspend 30% pelletsfraksjon i 20 ml prøvebuffer 2 og lag en prøve for å kjøre SDS-PAGE gel. Kast 30% pelletsfraksjonen.
    6. Vurder det første volumet av den 30% supernatante fraksjonen. Tilsett ammoniumsulfat ved en 40% metning nås (6,14 g / 100 ml), rør løsning, unngå bobler og sentrifuger som før. Overfør den 40% supernatante fraksjonen til en ren kolbe. Resuspend 40% pelletsfraksjon i 10 ml prøvebuffer 2 og lag en prøve for å kjøre SDS-PAGE gel. Kast den 40% supernatante brøkdelen.
      MERK: Vurder kvaliteten på αβStTS-komplekset ved hjelp av prøver av 30% og 40% supernatant og pelletsfraksjoner i en 12% SDS-PAGE gel25. Hvis du bekrefter at et annet mutant αβStTS-kompleks er i den 40% overnatante fraksjonen, fortsett med en 60% metning av ammoniumsulfat (13,0 g / 100 ml). Pre-renset protein aliquots av pre-renset α2β2 StTS komplekset kan lagres langsiktig ved -80 °C eller brukes umiddelbart for proteinrensing på en størrelse eksklusjon kromatografi kolonne (SEC).
    7. Mikrocentrifuger proteinprøven ved 10.000 x g,20 min, 4 °C og last den supernatante fraksjonen på en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-kolonne festet til en rask proteinvæskekromatografi med en strømningshastighet på 0,5 ml min-1, tidligere likevektet i SEC-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5 % glliose, gol 0,1 mM pyridoksalt fosfat).
      MERK: For å rense store mengder kompleks, last en 5 ml prøve ved 20-25 mg ml-1 på en HiLoad 26/600 Superdex 200 pg kolonne med en strømningshastighet på 1,5 ml min-1.
    8. Vurder prøver samlet inn langs ammoniumsulfatfraksjonering og toppfraksjoner fra SEC-kolonnen på en 12% SDS-PAGE gel farget med Coomassie strålende blåflekk 25.
    9. Konsentrer den ville typen eller mutanten α2β2StTS-kompleks med en 15 ml 100 kDa cutoff sentrifugalfilterenhet ved å spinne ved 3000 x g ved 4 °C. Overfør det konsentrerte proteinet til et friskt 2,0 ml rør og mikrosenter (10 000 x g, 10 min, 4 °C) for å fjerne aggregater.
    10. Bestem proteinkonsentrasjon24, forbered 0,5 ml aliquots ved 20-25 mg ml-1, etikett, blitsfrysing i flytende nitrogen og lagre dem ved -80 °C.

3. Optimalisert krystallisering for vill type og mutant form av α2β2StTS kompleks

MERK: Den første krystalliseringsbetingelsen for α2β2StTS-komplekset ble tidligere rapportert under forhold som inneholder 12% PEG 8000 og 2 mM spermin22.

  1. Forbered lagerløsninger før krystalliseringsanalysene for å oppnå en bedre krystalliseringsreroduserbarhet. For å utføre strukturelle studier med TS, krystalliser protein med Na+ eller Cs+ ion på metallkoordinasjonsstedet til bienzymekomplekset.
    1. Forbered 5 ml lagerløsning på 200 mM spermin i vann og hold 500 μL aliquots ved -20 °C.
    2. Forbered 50 ml lagerløsning på 30% (w / v) PEG 8000 i vann og hold 25 ml aliquots i en 50 ml engangs sentrifuger koniske kolber ved 25 °C.
    3. Forbered en 25 ml lagerløsning på 1 M CsCl i vann og hold den ved 25 °C.
    4. Forbered 25 ml lagerløsning på 1 M NaCl i vann og hold den ved 25 °C.
    5. Forbered 3x 50 ml lagerløsning på 1 M bicin og titrat med CsOH eller NaOH for å oppnå bufrede løsninger ved pH 7,6, 7,8 og 8,0. Oppbevar 25 ml aliquots ved 4 °C.
  2. Tine en prøve på α2β2StTS-kompleks (20-25 mg ml-1) på et isbad.
  3. Microcentrifuge prøve ved 10,000 x g i 10 min ved 25 °C for å fjerne protein aggregater.
  4. Overfør den fjernede supernatante fraksjonen til et rent mikrosenterrør.
  5. Estimert proteinkonsentrasjon24 og fortynnet protein aliquots (150-200 μL) ved 15 mg ml-1 med 50 mM bicin-CsOH eller -NaOH, pH 7,8 som inneholder 50 mM CsCl eller NaCl. Oppbevar proteinprøven ved 25 °C.
  6. Forbered 500 μL reservoarløsninger for 3x 24-brønns sittedråpeplater i sterile 1,5 ml merkede mikrocentrifugerør. Reservoarløsningen inneholder 50 mM bicin-CsOH eller -NaOH, 50 mM CsCl eller NaCl og PEG 8000. Varier konsentrasjonen av PEG 8000 (6-11%) på platekolonnene og konsentrasjonen av spermin (2-8 mM) på tallerkenradene. Endre buffer-pH (pH 7,6, 7,8 og 8,0) for hvert sett.
  7. Hette rørene og virvelen kraftig minst 10 sek. Sentrifugerør ved 10.000 x g i 10 min ved 25 °C for å fjerne bobler. Dispenser 500 μL bufret oppløsning i hvert merket reservoar.
  8. Bruk en P-10 mikropipette og dispenser 5 μL proteinoppløsning ved 15 mg ml-1 per sittedråpe godt. Unngå bobler. Tilsett 5 μL av hver korrespondent reservoarløsning til proteindråpen. Unngå bobler under blanding og ikke pipette opp og ned for å homogenisere blandingen.
  9. Tape platen med et gjennomsiktig tape og oppbevar platen ved 25 °C. Krystaller vises i 2-5 dager og vokser til sine fulle dimensjoner innen to uker.

4. Innsamling av røntgendiffraksjonsdata og α2β2StTS kompleks strukturløsning

MERK: Før innsamling av røntgendiffraksjonsdata, klargjør du kryoprektantløsning for hver krystall på forhånd. Bruk den spesifikke reservoarløsningen til å klargjøre 3 aliquots som inneholder økende konsentrasjoner av dimetylsulfoksid i oppløsning (10, 20 og 30% v/v) og spesifikk ligand (s). Dimetylsulfoksid ble funnet å være et bedre kryoprektivt middel enn glyserol, etylenglykol og PEG 200-300.

  1. Høst en stor enkelt krystall ved hjelp av en kryoop under det stereoskopiske mikroskopet.
  2. Pipette 2 μL av hver kryotopektantløsning som inneholder utfellingsløsningen pluss høyere konsentrasjoner av dimetylsulfoksid og ligand (er) på en ny dekselsklie.
  3. Sekvensielt, suge crystal i hver dråpe og la krystallen likevekt for 30 s i kryopreotektantoppløsningen.
  4. Blinkkjøling av den kryokroterte krystallen ved hjelp av en gassformet nitrogenstrøm ved -173 °C (100 K) eller dypp i flytende nitrogen for langvarig lagring i pucker.
    MERK: Fyll et skum Dewar med flytende nitrogen, forkjøl en krystallpuck, oppbevar krystaller i den kryogene lagringen Dewar, og send krystaller til synkrotronen ved hjelp av en tørr avsender.
  5. Fortsett med innsamling av røntgendiffraksjonsdata ved -173 °C. Registrer røntgendiffraksjonsdata ved hjelp av en eksponeringstid på 0,5-4,0 og 0,5° svingninger. Roter krystall 180-360°.
  6. Behandle røntgendiffraksjonsbildene med iMosflm27 for å generere refleksjonsfil i riktig romgruppe. Vanligvis tilhører α2β2StTS-krystaller romgruppen C 121 (C2).
  7. Skaler sammen flere observasjoner av refleksjoner med Scala28, implementert i CCP4-pakken29.
  8. Løs strukturen til høyoppløselig α2β2StTS-kompleks ved molekylær erstatning ved hjelp av MolRep30 og en passende søkemodell. Inspiser modellen og elektrontetthetskartet i Coot31 etter en vellykket strukturløsning.
    MERK: Det er mange TS-krystallstrukturer deponert i Protein Data Bank med forskjellige ligand (er). For et bedre molekylært erstatningstrinn og redusert tid på å tilpasse den nyere krystallstrukturen, bruk den beste søkemodellen som inneholder ligand (er) av interesse. Fortsett med krystallstruktur raffinement i CCP429,30 eller Phenix31.
  9. Foreta manuelle justeringer av modellen ved hjelp av Coot32, etterfulgt av automatisk forbedring med Refmac29,33 eller phenix.refine31,34. Bygg og finpuss den endelige modellen ved å kjøre iterative runder med modellbygging i Coot32 og automatisert raffinement.
  10. Fortsett med koordinat- og strukturfaktorer avsetning på proteindatabankens nettsted.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rensing av α- og β-underenheter av tryptofansyntase
Den α-underenheten (αStTS) og β-subenheten (βStTS) av Salmonella typhimurium tryptofan synthase ble subklonert i den modifiserte pET SUMO-vektoren. Figur 1A viser representative SDS-PAGE-resultater av to sterke bånd som tilsvarer fusjonsproteinet His6-SUMO-αStTS (lane αON) og His6-SUMO-βStTS (lane βON). Renseprotokollen beskrevet i dette arbeidet tillot rensing av begge underenhetene individuelt innen 2 dager. Den første dagen ble brukt til å rense hvert protein av Ni-NTA affinitetskromatografi, ammoniumsulfatutfelling etterfulgt av His-SUMO-tag spalting, fjerning av His-SUMO-tag spor og proteinkonsentrasjon. Figur 1B og 1C viser representative SDS-PAGE-resultater av henholdsvis α-underenheten og β-underenhetsrensing. På den andre dagen ble konsentraten α-underenhet, β-underenhet og α2β2StTS-komplekset fra α- og β-underenheter lastet på en størrelseseksklusjonskromatografikolonne. Figur 1D viser en typisk elutionprofil av αStTS, βStTS og α2β2StTS-komplekser på en S-200 HR-størrelse ekskluderingskolonne. Figur 1E viser et representativt resultat av SDS-SIDE for de innsamlede toppfraksjonene. De reneste toppfraksjonene ble samlet, konsentrert, og α2β2StTS-komplekset ble brukt til proteinkrystalliseringsstudier.

Rensing av villtype og mutant α2β2StTS-komplekset
En annen rask og effektiv protokoll for å rense den ville typen og mutantformen til α2β2S. typhimurium tryptofan synthasekompleks er beskrevet i dette arbeidet. Figur 2 viser en representasjon av pEBA-10-konstruksjonen som inneholder den ville typen oversettelsesgen (trpA og trpB) for α- og β-underenheter22. Den to-trinns PCR-mutageneseprotokollen for å generere mutante former for α2β2StTS-komplekset er avbildet i figur 3.

Kodingsområdene til mutant α2β2StTS-komplekset i pEBA10 ble bekreftet av DNA-sekvensering og brukt til å transformere E. coli-stamme CB149-celler26. Den ville typen og mutantformen til α2β2StTS-komplekset ble overekspressert og de rekombinante proteinene ble renset vellykket innen 1-2 dager. Ammoniumsulfatfraksjonering ved romtemperatur fjernet lett de fleste forurensningsproteinene fra det heterografiske uttrykkssystemet (Figur 4A, baner 20P, 30P og 40S). En representativ elutionprofil med relativ elutionposisjon på α2β2StTS-kompleks (143,06 kDa) på et HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-størrelse utelukkelseskromatografikolonne vises i figur 4B. Renheten til de utelatte toppfraksjonene ble analysert før gruppering (figur 4C).

Optimalisering av villtype og mutant α2β2tryptofan syntase kompleks krystallisering
Aliquots av vill type og mutant α2β2StTScomplex ved 15 mg ml-1 ble brukt til å sette opp 24-brønns sittedråpeplater. Vanligvis ble dråper som består av 5 μL proteinoppløsning og tilsvarende volum reservoarløsning likevekt mot 500 μL reservoarløsning (figur 5). Spermin er nødvendig for å krystallisere den ville typen og mutanten α2β2StTS-komplekset22. Mens den endelige konsentrasjonen av spermin for å krystallisere den ville typen er 2 mM, viste konsentrasjonen av spermin for å krystallisere mutantkomplekset i dette arbeidet å være litt høyere (4-8 mM).

Store enkeltkrystaller ble oppnådd gjennom en fin krystalliseringsoptimalisering, varierende PEG 8000 (6-11%) og bicinbuffer pH. Krystaller med forskjellige morfologier dukket opp i 2-5 dager og krystaller vokste til full størrelse innen to uker (Figur 6). Før innsamling av røntgendiffraksjonsdata ble krystaller gjennomvåt i kryotoprotektiv oppløsning (reservoarbuffer som inneholder opptil 30 % dimetylsulfoksid). Den optimaliserte prosessen resulterte i kvalitetskrystaller egnet for røntgendiffraksjonsmålinger ved nær atomoppløsning.

Analyse av røntgendiffraksjonsdata
En krystallstruktur av den ville typen α2β2StTS-komplekset ble utarbeidet med metoder beskrevet i denne artikkelen, og røntgendiffraksjonsdata ble samlet inn ved nær atomoppløsning. Krystallen ble gjennomvåt i kryobeskyttende oppløsning som inneholdt F9-hemmer (2- ({[4- (Trifluoromethoxy)Fenyl]Sulfonyl}Amino)Etyl dihydrogenfosfat) og L-Tryptofan.

Et komplett røntgendiffraksjonsdatasett ble samlet inn på SIBYLS synkrotronstrålelinje 12.3.1 ved Advanced Light Source (Berkeley-CA) ved å rotere krystallen 360° i trinn på 0,5°. Røntgendiffraksjonsintensiteter ble behandlet, og datainnsamlingsstatistikk er oppsummert i tabell 1. Symmetrianalyse indikerer at krystallen tilhørte den monokliniske romgruppen C2. Enhetscelleparameterne er a = 182,55, b = 59,30, c = 67,37Å, α = 90,00, β = 94,82, γ = 90,00°. Den beregnede verdien av Matthews koeffisient (Vm = 2,57 Å3 Da-1) antyder tilstedeværelsen av ett TS-heterodimermolekyl (αβ StTS) i krystallens asymmetriske enhet med et løsningsmiddelinnhold på 52,08%35,36. Alle røntgendata ble samlet inn ved lave temperaturer (100 K) for å forbedre diffraksjonskvaliteten og redusere strålingsforfallet. Den α2β2StTS krystallstruktur i komplekset ble løst ved molekylær erstatningsmetode ved hjelp av wild type αβ StTS-modellen i kompleks med inhibitor F9 på α-stedet og cesiumion på metallkoordineringsstedet (PDB ID-kode: 4HT3). Den endelige koordinatfilen og strukturfaktorene ble deponert i PDB med tiltredelseskode 5CGQ (figur 7A). Krystallstrukturen til den ville typen α2β2StTS-kompleks med inhibitor F9 ved enzymet α-site (Figur 7B), cesiumion på metallkoordinasjonsstedet (Figur 7C), kofaktor pyridoksal 5'-fosfat kovalent bundet til βLys87 (Figur 7D), og produktet L-tryptofan ved enzymet β-site ( Figur7E) ble løst ved 1,18 Angstrom oppløsning. Modell 5CGQ er den høyeste oppløsningen α2β2StTS krystallstruktur deponert i PDB til dags dato.

Figure 1
Figur 1: Rensing av α- og β-underenheter og α2β2StTS-komplekset. (A) Rekombinant proteinuttrykk. 12% SDS-PAGE gel av nattuttrykksprofilen til SUMO-αStTS (αON) og SUMO-βStTS (βON) etter IPTG-induksjon ved 30 °C (α/β0 før IPTG-induksjon). (B, C) Ni-NTA affinitetskromatografi etterfulgt av ammoniumsulfatutfelling (60% metning), (S) klargjort råoljeekstrakt (FT1) Ni-NTA-kolonne passerer gjennom prøve (W) kolonnevaskprøve (E) eluate prøve (60S) og (60P) supernatant og utfelling fraksjoner etter høyhastighets sentrifugering, henholdsvis (D) SUMO-protease fordøyelsesprodukt (FT2) Ni-NTA-kolonnen passerer gjennom prøven som inneholder den tagløse αStTS eller βStTS-underenhet. (D) elution profil av αStTS subenhet (28.67 kDa), βStTS subenhet (42.86 kDa), og α2β2StTS kompleks (143.06 kDa) med en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR størrelse utelukkelse chromatography kolonne chromatography Hver kjøring ble utført separat. (E) SDS-PAGE geler av de ekskluderte toppfraksjonene fra hver enkelt kromatografi. Mens 15% SDS-PAGE geler ble forberedt på å analysere α2β2StTS-komplekset og αStTS-underenhet, ble en 12% SDS-PAGE gel forberedt på å analysere βStTS-underenhet. Lane MW, molekylvektmarkører i kDa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representasjon av konstruksjonen pEBA-10. (A) Representasjon av den ville typen oversettelsesbindende gen (trpA og trpB) som koder α- og β-underenheter av tryptofansyntase fra bakterien Salmonella enterica serovar typhimurium (Yang, Ahmed et al. 1996). (B) Vektoren inneholder en ampicillin motstand (amp) gen, en replikasjon opprinnelse (ori), en lacIq gen for bedre nedleggelse en lac promotør i fravær av IPTG induser, og LacI-undertrykt promotør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Samlet representasjon av den to-trinns PCR-mutageneseprotokollen. pEBA-10-vektoren ble brukt som EN DNA-mal. Den første runden av PCR ble utarbeidet med primere TS-FW-NcoI og MUT-REV (en omvendt primer som inneholder en mutasjon) for å generere det første fragmentet og primerne TS-Rev-SacI og MUT-FW (en fremoverprimer som inneholder en mutasjon) for å generere det andre fragmentet). Fragmenter ble gelrenset og likemolart kombinert, varme denaturert og glødet. De rekombinante trådene ble utvidet med polymerase og deoksyribonukleotider. Den andre runden av PCR ble utarbeidet med primere TS-FW-NcoI og TS-Rev-SacI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Rensing av villtype og mutantform av α2β2StTS-kompleks. (A) 12% SDS-PAGE gel av prøver samlet inn langs ammoniumsulfatutfellingen ved hjelp av 20, 30, 40 og 50% ammoniumsulfatmetning ved romtemperatur: (CE) råekstrakt (S) og (P) supernatant og utfellingsfraksjoner etter høyhastighets sentrifugering. (B) Elution profil av α2β2StTS (143.06 kDa) kompleks med en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR størrelse utelukkelse kromatografi kolonne. (C) 12% SDS-PAGE gel bilde av de ekskluderte toppfraksjonene. Lane MW, molekylvektmarkører i kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Krystalliseringsoptimalisering for villtype og mutantform av α2β2StTS-kompleks. Krystaller ble dyrket i 50 mM Bicine-CsOH buffer som inneholder 50 mM CsCl2. Konsentrasjonen av polyetylenglykol 8000 (6-11%) og spermin (2-8 mM) var variert for å oppnå enkle store krystaller for å utføre strukturelle studier av røntgenproteinkrystallografi. (A) Bicine-CsOH, pH 7.6. (B) Bicine-CsOH, pH 7,8. (C) Bicine-CsOH, pH 8.0. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Fotomikrograf av krystaller av vill type og mutant form for α2β2StTS kompleks. Krystaller varierer i morfologi, men de tilhører romgruppen C2. Krystallene vokste til sine fulle dimensjoner under de endelige forholdene etter to uker. Krystaller på ca. 0,20 x 0,15 x 0,10 mm i størrelse. (A-D) PLP holo-krystaller i kompleks med cesiumion på metallkoordinasjonsstedet av villtypeformen (kolonne A), mutantform α2β2 βQ114A (kolonne B), α2β2 βK167T (kolonne C) og α2β2 βS377A (kolonne D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Generell visualisering av krystallstruktur og validering av elektrontetthetskart oppnådd etter krystallstrukturforbedring. (A) krystallstruktur av den ville typen α2β2StTS-kompleks med inhibitor F9 ved enzymet α-stedet (gulfarget), cesiumion på metallkoordinasjonsstedet (blåfarget), kofaktoren pyrid 5-fosfat kovalent bundet til βLys87 (grønnfarget), og produktet L-tryptofan ved enzymet β-site (cyan farget) ved 1,18 Angstrom oppløsning. Mens α-underenheten er farget i lyseblå, er β-underenheten farget i laks. (B-E) Elektrontetthet kart konturert på 1,0 r.m.s. nivå rundt (B) inhibitor F9 (C) cesium ion (D) pyridoksal-5′-fosfat, og (E) L-Tryptofan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Datainnsamling og behandling
Røntgenkilde / Bjelkelinje ALS Bjelkelinje 12.3.1
Bølgelengde (Å) 10,000
Oppløsning (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
Totalt antall gjenspeilinger 2151280 (252941)
Totalt antall unike gjenspeilinger 231646 (32187)
Områdegruppe for indeksering, skalering og fletting C 1 2 1
Celledimensjoner
a, b, c (Å) 182.55, 59.30, 67.37
α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
Mosaikk 0.61
Matthews volum VM (Å3 Da-1) 2.57
Rmeas (%) 8.6 (93.0)
14.7 (3.0)
CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
Fullstendighet (%) 98.6 (94.2)
Mangfold 9.3 (7.9)
Statistikk for presisering
R arbeid/rfree (%) 14.04 / 16.05
RMSD-bindingslengde (Å) 0.0120
RMSD-bindingsvinkel (°) 14,059
Ramachandran favoriserte 515 (96.44%)
Ramachandran tillatt 16 (3.00%)
Ramachandran nektet 3 (0.56%)

Tabell 1: Datainnsamling og behandling. Verdier i parentes er for det ytre skallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har vellykket konstruert mutantform α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, og α2β2 βS377A StTS-komplekser for strukturfunksjonskorrelasjonsstudier. I utgangspunktet har vi forsøkt å rense mutantene ved hjelp av en tidligere renselsesprotokoll22, som krever α2β2StTS kompleks krystallisering med PEG 8000 og spermin under rensing. Selv om krystalliseringshastigheten avhenger av mutantformen og konsentrasjonen av komplekset i løsningen, er det vanskelig å forutsi når krystaller vises i et stort løsningsvolum. Krystallisering kan oppnås enten etter lange perioder (48-96 h) eller være nødvendig tillegg av ekstra mengder PEG 8000 etter krystallisering initiering15.

Dessverre ble mutante former for α2β2StTS-kompleks presentert i dette arbeidet ikke vellykket renset ved hjelp av denne protokollen siden de ikke klarte å krystallisere under de første trinnene i protokollen, svekkende krystallografiske studier. Derfor har vi laget en enkel og effektiv renseprotokoll som består av ammoniumsulfatfraksjonering og størrelseseksklusjonskromatografi, som gir høye utbytter av vill type og mutant form for α2β2StTS-kompleks. Denne protokollen er raskere (1-2 dager) og reproduserbar sammenlignet med forrige protokoll (5-7 dager)15,22, siden det ikke er noen krystalliseringskrav og protokollfeilsøking langs rensing. I tillegg har vi laget nye uttrykkskonstruksjoner og protokoll for å rense høye mengder av α-underenhet, β-underenhet og rekonstituere α2β2StTS-komplekset fra isolasjonene.

Fremtidig anvendelse inkluderer rekombinasjon av villtype og mutante underenheter for å utføre funksjonelle og strukturelle studier. Mutant α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, og α2β2 βS377A kompleks krystallisert under forhold som inneholder høyere konsentrasjoner av spermin (4-8 mM) sammenlignet med villtypeformen (2 mM). Derfor er det verdt å bruke tid på å forbedre kvaliteten på proteinkrystaller ved å variere konsentrasjonen av utfellingsmidler og buffer pH. Enkle store krystallformer vokste tilfeldig i bicinbufret løsning (pH 7,6-8,0) som inneholder 6-11% PEG 8000. Metodene beskrevet i dette arbeidet vil bli brukt til å forberede krystallstrukturer av den ville typen og mutantformene til α2β2-komplekset med forskjellige ligander innenfor α- og β-aktive stedene, etterligne forskjellige mellomprodukter og overgangstilstander involvert i konvertering av indole og serin til tryptofan. Krystallstrukturene til disse mutantene forventes å gi ny innsikt i mekanismen og rollene som spilles av viktige rester i L-Tryptofan syntese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre og erklære ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av US National Institute of Health (GM097569).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL 10 kDa filter MilliporeSigma UFC901024 centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter MilliporeSigma UFC910024 centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials Corning CLS430489 Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-141 microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate Hampton Research HR3-158 24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100 Chemical
50 mL centrifuge conical tubes Thermo Scientific 12-565-270 centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic Fisher Scientific 13-636-AB15 pH meter
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 Agarose gel
ammonium sulfate Fisher Scientific A702-500 Chemical
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5 Antibiotic
Bacterial incubator Fisher Scientific S35836 incubator.
BamHI New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
bicine Fisher Scientific BP2646100 Chemical
Branson 450 Digital Sonifier Brason B450 Cell disruptor
Cesium chloride Fisher Scientific BP210-100 Chemical
Cesium hydroxide Acros Organics AC213601000 Chemical
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 Antibiotic
dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D1391 Chemical
dithiothreitol Fisher Scientific BP172-5 Chemical
DNA Polymerase Thermo Scientific F530S HF polymerase
dNTP Set Invitrogen 10-297-018 dNTPs set
EcoRI New England Biolabs R0101S Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chemical
Excella E25R Orbital Shaker Eppendorf New Brunswick M1353-0004 Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus GE Healthcare 8149-30-0004 FPLC
Gel Extraction Kit Invitrogen K210012 DNA purification kit
Glycerol Fisher Scientific G33-500 Chemical
HindIII New England Biolabs R0104S Restriction enzyme
His-Trap columns GE Healthcare GE17-5255-01 5 mL Histrap column
imidazole Fisher Scientific O3196-500 Chemical
IPTG Thermo Fisher Scientific R0392 Inducer
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Antibiotic
Kelvinator Series-100 Kelvinator discontinued Ultra low freezer
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Liquid broth
Luria Bertani agar Fisher Scientific BP1425-2 Solid broth
NaCl Fisher Scientific S271-500 Chemical
NcoI New England Biolabs R0193S Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads Thermo Fisher Scientific R90115 Ni-NTA agarose beads
PEG 8000 Fisher Scientific BP233-100 Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific 44-865-0 Chemical
pyridoxal phosphate Acros Organics AC228170010 Chemical
S-200 HR Cytiva 45-000-196 Size exclusion column
SacI New England Biolabs R0156S Restriction enzyme
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge Sorvall 8327-30-1004 Floor cetrifuge
Spermine Acros Organics AC132750010 Chemical
Superdex 200 prep grade Cytiva 45-002-491 Size exclusion column
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S DNA liagse
Tris Fisher Scientific BP152-500 Chemical
Ubl-specific protease 1 Thermo Scientific 12588018 SUMO Protease

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

Tags

Biokjemi Utgave 163 Tryptofan syntase rekombinant protein mutantprotein proteinuttrykk proteinrensing ammoniumsulfatutfelling størrelseseksklusjonskromatografi proteinkrystallisering
PCR Mutagenesis, Kloning, Uttrykk, Rask Protein Rensing Protokoller og Krystallisering av Wild Type og Mutant Former for Tryptophan Synthase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hilario, E., Fan, L., Mueller, L.… More

Hilario, E., Fan, L., Mueller, L. J., Dunn, M. F. PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase. J. Vis. Exp. (163), e61839, doi:10.3791/61839 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter