Summary
本文介绍了一系列连续的方法来表达和净化 沙门氏菌色氨酸 合成酶，使该协议成为一天中净化蛋白质复合物的快速系统。覆盖的方法包括现场定向突变、 大肠杆菌中的蛋白质表达、亲和色谱、凝胶过滤色谱和结晶。
Abstract
对来自沙门氏菌的色氨酸合成酶（TS）双酶复合物（α 2 β 2 TS）进行了结构研究，以更好地了解其催化机制、同位素行为以及PPLP依赖酶中基质向产品酶转化的细节。在这项工作中，一种新的表达系统，以产生孤立的α和孤立的β子单位允许净化大量的纯子单位和α 2 β 2圣TS综合体从孤立的亚单位在2天内。净化由亲和度色谱进行，然后是亲和力标记的、硫酸铵沉淀和大小排除色谱（ SEC ）。为了更好地了解酶β部位的关键残留物的作用，在以前的结构研究中进行了现场直接突变。另一个协议被创建，以净化野生类型和突变体α 2 β 2圣TS综合体。使用硫酸铵分馏和 SEC 的简单、快速和高效的协议允许在一天内净化α2β2StTS 复合物。与之前使用 PEG 8000 和精氨酸沿净化协议对同一复合物进行净化的先前协议相比，本文中描述的两种净化协议都具有相当大的优势，使α2β2StTS 复合体结晶。野生类型和某些突变形式的结晶发生在略有不同的条件下，损害了使用PEG 8000和精子的一些突变体的净化。为准备适合X射线晶体学研究的晶体，我们努力优化结晶、晶体质量和低温保护。这里提出的方法通常应适用于净化色氨酸合成酶亚单位和野生类型和突变α2β2圣TS复合物。
Introduction
色氨酸合成酶（TS）双酶复合物（α 2 β 2）是一种异体酶，催化了细菌、植物和真菌1、2、3中氨基酸L-色氨酸生物合成的最后两步。沙门氏菌肠血清病毒血清素（圣）引起人类和其他动物的严重胃肠道感染。由于人类和高等动物没有 TS（EC 4.2.1.20），S 的抑制。 二甲苯甲酸酯α 2 β 2 TS复合物（α 2 β 2StTS）已被探索为治疗隐孢子虫病和结核病4，生殖器和眼部感染5，以及农业中潜在的除草剂使用的潜在药物目标6。 α - 亚单位通过形成一种氨基苯丙胺陶托默中间体，随后产生 GAP 和内脏3 ， 6的碳碳粘结，促进甘油三磷酸盐（ GAP ）和内脏的碱性。β催化剂位点含有一种通过希夫碱与β-Lys87结合的磷酸杆菌（PLP）共因子分子，在酶β-子单位3、7的反应过程中充当电子汇。β部位通过用惰性剂促进L-Serine侧链羟基的替代，使L-色氨酸和水分子在PLP依赖反应中。圣TS是研究多酶复合物2、3中基质导流和同位素通信的长期模型。TS 的α和β子单元之间的双向同体通信对于同步催化步骤和防止 L-色氨酸合成3期间的内多尔释放是必要的。为了扩大这一努力，我们准备了几个突变体（β-Gln114Ala、β-Lys167Thr和β-Ser377Ala），用于进一步探索圣TS β子单位催化部位酶结构、机制和功能之间的关系。
伊迪丝·迈尔斯研究小组对α 2 β 2圣TS的催化机理进行了详细的研究。早期研究与本地大肠杆菌α 2 β 2TS复合体，重点是净化和定性孤立的α子单元8，9，孤立的β子单元10，11和重组α 2 β 2TS综合体从孤立的子单元12。净化是通过硫酸铵沉淀、样品透析、DEAE-Sephadex色谱、透析和DEAE-Sephadex列12上的第二个色谱圆进行的。在另一个协议中，通过将澄清的细胞裂解物加载到DEAE-Sephadex柱上，然后在Sepharose 4B柱上加载色谱步骤、硫酸铵沉淀和透析13，改进了同一复合物的净化。两种净化协议持续 4-5 天。大肠杆菌α 2 β 2TS复合结晶，但晶体当时不适合X射线衍射。
在一项新的研究中，重组和野生类型的S.型甲基βα甲基重组α 2 β 2圣TS复合体在携带pEBA-10表达载体的大肠杆菌株CB149中过度表达。初步结晶和X射线衍射数据收集和分析的α 2 β 2圣TS综合体报告14。然而，像α 2 β 2圣TS晶体的长而细的针头损害了结构研究。为了收集更好的X射线衍射数据，另一个净化协议被描述为净化野生类型和突变形式的α 2 β 2圣TS复合体15。净化是使用精氨酸和PEG 8，000进入澄清细胞解剖进行初始降水，并通过离心去除一个大的散沉淀物。含有大量α 2 β 2StTS复合物的超高分数在4°C下储存了16-48小时，直到黄色晶体沉淀。晶体被洗净，并广泛透析对不同的缓冲。蛋白质复合物在含有硫酸铵的缓冲器中重新装覆，并透析15。虽然蛋白质结晶取决于溶液中的蛋白质和沉淀物浓度，但很难监测、预测和繁殖溶液中其他突变形式的α2β2StTS 复合物的纯化。此协议具有不使用任何色谱方法的优势：然而，缺点是结晶、透析和重新装覆所需的较长的净化时间，通常需要 5-7 天。为了获得适合X射线数据采集的晶体，使用蛋白质浓度、温度、沉淀剂（PEG 4，000、6，000和8，000）和添加剂（CaCl 2、MnCl2、ZnCl2、尸体、普氏精氨酸、精子或精氨酸）的组合和变异对600多个结晶条件进行了评估。晶体具有更好的晶体形式，在含有 12% PEG 8，000 和 2mM 精子的条件下生长得更快。结晶在 25 °C 时比在 4、30 或 42 °C 更有利，并在15天内增长到最大尺寸。据报道，当时（1996-1999年）16、17、18、19、20、21和许多其他结构已公布α 2 β 2个圣TS晶体结构。
在这里，主要目的是提出替代协议，以净化色氨酸合成酶和优化蛋白质结晶。目前的工作表明，在净化野生类型孤立的α子单元（α圣TS），孤立的β子单位（β圣TS），重建α 2 β 2圣TS综合体从孤立的亚单位，野生类型和突变形式的α 2 β 2圣TS综合体。 由于净化时间显著缩短，结晶和低温保护得到优化，与以往协议相比，其优势相当大。在这项工作中设计的α 2 β 2StTS复合体的突变形式已经结晶，接近野生类型形式所用的条件。然而，为了获得质量足够的大单晶，在接近原子分辨率的结构确定方面，必须进行精细的结晶优化。迄今为止，蛋白质数据库（PDB）中存存的色氨酸合成酶晶体结构有134个，分别占细菌、古生物和真核生物晶体结构的101个、31个和2个晶体结构。不错的是，73个结构属于S.肠血清石，5个晶体结构的α 2 β 2圣TS综合体有分辨率限制高于1.50安格斯特罗姆。毫不奇怪，我们的研究小组准备了 4 分 5 秒（PDB ID：5CGQ 在 1.18 + ， 4HT3 在 1.30 +， 4HPJ 在 1.45 +， 6DZ4 在 1.45 + 分辨率）。α 2 β 2圣TS 复合体的突变形式的精炼晶体结构预计将为了解 L-色氨酸合成中所涉及的基本氨基酸残留物所起的机制和作用提供新的见解。
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Protocol
1. 快速协议，以净化α和β子和重组α 2 β 2圣TS 综合体
- 脱氧核糖核酸分包成 pETSUMO 表达载体
- 获得翻译耦合基因（trpA和trpB）编码 α-和 β- 从 细菌沙门氏菌肠 血清石 血清石 克隆在pEBA-10表达载体22的色氨酸合成酶的亚单位。使用 pEBA-10 载体作为 DNA 模板。
注：或者，下面列出的引物可用于放大 来自沙门氏菌肠 血清素 血清素血清素 基因组的两个基因。所有分子生物学步骤都遵循分子克隆：实验室手册23中描述。 - 使用聚合酶链反应 （PCR） 单独放大α子联盟（αStTS） 的全长多核苷酸序列，并αStTS-FW-Bam 和α入门α圣TS-Rev-Eco 和全长序列的β子联盟 （β圣TS） 与引物β圣TS-FW-Bam 和β圣TS-Rev-欣德。使用约 55 °C 的熔化温度和 2 分钟的聚合酶延长时间。
- 使用高保真DNA聚合酶（例如 Phusion）和制造商的协议来放大 DNA 序列。对于 50 μL PCR 反应添加 34 μL 无核糖酶水，10 μL 的 5 倍反应缓冲， 1 μL 的 10 mM dNTP， 1 μL 的 10 μM 前进引物， 1 μL 的 10 μM 反向引物， 1 μL 的模板 DNA （200 ng）， 1.5 μL 的 DMSO， 0.5 μL 的 Phusion DNA 聚合酶。
- 对于 PCR 程序，请使用热启动（98 °C 时为 180 秒），然后是 30 个放大周期（30 秒在 98 °C，30 秒在 55 °C 时为 120 秒，在 72 °C 处为 120 秒），最后一个扩展（300 秒在 72 °C）。
注：迭形序列分别对应于 BamHI、Eco RI、BamHI 和欣德III 限制站点。通过添加额外的碱基（小写序列），增强了接近 PCR 片段术语的酶效率。
α圣茨 - 弗 - 巴姆： 5 + cgcggatcc阿特加查塔卡 - 3+
α圣茨 - 雷夫 - 生态： 5 + ccg加特克塔格格特克 - 3 +
β圣茨 - Fw - bam： 5 + cgcggatcc阿特加卡actctcaac - 3+
β圣茨 - 雷夫 - 欣德： 5 + - ccc阿格特· 塔加特克 - 3+
- 将PCR产品装载在6 V/cm的1x TAE缓冲器（40 mM Tris、20mM醋酸和1m EDTA）中0.8%的玫瑰凝胶上，凝胶提取感兴趣的DNA带，并根据制造商的指示使用硅珠套件净化PCR片段。
- 在37°C下，将每个DNA片段中至少200 ng与制造商推荐的适当限制酶和条件一起消化2小时。
- 要设置 50 μL 限制消化反应，请添加 34 μL 无核糖水、10 μL DNA （200 ng）、5 μL 10 倍反应缓冲器、0.5 μL 限制酶 1 和 0.5 μL 限制酶 2。
- 将消化产品加载到 6 V/cm 的 1x TAE 上的 0.8% 的玫瑰凝胶上，使用商业套件将凝胶提取物和凝胶净化消化片段。
- 将每个片段单独分入 大肠杆菌 表达改性载体 pET SUMO 中，以前用适当的酶和凝胶净化消化。
注：此矢量是商业 pET SUMO 的修改版本。该载体已优化为限制酶克隆。pET28b 载体（ Bam HI 、 EcoRI 、 萨克 I 、 SalI 、 欣德三世、 不是我和 XhoI ）的多克隆站点（ MCS ）入 pET 相扑克隆站点。该载体包含一个N-终端6x-Histidine标签在框架与小育碧素样修饰蛋白（SUMO）和多个克隆位点。 - 在 25 °C 下，用 T4 DNA 韧带将 100 ng 的改性 pET SUMO 和 50 ng 的 PCR 片段配上 2 小时。
- 将构建的质粒转化为大肠杆菌株DH10B α细胞的称职细胞。含有 35 μg/mL卡纳霉素的LB 阿加板上的板细胞。在 37 °C 下将板倒置过夜。
- 从每个转化中选择一个单一的菌落，准备超纯质粒DNA，并执行DNA测序，以验证 α圣TS 或β圣TS 是用 N 端 His6-SUMO 标签在框架中克隆的。
注：准备细胞培养的甘油库存（将细胞悬浮在无菌甘油最终浓度的16%）中转动细胞悬浮，并长期储存在-80°C。 - 将表达质粒SUMO-α圣TS 或相扑β圣TS 单独转换为大肠杆菌表达应变罗塞塔 （DE3） plysS的称职细胞，并采用基于 T7 的促进器系统。将重组细胞镀在卢里亚·贝尔塔尼（LB）的茄板上，含有35微克/mL卡纳米辛和氯霉素。在 37 °C 下将板倒置过夜。
- 成功形成殖民地后，选择一个单一的殖民地（没有任何卫星殖民地），并分散在5兆L的LB介质与两种抗生素。培养细胞在 37 °C 下以 200 rpm 的速度摇晃过夜。
注：准备细胞培养的甘油库存，长期储存在-80°C或立即用于重组蛋白质表达。
- 获得翻译耦合基因（trpA和trpB）编码 α-和 β- 从 细菌沙门氏菌肠 血清石 血清石 克隆在pEBA-10表达载体22的色氨酸合成酶的亚单位。使用 pEBA-10 载体作为 DNA 模板。
- 苏莫 -α圣Ts 和相扑 - β圣Ts 子单位的表达
- 接种新鲜 大肠杆菌 菌株罗塞塔 （DE3） plysS 细胞窝藏苏莫- α圣TS 或相扑 - β圣TS 构建或刮一些冷冻甘油库存到 50 mL 培养 LB 包含 35 μg/mL 卡纳霉素和氯霉素。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度在夜间生长细胞。
- 第二天早上，在新鲜无菌的 2x 1000 mL LB 中接种 5 mL 的隔夜细胞培养物，其中含有 2% 甘油外加卡纳霉素和氯霉素（2.8 L Fernbach 烧瓶）。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度进行摇晃，培养细胞培养。
注：在LB汤中表达SUMO-α圣TS或相扑-β圣TS每升产生125-150毫克标签蛋白。考虑上下扩展协议以满足特定需求。 - 当OD600 达到0.6-0.8时，通过添加异丙基β-D-1硫高非他明（IPTG），在0.4mM的最终浓度下诱导重组蛋白表达，然后在30°C的夜间孵化，在200转/分处摇晃。
- 在 4 °C 下以 4，000 x g 离心收集细胞，20 分钟。取出超高分子，用冷裂解缓冲器1（50 mM Tris-Cl，pH 8.0，含500m NaCl，5%甘油，10mM 2-甲醇，和40mM imidazole-Cl）重新悬浮细胞颗粒，最终体积为60mL。
注：细胞可长期储存在-80°C或立即用于蛋白质纯化。要储存细胞，将细胞悬浮物拆分成 2 x 50 mL 一次性离心机锥形管，并将细胞颗粒保持在 -80 °C，直到蛋白质净化步骤。
- 净化 α- 和色氨酸合成酶的β子单位
注：除非另有说明，否则所有程序均应在 4 °C 下执行。为了减少纯化时间，在蛋白质纯化之前或重组蛋白表达过程中，将Ni-NTA的镍电压亲和力柱和大小排除列等于缓冲。- 使用带有 1/2"喇叭探头（或类似设备）的数字声震器进行声波，从而破坏细胞颗粒。使用 10s 脉冲和 20s 休息或直到完全细胞中断，在冰水浴上以 80% 振幅值班周期执行 20 个循环。
- 将细胞以 30，000 x g 离心，30 分钟。吸气超高，确保颗粒不会从管子中脱落。在冰上用 0.45 μm 过滤装置过滤超高纳坦，并将其流过 15 mL Ni-NTA 的镍电荷亲和力柱，在裂解缓冲器 1 中预先平衡。
注：每个Ni-NTA阿加罗斯柱将用于净化相扑-α圣TS或相扑-β圣TS重组蛋白。净化可以在连接到快速蛋白质液相色谱系统的 2x 5 mL Ni-NiTA 列中执行。一次纯化一种蛋白质。 - 在 100 mL 裂解缓冲 1 中清洗 Ni-NTA 阿加罗斯柱。
- 继续一个80mL单步洗礼与缓冲E1（25 mM特里斯-Cl缓冲器，pH 7.8，包含200 mM NaCl，5%甘油，和400mM imidazole-Cl）。
注：SUMO 蛋白酶耐受高达 300 mM 的 imidazole，离心滤芯装置的膜耐受性高达 100 mM imidazole。我们建议进行硫酸铵降水，以去除大量的伊米达佐尔，减少净化时间，而不是稀释蛋白质样品和浪费时间与蛋白质浓度。 - 评估超高分数的初始体积。一次慢慢加入少量硫酸铵，直到达到 25 °C 的 60% 饱和度（39.48 克/100 mL）。轻轻搅拌溶液 30 分钟，避免冒泡。离心机在 10，000 x g 为 15 分钟。
- 小心地吸气并丢弃超高分。将颗粒分数重新消耗在 20 mL 的样品缓冲区（20 mM Tris-Cl、pH 8.0、300 mM NaCl 和 5% 甘油）中。
- 对于使用 SUMO 蛋白酶的 SUMO 标签，请以 1 ： 1000 的比例从 糖核酸酯e 中加入 Ubl 特异性蛋白酶 e 的重组片段，并在 4 °C下孵育混合物 2 小时。
- 在 25 °C 下以 10，000 x g 的速度将消化产品离心 20 分钟，以在通过亲和色谱柱加载样品之前去除蛋白质聚合物。
- 删除通过 15 mL Ni-NTA agarose 柱上的 20 mL 重悬样品的 His6-SUMO 标签的痕迹，该列以前在裂解缓冲 1 中平衡。
- 收集包含未标记的圣 TS或β圣TS α的直通样本。
- 在缓冲 1 的 20 mL 中清洗 Ni-NTA 列，收集未标记 的α圣TS 或β圣TS 的剩余部分。
- 在 4 °C 下以 3，000 x g 的速度旋转，将每个子单元分别集中到 15 mL 10 kDa 切断离心滤芯单元中。 将浓缩蛋白转移到新鲜的 2.0 mL 管和微中心（10，000 x g，10 分钟，4 °C）以去除聚合物。确定蛋白质浓度24，准备1mL的aliquot在20-25毫克mL-1，标签，闪存冻结在液氮，并储存在-80°C。
注：预纯蛋白样品可长期储存在-80 °C下，或立即用于大小排除色谱柱（SEC）上的蛋白质纯化。 - 以蛋白质阿利奎特（20毫克）和微中心在10，000 x g 10分钟删除聚合之前SEC。
- 在尺寸排除色谱柱（例如 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR）上加载样品，以 0.5 mLmin-1的流动速率连接到快速蛋白质液相色谱，以前在 SEC 缓冲区（10 m M Tris-Cl） 中均等化， pH 7.8， 100 m M NaCl， 5% 甘油， 0.1 m 磷酸二醇）。
注：为了净化更多的孤立α圣TS 或β圣TS 子组，并减少 SEC 轮数，请在尺寸排除色谱柱上以 20-25 毫克 mL-1在 5 mL 样品上加载 5 mL 样品，流量为 1.5 mL 最小-1。 - 评估α圣TS 或β圣TS 在峰值分数的质量使用 12% 或 15% 的硫酸钠硫酸盐凝胶电泳 （SDS-PAGE）， 分别沾染库马西辉煌的蓝色污渍25.
- 用新鲜的15mL 10 kDa切断离心滤芯单元浓缩蛋白质，确定蛋白质浓度24，在20-25毫克mL-1下制备0.5mL的alquot，标签，液氮中的闪光冻结，并储存在-80°C。
- 从α和β单位净化α 2 β 2圣TS 综合体
注：在 SEC 缓冲区（10 mM Tris-Cl，pH 7.8，100 mM NaCl，5% 甘油，0.1 m M 磷酸 pyridoxal）中等价大小排除色谱列（Sephadex S-200 HR 或 Superdex 200 pg）。- 为了从α和β单位中净化野生型α 2 β 2StTS 复合体，在 4 °C 下解冻α圣TS 和β圣TS 子单位的浓缩样品。
- 结合异丙酸（1.2 α圣TS： 1.0 β圣TS 摩尔比率），并在 4 °C 下孵育 1 小时。
注：为了确保大多数β圣TS将纳入α 2 β 2圣TS综合体，需要超额的*ST+ - 通过微浓缩去除蛋白质聚合物（10，000 x g，10 分钟，4 °C）。
- 将已澄清的超纳特加载到大小排除列中。
- 评估α圣TS 或β圣TS 在峰值分数的质量使用 12% 或 15% 的硫酸钠硫酸盐凝胶电泳 （SDS-PAGE）， 分别沾染库马西辉煌的蓝色污渍25.
- 确定蛋白质浓度24，在 15-20 毫克 mL -1 中准备 250-1000 微升的 aliquot，在液氮中闪冻结，并储存在 -80 °C 下。
2. 净化α 2 β 2圣TS复合体的野生类型或突变形式
- 现场定向突变， 准备突变β圣Ts
- 在聚合酶链反应的两步过程中，使用结构pEBA-10表达载体22 作为DNA模板，在 β链TS多核苷酸序列中引入特定点突变。
注：此协议可用于从沙门氏菌色氨酸合成酶中引入α或β子单位中的单点突变。对于额外的，新的寡核苷酸引物包含理想的突变必须适当设计。在本工作中，列出了 Q114A、βK167T、β S377A β突变。 - 使用一对核苷酸引物 TS-FW-NcoI/Q114A-Rev、TS-FW-NcoI/K167T-Rev 和 TS-FW-NcoI/S377A-Rev 执行 PCR 反应，分别生成片段 A1、B1 和 C1。
注：寡核苷酸 TS-NcoI-FW 和 TS-SacI-Rev 分别在 pEBA-10 载体中克隆的 *StTS 多核苷酸序列的上游和下游退火。- 使用高保真DNA聚合酶（例如 Phusion）和制造商的协议来放大 DNA 序列。对于 50 μL PCR 反应，添加 34 μL 无核糖酶水， 10 μL 的 5 倍反应缓冲，1 μL 的 10 mM dNTP，1 μL 的 10 μM 前引物，1 μL 的 10 μM 反向引物，1 μL 的模板 DNA （200 ng），1.5 μL 的 DMSO，0.5 μL 的 DNA 聚合酶。
- 对于 PCR 程序，请使用热启动（98 °C 时为 180 秒），然后是 30 个放大周期（30 秒在 98 °C，30 秒在 55 °C 时为 120 秒，在 72 °C 处为 120 秒），最后在 72°C 处使用 300 秒。
注：所有分子生物学步骤都遵循分子克隆：实验室手册23。虽然小写序列对应于限制位点，但粗体序列和通要序列对应于突变。
Ts - fw - ncoi： 5 '- 卡 · 特特 · 卡卡 · 阿卡 · 阿加 · 阿加 · 卡 · 塔格- 3'
Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
K167t - Rev： 5 '- Ctc Gtt 阿卡 Ggc Atc Tgt 标签 Cgt Agc Gga Gcc - 3'
S377a - Rev： 5 '- c Ttt Atc Tcc Gcc Gcc AgAg G ga g att Gac CAC CAG - 3'
- 使用一对核苷酸引物 TS-Rev-SacI/Q114A-FF、TS-Rev-Saci/K167T-FF 和 TS-Rev-Saci/S377A-FF 执行 PCR 反应，以生成片段 A2、B2 和 C2。
Ts - Rev - saci （5'- tta tgc gct Ggc Ggc Ttt 猫 Ggc Tga G - 3'
Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
K167t - ff 5 '- Ggc Tcc Gct Acg Cta 阿卡 加特 Gcc t agt Aac gag - 3'
S377A-FF 5'-CTG GTGCT AAT CTC GCT GGC GGA GAT AA G-3' - 使用聚合酶链反应单独放大部分片段。使用 55 °C 的熔化温度和 2 分钟的聚合酶延长时间。
- 要执行第二轮PCR反应，请将上述PCR产品加载在 1x TAE 上的 0.8% 的玫瑰凝胶上，以 6 V/cm 的速度加载凝胶，凝胶提取物和凝胶净化感兴趣的片段。
- 将片段 A1/A2、B1/B2 和 C1/C2 分别混合在等量下，在 96 °C 下加热混合物 10 分钟，在 25 °C 下将退火。 根据制造商的协议，用高保真聚合酶和脱氧核糖核苷酸延长重组链。
- 要生成全长突变DNA片段的高拷贝数，添加寡头底漆 TS-FW-NcoI 和 TS-Rev-SacI 以执行第二个 PCR。
- 在 6 V/cm 的 1x TAE 缓冲器中装载 0.8% 的 PCR 产品，凝胶提取感兴趣的 DNA 带，凝胶净化 PCR 片段，并在制造商建议的适当缓冲和条件下，在 37 °C 下进行适当的限制消化 2 小时。
- 在37°C下，将每个DNA片段中至少200 ng与制造商推荐的适当限制酶和条件一起消化2小时。 要设置 50 μL 限制消化反应，请添加 34 μL 无核糖水、10 μL DNA （200 ng）、5 μL 10 倍反应缓冲器、0.5 μL 限制酶 1 和 0.5 μL 限制酶 2。在 6 V/cm 的 1x TAE 缓冲器中，在 0.8% 的气化物上加载消化产品，并净化消化的 PCR 片段。
- 根据制造商的建议，文摘 200 ng pEBA-10 结构与限制酶 NcoI 和 SacI。将消化产品加载在 6 V/cm 的 1x TAE 缓冲器中，将消化产品加载到 0.8% 的藻糖凝胶上，将带通讯员切除到载体上，并凝胶净化消化的载体。
- 利盖特100ng的载体与50ng的PCR片段，以前消化和纯化，与T4DNA韧带2小时在25°C。 将构建的质粒转化为称职细胞 大肠杆菌 株DH10B 细胞。LB Agar 板上的板细胞含有 50 μg/mL 安培素。 在 37 °C 下将板倒置过夜。
- 从每个细胞转化中挑选一个菌落（没有任何卫星菌落），并将其分散在含有安培林的 5 mL LB 介质中。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度在夜间生长细胞。 从每个工程结构中准备 10 μg 的超纯质粒 DNA。准备细胞培养的甘油库存（将细胞悬浮在无菌甘油最终浓度的16%）中转动细胞悬浮，并长期储存在-80°C。
- 执行DNA测序，以确认编码色氨酸合成酶的α和β子单位的全长序列。确认每个单个突变，并丢弃任何含有不良随机突变的质粒结构。本研究中使用的寡核苷酸引物如下所列。
TS-1F： 5'-阿特加卡ACTCCAC-3'
TS-1R： 5'-加特加卡卡塔克-3'
TS-2F： 5'-卡格特克加加克-3'
TS-3F： 5'-加特加特卡-3'
TS-4F： 5'-CTG卡特加查克-3'
TS-5F： 5'-CGTTGCATCATTG-3'
注：β子线多核苷酸序列上的寡核苷酸引物 TS-1F、TS-1R、TS-2F 和 TS-3F 退火剂（GenBank 加入代码：CP051286.1）。引物 TS-4F 和 TS-5F 退火剂对α子的多核苷酸序列（GenBank 加入代码：CP053865.1）。 - 使用每个质粒结构的200 ng（pEBA-10-β Q114A，pEBA-10-β K167T，和pEBA-10-β S377A）来改造大肠杆菌表达菌株CB149的称职细胞，缺乏trp operon26。成功形成菌落后，选择一个单一的菌落，在含有50μg/mL安皮西林的LB介质的5ml中生长细胞。细菌孵化器中的培养在37°C过夜。准备细胞培养的甘油库存，长期储存在-80°C或立即用于重组蛋白质表达。
注：单点突变在α或β子单位从 沙门氏菌硫化物 色氨酸合成酶可能会损害酶功能或低合成L-色氨酸在 大肠杆 菌菌株CB149。请考虑使用 大肠杆菌 菌株 BL21 （DE）plys-S 或罗塞塔 （DE3）plys-S，如果没有表达或较低的重组量α2β2圣TS 复合体在 SDS-PAGE 凝胶中检测到。
- 在聚合酶链反应的两步过程中，使用结构pEBA-10表达载体22 作为DNA模板，在 β链TS多核苷酸序列中引入特定点突变。
- 大肠杆菌中野生类型和变异形式的表达α2β2圣TS 复合体
- 生长 大肠杆菌 表达应变窝藏在新鲜和无菌的50mLLB介质含有50微克/mL安培素的理想结构。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度在夜间生长细胞。
- 在新鲜无菌的 2x 1000 mL LB 中加入 5 mL 的隔夜细胞培养物，其中含有 2% 甘油加安培素（2.8 L Fernbach 烧瓶）。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度进行摇晃，培养细胞培养。
- 当OD600 达到0.6-0.8时，通过在0.4 mM的最终浓度添加IPTG，然后在30°C的夜间孵化，在200 rpm处摇晃，诱导重组蛋白表达。
- 在 4 °C 下以 4，000 x g 离心的方式收集细胞，20 分钟。取出超高分子，用冷裂解缓冲器 2（50 mM Tris-Cl、pH 7.80、包含 100 mM NaCl、5 mM 二甲酸酯、1 mM EDTA 和 1 mM PMSF）重新悬挂细胞颗粒，最终体积为 50 mL 缓冲器。
注：细胞可长期储存在-80°C或立即用于蛋白质纯化。要储存细胞，将细胞悬浮物拆分成 2 x 50 mL 一次性离心机锥形管，并将细胞颗粒保持在 -80 °C，直到蛋白质净化步骤。LB肉汤中2α β 2圣TS复合物的突变和野生类型形式的表达每升产生125-150毫克蛋白质。考虑向上或向下扩展协议以满足特定需求。
- 净化野生类型或突变形式的α2β2圣TS 复合物
注：以下协议旨在净化重组α的非标记重组野生类型或突变形式2β2StTS 综合体在 1 天内，取决于技能组合和努力。为了减少纯化时间，在缓冲器中平衡大小排除列，以缓冲先前的蛋白质纯化/表达。纯化野生类型或突变α2β2StTS 复合物通过两步净化进行，包括硫酸铵分馏和大小排除色谱。该协议从 LB 介质的 1 L 中产生 60-100 毫克纯复合物。- 使用带有 1/2"喇叭探头（或类似设备）的数字声震器进行声波，从而破坏细胞颗粒。使用 10s 脉冲和 20s 休息或直到完全细胞中断，在冰水浴上以 80% 振幅值班周期执行 20 个循环。
- 在 25 °C 下将细胞以 30，000 x g 为离心解剖 30 分钟。 吸气超高，确保颗粒不会从管子中脱落。在室温下用 0.45 μm 过滤器过滤已澄清的超高分数。
- 评估澄清的超高分数的初始体积。一次慢慢加入少量硫酸铵，直到达到20%饱和度（11.51克/100ml）。在 25 °C 下进行硫酸铵分馏。 轻轻搅拌溶液 10 分钟，避免冒泡。
- 离心机在 30，000 x g 10 分钟在 25 °C. 将 20% 的超高分数转移到干净的烧瓶中。在 20 mL 的样品缓冲器 2（50 mM Tris-Cl，pH 7.80，包含 100 mM NaCl、1 mM EDTA 和 2 mM 二甲基三醇）中轻轻重复 20% 颗粒分数），并准备样品以运行 SDS-PAGE 凝胶。丢弃 20% 颗粒分数。
- 评估 20% 超高分数的初始体积。加入硫酸铵达到30%饱和度（5.94克/100ml），搅拌溶液，避免气泡，和离心机一样。将 30% 的超高素分数转移到干净的烧瓶中。轻轻地在 20 mL 的样品缓冲 2 中重复 30% 的颗粒分数，并准备样品以运行 SDS-PAGE 凝胶。丢弃 30% 颗粒分数。
- 评估 30% 超高分数的初始体积。在达到 40% 饱和度时加入硫酸铵（6.14 克 / 100 mL），搅拌溶液，避免气泡，像以前一样离心机。将 40% 的超高素分数转移到干净的烧瓶中。轻轻地在 10 mL 的样品缓冲器 2 中重复 40% 颗粒分数，并准备样品以运行 SDS-PAGE 凝胶。丢弃 40% 的超高分数。
注：使用 12% SDS-PAGE 凝胶 25 中的 30% 和 40% 超纳坦和颗粒分数样本，评估+StTS 复合物的质量。如果您验证任何其他突变+stTS 复合物处于 40% 超高值分数，则继续执行硫酸铵 60% 饱和度（13.0 g / 100 mL）。预纯化α 2 β2 StTS 复合物的预纯蛋白小品可长期储存在 -80 °C 下，或立即用于大小排除色谱柱 （SEC） 上的蛋白质纯化。 - 微浓缩蛋白质样品在10，000 x g，20分钟， 4 °C，将超高分子分数加载到 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 列上，该柱以 0.5 mLmin-1的流速连接到快速蛋白质液相色谱，以前在 SEC 缓冲区（10 mM Tris-Cl，pH 7.8， 100 mM NaCl， 5% 甘油， 0.1 m 磷酸酯）。
注：要净化大量复杂，请在 HiLoad 26/600 Superdex 200 pg 列上以 20-25 毫克 mL-1 的流量将 5 mL 样品加载到 1.5 mL 最小-1上。 - 评估沿硫酸铵分馏和峰值分数从SEC列收集的样本在12%SDS-PAGE凝胶沾染库马西辉煌的蓝色污渍25。
- 将 野生类型或突变体 α2β2StTS 复合体集中，在 4 °C 下旋转 3，000 x g， 配备 15 mL 100 kDa 切断离心滤芯单元。 将浓缩蛋白转移到新鲜的 2.0 mL 管和微中心（10，000 x g，10 分钟，4 °C）以去除聚合物。
- 确定蛋白质浓度24，准备0.5mL的aliquots在20-25毫克mL-1，标签，液氮的闪光冻结，并储存在-80°C。
3.α 2 β 2StTS复合体野生类型和突变形态的优化结晶
注：α 2 β 2圣TS综合体的初始结晶条件之前报告的条件包含12%PEG 8，000和2mM精子22。
- 在结晶检测之前准备库存解决方案，以实现更好的结晶可重复性。要与 TS 进行结构研究，在双酶复合物的金属协调部位用 Na+ 或Cs + 离子结晶蛋白质。
- 在水中准备 200 mM 精氨酸的 5 mL 库存溶液，并将 500 μL 的 aliquot 保持在 -20 °C。
- 在水中准备 30% （w/v） PEG 8000 的 50 mL 库存溶液，并在 25 °C 下将 25 mL 的 aliquot 放到 50 mL 一次性离心机锥形烧瓶中。
- 在水中准备 1 M CSCl 的 25 mL 库存溶液，并保持在 25 °C。
- 准备 25 mL 库存溶液 1 M NaCl 在水中，并保持在 25 °C。
- 准备 1 M Bicine 的 3x 50 mL 库存解决方案，并与 CsOH 或 NaOH 一起点缀，以 pH 7.6、7.8 和 8.0 获得缓冲解决方案。将 25 mL 的阿利报价保持在 4 °C。
- 在冰浴中解冻α2β2圣TS 综合体 （20-25 毫克 mL-1）的样本。
- 微中心样品在 10，000 x g 10 分钟在 25 °C 下去除蛋白质聚合物。
- 将清除的超高位分数转移到干净的微中心管中。
- 估计蛋白质浓度24 和稀释蛋白质 aliquot （150-200 μL） 在 15 毫克 mL-1 与 50 mM bicine-CsOH 或 -NaOH， pH 7.8 包含 50 mM CsCl 或 NaCl.将蛋白质样本保持在 25 °C。
- 在无菌 1.5 mL 标记的微中心管中为 3x 24 井坐落板准备 500 μL 储液池解决方案。储层溶液包含 50 mM 二甲基辛-CsOH 或 -NAOH、50 mM CsCl 或 NaCl 以及 PEG 8000。改变板柱上 PEG 8000（6-11%）的浓度和板行上的精子 （2-8 mM） 浓度。每套更换缓冲 pH 值（pH 7.6、7.8 和 8.0）。
- 将管子和漩涡大力封顶至少 10 秒。离心管在10，000 x g 为10分钟在25°C去除气泡。 在每个标记的储层中分配 500 μL 缓冲溶液。
- 使用P-10微管，以每坐一滴15毫克-1 微管分配5微升蛋白质溶液。避免冒泡。在蛋白质滴中加入每个通讯员储液的 5 μL。在混合过程中避免气泡，不要上下移液器使混合物均质化。
- 用透明胶带胶带粘合盘子，并将板材存放在 25 °C 下。 晶体在2-5天内出现，并在两周内长到其全部尺寸。
4. X 射线衍射数据收集和α2β2StTS 复杂结构解决方案
注：在X射线衍射数据收集之前，请提前为每个晶体准备冷冻保护液。使用特定的储液库溶液制备 3 个含有溶液中含增加浓度的二甲基硫氧化物（10、20 和 30% v/v）和特定配体 （s）。发现二甲基硫氧化物比甘油、乙二醇和PEG 200-300更好的低温保护剂。
- 在立体显微镜下使用低温收集一个大的单晶。
- Pipette 2 μL 的每个低温保护溶液包含降水溶液加上更高浓度的二甲基硫氧化物和配体 （s） 到一个新的封面幻灯片。
- 依次浸泡在每滴中 ，让晶体在低温保护液中均等于 30s。
- 在 -173 °C （100 K） 下使用气态氮流闪冷低温保护晶体，或浸入液氮中，以便长期储存在冰球中。
注：用液氮填充泡沫德瓦尔，预冷水晶冰球，将晶体储存在低温存储德瓦尔，并使用干托运器将晶体运送到同步器。 - 在-173 °C下进行X射线衍射数据收集。 使用 0.5-4.0 的曝光时间和 0.5° 振荡记录 X 射线衍射数据。旋转晶体 180-360°。
- 使用 iMosflm27处理 X 射线衍射图像，以在适当的空间组中生成反射文件。一般来说，α 2 β 2圣TS晶体属于空间组C121（C2）。
- 将与 Scala28的多个反射观测值一起缩放，在 CCP4 包29中实施。
- 使用 MolRep30和适当的搜索模型进行分子替换，解决高分辨率α 2 β2StTS 复合体的结构。在成功的结构解决方案后，检查 Coot31中的模型和电子密度图。
注：有许多 TS 晶体结构沉积在蛋白质数据库中，具有不同的配体。为了更好的分子替换步骤和缩短时间适合较新的晶体结构，请使用包含感兴趣配体的最佳搜索模型。进行CCP429、30或Phenix31的晶体结构精炼。 - 使用 Coot32对模型进行手动调整，然后自动改进与参考29，33或 phenix.精炼31，34。通过在 Coot32中运行迭次模型构建和自动改进，构建和改进最终模型。
- 继续蛋白质数据库网站上的坐标和结构因素沉积。
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Representative Results
色氨酸合成酶的α和β子单位的净化
沙门氏菌斑马素合成酶的α子联盟（+StTS） 和β子联盟 （βStTS） 在修改后的 pET SUMO 载体中进行了分克隆。图1A显示了两个强频段的代表性SDS-PAGE结果，对应于他的6-SUMO-α圣TS（车道+ON）和他的6-SUMO-β圣TS（车道+ON）融合蛋白。本著作中描述的净化协议允许在 2 天内分别对两个子单位进行净化。第一天用于通过 Ni - NTA 亲和色谱、硫酸铵沉淀以及他的 SUO 标签、去除他的 SUO 标签痕迹和蛋白质浓度来净化每种蛋白质。图1B和1C分别显示了α子组和β子组净化的代表性SDS-PAGE结果。第二天，集中α子单元、β子单元和α和β子单位的α 2 β 2 StTS复合体被加载在大小排除色谱柱上。图 1D显示了S-200 HR大小排除列中 1ST TS、βStTS 和α2β2StTS 复合体的典型脱口而出了特征。图 1E显示了收集的峰值分数的代表性 SDS-PAGE 结果。最纯净的峰值分数被集中，浓缩，α 2 β 2圣TS复合物用于蛋白质结晶研究。
纯化野生类型和突变体α2β2圣TS 复合体
本文描述了另一种快速高效的程序，以净化α 2 β 2S.硫化钛色氨酸合成酶复合物的野生类型和突变形式。图2显示了pEBA-10结构的表示，其中包含用于α的野生类型转化耦合基因（trpA和trpB）编码，以及β-子单位22。图3中描绘了产生α 2 β 2圣TS 复合体突变形式的两步 PCR 突变方案。
pEBA10中突变α 2 β 2圣TS复合体的编码区域通过DNA测序得到确认，用于转化大肠杆菌菌株CB149细胞26。α 2 β 2圣TS 复合体的野生类型和突变形式过度表达，重组蛋白在 1-2 天内成功纯化。硫酸铵在室温下分馏很容易从异质表达系统中去除大部分污染物蛋白（图4A，车道20P，30P和40S）。在图 4B中显示了具有相对椭α2β2StTS （143.06 kDa） 复合物的具有相对椭形位置的代表性椭形配置文件。排除峰值分数的纯度在汇集前进行了 SDS-PAGE 分析（图 4C）。
优化野生类型和突变α2β2色氨酸合成酶复合结晶
野生类型和突变α2β2StTScomplex 在 15 毫克毫升-1的阿里奎特被用来设置 24 井坐滴板。通常，由 5 μL 蛋白质溶液和等量的储层溶液组成的液滴与 500 μL 的储液溶液（图 5）均等。精子需要结晶的野生类型和突变α 2 β 2圣TS复合物22。虽然精子结晶野生类型的最终浓度为2mM，但在此工作中，精子结晶突变复合物的浓度略高（4-8mM）。
大单晶是通过精细的结晶优化获得的，变化PEG 8000（6-11%）和二甲酸缓冲pH值。不同形态的晶体在2-5天内出现，晶体在两周内长到全尺寸（图6）。在X射线衍射数据收集之前，晶体被浸泡在低温保护液中（储液缓冲器含有高达30%的二甲基硫氧化物）。优化的过程产生了质量晶体，适合以接近原子分辨率的X射线衍射测量。
X 射线衍射数据分析
野生型α 2 β 2StTS复合物的晶体结构是用本文中描述的方法制备的，X射线衍射数据以接近原子分辨率的速度收集。晶体浸泡在含有F9抑制剂（2-（[4-）（三氟甲基）苯基+硫化物+氨基）乙基二氢磷酸盐）和L-色氨酸的低温保护溶液中。
通过以0.5°的增量旋转晶体360°，在高级光源（伯克利-CA）的SIBYLS同步光束线12.3.1上收集了完整的X射线衍射数据集。处理了X射线衍射强度，并将数据收集统计数据汇总在表1中。对称分析表明，该晶体属于单气候空间组C2。单位单元参数为= 182.55，b = 59.30，c = 67.37+，α = 90.00，β = 94.82，γ = 90.00°。 马修斯系数的计算值（Vm = 2.57 =3 Da-1）表明晶体的不对称单元中存在一个 TS 异质分子 （+St TS），溶剂含量为 52.08%35，36。 所有 X 射线数据都是在低温 （100 K） 下收集的，以提高衍射质量并减少辐射衰变。复杂中α2β2StTS 晶体结构是使用野生类型 + StTS 模型在复合物中与α部位的抑制剂 F9 和金属协调部位的钚离子 （PDB ID 代码： 4HT3） 解决的。最终坐标文件和结构因素存入PDB与加入代码5CGQ（图7A）。野生型的晶体结构α 2 β 2圣TS复合物与抑制剂F9在酶α部位（图7B），在金属协调点（图7C），共因子皮里多克斯 5'-磷酸盐共价粘结到βLys87（图7D），酶β位（图7E）的产品L-色氨酸以1.18安斯特伦分辨率解决。型号 5CGQ 是迄今为止存放在 PDB 中的最高分辨率α2β2StTS 晶体结构。
图1：净化α和β单位和α 2 β 2圣TS综合体。（A） 重组蛋白表达。12% SDS-PAGE 凝胶的隔夜表达配置文件的相扑α圣TS （+ON） 和相扑β圣TS （+ON） 后，IPTG 感应在 30 °C （α/0 之前 IPTG 诱导）。（B， C）Ni-NTA 亲和色谱，然后是硫酸铵沉淀（60% 饱和度），（S） 澄清粗提取物 （FT1） Ni-NTA 列通过样品 （W） 柱洗样品 （E） eluate 样品 （60S） 和 （60P） 超高沉淀分数后高速离心， 分别 （D） SUMO 蛋白酶消化产品 （FT2） Ni-NTA 列通过包含无标签的α圣TS 或β圣TS 子联盟的样品。（D） α圣TS 子联盟 （28.67 kDa）、 β圣TS 子联盟 （42.86 kDa） 和 α2的逃学概况 β2圣TS 复合物 （143.06 kDa） 与 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 大小排除色谱柱。每个运行是单独执行的。（E） 每个单色谱中排除峰值分数的 SDS-PAGE 凝胶。15% 的SDS-PAGE 凝胶准备分析α2β2StTS 综合体和α圣TS 子组，12% SDS-PAGE 凝胶准备分析圣TS子组的β。巷 MW，kDa 中的分子量标记。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：构建pEBA-10的表示。（A） 表示从沙门氏菌肠血清素血清素（杨，艾哈迈德等人）中编码α的野生类型转化耦合基因（trpA和trpB）和β-亚单位。（B） 载体包含安非他林耐药性（amp）基因、复制源（ori）、在没有IPTG诱导剂的情况下更好地关闭乳酸促进剂的lacIq基因，以及LacI抑制促进剂。
图3：两步PCR突变协议的总体表示。pEBA-10载体被用作DNA模板。第一轮PCR是用引物 TS-FW-NcoI 和 MUT-REV（包含突变的反向引物）准备的，以生成第一个片段和引物 TS-Rev-SacI 和 MUT-FW（包含突变的前进引物）生成第二个片段。碎片被凝胶纯化和等价结合，热变性和退火。重组链用聚合酶和脱氧核糖核酸延长。第二轮PCR是用引物 TS-FW-NcoI 和 TS-Rev-Saci 准备的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：α 2 β 2StTS复合体的野生类型和突变形态的净化。（A） 使用20、30、40和50%的硫酸铵饱和在室温下收集的样品的12%SDS-PAGE凝胶：（CE）粗提取物（S）和（P）高速离心后超高沉淀分馏。（B） α 2 β 2圣TS （143.06 kDa） 复合物的椭形配置文件，带有 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 尺寸排除色谱柱。（C） 12% SDS-PAGE 凝胶图片的排除峰值分数。巷 MW， kDa 中的分子量标记 （精度加蛋白质未染色标准， 生物拉德） 。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：野生类型和变异形态的结晶优化α 2 β 2圣TS复合体。晶体生长在50mM比辛-CsOH缓冲器中，含有50mM CsCl2。聚乙烯乙二醇8000（6-11%）和精氨酸（2-8mM）的浓度各不相同，以获得单个大晶体形式，通过X射线蛋白晶体学进行结构研究。（A） 比辛-C索，pH 7.6。（B） 比辛-C索，pH 7.8。（C） 比辛-C索，pH 8.0。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：野生晶体光谱仪和α 2 β 2圣TS复合体的突变形态。晶体的形态不同，但它们属于空间C2组。两周后，晶体在最终条件下长到全部尺寸。晶体大小约 0.20 x 0.15 x 0.10 mm。（A-D）PLP 全息晶体在野生类型形式（列 A）的金属协调部位与氦离子复合，突变形式α2β2 β114A （列 B），α2β2 β167T （列 C）， 和α2β2 βS377A （列 D）。请单击此处查看此图的较大版本。
图7：晶体结构的整体可视化和晶体结构优化后获得的电子密度图的验证。（A） 野生型α 2 β 2圣TS复合物的晶体结构，酶α部位（黄色）、金属协调部位（蓝色）、共生器Pyrid的抑制剂F9草5'磷酸盐共价粘结到+Lys87（绿色），产品L-色氨酸在酶β位（青色）在1.18安斯特伦分辨率。α子组为浅蓝色，β子组为鲑鱼色。（B-E）电子密度图轮廓在1.0 r.m s水平周围（B） 抑制剂F9（C） 二恶英离子（D） 磷酸二恶英 - 5+磷酸盐 ， 和（E） L - 色氨酸。请单击此处查看此图的较大版本。
| 数据收集和处理 | |
| X 射线源 / 光束线 | ALS 光束线 12.3.1 |
| 波长 （+） | 10,000 |
| 分辨率 （+） | 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18) |
| 反射总数 | 2151280 (252941) |
| 总数唯一反射 | 231646 (32187) |
| 用于索引、缩放和合并的空间组 | C 1 2 1 |
| 单元格尺寸 | |
| a， b， c （+） | 182.55, 59.30, 67.37 |
| α, β, γ (°) | 90.00, 94.82, 90.00 |
| 马赛克 | 0.61 |
| 马修斯卷 VM（+3 Da-1） | 2.57 |
| 雷米亚斯 （%） | 8.6 (93.0) |
| 14.7 (3.0) | |
| CC1+2 （%） | 0.999 (0.778) |
| 完整性 （%） | 98.6 (94.2) |
| 多样性 | 9.3 (7.9) |
| 精细化统计 | |
| 工作/自由 （%） | 14.04 / 16.05 |
| RMSD 债券长度 （+） | 0.0120 |
| RMSD 键角 （+） | 14,059 |
| 拉马坎德兰青睐 | 515 (96.44%) |
| 拉马坎德兰允许 | 16 (3.00%) |
| 拉马尚德兰不允许 | 3 (0.56%) |
表1：数据收集和处理。括号中的值用于外壳。
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Discussion
我们成功设计了变异体形式α2β2 β114A、α2β2 0+K167T 和α2β2 S377A + StTS 复合体，用于结构功能相关性研究。最初，我们尝试用以前的纯化协议22净化突变体，这需要α 2 β 2圣TS复合结晶与PEG 8000和精子在净化过程中。虽然结晶率取决于突变形式和复杂物在溶液中的浓度，但很难预测晶体何时以大溶液体积出现。结晶可以在长时间（48-96小时）后实现，或在结晶启动15后增加额外的PEG 8000。
不幸的是，本作品中提出的α 2 β 2StTS复合体的突变形式没有使用此协议成功净化，因为它们未能在协议的初始步骤中结晶，损害了结晶研究。因此，我们创建了一个简单高效的净化方案，包括硫酸铵分馏和大小排除色谱，使野生类型和突变形式的高产量α 2 β 2圣TS 复合体。此协议比之前的协议（5-7 天） 15、22 更快（1-2 天），并且可重复，因为没有结晶要求和协议故障排除沿净化。此外，我们还创建了新的表达结构和协议，以净化大量α子组、β子组和重组α2β2StTS 综合体与隔离体。
未来的应用包括重组野生类型和突变子单元，以进行功能和结构研究。突变α2β2 β114A，α2β2 βK167T，α2β2 βS377A 复合结晶的条件包含更高的精子浓度 （4-8 mM） 相比，野生类型形式 （2 mM）.。因此，通过改变沉淀物和缓冲pH值的浓度来提高蛋白质晶体的质量是值得的。单个大晶体形式随机生长在二头肌缓冲溶液 （pH 7.6-8.0） 包含 6-11% PEG 8，000。本研究中描述的方法将用于制备野生类型和变异形式的晶体结构，α 2 β 2复合体在α和β活跃部位具有不同的配体，模仿不同的中间体和过渡状态，参与将内单体和血清转换为色氨酸。这些突变体的晶体结构预计将为L-色氨酸合成中的关键残留物所起的机制和作用提供新的见解。
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Disclosures
作者没有什么可披露的，也没有宣布没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院（GM097569）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
| 15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
| 2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
| 24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
| 50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
| AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
| Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
| Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
| Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
| dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
| dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
| Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
| GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
| Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
| His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
| Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
| Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
| NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
| Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
| pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
| S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
| SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
| Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
| Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
| Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
| Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |
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