Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører optogenetiske eksperimenter til kontrol af genekspression med rødt og langt rødt lys ved hjælp af PhyB og PIF3. Inkluderet er trinvise instruktioner til opbygning af et enkelt og fleksibelt belysningssystem, som muliggør kontrol af genekspression eller anden optogenetik med en computer.
Abstract
Kontrol af biologiske processer ved hjælp af lys har øget nøjagtigheden og hastigheden, hvormed forskere kan manipulere mange biologiske processer. Optisk kontrol giver mulighed for en hidtil uset evne til at dissekere funktion og har potentialet til at muliggøre nye genetiske terapier. Imidlertid kræver optogenetiske eksperimenter tilstrækkelige lyskilder med rumlig, tidsmæssig eller intensitetskontrol, ofte en flaskehals for forskere. Her beskriver vi, hvordan man bygger et billigt og alsidigt LED-belysningssystem, der let kan tilpasses til forskellige tilgængelige optogenetiske værktøjer. Dette system kan konfigureres til manuel eller computerstyring med justerbar LED-intensitet. Vi leverer en illustreret trin-for-trin guide til opbygning af kredsløbet, hvilket gør det computerstyret og konstruerer lysdioderne. For at lette samlingen af denne enhed diskuterer vi også nogle grundlæggende loddeteknikker og forklarer kredsløbet, der bruges til at styre lysdioderne. Ved hjælp af vores open source-brugergrænseflade kan brugerne automatisere præcis timing og pulsering af lys på en personlig computer (pc) eller en billig tablet. Denne automatisering gør systemet nyttigt til eksperimenter, der bruger lysdioder til at kontrollere gener, signalveje og andre cellulære aktiviteter, der spænder over store tidsskalaer. For denne protokol kræves der ingen forudgående ekspertise inden for elektronik for at bygge alle de nødvendige dele eller bruge belysningssystemet til at udføre optogenetiske eksperimenter.
Introduction
Optogenetiske værktøjer bliver allestedsnærværende, og ny teknologi udvikles konstant til optisk styring af biologiske processer såsom genekspression, cellesignalering og mange flere 1,2,3. Evnen til at styre cellulære processer med lys giver mulighed for hurtig kinetik, stram rumlig kontrol og dosisafhængig regulering, der kan styres af lysintensitet og eksponeringstid. For at bruge disse værktøjer er en enhed til styring af disse parametre nødvendig. Vi har for nylig udviklet en genetisk kodet PhyB-PIF3 pattedyrs genkontakt, der reversibelt aktiverer og deaktiverer gener ved hjælp af henholdsvis rødt/langt rødt lys4. Dette system blev testet i flere pattedyrcellelinjer og muliggjorde uovertruffen induktion af genekspression selv med meget små mængder lys, herunder lysimpulser. Forskere, der ønsker at bruge PhyB-kontakten og lignende værktøjer 5,6, anmoder ofte om oplysninger om metoder til styring af belysningens intensitet og varighed. Derfor udviklede vi denne protokol med trinvise instruktioner for at muliggøre bredere anvendelse af disse værktøjer til optogenetik.
Før den udbredte anvendelse af lysdioder blev bredbåndslyskilder med filtre brugt til at studere lysresponsive proteiner såsom fytokromer7. For nylig, nogle LED-belysningssystemer er blevet offentliggjort sammen med optogenetiske værktøjer 8,9,10,11,12, men disse protokoller kan kræve betydelig ekspertise inden for elektronik / software, kræve specialudstyr (f.eks. 3D-printere, laserskæremaskiner eller fotomasker) eller giver ikke de trinvise instruktioner, som nogle forskere skal implementere til deres forskningsbehov. Mens uafhængig kontrol af individuelle brønde i en multibrøndplade kan være nyttig, er det ofte unødvendigt, når forskere kun behøver at sammenligne flere forskellige prøver i lyst og mørkt eller rødt lys versus langt rødt lys. Mange eksisterende kommercielle systemer er også dyre med begrænset tilpasningsevne. Imidlertid er LED'erne beskrevet i denne protokol omkostningseffektive, lyse, og kan monteres på mange måder; Derfor kan de bruges til at belyse flere forskellige typer prøver. Med protokollen og den medfølgende software kan lysdioder, der spænder fra ultraviolet (UV) til NIR, bruges og styres med software til at udføre optogenetiske eksperimenter ved hjælp af UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV-domæner 17,18, Step Function Opsins 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, bakterielle fytokromer26,27,28,29 og andre lysfølsomme systemer 30,31,32.
Denne protokol udgør en tutorial til samling af kredsløb og anden hardware, der er nødvendig for at kontrollere forskellige parametre til lysstimulering samt de molekylære / cellulære værktøjer til at køre et optogenetisk eksperiment. Derudover rapporterer vi plasmider optimeret fra Kyriakakis et al.4 , der er mindre og mere stabile til kloning. Gennem denne protokol kan biologer uden ekspertise inden for elektronik og optik bygge belysningssystemer, der er fleksible og robuste. På en trinvis måde viser vi, hvordan man bygger LED-systemer og fjerner den tekniske flaskehals for en bredere anvendelse af optogenetiske værktøjer. Dette system kan let bruges i de fleste cellekulturinkubatorer, selvom de ikke indeholder trådporte. For eksempel har vi opbevaret LED-systemet i en befugtet CO2 -inkubator kontinuerligt i mere end 6 måneder uden fald i ydeevnen. Vi forklarer også, hvordan du forbinder LED-systemet til en computer og forbinder det med open source-software, vi leverer på GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Opbygning af et system ved hjælp af denne protokol giver forskere den grundlæggende viden til at fejlfinde potentielle problemer, udskifte dele og forbedre / udvide funktionaliteter.
Systemoversigt
Opbygning af belysningssystemet involverer (1) opbygning af det elektroniske kredsløb, (2) opbygning af periferiudstyr (strømforsyningsledning, afbryder osv.), (3) opbygning af lysdioderne, (4) samling af alle disse komponenter og (5) installation af softwaren til styring af lysdioderne med en brugergrænseflade (figur 1A). Når belysningssystemet er færdigt, kan det styre op til fire lysdioder uafhængigt med en brugergrænseflade (figur 1B). Brugergrænsefladen gør det muligt for hver LED at pulsere med bestemte tidsintervaller og slukke efter et bestemt tidspunkt. Der er også en startforsinkelse for at starte belysningsprogrammer på et bestemt tidspunkt. Potentiometre (POT'er) regulerer hver LED's intensitet uafhængigt eller kan bruges til manuel LED-kontrol uden en computer. Ledningerne til lysdioderne kan være enhver brugerdefineret længde, så de let kan placeres i en inkubator eller laboratorieplads. På grund af disse lysdioders høje effekt kan de bruges til at belyse et stort område med en enkelt LED på afstand.
Beskrivelse af LED-driver
For at drive og kontrollere LED'ernes intensitet gennemgår denne protokol trin for at opbygge en "LED-driver". Hver LED har en række spændinger, hvor den fungerer (figur 1C). Under drift kan regulatorens udgangsspænding, som styrer lysintensiteten, indstilles af et potentiometer. POT varierer modstanden og justerer udgangsspændingen/lysstyrken. Tuning med en 1kΩ (1 kilo-ohm) POT giver det, vi kalder "højspændingskredsløbet" og har en rækkevidde på 1,35 V til 2,9 V. Da 2,9 V er for høj til betjening af lavspændings-LED'erne (figur 1C), viser vi en enkelt ændring (modstand 3 eller "R3" supplerende figur 1A), der begrænser rækkevidden til at matche lavspændings-LED'erne. R3 tjener til at reducere den maksimale spænding, der påføres LED'erne, til 1,85 V (samling beskrevet i supplerende figur 8), når den er parallel med potentiometeret. Ved at bruge spænding til at styre lysstyrken i stedet for strøm er systemet mere fleksibelt til lysdioder med forskellige driftsspændinger. Figur 1C indeholder en liste over høj- og lavspændings-LED'er til at guide det optimale kredsløbsvalg. Dette design holder minimumsspændingen lav nok, så LED'en er helt slukket, når potentiometeret er slukket, og tillader ikke, at spændingen går over LED'ens typiske driftsspænding. Til PhyB-optogenetik bruger vi dybe røde og langt røde lysdioder, der bruger lavspændingskredsløbet.
Beskrivelse af LED-computerstyringssystem
LED-belysningssystemet kan bruges til konstant belysning uden computer eller mikrocontroller. Til pulserende programmer og til styring af individuel LED-timing skal der dog installeres en mikrocontroller. For at bruge en mikrocontroller til at styre lysdioderne kræves en transistor for at forbinde mikrocontrolleren til kredsløbet. Denne transistor registrerer spænding fra mikrocontrolleren og skifter fra at være ledende eller isolerende. For at styre "on" og "off" bruger vi det, der kaldes en "NPN switching type transistor" (2N2222) som en kontrollerbar shunt over R2 (supplerende figur 1A). Når spændingen fra mikrocontrolleren påføres transistorbasen, transistoren bliver ledende og gør LED-spændingen lav og slukker LED'en. Således styres LED og transistorens tænd og sluk-tilstande direkte af mikrocontrolleren, som styres af den software, der er installeret på pc'en.
For at fremstille belysningssystemet kræves følgende trin: Byg det elektriske kredsløb; bygge strømforsyningen, manuel afbryder, POT'er og mikrocontrollerforbindelse; bygge lysdioderne; rumme en sort boks, der passer til belysningssystemet; tilslut alle ledninger og enheder; installer LED-styringssoftwaren, stimulere cellerne med lys; Mål genekspression ved hjælp af et dobbelt luciferase-assay.
Protocol
1. Byg det elektriske kredsløb
BEMÆRK: Protokollen til opbygning af et enkelt kredsløb til en tilgængelig LED er beskrevet her. Instruktioner til at udvide dette op til fire lysdioder er inkluderet i den supplerende info.
- Tænd for røgdæmperen og loddejernet. Tilsæt vand til aftørringssvampen, hav loddet ved hånden.
FORSIGTIG: Sørg for at tage sikkerhedsforanstaltninger for at fjerne røg og forhindre forbrændinger. - Begynd lodning af kredsløbskomponenter til printkortet (printkort) i den rækkefølge, der vises i de supplerende paneler.
BEMÆRK: Brug en lille mængde loddemetal på loddejernspidsen til først at opvarme komponentens metal og printkortet og smelte yderligere lodde direkte på komponenterne; Flux kan hjælpe meget. - Loddejumperledninger og komponenter (supplerende figur 2 og supplerende figur 3).
- Til jumperledningerne (de isolerede ledninger, der forbinder to punkter på printkortet), brug to stykker orange [7.6 mm (0.3 tommer)] og gule [12 mm (0.4 tommer)] ledninger fra jumpersættet.
- Sæt printkortet på de "hjælpende hænder", og indsæt jumperledningerne i følgende pinholes, bøj klemmerne 45 grader og tilføj flux (figur 2, supplerende figur 2 og supplerende figur 3): a1 og a3 → jorden (-) (orange), a7 → strømforsyning (+) #7 (gul), d2 → d6 (gul).
- Lod og trim derefter bagsiden af ledningerne.
- Indsæt LM317T-spændingsregulatoren i følgende pinholes, bøj stifterne, og tilføj flux (figur 2 og supplerende figur 4): Adj → e5, Vud → e6, Vi → e7.
- Lod venstre og højre terminal først, trim dem, lod derefter og trim den midterste terminal.
- For at indstille kredsløbets lavspændingsområde skal du indsætte en 820 Ω modstand helt ned i pinholes, lodde og trim c2 → c5 (figur 2 og supplerende figur 5).
- For at aktivere LED-styring af mikrocontrolleren skal du indsætte transistoren i b3–b5 (figur 2 og supplerende figur 6): Kollektor → b3, base → b4, emitter → b5.
BEMÆRK: Vær opmærksom på transistorens retning, der skal indsættes korrekt; tjek specifikationerne for at finde betegnelsen Collector, Base og Emitter.
- Lod ledning-til-ledning-stikkene til POT, LED, mikrocontroller og strømkilde.
BEMÆRK: Vær opmærksom på farven på ledningerne på ledningerne til ledningerne, og om du bruger et hun- eller hanstik til ledning.- Bestem, om der kræves et "lavspændingskredsløb" eller "højspændingskredsløb" til den ønskede LED (figur 1C).
BEMÆRK: Hvis LED'en er på listen "lavspænding", kræves en modstand parallelt med POT. - For kredsløbet "lavspænding" eller "højspænding" placeres ledningen fra et hunstik fra ledning til ledning gennem hul a5 (supplerende figur 7). Lod ikke på plads endnu, hvis du laver lavspændingskredsløbet.
BEMÆRK: Drej de bare trådender, så de små trådhår ikke flager ud. Hvis ledningen virker for tyk til at skubbe gennem pinhullet uden at flosse, skal du skære 2-6 tråde og derefter dreje dem sammen igen (supplerende figur 7B-D). - Hvis du laver "højspændingskredsløbet", skal du springe til trin 1.4.5. Hvis du laver "lavspændingskredsløbet", skal du skubbe en 560Ω modstand gennem det samme hul (a5) og lodde med ledning-til-ledning-stikledningen.
- Tilslut den anden ende af modstanden til jorden (supplerende figur 7G).
- Indsæt den anden ende af hun-loddetilslutningen i et 5-hul, der forbinder den med jorden, og lod den (supplerende figur 8A,B).
- For mikrocontrollerforbindelsen indsættes den ene ende af et hanstik fra ledning til ledning i hul a4 og den anden i et hul, der er forbundet med jorden (supplerende figur 9A-C).
- For LED-forbindelsen skal du indsætte den ene ende af et hunstik fra ledning til ledning i hul a2 og den anden ende i et hul, der er forbundet til jorden (supplerende figur 9D,E).
- Bestem, om der kræves et "lavspændingskredsløb" eller "højspændingskredsløb" til den ønskede LED (figur 1C).
2. Byg strømforsyning, manuel afbryder, POT'er og mikrocontrollerforbindelse
- Byg strømforsyningen.
- Lod en orange [7,6 mm (0,3 tommer)] jumper fra a29 til jorden (supplerende figur 10).
- Lod et hunstik fra a30 til strømforsyningen (+) (supplerende figur 11A-C).
- Lod et hanstik fra c29 til c30 (supplerende figur 11D-F).
- Klip stikket af en netledning, blotlæg ledningerne, og strip dem (supplerende figur 12A-C).
- Tilsæt flux til ledningerne inden lodning ved hjælp af en fluxpen (supplerende figur 3G).
- Placer et krympeslange på 3,18 mm (1/8 tomme) omkring et hanstik fra ledning til ledning og et tykkere stykke 4,76 mm (3/16 tommer) over strømforsyningsledningen (supplerende figur 12D).
- Drej ledningerne fra strømforsyningen og han-til-ledning-stikket sammen og loddet (supplerende figur 12E, 13A, B).
- Anbring krymperøret med mindre diameter 3,18 mm (1/8 tomme) over tilslutningerne, og krymp dem med en varmepistol (supplerende figur 13C, D).
- Anbring et krympeslange med større diameter 4,76 mm (3/16 tommer) over det mindre krympeslange 3,18 mm (1/8 tomme) og opvarm igen (supplerende figur 13E, F).
- Byg den manuelle afbryder.
- Krymperøret anbringes 3,18 mm (1/8 tomme) over ledningerne til afbryderen (supplerende figur 14A).
- Drej og lod ledningerne til et hanstik fra ledning til ledning (supplerende figur 14B,C).
- Krymperøret anbringes 3,18 mm (1/8 tomme) over loddede sektioner, og krympet med en varmepistol (supplerende figur 14D,E).
- Tilslut han-til-lednings-stikket til POT.
- Sløjf ledning-til-tråd-stikkets sorte ledning rundt om POT'ens midterste terminal (supplerende figur 15B).
- Drej ledningen, der er sløjfet tæt rundt om terminalen, og lod den (supplerende figur 15C).
BEMÆRK: Små præcisionstrænger kan hjælpe med at lave et tæt twist. - Gentag med den røde ledningsforbindelse til terminalen, som i supplerende figur 15D.
- Brug en tang til at bryde metaltappen nær den røde pil (supplerende figur 15E,F).
- Byg mikrocontrollerforbindelsen (kun nødvendig for computerstyrede lysdioder).
- Hvis du laver en LED-driver til mere end én LED, skal du afskære de sorte ledninger fra alle tråd-til-tråd-stik undtagen én hun (supplerende figur 16A).
- Krympning af enderne af wire-to-wire-konnektorerne som vist (supplerende figur 16B-D).
- Skub de krympede ender gennem det rektangulære stik (supplerende figur 16E).
3. Byg lysdioderne
- Trådenderne fjernes (~5 mm), og flux påføres med en fluxpen som vist i supplerende figur 3G.
BEMÆRK: For effektivt at lodde ledningerne på LED-basen, flux skal tilføjes til kontakterne på LED-basen og ledningerne. - Dåse ledningen ved at opvarme ledningen nedefra og tilføje loddemetal fra toppen (supplerende figur 17B).
- Brug fluxpennen til at placere flux på LED-basens overfladekontakt (supplerende figur 17C).
- Anbring en generøs mængde loddemetal på en stor loddespids (~4–5 mm) (supplerende figur 17D), brug den til at opvarme LED-basen ved kontakten (supplerende figur 17E). Efter et par sekunder trækkes loddet hen over kontakten (supplerende figur 17F). Gentag trin 3.3-3.4 på den anden kontakt (supplerende figur 17G).
FORSIGTIG: LED-basen kan blive meget varm under lodning. Placer LED-basen på en overflade, der ikke smelter eller brænder. - Sæt den sorte ledning fast på kontakten "C+" (katoden) ved hjælp af hårklemmerne (supplerende figur 18A).
- Anbring en generøs mængde loddemetal på den store loddespids (supplerende figur 18B), og tryk den ned på ledningen, indtil loddet på LED-basen smelter (supplerende figur 18C). Hold ledningen nede (supplerende figur 18D), og fjern loddejernet, mens du holder ledningen på plads (supplerende figur 18E).
- Anbring en lille mængde loddepasta på puderne til LED-tilslutningerne (supplerende figur 19A, B), og placer LED'en over puderne med pincet (supplerende figur 19C).
BEMÆRK: Hvis placeringen er lidt væk, er det okay; Det vil gå på plads, når loddepastaen smelter. - Hold den røde ledning på "A+" (anoden) og klip den med en hårklemme (supplerende figur 20A-C).
- Placer en generøs mængde loddemetal på den store loddespids (supplerende figur 20D), og tryk den ned på ledningen, indtil loddet på LED-basen og loddepastaen under LED'en smelter (supplerende figur 20E).
BEMÆRK: Når loddepastaen smelter, bliver farven sølv (supplerende figur 20H,I). - Vælg længden på den ledning, der er nødvendig for den ønskede opsætning. Fjern LED-ledningerne og et hanstik fra ledning til ledning (supplerende figur 21A), og tilføj derefter flux som i supplerende figur 3G.
- Placer krymperøret over ledningerne. Brug et krympeslange på 3,18 mm (1/8 tommer) over ledning-til-tråd-stikkene og et krympeslange på 4,76 mm (3/16 tommer) over ledningen (supplerende figur 21B).
- Klip ledning-til-tråd-stikket med en "hjælpende hånd", drej stikkets ende med ledningen (supplerende figur 21C), og lod dem. Gentag med den anden ledning (supplerende figur 21D,E).
- Anbring krympeslangerne på 3,18 mm (1/8 tomme) over loddet, og krymp dem (supplerende figur 21F–G).
- Placer krymperøret på 4,76 mm (3/16 tommer) over krymperøret på 3,18 mm (1/8 tomme), og krymp (supplerende figur 21H–I).
- Klip LED-ledningerne til de "hjælpende hænder" med tape under den (supplerende figur 22A).
- Bland epoxy i henhold til producentens anvisninger og spred den over toppen af loddet LED (supplerende figur 22B). Forlad natten over for at helbrede.
- Hvis du monterer ved hjælp af en berøringslukning, skal du skære et lille stykke af berøringsfastgørelsen (supplerende figur 23A) og trykke det mod bagsiden af LED'en i 30 sekunder.
- Brug et højhastighedsdrejeværktøj til at lave et hak på låget af en sort boks (supplerende figur 23C-E).
- Byg en montering til en enkelt LED gennem en privatlivsfilm.
- Brug spadeboret til at bore et hul på 1,75 cm (11/16 tomme) gennem toppen af en sort boks, hvor LED'en placeres (supplerende figur 24A).
- Brug et højhastighedsdrejeværktøj til at lave et hak på den ene side af hullet for at gøre plads til LED-ledningen, som vist i supplerende figur 24A.
- Klip et stykke privatlivsfilm (25-30 mm) og tape på indersiden af den sorte boks, der dækker hullet, som LED'en lyser igennem (supplerende figur 24A).
- Placer LED'en uden for den sorte boks oven på hullet med privatlivsfilm og tape på plads med elektrisk tape (supplerende figur 24B–E).
4. Tilpas en sort boks, der passer til belysningssystemet
- For et fire LED-system skal du bore fire 0,83 cm (21/64 tommer) huller på låget 3,81 cm (1,5 tommer) fra hinanden, hvor potentiometrene vil blive fastgjort (supplerende figur 25).
- Brug et højhastighedsdrejeværktøj til at skære et rektangulært hul på 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 tommer x 0,75 tommer) i øverste venstre hjørne (supplerende figur 25).
- Brug spadeboret til at bore et hul på 1,75 cm (11/16 tomme) på den sorte boks (supplerende figur 26).
- Hullerne fileres, og stumpen indsættes i hullet, der er boret ind (supplerende figur 26).
- For de computerstyrede lysdioder skal du sandpapir det område, hvor mikrocontrolleren limes i en sort boks, samt undersiden af mikrocontrollerholderen.
- Klik mikrocontrolleren på holderen, før du fastgør holderen i den sorte boks, og epoxy dem derefter på plads (supplerende figur 27A).
- Brug sandpapir til at slibe bunden af to clips og området i en sort boks, hvor kredsløbet skal placeres, og fastgør clipsene inde i den sorte boks med epoxy (supplerende figur 27A).
- Fastgør printkortet i klip (supplerende figur 27B).
- Tryk afbryderen gennem det firkantede hul i låget i supplerende figur 25 , og klik den på plads (supplerende figur 28A).
- Skub POT'erne gennem hullerne på låget, skru dem på plads (supplerende figur 28A), og sæt knappen på POT (supplerende figur 28B).
5. Tilslut alle ledninger og enheder
- Mærk ledning-til-ledning-konnektorerne (f.eks. LED, POT, COM) (supplerende figur 29A).
- Fastgør de krympede konnektorer i trin 2.4 (supplerende figur 16) til han-stikket-til-ledning-konnektoren mellem de to hunstik (POT og LED) (supplerende figur 7A og S37).
- Tilslut de krympede ender til mikrocontrolleren (supplerende figur 30).
- Træk USB-kablet gennem grommet, og sæt det i mikrocontrolleren.
- Træk ledningerne til LED'erne gennem grommet, og tilslut til hun-til-tråd-stikket til venstre for mikrocontrollerforbindelsen (supplerende figur 9D og 38).
- Træk ledningen til strømforsyningen gennem grommet, og tilslut den til han-til-tråd-stikket på højre side af printkortet (supplerende figur 11D).
- Tilslut han-til-tråd-stikket fra afbryderen til hun-til-tråd-stikket til højre for printkortet (supplerende figur 11A).
- Tilslut han-til-tråd-konnektorerne fra POT'erne på låget til hun-til-tråd-stikkene på printkortet (supplerende figur 8 og 36).
BEMÆRK: Tænd ikke kredsløbet, uden at potentiometrene er tilsluttet.
6. Installer LED-styringssoftwaren
BEMÆRK: Se de detaljerede softwareinstallationsinstruktioner i den supplerende fil på Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces
- Download og installer softwaren til programmering af mikrocontrolleren
- Download og installer pakkehåndteringen.
- Programmer mikrocontrolleren.
- Download og installer runtime-motoren.
- Download brugergrænsefladen.
7. Stimuler cellerne med lys
- Transfekt HEK293-celler.
- Plade HEK293-celler ved 100k celler pr. Brønd i en 24-brøndplade.
- Brug eksempeltabellen til at beregne serumfrie medier, polyethylenimin (PEI) og DNA-volumener (supplerende figur 39) og transfektere ved hjælp af producentens protokol.
- Stimulerende celler med lys.
BEMÆRK: Celler skal opbevares i mørke efter transfektion eller håndteres ved hjælp af en lyskilde, der ikke ophidser det optogenetiske system.- Bestem, hvilken type stimulering der skal bruges på cellerne (kontinuerligt lys, pulserende intensitet osv.).
- Når POT'erne er slukket (mod uret), skal du tænde LED-strømforsyningen.
- Placer en lysmåler inde i den sorte boks, hvor cellerne skal placeres, og placer låget med LED'en over måleren. Juster lysintensiteten efter behov.
- Hvis du bruger computeren til at styre LED'erne, skal du åbne brugergrænsefladesoftwaren.
- Programmér brugergrænsefladen (figur 5A, B).
- På øverste venstre panel skal du vælge COM-porten til mikrocontrolleren og klikke på Opret forbindelse.
- Brug panelerne til højre til at programmere hver LED. For kontinuerligt lys skal du vælge ethvert tidspunkt undtagen nul i "Time On" og indstille "Time Off" til nul.
- På nederste højre panel skal du programmere hovedtimingkontrollen.
- Hvis du vil forsinke belysningen, skal du vælge en startforsinkelse (HH:MM).
- Hvis du vil slukke alle LED'er efter et angivet tidspunkt, skal du vælge en kørselstid (HH:MM).
- Start belysningsprogrammet ved at klikke på knappen Kør (figur 5A).
8. Mål genekspression ved hjælp af et dobbelt luciferase-assay
- Der fremstilles luciferasereagens ved at blande 10 ml luciferasebuffer med luciferasereagens og en prøve i 1 ml reagensglas, der skal opbevares ved -80 °C i op til 1 år.
- Forbered lysisbuffer 5x i 1x til 100 μL til N + 2 huller. f.eks. til 30 prøver, 30 x 20 μL 5X lysisbuffer og 30 x 80 μL MQ H2O.
- Forbered Renilla-substratopløsning: 20 μL Renilla-substrat til 1 ml Renilla-buffer (denne mængde er egnet til 10 assays).
- Fjern celler fra inkubatoren, aspirer mediet, tilsæt 100 μL 1x lysisbuffer pr. Brønd og læg den på en ryster ved 100 RPM i 15 min.
- Anbring i -20 °C i mindst 1 time.
- Der tilsættes 100 μL luciferasereagens pr. prøve i et hul i en hvid plade med 96 huller.
- Konfigurer pladelæseren til luminescens. Brug luminometermodulet på pladelæseren til at indstille integrationen til 1 s.
- Der tilsættes optøede lysater i hullerne under luciferasereagenset. Ved hjælp af en multikanalpipette blandes 20 μL prøve i luciferasereagenset, og luminescensen måles straks.
- Efter aflæsningsplateauet tilsættes 100 μL Renilla-substratopløsning og scannes igen.
- Opdel Luciferase-signalet med Renilla-signalet for at tage højde for transfektionseffektivitet.
- Sammenlign luciferasesignaler normaliseret for transfektionseffektivitet (f.eks. Sammenlign signalet fra rødt lys oplyst og langt rødt lys belyste prøver).
Representative Results
Når strømkredsløbet, strømforsyningen, afbryderen, POT'erne og en LED er samlet (op til supplerende figur 21), kan kredsløbet testes. Med alle POT'erne på plads styrer POT LED-intensiteten. Når samlingen er afsluttet op til supplerende figur 29, kan systemet bruges manuelt til optogenetik eller andre applikationer. Hele systemets strøm kan styres manuelt med afbryderen. Intensiteten af hver LED kan styres uafhængigt ved hjælp af POT, der er tilsluttet hvert kredsløb.
Efter installation af softwaren og programmering af mikrocontrolleren kan brugergrænsefladen kommunikere med mikrocontrolleren. Med brugergrænsefladen kan LED'erne styres midlertidigt på flere måder: (1) hver LED kan programmeres til at forblive tændt i et bestemt tidsrum, (2) hver LED kan programmeres til at pulsere, (3) en global startforsinkelse (f.eks. Når transfekterende og skinnende lys 24 timer senere) kan programmeres (figur 6B), (4) den samlede tid for programmet til at køre efter forsinkelsen. Der er to brugergrænseflader, en med større knapper, der kan styre to lysdioder ad gangen, og en anden, der kan styre fire lysdioder (figur 5A, B). De to LED-brugergrænseflader er optimeret til tablets og er tilstrækkelige til at styre røde og langt røde lysdioder til mange eksperimenter.
Til større eksperimenter kan den anden brugergrænseflade bruges til at styre op til fire lysdioder. Ved inducering af genekspression afhænger det forventede resultat af flere parametre. Disse omfatter induktionstid, induktionsniveauer (f.eks. Mængde lys eller lægemiddel) og kopinummer af den inducerbare konstruktion i cellen. For at vise dette transfekterede vi PhyB-genkontakten sammen med forskellige mængder reporter-DNA (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% og 8% af det transfekterede DNA) (figur 6A) og belyste som vist i figur 6B. I prøver indeholdende PhyB, men intet plasmid til fremstilling af phycocyanobilin (PCB-kromofor) (dvs. ikke reagerer på lys), øges luciferase-genekspression / lækage med mængden af reporter-DNA (figur 6C) (Far-red P < 0,0001, lineær regression efterfulgt af en Wald-test), (Rød P < 0,0001, lineær regression efterfulgt af en Wald-test). Derudover, når hele PhyB-genkontakten, inklusive PCB-kromoforproducerende plasmid (lysfølsomme celler), belyses for langt rødt lys, øges Luciferase-ekspressionen også med de stigende reporterkonstruktionsmængder i transfektionsblandingen (figur 6C, D) (langt rødt lys P < 0,0001, lineær regression efterfulgt af en Wald-test). Tilsvarende, når de lysfølsomme celler belyses med rødt lys, øges luciferase-ekspressionen også med øget reportermængde (P < 0,0001, lineær regression efterfulgt af en Wald-test). Når vi sammenlignede induktionsniveauer for de røde lysbehandlede celler med de fjernrøde lysbehandlede celler, fandt vi et lille fald i foldaktiveringen med stigende reportermængde (figur 6E) (P = 0.0141, lineær regression efterfulgt af en Wald-test).
Figur 1: Et grundlæggende kredsløb til en enkelt LED. (A) Et rutediagram, der viser en oversigt over de trin, der er nødvendige for at opbygge LED-belysningssystemet. (B) LED-belysningsstyringssystemet. (venstre) Kontrolboks til regulering af LED-intensitet og timing. (i midten) En pc-tablet, der kører brugergrænseflade til styring af lysdioder. (højre) En sort boks til montering af lysdioder og placering af celler til optisk stimulering. (C) Tabel til bestemmelse af, om LED'en kræver et høj- eller lavspændingskredsløb. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Instruktioner til lodning af komponenterne på plads. (A) Et eksempel på trin-for-trin tegneserieinstruktioner til opbygning af kredsløbet. (B,C) Eksempel på instruktioner med billeder af enheden, der samles. D) Eksempel på instruktioner til samling af flere kredsløb samtidigt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Visninger af et samlet LED-styresystem. (A) Set udefra af det samlede system. (B) Et indvendigt billede af et samlet fire LED-belysningssystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Instruktioner til reflowlodning af LED'en på kølelegemet. (A) LED-basen og et nærbillede af en dyb rød LED. (B) Placering af loddepasta på LED-basen. (C) Billede af loddet LED. Røde pile peger på loddepuder. Sammenlignet med grå før lodning (A), efter lodning ser loddet metallisk / skinnende ud. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Software til styring af optogenetiske eksperimenter. (A) En to LED-brugergrænseflade med store knapper til nem brug med en billig tablet. (B) En fire LED-brugergrænseflade. Begge grænseflader tillader uafhængig LED-kontrol. Til pulsering kan LED'er programmeres til at tænde og slukke for specifikke pulsbredder og specificerede varigheder. Pulseringen kan også have en startforsinkelse og en forudbestemt samlet driftstid. (C) LED-kontroltabletten monteret på en cellekulturkuvøse. (D) Illustration af PhyB-gensystemet, når det belyses med langt rødt lys. Langt rødt lys holder genet i "slukket" eller "mørk" tilstand. E) Illustration af PhyB-gensystemet, når det belyses med rødt lys. Rødt lys inducerer genekspression ved at fremme interaktionen mellem PhyB og PIF3. Denne interaktion lokaliserer genaktiveringsdomænet (AD) fusioneret til PIF3 til UAS-promotoren og aktiverer reportergenet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Forventede resultater ved hjælp af LED-systemet til styring af PhyB. (A) Et plasmid, der koder for PhyB + PIF3 to-hybridpartnere (pPK-351), et plasmid, der koder for phycocyanobilin (PCB-kromofor) synteseenzymer (pPK-352) og et Luciferase reporter-plasmid (pPK-202). (B) Tidslinje for lysinduktionseksperimenter for C-E. (C) Basaltranskriptionsniveauer (AKA utæthed) med stigende mængder reporter-DNA. "Lækage" -prøver transfekteres ikke med pPK-352 (dvs. reagerer ikke på lys), men belyses med rødt eller langt rødt lys. Light Switch (LS) prøver omfatter alle lys-gen switch plasmider og er belyst med rødt eller langt rødt lys. (D) Lysinduktionsniveauer som reaktion på rødt og langt rødt lys. (LS-Far-rødt lys er de samme data i C og D.) (E) Foldinduktion af luciferase i celler oplyst med rødt lys/langt rødt lys. Klik her for at se en større version af denne figur.
Klik her for at downloade supplerende figur 1-39.
Supplerende figur 1: Elektronisk driverkredsløb til flere lysdioder. (A) Kredsløbsdiagrammet for et enkelt LED-system. (B) Kredsløbsdiagrammet for et fire LED-system.
Supplerende figur 2: Placering af kredsløbssammenkoblinger. (A) Sæt dit printkort på dine hjælpende hænder. (B) Hovedkredsløbsspringernes placering i de gennemgående huller i billedet. (C) Diagram over ledningsstik, der kortlægger koordinaterne. For de fire LED-systemer skal du tegne linjer, der deler hvert kredsløb som vist (sorte lodrette linjer). Supplerende figur 31–38 beskriver samlingen af fire kredsløb samtidigt.
Supplerende figur 3: Lodning af ledningerne på printkortet. (A) Bøj jumpere, så de kommer i direkte kontakt med printkortet og forbliver på plads under lodning. (B) Et andet billede af de bøjede ledninger. (C) Ledninger efter lodning. (D) Trimmede ledninger på printkortet. (E) Krympet isolering efter opvarmning med lodde. (F) Flytning af isoleringen på plads for at dække det gennemgående hul (blå pil) (G) Tilføjelse af flux til en trådende eller terminal.
Supplerende figur 4: Lodning af spændingsregulatoren på plads. (A) Kort over spændingsregulatorens koordinater. (B) Placering af spændingsregulatoren. (C) Bøjede spændingsregulatorledninger. (D) Spændingsregulatorterminaler efter lodning.
Supplerende figur 5: Lodning af R1-modstanden på plads. (A) Kort over R1-modstanden (820Ω) koordinater. (B) Træk modstanden igennem med ledningen ved hjælp af en tang (C) Den trukne modstand tæt på PCB. (D) Den loddede modstand tæt på PCB.
Supplerende figur 6: Lodning af transistoren på plads. (A) Kort over transistorkoordinater og retning. (B) Bemærk transistorens retning; etiketten i denne model vender mod spændingsregulatoren (LM317T). Dobbelttjek transistorens specifikation for at sikre, at "Emitter", "Base" og "Collector" er i de rigtige huller. (C) Transistoren med klemmerne bøjet før lodning.
Supplerende figur 7: Lodning af wire-to-wire-stikket til potentiometeret på plads (plus en 560Ω modstand til lavspændingskredsløbet). (A) Kort over koordinaterne for ledning-til-ledning-stikket (plus R3-560Ω, hvis lavspændingskredsløbet bygges, placeres ledning-til-tråd-stikket i hullet før modstanden). (B) Et hunstik fra ledning til ledning. (C) For at gøre det lettere at montere modstanden og wire-to-wire-stikket i det gennemgående hul bøjes 3-5 tråde af den flettede ledning. (D) Trådene afskæres med trådskærere så tæt på isoleringen som muligt. (E) Indsæt rød ledning på en hun wire-to-wire-forbindelse gennem a5-gennemgående hul (for lavspændingskredsløbet indsættes R3 gennem det samme gennemgående hul). (F) Set fra undersiden af modstanden og wire-to-wire-konnektoren før lodning. (G) Billede af loddet R3-modstand, der er forbundet til jorden (F = hun).
Supplerende figur 8: Lodning af wire-to-wire-konnektoren til potentiometeret til jorden. (A) Kort over koordinaterne for jordforbindelsen for potentiometerets wire-to-wire-stik. (B) Set ovenfra af potentiometerets wire-to-wire-stik parallelt med R3 (F = hun).
Supplerende figur 9: Lodning af mikrocontrolleren og LED-lednings-til-ledningsstik. (A) Kort over koordinaterne for wire-to-wire-stikket til tilslutning af 2N222A og jorden til mikrocontrolleren. (B) Loddet han wire-to-wire stik. (C) Set ovenfra af (B). (D) Kort over de kvindelige wire-to-wire-stikkoordinater til tilslutning af indgangen til kredsløbet og jorden til LED'en. (E) Loddet hunstik fra ledning til ledning (F = hun, M = han).
Supplerende figur 10: Lodning af jumperen til strømforsyningskredsløbet. (A) Kort over koordinaterne for den orange jumper til tilslutning af strømforsyningen til jorden. (B) Den orange trøje loddet på plads. (C) Undersiden af jumperen loddet på plads.
Supplerende figur 11: Lodning af afbryderen og strømkildens wire-to-wire-stik. (A) Kort over koordinaterne for hun-til-lednings-stikket til tilslutning af afbryderen. (B) Det kvindelige wire-to-wire-stik loddet på plads. (C) En anden opfattelse af (B). (D) Kort over koordinaterne for han-stikket, wire-to-wire-stik til tilslutning af strømkilden. (E) Loddet han wire-to-wire stik. (F) En anden visning af (E) (F = kvinde, M = mand).
Supplerende figur 12: Tilslutning af strømforsyningen til et hanstik fra ledning til ledning. (A) Den umodificerede strømforsyning. (B) Afskæring af strømforsyningsledningerne. (C) Strømforsyningsledningerne strippet og med overskydende isolering skåret væk. (D) Placering af krymperør omkring strømforsyningsledninger. Slange, der adskiller de to forbindelser (røde pile) og slanger til at holde de adskilte ledninger (gul pil). (E) Snoede ledninger, der forbinder strømforsyningen med hun-til-lednings-stikket.
Supplerende figur 13: Lodning og isolering af strømforsyningsforbindelsen til et hanstik fra ledning til ledning. (A) Den loddede forbindelse mellem strømforsyningsjorden og et hunstik fra ledning til ledning. (B) Den loddede forbindelse mellem strømforsyningens positive terminal og et hunstik fra ledning til ledning. (C) Krymperør trukket over de loddede individuelle forbindelser (rød pil). (D) Begge strømforsyningsforbindelser loddet og med varmebehandlet krympeslange. (E) Placering af krymperør over individuelle forbindelser (gul pil). (F) Afsluttet strømforsyning.
Supplerende figur 14: Lodning af afbryderen til et hanstik fra ledning til ledning. (A) Afbryder med strippede ledninger og krymperør placeret over ledningerne (røde pile). (B) Ledninger, der forbinder afbryderen og han-til-lednings-stikket, snoet sammen inden lodning. (C) Anbringelse af krymperøret over loddeforbindelserne. D) Tilslutninger dækket af det varmebehandlede krymperør. (E) En afbryder monteret med et hanstik fra ledning til ledning.
Supplerende figur 15: Tilslutning af et potentiometer til et hanstik fra ledning til ledning. A) Potentiometerets dele. (B) Et han-wire-to-wire-stik, der er snoet og bøjet for at kroge rundt om potentiometerets midterste terminal. (C) Et han-wire-to-wire-stik snoet rundt om potentiometerets midterste terminal. (D) Loddede wire-to-wire-forbindelser. (E) Rød pil, der peger på metaltappen før fjernelse. (F) Potentiometeret efter fjernelse af metaltappen.
Supplerende figur 16: Tilslutning af mikrocontrolleren. (A) Ledninger til hun-wire-to-wire-konnektorer, der strippes og skæres over som forberedelse til krympning. (B) Anbringelse af krympen på wire-to-wire-stikket. (C) Krympning af wire-to-wire-stikket. (D) Krympet wire-to-wire-stik. (E) Fuldt monteret mikrocontrollerforbindelse.
Supplerende figur 17: Lodning af ledninger og LED på LED-basen Del 1. (A) Materialer, der er nødvendige for at lodde LED'en til LED-basen. (B) Fortinning af spidsen af den strippede tråd. (C) Påføring af flux på kontakt med LED-basen. (D) Tilføjelse af loddemetal til den store loddespids til fortinning af LED-basen. (E) Placering af loddemetal på kontakten for at opvarme LED-basen. (F) LED-basen efter at have trukket loddespidsen hen over kontakten. (G) Den samme procedure for den anden kontakt.
Supplerende figur 18: Lodning af ledninger og LED på LED-basen Del 2. (A) En fortinnet tråd, der er klippet fast til kontakten ved hjælp af en hårklemme. Bemærk, at den sorte ledning er loddet til katoden "C-". (B) Tilsætning af en generøs mængde loddemetal til loddespidsen. (C) Loddespidsen presser ned på ledningen, smelter loddet på LED-basen og ledningen. (D) Hold ledningen nede, så den forbliver sat, når loddejernet fjernes. (E) Hold ledningen på plads, indtil loddet hærder.
Supplerende figur 19: Loddeledninger og LED på LED-basen Del 3. (A) Brug en skarp spids til at placere loddepasta på LED-basen til montering af LED'en. (B) LED-basen med loddepastaen på plads. (C) Placering af LED'en på LED-basen, så LED- og LED-basens kontakter matcher.
Supplerende figur 20: Lodning af ledninger og LED på LED-basen Del 4. (A) Den sorte ledning, der stadig er fastgjort til kontakten af hårklemmen. (B,C) Ved hjælp af en anden hårklemme holdes den røde ledning på plads. Bemærk, at den røde ledning er loddet til anoden "A +". (D) Tilsætning af en generøs mængde loddemetal til loddespidsen. (E) Loddespidsen presser ned på ledningen, smelter loddet på LED-basen og ledningen samt loddepastaen under LED'en. (F) Den varme LED-basekøling efter lodning. (G) LED-basen med ledningerne og LED'en loddet på. (H,I) Røde pile peger på loddepuder. Efter lodning fremstår loddet metallisk/skinnende (sammenlignet med gråt før lodning (supplerende figur 16D)).
Supplerende figur 21: Tilslutning af LED-ledningen til et hanstik fra ledning til ledning. (A) Strippede ledninger og han wire-to-wire-stik ved siden af krymperøret skåret i halve (1/8 tommer og 3/16 tomme). (B) Krymperørets placering over ledningerne inden lodning. (C) Ledninger snoet sammen inden lodning. (D) Den loddede forbindelse fra ledningen til ledningsforbindelsen. (E) Både de røde og sorte ledninger loddet sammen. (F) Placering af 1/8 tommer krymperør over loddeforbindelsen. (G) Krymperøret efter krympning med varmepistolen. (H) Placering af krymperøret på 3/16 tommer over det mindre krymperør. (I) Forbindelsen loddet og forseglet med krymperøret.
Supplerende figur 22: Fastgørelse af ledninger og lysdioder til LED-basen ved hjælp af epoxy. (A) Brug en træapplikator til at placere epoxy i LED-basen. Et bånd placeres nedenfor for at fange dryppende epoxy. (B) Epoxy fordeles jævnt over hele overfladen. (C) LED'en efterlades natten over for at hærde.
Supplerende figur 23: Montering af LED'er inde i et kasselåg. (A) En LED med et berøringsfastgørelsesstykke fastgjort til nem montering. (B) Forskellige farve LED'er monteret på indersiden af en sort boks ved hjælp af en berøringsfastgørelse. (C) Et hak på låget på den sorte boks lavet af et højhastighedsdrejeværktøj for at gøre plads til LED-ledningen. (D) En sort boks til stimulering af cellerne med berøringsfastgørelseselementer til montering af LED'en. (E) Placering af en multibrøndskål inde i touch-fastgørelsesversionen af LED-boksen.
Supplerende figur 24: Montering af LED'er uden for et kasselåg. (A) Hul boret ind i låget på den sorte boks med et hak fra højhastighedsdrejeværktøjet for at gøre plads til tråden (rød pil). (B) LED placeret i hullet med ledningen i hakket, holdt på plads med elektrisk tape. (C) Yderligere to stykker tape bruges til at fastgøre LED'en. Bagsiden af kølelegemet udsættes for at maksimere varmevekslingen. (D) Privatlivsfilm tapet over hullet, hvor LED'en skal placeres. Den røde pil peger på privatlivsfilmen. (E) En sort boks til stimulering af cellerne med en LED monteret uden for kassen og med privatlivsfilm til spredning af belysningen. (F) Placering af en multiwell-skål inde i den eksterne LED + privatlivsfilmversion af LED-boksen.
Supplerende figur 25: Boring af huller på kasselåget til afbryder og potentiometre. (A) En CAD-tegning med kommenterede mål på kasselåget. (B) Kassens låg med potentiometer og huller til afbryderen.
Supplerende figur 26: Klargøring af trådudløbshullet. (A) En CAD-tegning med kommenterede dimensioner. (B) Billede af det borede hul med boret. (C) Udglatning af udløbshullet med højhastighedsdrejeværktøj eller arkivværktøj. (D) Anbringelse af grommet i udløbshullet.
Supplerende figur 27: Placering af mikrocontrolleren og printkortet i kassen. (A) Mikrocontrollerholderen (orange) og PCB-holderne inde i kassen. (B) Mikrocontrolleren og printkortet fastgjort i kassen.
Supplerende figur 28: Placering af potentiometre og afbryder. (A) Set forfra af et kasselåg med afbryder og fire gryder. (B) Set forfra af kasselåget med potentiometerknapper tilføjet. (C) Set bagfra af kasselåget med de monterede komponenter.
Supplerende figur 29: Det samlede LED-styresystem. (A) En åben kontrolboks med ledningerne mærket med en etiketprinter og lynlås bundet til organisering. (B) Kassen, når den er fuldt samlet med hver POT mærket sammen med pinkoden.
Supplerende figur 30: Placering af det krympede lednings-til-ledningsstik. (A) Billede af de krympede wire-to-wire-stik til et fire LED-mikrocontroller-system. (B) Placering af det krympede stik i mikrocontrollerportene.
Supplerende figur 31: Placering af jumperledningerne. (A) Et printkort med koordinaterne for de røde jumperledninger mærket. (B) Et printkort med koordinaterne for de gule jumperledninger mærket.
Supplerende figur 32: Placering af jumperledningerne. Et printkort, der viser koordinater for de gule jumperledninger.
Supplerende figur 33: Tilføjelse af spændingsregulatorer. LM317T-spændingsregulatorerne føjes til kredsløbet med deres koordinater mærket i diagrammerne.
Supplerende figur 34: Isætning af 820Ω modstande. R1-modstandene føjes til kredsløbet med deres koordinater mærket i diagrammerne.
Supplerende figur 35: Indsættelse af transistorer. 2N2222A-transistorerne føjes til kredsløbet med deres koordinater mærket i diagrammerne.
Supplerende figur 36: Isætning af hun-til-lednings-stik og modstande (valgfrit) til POT-forbindelsen. Ledningerne og modstandene føjes til kredsløbet med deres koordinater mærket i diagrammerne. (A) Indsæt den røde ledning efterfulgt af R2-modstanden (560Ω) (kun for lavspændingskredsløbet). (B) Indsæt den anden ende af modstanden i det angivne jordhul. (C) Indsæt de sorte ledninger i de markerede huller for at forbinde til jorden. Bemærk: R2 (560Ω) er parallel med potentiometeret.
Supplerende figur 37: Isætning af hanstik fra ledning til ledning til mikrocontrollertilslutning og strømforsyning. Ledningerne føjes til kredsløbet med deres koordinater mærket i diagrammerne. (A) Indsæt de røde ledninger i de angivne huller. (B) Indsæt de sorte ledninger i de markerede huller.
Supplerende figur 38: Tilføjelse af LED-lednings-til-lednings-stik. (A) Hun-wire-to-wire-stik med de røde blykoordinater fremhævet. (B) Hun-wire-to-wire-stik med de sorte blykoordinater fremhævet.
Supplerende figur 39: Opsætning af et PhyB-PIF3 genskifteeksperiment. (A) Et eksempel på en masterblanding indeholdende Renilla til intern kontrol. (B) En eksempeltabel til opsætning af DNA-blandingen til et Dual-Luciferase Reporter-assay af et PhyB-PIF3 optogenetisk eksperiment. (C) En eksempeltabel til opsætning af PEI-transfektionsreagens og aliquotering af blandingen på celler (dråbevis). (D) Placering af lysmåleren til indstilling af LED-lysstyrken.
Discussion
LED-systemet beskrevet her er blevet brugt i vores laboratorium til at optimere, karakterisere og arbejde med flere optogenetiske værktøjer. I Kyriakakis et al.4 testede vi mange kombinationer af PhyB-PIF-genskift parallelt. Vi brugte derefter dette system til at teste lysimpulser ved forskellige frekvenser for at måle genskiftekinetikken og den effektive lysintensitet. Dette system blev også brugt til at optimere og karakterisere to optogenetiske systemer, der bruger blåt lys til stimulering 5,6. Da kun en LED skulle være lys nok til at aktivere de fleste optogenetiske værktøjer, er det ikke altid nødvendigt at købe et system med et stort antal lysdioder over hver brønd. Denne opsætning er billig, pålidelig, nem at omkonfigurere og kræver ingen forudgående elektrisk ekspertise for at følge monteringsprotokollen.
I de supplerende supplerende figurer 31-38 beskriver vi, hvordan op til fire lysdioder kan indbygges i systemet. Selvom dette kan begrænse nogle eksperimenter, der kræver et stort antal parallelle forhold, kan flere lysdioder tilføjes ved at erstatte 9 Volt strømforsyningen, der bruges i denne protokol, med en højere watt. På samme måde kan flere LED'er med lavere effekt tilsluttes parallelt med hvert kredsløb. I sidstnævnte arrangement styres nogle lysdioder ikke individuelt, men dette kan være nyttigt, når der kræves mange lysdioder for at dække et større område. Når du først er fortrolig med elektronikken i dette system, er der mange måder at tilpasse det på. Yderligere strategier til tilpasning af systemet inkluderer placering af LED'en længere eller tættere på prøven og belysning gennem filtre / diffusorer for homogene belysningsforhold eller for at forhindre opvarmning som i (supplerende figur 23) og Allen et al.5. Et andet bemærkelsesværdigt træk ved vores LED-design er, at det er indkapslet i epoxy og har en berøringslukning på bagsiden; dette gør det muligt at placere LED'en sikkert med lethed stort set overalt: i inkubatorer, akvarier, dyrebure, vægge osv.
Mange eksperimenter, der bruger optogenetik til at kontrollere gener, signalveje og anden cellulær aktivitet, kræver ofte pulsering, spænder over store tidsskalaer eller skal udføres i en inkubator, hvilket kræver automatisering eller fjernmanipulation uden mikroskop. Dette LED-system er blevet testet kontinuerligt i flere måneder inde i en befugtet CO2 -inkubator uden problemer. Derudover kan eksperimentatoren med reversible systemer såsom PhyB optogenetiske systemer muligvis programmere specifikke pulserende belysningsplaner. I vores tidligere arbejde4 brugte vi pulserende programmer til at teste reversibilitetsdynamikken af en PhyB-PIF3-switch i pattedyrceller gennem brugergrænsefladen. Ved hjælp af den metode, der er beskrevet i dette manuskript, er programmering af en pulserende protokol let, hvilket giver den fleksibilitet og autonomi, der er nødvendig for mange typer optogenetiske eksperimenter på en brugervenlig måde.
De mest kritiske trin i opbygningen af dette system inkluderer at sammensætte det elektriske kredsløb på printkortet og forbinde komponenterne, som er beskrevet i afsnit 1 og afsnit 2. Det er vigtigt nøje at følge hvert trin i disse sektioner og dobbelttjekke pinhole-numrene linje for linje, før du lodder hver komponent. Afsnit 2 forklarer, hvordan du konfigurerer de komponenter, der skal tilsluttes kredsløbet. For at komponenterne tilsluttes i den rigtige retning, er det især vigtigt at sikre, at farverne på de sorte og røde ledninger på ledning-til-tråd-stikkene matcher. Små forglemmelser i disse to sektioner vil meget sandsynligt påvirke systemets funktionalitet. Faktisk vil det første trin i fejlfinding af denne metode være at kontrollere, at kredsløbet blev bygget korrekt, og at alle forbindelser er på plads. For det andet er det særlig vigtigt at kontrollere loddekvaliteten for løse forbindelser og ledningerne til flaring af trådhår, der kan kortslutte kredsløbet. Et tredje trin ville være at sikre, at lysdioderne fungerer korrekt, hvilket kan gøres ved hjælp af en strømforsyning eller et 1,5 V batteri ved at klippe LED'ens to terminaler med alligatorklip. En anden potentielt kritisk overvejelse er at forhindre opvarmning (når du bruger LED'erne ved høj effekt) eller diffundere lyset for bredere spredt belysning. For at imødekomme disse overvejelser kan LED'erne monteres uden for en sort boks med "privatlivsfilm" på indersiden, som beskrevet i supplerende figur 23 og Allen et al.5. På grund af enkelheden i dette system er det ikke svært at skille det ad for at verificere, ændre, opgradere eller reparere modulære komponenter.
En anden kritisk faktor for inducerbare gensystemer er at overveje, hvor meget aktivering der kræves, eller hvor meget lækage der er acceptabel for det biologiske system, der kontrolleres. Som vist i figur 6 kan disse variere med mængden af reporter-DNA. Derudover vil transfektionseffektiviteten og derfor kopiantallet af reporterkonstruktioner i hver celle variere. Det kan være fordelagtigt for nogle eksperimenter at lave en cellelinje med en fast mængde reporter- eller PhyB-genkontaktkomponenter og screene for kloner med det ønskede interval af induceret ekspression, som det almindeligvis gøres med lægemiddelinducerbare systemer. På grund af størrelsen og ustabiliteten af lentiviral plasmid pPK-2304 lavede vi også ikke-lentivirale plasmidversioner af PhyB-kontakten i pcDNA-rygraden pPK-351 (Addgene #157921) og pPK-352 (Addgene #157922).
Ved at opbygge dette LED-belysningssystem efter denne protokol, brugere har alle de nødvendige komponenter til at udføre en bred vifte af optogenetiske eksperimenter in vitro og in vivo. Kombineret med instruktionerne til brug af PhyB-PIF3 i pattedyrceller vil denne protokol give ikke-ingeniører og biologer mulighed for fleksibelt og effektivt at bruge PhyB-baseret optogenetik i en række sammenhænge.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang og Molly Allen for at teste forskellige versioner af LED-systemet, da det blev udviklet. Dette arbejde blev støttet af Kavli Institute for Brain and Mind ved UC San Diego og Salk Institute, National Science Foundation gennem NSF Center for Science of Information under Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 og NIH Grant R21DC018237.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18AWG 2pin RED Black wire | Amazon | 15M-28AWG-2468 | Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| 1K Ohm potentiometer | Amazon | 52161500 | 2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| 20 Gauge Silicone JST Connector | Amazon | SIM&NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| 22 AWG solid jumper wires | Amazon | WJW-60B-R | Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| 560 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | a14051600ux0301 | Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN |
| 820 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | TTL-A-8035-50Ea | Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor |
| A Male to B Male Cable (10 Feet) | Amazon | Part# 30-001-10B | The cable that comes with the Arduino doesn't fit well in the box. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Ardiuino UNO equivilent | Amazon | Elegoo EL-CB-001 | UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Arduino holder | Digikey | X000018 | Fits very snug. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632 |
| Black boxes for circuits and light chambers | Amazon | 1591ESBK | Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Blue LED | Digikey | LXML-PB01-0040 | LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134 |
| Cable ties | Amazon | sd027 | Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Command Fridge Clips | Amazon | 17210CLR | Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Cyan LED | Digikey | LXML-PE01-0070 | LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd |
| Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack | Amazon | 03429NA | Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK |
| Farred LED 720nm | Luxeon Star LEDs | LXML-PF01 | Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW |
| Farred LED 740nm | Ushio | EDC740D-1100-S5 | Uses "STAR XP 3535" base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf |
| Farred LED 780nm | Ushio | EDC780D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf |
| Farred LED 810nm | Ushio | EDC810D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf |
| Farred LED 850nm | Ushio | EDC850D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf |
| Grommets | Amazon | Pico 6120D | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G |
| Hair/Alligator Clips | Amazon | 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
|
| LED base | Luxeon Star LEDs | LXB-RS20A | Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds |
| LED PCB fopr Ushio LEDs | Adura LED solutions | STAR XP 3535 Package LED | Fits many other LEDs by Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led |
| Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe | Amazon | 1943587 | Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C |
| NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS | Amazon | B000FIDTYG | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Picture Hanging Velcro Strips | Amazon | PH204-16NA | With these you can hang the LEDs in many places. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H |
| Power supply | Amazon | tb013 | Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Power switch Rocker Switch | Amazon | SIXQJZML | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011 |
| Rectangular Connectors - for crimped wires | Digikey | 2183-1905-ND | 6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100" (2.54mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB |
| Red LED | Digikey | LXM3-PD01 | LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd |
| Sandpaper | Amazon | B002NEV6GS | 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1 |
| Solder for soldering wires and circuit components | Amazon | Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY |
| Solder-able Breadboard for building the circuit | Amazon | GK1007 | Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Spade drill bit | Amazon | Irwin 88811 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit |
| Transistor | Newark | 2N2222A | Can buy from many places. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197 |
| Voltage regulator | Newark | LM317T | Equivilent to NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC |
| Windows 10 tablet | Amazon | B08BYTT79Y | Any Windows 10 PC will do. https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Cell Culture Reagents | |||
| Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 | ATCC | ATCC CRL-1573 | Common Cell line. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose | ThermoFisher | 11965−092 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118 |
| 10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122 |
| White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates | ThermoFisher | 07-200-589 | White plates are preferred. Do not use clear plates. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852 |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | PolySciences | 24765-1 | Can be replaced with another transfection reagent. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/ |
| Name of Equipment | |||
| Diagonal Cutting Plier (110mm) | Amazon | Proskit 1PK-037S | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11 |
| Dremil 3000 with cutting tool and grinder | Amazon | Dremel 3000 | Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3 |
| Dremil cutting and grinding tool | Amazon | Dremel 200-1/15 | Any similar Dremil will work. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Dremil grinding tip | Amazon | Dremel 84922 | Silicon Carbide Grinding Stone. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922 |
| EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT | Amazon | DS017 | For removing solder/mistakes. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI |
| Helping Hand with Magnifying Glass | Amazon | SE MZ101B | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch |
| Pointed Nose Micro Pliers | Amazon | Hakko CHP PN-20-M | Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Small screw drivers | Amazon | Wiha 26197 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set |
| Soldering iron | Amazon | Yihua 939D+ Digital Soldering Station | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR |
| TraceTech No-Clean Flux Pen | Amazon | 2507-N | Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1 |
| Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber | Amazon | WSA350 | For soldering safety. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK |
| Wire strippers | Amazon | CSP-30-7 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG |
| IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG | Amazon | IWS-3220M | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
References
- Klewer, L., Wu, Y. W. Light-induced dimerization approaches to control cellular processes. Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).
- Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms. Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).
- Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology. Advanced Science. 6 (1), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 1800952 (2019).
- Kyriakakis, P., et al. Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (2), electronic resource 706-717 (2018).
- Allen, M. E., et al. An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics. ACS Synthetic Biology. 8 (10), electronic resource 2359-2371 (2019).
- Huang, Z., et al. Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy. Science Advances. 6 (8), (2020).
- Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A.
- Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2). Methods. 164-165, 81-90 (2019).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).
- Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch. Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
- Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nature Communications. 4, 1779 (2013).
- Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J.
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature Communications. 6, 6256 (2015).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K.
- Gong, X., et al. An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques. Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Levskaya, A., et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).
- Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
- Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).
- Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. Engineering an E. coli near-infrared light sensor. ACS Synthetic Biology. 7 (1), electronic resource 240-248 (2018).
- Zhang, W., et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).
- Lee, D., et al. Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).
- Kim, M. W., et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout. eLife. 6, (2017).
