Summary
Detta protokoll beskriver hur man utför optogenetiska experiment för att kontrollera genuttryck med rött och långrött ljus med hjälp av PhyB och PIF3. Inkluderat är steg-för-steg-instruktioner för att bygga ett enkelt och flexibelt belysningssystem, vilket möjliggör kontroll av genuttryck eller annan optogenetik med en dator.
Abstract
Att styra biologiska processer med hjälp av ljus har ökat noggrannheten och hastigheten med vilken forskare kan manipulera många biologiska processer. Optisk kontroll möjliggör en oöverträffad förmåga att dissekera funktion och har potential att möjliggöra nya genetiska terapier. Optogenetiska experiment kräver dock adekvata ljuskällor med rumslig, tidsmässig eller intensitetskontroll, ofta en flaskhals för forskare. Här beskriver vi hur man bygger ett billigt och mångsidigt LED-belysningssystem som enkelt kan anpassas för olika tillgängliga optogenetiska verktyg. Detta system kan konfigureras för manuell eller datorstyrning med justerbar LED-intensitet. Vi tillhandahåller en illustrerad steg-för-steg-guide för att bygga kretsen, göra den datorstyrd och konstruera lysdioderna. För att underlätta monteringen av denna enhet diskuterar vi också några grundläggande lödtekniker och förklarar kretsarna som används för att styra lysdioderna. Med hjälp av vårt användargränssnitt med öppen källkod kan användare automatisera exakt timing och pulsering av ljus på en persondator (PC) eller en billig surfplatta. Denna automatisering gör systemet användbart för experiment som använder lysdioder för att styra gener, signalvägar och andra cellulära aktiviteter som spänner över stora tidsskalor. För detta protokoll krävs ingen tidigare expertis inom elektronik för att bygga alla delar som behövs eller för att använda belysningssystemet för att utföra optogenetiska experiment.
Introduction
Optogenetiska verktyg blir allestädes närvarande och ny teknik utvecklas ständigt för att optiskt styra biologiska processer som genuttryck, cellsignalering och många fler 1,2,3. Förmågan att styra cellulära processer med ljus möjliggör snabb kinetik, tät rumslig kontroll och dosberoende reglering som kan styras av ljusintensitet och exponeringstid. För att använda dessa verktyg krävs en enhet för att styra dessa parametrar. Vi har nyligen utvecklat en genetiskt kodad PhyB-PIF3 genomkopplare för däggdjur som reversibelt aktiverar och inaktiverar gener med rött/långrött ljus respektive4. Detta system testades i flera däggdjurscellinjer och möjliggjorde oöverträffad induktion av genuttryck även med mycket små mängder ljus, inklusive ljuspulser. Forskare som vill använda PhyB-omkopplaren och liknande verktyg 5,6 begär ofta information om metoder för att kontrollera belysningsintensitet och varaktighet. Därför utvecklade vi detta protokoll med steg-för-steg-instruktioner för att möjliggöra bredare antagande av dessa verktyg för optogenetik.
Innan den utbredda användningen av lysdioder användes bredbandsljuskällor med filter för att studera ljuskänsliga proteiner som fytokromer7. Nyligen har vissa LED-belysningssystem publicerats tillsammans med optogenetiska verktyg 8,9,10,11,12, men dessa protokoll kan kräva betydande expertis inom elektronik / programvara, kräva specialutrustning (t.ex. 3D-skrivare, laserskärmaskiner, eller fotomasker), eller ger inte de steg-för-steg-instruktioner som vissa forskare skulle behöva distribuera för sina forskningsbehov. Medan oberoende kontroll av enskilda brunnar i en multiwellplatta kan vara användbar, är det ofta onödigt när forskare bara behöver jämföra flera olika prover i ljus och mörkt eller rött ljus kontra långt rött ljus. Dessutom är många befintliga kommersiella system dyra, med begränsad anpassningskapacitet. Lysdioderna som beskrivs i detta protokoll är dock kostnadseffektiva, ljusa, och kan monteras på många sätt; Därför kan de användas för att belysa flera olika typer av prover. Med protokollet och den medföljande programvaran kan lysdioder som sträcker sig från ultraviolett (UV) till NIR användas och styras med programvara för att utföra optogenetiska experiment med UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV-domäner 17,18, stegfunktion opsiner 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, bakteriella fytokromer26,27,28,29 och andra ljuskänsliga system 30,31,32.
Detta protokoll utgör en handledning för montering av kretsar och annan hårdvara som behövs för att styra olika parametrar för ljusstimulering samt molekylära / cellulära verktyg för att köra ett optogenetiskt experiment. Dessutom rapporterar vi plasmider optimerade från Kyriakakis et al.4 som är mindre och stabilare för kloning. Genom detta protokoll kan biologer utan expertis inom elektronik och optik bygga belysningssystem som är flexibla och robusta. På ett steg-för-steg-sätt visar vi hur man bygger LED-system, vilket tar bort den tekniska flaskhalsen för ett bredare antagande av optogenetiska verktyg. Detta system kan enkelt användas i de flesta cellodlingsinkubatorer, även om de inte innehåller trådportar. Till exempel har vi hållit LED-systemet i en fuktad CO2-inkubator kontinuerligt i mer än 6 månader utan att minska prestandan. Vi förklarar också hur man ansluter LED-systemet till en dator och gränssnitt det med öppen källkodsprogramvara som vi tillhandahåller på GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Att bygga ett system med detta protokoll ger forskare grundläggande kunskaper för att felsöka potentiella problem, byta ut delar och förbättra / utöka funktioner.
Systemöversikt
Att bygga belysningssystemet innebär (1) att bygga den elektroniska kretsen, (2) att bygga kringutrustning (nätsladd, strömbrytare etc.), (3) att bygga lysdioderna, (4) montera alla dessa komponenter och (5) installera programvaran för att styra lysdioderna med ett användargränssnitt (figur 1A). När det är klart kan belysningssystemet styra upp till fyra lysdioder oberoende av varandra med ett användargränssnitt (figur 1B). Användargränssnittet gör det möjligt för varje lysdiod att pulsera vid angivna tidsintervall och stänga av efter en viss tid. Det finns också en startfördröjning för att starta belysningsprogram vid en viss tidpunkt. Potentiometrar (POTTs) reglerar varje LED-intensitet oberoende eller kan användas för manuell LED-styrning utan dator. Ledningarna till lysdioderna kan vara vilken anpassad längd som helst, så att de enkelt kan placeras i en inkubator eller labbutrymme. På grund av dessa lysdioders höga effekt, de kan användas för att belysa ett stort område med en enda LED på avstånd.
Beskrivning av LED-drivrutin
För att driva och kontrollera lysdiodernas intensitet kommer detta protokoll att gå igenom steg för att bygga en "LED-drivrutin". Varje lysdiod har ett spänningsområde där den arbetar (figur 1C). Under drift kan regulatorns utspänning, som styr ljusintensiteten, ställas in med en potentiometer. POT varierar motståndet och justerar utspänningen/ljusstyrkan. Tuning med en 1kΩ (1 kilo-ohm) POT ger det vi kallar "högspänningskretsen" och har en räckvidd på 1,35 V till 2,9 V. Eftersom 2,9 V är för högt för att driva lågspänningslamporna (figur 1C) visar vi en enda modifiering (motstånd 3 eller "R3" kompletterande figur 1A) som begränsar intervallet för att matcha lågspänningslamporna. R3 tjänar till att minska den maximala spänningen som appliceras på lysdioderna till 1,85 V (montering som beskrivs i kompletterande figur 8) när den är parallell med potentiometern. Genom att använda spänning för att styra ljusstyrka istället för ström är systemet mer flexibelt för lysdioder med olika driftspänningar. Figur 1C innehåller en lista över hög- och lågspänningslysdioder för att styra det optimala kretsvalet. Denna design håller minimispänningen tillräckligt låg så att lysdioden är helt avstängd när potentiometern är avstängd och tillåter inte spänningen att gå över lysdiodens typiska driftspänning. För PhyB-optogenetik använder vi djupröda och långröda lysdioder, som använder lågspänningskretsen.
Beskrivning av LED-datorstyrsystem
LED-belysningssystemet kan användas för konstant belysning utan dator eller mikrokontroller. i alla fall, för pulserande program och för att styra individuell LED-timing, en mikrokontroller måste installeras. För att använda en mikrokontroller för att styra lysdioderna krävs en transistor för att ansluta mikrokontrollern till kretsen. Denna transistor känner av spänning från mikrokontrollern och växlar från att vara ledande eller isolerande. För att styra "på" och "av" använder vi vad som kallas en "NPN-switchande transistor" (2N2222) som en kontrollerbar shunt över R2 (kompletterande figur 1A). När spänningen från mikrokontrollern appliceras på transistorbasen blir transistorn ledande och gör LED-spänningen låg och stänger av lysdioden. Således styrs LED och transistorn på och av tillstånd direkt av mikrokontrollern, som styrs av programvaran installerad på datorn.
För att göra belysningssystemet krävs följande steg: Bygg den elektriska kretsen; bygga strömförsörjningen, manuell strömbrytare, POT och mikrokontrolleranslutning; bygga lysdioderna; rymma en svart låda för att passa belysningssystemet; anslut alla ledningar och enheter; installera LED-kontrollprogramvaran, stimulera cellerna med ljus; mäta genuttryck med hjälp av en dubbel luciferasanalys.
Protocol
1. Bygg den elektriska kretsen
OBS: Protokollet för att bygga en enda krets för en tillgänglig LED beskrivs här. Instruktioner för att utöka detta upp till fyra lysdioder ingår i tilläggsinformationen.
- Slå på rökabsorbenten och lödkolven. Tillsätt vatten i torksvampen, ha lödet till hands.
VARNING: Se till att vidta säkerhetsåtgärder för att ta bort rök och förhindra brännskador. - Börja löda kretskomponenter till kretskortet (PCB-kort) i den ordning som visas i tilläggspanelerna.
OBS: Använd en liten mängd löd på lödkolvspetsen för att värma komponentens metall och kretskortet först och smälta ytterligare löd direkt på komponenterna; Flux kan hjälpa mycket. - Lödbygeltrådar och komponenter (kompletterande figur 2 och kompletterande figur 3).
- För bygelkablarna (de isolerade ledningarna som förbinder två punkter på kretskortet), använd två bitar orange [7,6 mm (0,3 tum)] och gula [12 mm (0,4 tum)] ledningar från bygelsatsen.
- Fäst kretskortet på "hjälpande händer" och sätt in bygelkablarna i följande pinhål, böj terminalerna 45 grader och tillsätt flöde (figur 2, kompletterande figur 2 och kompletterande figur 3): A1 och A3 → jord (-) (orange), A7 → strömförsörjning (+) #7 (gul), D2 → D6 (gul).
- Löd och trimma sedan baksidan av ledningarna.
- Sätt in LM317T spänningsregulator i följande pinhål, böj stiften och tillsätt flöde (figur 2 och kompletterande figur 4): Adj → e5, Vut → e6, Vi → e7.
- Löd först vänster och höger terminal, trimma dem, löd sedan och trimma mittterminalen.
- För att ställa in kretsens lågspänningsområde, sätt in ett 820 Ω motstånd hela vägen ner i pinhål, löd och trimma c2 → c5 (figur 2 och kompletterande figur 5).
- För att aktivera LED-styrning med mikrokontrollern, sätt in transistorn i b3–b5 (figur 2 och kompletterande figur 6): Samlare → b3, bas → b4, emitter → b5.
OBS: Var medveten om transistorns orientering för att infoga korrekt; kontrollera specifikationerna för att hitta Collector-, Base- och Emitter-beteckningen.
- Löd tråd-till-kabel-kontakterna för POT, LED, mikrokontroller och strömkälla.
OBS: Var uppmärksam på färgen på ledningarna i tråd-till-kabel-kontakterna och om du använder en kvinnlig eller manlig tråd-till-tråd-kontakt.- Bestäm om en "lågspänningskrets" eller "högspänningskrets" krävs för önskad lysdiod (figur 1C).
OBS: Om lysdioden finns på listan "lågspänning" krävs ett motstånd parallellt med POT. - För kretsen "lågspänning" eller "högspänning", placera ledningen från en honkontakt för tråd till tråd genom hål a5 (kompletterande figur 7). Löd inte på plats ännu om du gör lågspänningskretsen.
OBS: Vrid de nakna trådändarna så att de små trådhåren inte flagnar ut. Om tråden verkar för tjock för att trycka igenom nålhålet utan att slita, klipp av 2–6 trådar och vrid dem sedan ihop igen (kompletterande figur 7B–D). - Om du gör "högspänningskretsen", hoppa till steg 1.4.5. Om du gör "lågspänningskretsen", tryck ett 560Ω-motstånd genom samma hål (a5) och löd med tråd-till-tråd-kontaktledningen.
- Anslut den andra änden av motståndet till marken (kompletterande figur 7G).
- Sätt i den andra änden av den kvinnliga tråd-till-tråd-kontakten lödd i ett 5-hål som förbinder den med marken och löd den (kompletterande figur 8A, B).
- För mikrokontrolleranslutningen, sätt in ena änden av en hankontakt tråd-till-tråd i hål a4 och den andra i ett hål anslutet till marken (kompletterande figur 9A–C).
- För LED-anslutningen, sätt in ena änden av en hona tråd-till-tråd-kontakt i hål a2 och den andra änden i ett hål anslutet till marken (kompletterande figur 9D, E).
- Bestäm om en "lågspänningskrets" eller "högspänningskrets" krävs för önskad lysdiod (figur 1C).
2. Bygg strömförsörjning, manuell strömbrytare, POT och mikrokontrolleranslutning
- Bygg strömförsörjningen.
- Löd en orange [7,6 mm (0,3 tum)] bygel från a29 till marken (kompletterande figur 10).
- Löd en honkontakt från a30 till strömförsörjningen (+) (kompletterande figur 11A–C).
- Löd en hankontakt från kabel till tråd från c29 till c30 (kompletterande figur 11D–F).
- Klipp av kontakten från en nätsladd, exponera ledningarna och ta bort dem (kompletterande bild 12A–C).
- Tillsätt flussmedel till ledningarna före lödning med hjälp av en flusspenna (kompletterande figur 3G).
- Placera ett krymprör på 3,18 mm (1/8 tum) runt en hankontakt för tråd till tråd och en tjockare bit 4,76 mm (3/16 tum) över strömförsörjningskabeln (kompletterande bild 12D).
- Vrid ledningarna från strömförsörjningen och hankontakten tråd-till-tråd tillsammans och löd (kompletterande figur 12E, 13A, B).
- Placera krympröret med mindre diameter 3,18 mm (1/8 tum) över anslutningarna och krymp dem med en värmepistol (kompletterande figur 13C, D).
- Placera ett krymprör med större diameter 4,76 mm (3/16 tum) över det mindre krympröret 3,18 mm (1/8 tum) och värm igen (kompletterande figur 13E, F).
- Bygg den manuella strömbrytaren.
- Placera krympröret 3,18 mm (1/8 tum) över strömställarnas ledningar (kompletterande bild 14A).
- Vrid och löd ledningarna i en hankontakt tråd-till-tråd (kompletterande figur 14B, C).
- Placera krympröret 3,18 mm (1/8 tum) över lödda sektioner och krymp med en värmepistol (kompletterande figur 14D, E).
- Anslut hankontakten tråd-till-tråd till POT.
- Dra tråd-till-kabel-kontaktens svarta ledning runt POT: s mittterminal (kompletterande figur 15B).
- Vrid tråden som är slingrad tätt runt terminalen och löd den (kompletterande figur 15C).
OBS: Små precisionstång kan hjälpa till att göra en snäv vridning. - Upprepa med den röda kabelanslutningen till terminalen, som i kompletterande figur 15D.
- Använd en tång för att bryta metallfliken nära den röda pilen (kompletterande figur 15E,F).
- Bygg mikrokontrolleranslutningen (endast nödvändig för datorstyrda lysdioder).
- Om du gör en LED-drivrutin för mer än en LED, klipp av de svarta ledningarna från alla utom en kvinnlig tråd-till-tråd-kontakt (kompletterande figur 16A).
- Krymp ändarna på tråd-till-tråd-anslutningarna, som visas (kompletterande figur 16B–D).
- Tryck de krusade ändarna genom den rektangulära kontakten (kompletterande figur 16E).
3. Bygg lysdioderna
- Ta bort trådändarna (~5 mm) och applicera flussmedel med en flusspenna som i kompletterande figur 3G.
OBS: För att effektivt lödda ledningarna på LED-basen måste flöde läggas till kontakterna på LED-basen och ledningarna. - Tenn tråden genom att värma tråden underifrån och lägga till löd uppifrån (kompletterande figur 17B).
- Använd flussstiftet för att placera flussmedel på LED-basens ytkontakt (kompletterande figur 17C).
- Placera en generös mängd löd på en stor lödspets (~ 4–5 mm) (kompletterande figur 17D), använd den för att värma LED-basen vid kontakten (kompletterande figur 17E). Efter några sekunder drar du lodet över kontakten (kompletterande bild 17F). Upprepa steg 3.3–3.4 på den andra kontakten (kompletterande figur 17G).
VARNING: LED-basen kan bli mycket varm under lödningen. Placera LED-basen på en yta som inte smälter eller brinner. - Fäst den svarta kabeln på kontakten "C+" (katoden) med hjälp av hårspännena (kompletterande figur 18A).
- Placera en generös mängd löd på den stora lödspetsen (kompletterande figur 18B) och tryck ner den på tråden tills lodet på LED-basen smälter (kompletterande figur 18C). Håll ner tråden (kompletterande figur 18D) och ta bort lödkolven medan du håller tråden på plats (kompletterande figur 18E).
- Placera en liten mängd lödpasta på dynorna för LED-anslutningarna (kompletterande figur 19A, B) och placera lysdioden över dynorna med pincett (kompletterande figur 19C).
OBS: Om placeringen är lite off är det okej; Det kommer att gå på plats när lödpastan smälter. - Håll den röda kabeln på "A +" (anoden) och klipp den med en hårklämma (kompletterande figur 20A-C).
- Placera en generös mängd löd på den stora lödspetsen (kompletterande figur 20D) och tryck ner den på tråden tills lodet på LED-basen och lödpastan under lysdioden smälter (kompletterande figur 20E).
OBS: När lödpastan smälter blir färgen silver (kompletterande figur 20H, I). - Välj längden på den tråd som behövs för önskad inställning. Ta bort LED-ledningarna och en hankontakt för tråd-till-tråd (kompletterande figur 21A) och lägg sedan till flöde som i kompletterande figur 3G.
- Placera krympröret över ledningarna. Använd ett krymprör på 3,18 mm (1/8 tum) över kabel-till-kabel-anslutningarna och ett krymprör på 4,76 mm (3/16 tum) över ledningen (kompletterande bild 21B).
- Fäst tråd-till-kabel-kontakten med en "hjälpande händer" och vrid kontaktens ände med ledningen (kompletterande figur 21C) och löd dem. Upprepa med den andra ledningen (kompletterande figur 21D,E).
- Placera krympslangarna på 3,18 mm (1/8 tum) över lodet och krymp (kompletterande figur 21F–G).
- Placera krympröret på 4,76 mm (3/16 tum) över krympröret på 3,18 mm (1/8 tum) och krymp (kompletterande figur 21H–I).
- Fäst LED-kablarna med "hjälpande händer" med tejp under den (kompletterande figur 22A).
- Blanda epoxi enligt tillverkarens anvisningar och sprid över toppen av den lödda lysdioden (kompletterande figur 22B). Lämna över natten för att bota.
- Om du monterar med ett beröringsfäste, skär en liten bit av beröringsfästet (kompletterande figur 23A) och tryck den mot lysdiodens baksida i 30 sekunder.
- Använd ett höghastighetsroterande verktyg för att göra ett hack på locket på en svart låda (kompletterande figur 23C–E).
- Bygg en montering för en enda LED genom en sekretessfilm.
- Använd spadborren och borra ett hål på 1,75 cm (11/16 tum) genom toppen av en svart låda där lysdioden kommer att placeras (kompletterande figur 24A).
- Använd ett höghastighetsroterande verktyg och gör ett hack på ena sidan av hålet för att göra plats för LED-ledningen, som visas i kompletterande figur 24A.
- Klipp ut en bit sekretessfilm (25–30 mm) och tejpa fast på insidan av den svarta lådan som täcker hålet som lysdioden lyser igenom (kompletterande figur 24A).
- Placera lysdioden utanför den svarta lådan ovanpå hålet med sekretessfilm och tejp på plats med elektrisk tejp (kompletterande figur 24B–E).
4. Rymma en svart låda för att passa belysningssystemet
- För ett fyra LED-system, borra fyra 0,83 cm (21/64 tum) hål på locket 3,81 cm (1,5 tum) från varandra där potentiometrarna kommer att fästas (kompletterande figur 25).
- Använd ett höghastighetsroterande verktyg och skär ett rektangulärt hål på 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 tum x 0,75 tum) i det övre vänstra hörnet (kompletterande figur 25).
- Använd spadborren och borra ett hål på 1,75 cm (11/16 tum) på den svarta lådan (kompletterande figur 26).
- Fila hålen och sätt in genomföringen i hålet som borrats in (kompletterande figur 26).
- För de datorstyrda lysdioderna, sandpapper området där mikrokontrollern kommer att limmas i en svart låda, liksom undersidan av mikrokontrollerhållaren.
- Fäst mikrokontrollern på hållaren innan du fäster hållaren i den svarta lådan och epoxi dem sedan på plats (kompletterande figur 27A).
- Använd sandpapper för att slipa botten av två klämmor och området i en svart låda där kretsen kommer att placeras och säkra klämmorna inuti den svarta lådan med epoxin (kompletterande figur 27A).
- Fäst kretskortet i klämmor (kompletterande figur 27B).
- Tryck strömbrytaren genom det fyrkantiga hålet i locket i kompletterande figur 25 och snäpp fast den på plats (kompletterande figur 28A).
- Tryck POTs genom hålen på locket, skruva på plats (kompletterande figur 28A) och sätt vredet på POT (kompletterande figur 28B).
5. Anslut alla ledningar och enheter
- Märk kabel-till-kabel-kontakterna (t.ex. LED, POT, COM) (kompletterande figur 29A).
- Fäst de krusade kontaktdonen i steg 2.4 (kompletterande figur 16) på hankontakten tråd-till-tråd mellan de två honkontakterna (POT och LED) (kompletterande figur 7A och S37).
- Anslut de krympta ändarna till mikrokontrollern (kompletterande figur 30).
- Dra USB-kabeln genom genomföringen och anslut den till mikrokontrollern.
- Dra ledningarna för lysdioderna genom genomföringen och anslut till honkontakten till vänster om mikrokontrolleranslutningen (kompletterande figurer 9D och 38).
- Dra kabeln för strömförsörjningen genom genomföringen och anslut den till hanens tråd-till-tråd-kontakt på höger sida av kretskortet (kompletterande figur 11D).
- Anslut den manliga tråd-till-kabel-kontakten från strömbrytaren till den kvinnliga tråd-till-kabel-kontakten till höger om kretskortet (kompletterande figur 11A).
- Anslut de trådbundna hankontakterna från POT:erna på locket till de trådbundna honkontakterna på kretskortet (kompletterande figur 8 och 36).
OBS: Slå inte på kretsen utan att potentiometrarna är anslutna.
6. Installera LED-kontrollprogramvaran
Se de detaljerade installationsanvisningarna för programvara i den kompletterande filen på Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces
- Ladda ner och installera programvaran för programmering av mikrokontrollern
- Ladda ner och installera pakethanteraren.
- Programmera mikrokontrollern.
- Ladda ned och installera runtime-motorn.
- Ladda ner användargränssnittet.
7. Stimulera cellerna med ljus
- Transfect HEK293 celler.
- Platta HEK293-celler vid 100k celler per brunn i en 24-brunnsplatta.
- Använd exempeltabellen för att beräkna serumfria medier, polyetylenimin (PEI) och DNA-volymer (kompletterande figur 39) och transfekt med tillverkarens protokoll.
- Stimulerande celler med ljus.
OBS: Cellerna måste hållas i mörker efter transfektion eller hanteras med en ljuskälla som inte exciterar det optogenetiska systemet.- Bestäm vilken typ av stimulering som ska användas på cellerna (kontinuerligt ljus, pulserande intensitet, etc.).
- När POT: erna är avstängda (moturs), slå på LED-strömförsörjningen.
- Placera en ljusmätare inuti den svarta lådan där cellerna ska placeras och placera locket med lysdioden över mätaren. Justera ljusintensiteten efter behov.
- Om du använder datorn för att styra lysdioderna, öppna programvaran för användargränssnittet.
- Programmera användargränssnittet (bild 5A,B).
- På den övre vänstra panelen väljer du COM-porten för mikrokontrollern och klickar på Anslut.
- Använd panelerna till höger för att programmera varje LED. För kontinuerligt ljus, välj vilken tid som helst utom noll i "Time On" och ställ in "Time Off" till noll.
- Programmera huvudtidskontrollen längst ned till höger.
- Om du vill fördröja belysningen väljer du en startfördröjning (HH:MM).
- Om du vill stänga av alla lysdioder efter en viss tid väljer du en körtid (HH:MM).
- Starta belysningsprogrammet genom att klicka på knappen Kör (bild 5A).
8. Mät genuttryck med hjälp av en dubbel luciferasanalys
- Bered luciferasreagens genom att blanda 10 ml luciferasbuffert med luciferasreagens och alikvot i 1 ml rör som ska förvaras vid -80 °C i upp till 1 år.
- Förbered lysbuffert 5x till 1x för 100 μL för N + 2 brunnar. t.ex. för 30 prover, 30 x 20 μL 5X lysbuffert och 30 x 80 μL MQH2O.
- Bered Renilla-substratlösning: 20 μL Renilla-substrat för 1 ml Renilla-buffert (denna mängd är lämplig för 10 analyser).
- Ta bort celler från inkubatorn, aspirera mediet, tillsätt 100 μL 1x lysbuffert per brunn och placera den på en shaker vid 100 rpm i 15 minuter.
- Placera i -20 °C i minst 1 timme.
- Tillsätt 100 μl luciferasreagens per prov i en brunn på en vit platta med 96 brunnar.
- Ställ in plattläsaren för luminiscens. Använd plattläsarens luminometermodul och ställ in integrationen på 1 s.
- Tillsätt tinade lysater i brunnar under luciferasreagenset. Blanda 20 μl prov i luciferasreagenset med hjälp av en flerkanalig pipett och mät luminiscensen omedelbart.
- Efter avläsningsplatån, tillsätt 100 μL Renilla-substratlösning och skanna igen.
- Dela Luciferassignalen med Renillasignalen för att ta hänsyn till transfektionseffektiviteten.
- Jämför luciferassignaler normaliserade för transfektionseffektivitet (jämför t.ex. signalen från rött ljus upplyst och långrött ljus belysta prover).
Representative Results
När strömkretsen, strömförsörjningen, strömbrytaren, POT och en lysdiod är monterad (upp till kompletterande figur 21) kan kretsen testas. Med alla POT: er på plats kommer POT att styra LED-intensiteten. När monteringen är klar fram till kompletterande figur 29 kan systemet användas manuellt för optogenetik eller andra applikationer. Hela systemeffekten kan styras manuellt med strömbrytaren. Intensiteten hos varje lysdiod kan styras oberoende med hjälp av POT ansluten till varje krets.
Efter installation av programvaran och programmering av mikrokontrollern kan användargränssnittet kommunicera med mikrokontrollern. Med användargränssnittet kan lysdioderna styras temporärt på flera sätt: (1) varje lysdiod kan programmeras att lysa under en viss tid, (2) varje lysdiod kan programmeras till puls, (3) en global startfördröjning (t.ex. vid transfektering och lysande ljus 24 timmar senare) kan programmeras (figur 6B), (4) den totala tiden för programmet att köras efter fördröjningen. Det finns två användargränssnitt, ett med större knappar som kan styra två lysdioder åt gången och ett annat som kan styra fyra lysdioder (figur 5A, B). De två LED-användargränssnitten är optimerade för surfplattor och är tillräckliga för att styra röda och långröda lysdioder för många experiment.
För större experiment kan det andra användargränssnittet användas för att styra upp till fyra lysdioder. Vid inducering av genuttryck beror det förväntade resultatet på flera parametrar. Dessa inkluderar induktionstid, induktionsnivåer (t.ex. mängd ljus eller läkemedel) och kopieringsnummer för den inducerbara konstruktionen i cellen. För att visa detta transfekterade vi PhyB-genomkopplaren tillsammans med olika mängder reporter-DNA (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% och 8% av det transfekterade DNA) (figur 6A) och belyste som visas i figur 6B. I prover som innehåller PhyB, men ingen plasmid för att producera fykocyanobilin (PCB-kromofor) (dvs svarar inte på ljus), ökar luciferasgenuttryck/läckage med mängden reporter-DNA (figur 6C) (Långröd P < 0,0001, linjär regression följt av ett Wald-test), (röd P < 0,0001, linjär regression följt av ett Wald-test). Dessutom, när hela PhyB-genomkopplaren, inklusive PCB-kromoforproducerande plasmid (ljuskänsliga celler), belyses för långrött ljus, ökar Luciferas-uttrycket också med de ökande rapportörkonstruktionsmängderna i transfektionsblandningen (figur 6C, D) (Långrött ljus P < 0,0001, linjär regression följt av ett Wald-test). På samma sätt, när de ljuskänsliga cellerna belyses med rött ljus, ökar luciferasuttrycket också med ökad reportermängd (P < 0,0001, linjär regression följt av ett Wald-test). När vi jämförde induktionsnivåerna för de röda ljusbehandlade cellerna med de långröda ljusbehandlade cellerna fann vi en liten minskning av vikaktiveringen med ökande reportermängd (Figur 6E) (P = 0,0141, linjär regression följt av ett Wald-test).
Figur 1: En grundkrets för en enda lysdiod. (A) Ett flödesschema som visar en översikt över de steg som behövs för att bygga LED-belysningssystemet. (B) LED-belysningskontrollsystemet. (vänster) Kontrollbox för reglering av LED-intensitet och timing. (mitten) En PC-surfplatta som kör användargränssnitt för att styra lysdioder. (höger) En svart låda för montering av lysdioder och placering av celler för optisk stimulering. (C) Tabell för att bestämma om lysdioden kräver en hög- eller lågspänningskrets. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Instruktioner för lödning av komponenterna på plats. (A) Ett exempel på steg-för-steg-tecknade instruktioner för att bygga kretsen. (B,C) Exempelinstruktioner med bilder av enheten som monteras. (D) Exempel på instruktioner för montering av flera kretsar samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Visningar av ett monterat LED-styrsystem. (A) En vy uppifrån från utsidan av det monterade systemet. (B) En invändig bild av ett monterat fyra LED-belysningssystem. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Instruktioner för återflödeslödning av lysdioden på kylflänsen. (A) LED-basen och en närbild av en djupröd lysdiod. (B) Placering av lödpasta på LED-basen. (C) Bild av lödd LED. Röda pilar pekar på lödkuddar. Jämfört med grått före lödning (A), efter lödning, verkar lodet metalliskt / glänsande. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Programvara för kontroll av optogenetiska experiment. (A) Ett två LED-användargränssnitt med stora knappar för enkel användning med en billig surfplatta. (B) Ett fyra LED-användargränssnitt. Båda gränssnitten möjliggör oberoende LED-kontroll. För pulsering kan lysdioder programmeras för att slå på och stänga av för specifika pulsbredder och angivna varaktigheter. Pulseringen kan också ha en startfördröjning och en förutbestämd total körtid. (C) LED-kontrollplattan monterad på en cellodlingsinkubator. (D) Illustration av PhyB-gensystemet när det belyses med långrött ljus. Långrött ljus håller genen i "av" eller "mörkt" tillstånd. E) Illustration av PhyB-gensystemet när det belyses med rött ljus. Rött ljus inducerar genuttryck genom att främja interaktionen mellan PhyB och PIF3. Denna interaktion lokaliserar genaktiveringsdomänen (AD) smält till PIF3 till UAS-promotorn, vilket aktiverar rapportgenen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Förväntade resultat med LED-systemet för att styra PhyB. (A) En plasmid som kodar för PhyB + PIF3 tvåhybridpartners (pPK-351), en plasmid som kodar för fykocyanobilin (PCB-kromofor) syntesenzymer (pPK-352) och en Luciferase reporterplasmid (pPK-202). (B) Tidslinje för ljusinduktionsexperiment för C-E. (C) Basala transkriptionsnivåer (AKA-läckage) med ökande mängder reporter-DNA. "Läckprover" transfekteras inte med pPK-352 (dvs. svarar inte på ljus), men är upplysta med rött eller långrött ljus. Light Switch (LS) prover inkluderar alla ljusgenomkopplare plasmider och är belysta med rött eller långrött ljus. (D) Ljusinduktionsnivåer som svar på rött och långrött ljus. (LS-Långt-rött ljus är samma data i C och D.) (E) Vikningsinduktion av luciferas i celler belysta med rött ljus/långrött ljus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Klicka här för att ladda ner kompletterande siffror 1-39.
Kompletterande figur 1: Elektronisk drivrutinskrets för flera lysdioder. (A) Kretsschemat för ett enda LED-system. (B) Kretsschemat för ett fyra LED-system.
Kompletterande figur 2: Placering av kretskopplingar. (A) Fäst ditt kretskort på dina hjälpande händer. (B) Placering av huvudkretshoppare i de genomgående hålen i bilden. (C) Diagram över trådanslutningar som kartlägger koordinaterna. För de fyra LED-systemen, rita linjer som delar varje krets enligt bilden (svarta vertikala linjer). Kompletterande figur 31–38 beskriver sammansättningen av fyra kretsar samtidigt.
Kompletterande figur 3: Lödning av ledningarna på kretskortet. (A) Böj hoppare så att de kommer i direkt kontakt med kretskortet och håller sig på plats under lödningen. (B) En annan vy av de böjda ledningarna. (C) Ledningar efter lödning. (D) Trimmade ledningar på kretskortet. (E) Krympt isolering efter uppvärmning med lödning. (F) Flytta isoleringen på plats för att täcka marken genom hålet (blå pil) (G) Lägga till flöde till en trådände eller terminal.
Kompletterande figur 4: Lödning av spänningsregulatorn på plats. (A) Karta över spänningsregulatorns koordinater. (B) Placering av spänningsregulatorn. (C) Böjda spänningsregulatorkablar. (D) Spänningsregulatorterminaler efter lödning.
Kompletterande figur 5: Lödning av R1-motståndet på plats. (A) Karta över koordinaterna för R1-motståndet (820Ω). (B) Dra motståndet genom ledningen med en tång (C) Det dragna motståndet nära kretskortet. (D) Det lödda motståndet nära PCB.
Kompletterande figur 6: Lödning av transistorn på plats. (A) Karta över transistorkoordinater och orientering. (B) Notera transistorns riktning; etiketten i denna modell är vänd mot spänningsregulatorn (LM317T). Dubbelkolla transistorns specifikation för att se till att "Emitter", "Base" och "Collector" är i rätt hål. (C) Transistorn med terminalerna böjda före lödning.
Kompletterande figur 7: Lödning av tråd-till-tråd-kontakten för potentiometern på plats (plus ett 560Ω-motstånd för lågspänningskretsen). (A) Karta över koordinaterna för tråd-till-tråd-kontakten (plus R3-560Ω om lågspänningskretsen byggs, placeras tråd-till-tråd-kontakten i hålet före motståndet). (B) En honkontakt tråd-till-tråd. (C) För att underlätta montering av motståndet och tråd-till-tråd-kontakten i det genomgående hålet böjs 3–5 trådar av den flätade tråden. (D) Kardelerna skärs av med trådskärare så nära isoleringen som möjligt. (E) Insatt röd tråd i en honkontakt tråd-till-tråd genom a5-genomgående hål (för lågspänningskretsen sätt in R3 genom samma genomgående hål). (F) Vy på undersidan av motståndet och tråd-till-tråd-kontakten före lödning. (G) Bild av det lödda R3-motståndet anslutet till marken (F = hona).
Kompletterande figur 8: Lödning av tråd-till-tråd-kontakten för potentiometern till marken. (A) Karta över koordinaterna för jordanslutningen för potentiometerns tråd-till-tråd-kontakt. (B) Ovanifrån av potentiometerns tråd-till-tråd-kontakt parallellt med R3 (F = hona).
Kompletterande figur 9: Lödning av mikrokontrollern och LED-kabel-till-kabel-kontakter. (A) Karta över koordinaterna för tråd-till-tråd-kontakten för anslutning av 2N222A och marken till mikrokontrollern. (B) Lödd hankontakt tråd-till-tråd. (C) Ovanifrån av (B). (D) Karta över koordinaterna för den kvinnliga tråd-till-kabel-kontakten för anslutning av kretsens och jordens ingång till lysdioden. (E) Lödd tråd-till-tråd-kontakt för hona (F = hona, M = hane).
Kompletterande figur 10: Lödning av bygeln för strömförsörjningskretsen. (A) Karta över koordinaterna för den orange bygeln för anslutning av strömförsörjningen till marken. (B) Den orange bygeln lödd på plats. (C) Bygelns undersida lödd på plats.
Kompletterande figur 11: Lödning av strömbrytaren och strömkällans kabel-till-kabel-kontakter. (A) Karta över koordinaterna för den kvinnliga tråd-till-tråd-kontakten för anslutning av strömbrytaren. (B) Honkontakten tråd-till-tråd lödd på plats. (C) En annan syn på (B). (D) Karta över koordinaterna för hankontakten tråd-till-tråd för anslutning av strömkällan. (E) Lödd hankontakt tråd-till-tråd. (F) En annan syn på (E) (F = kvinna, M = man).
Kompletterande bild 12: Anslutning av strömförsörjningen till en tråd-till-kabel-kontakt för hane. (A) Den omodifierade strömförsörjningen. (B) Klippa av strömförsörjningskablarna. (C) Strömförsörjningsledningarna avlägsnade och med överflödig isolering bortskuren. (D) Placering av krympröret runt strömförsörjningsledningar. Slangar som separerar de två anslutningarna (röda pilar) och slangar för att hålla de separerade ledningarna (gul pil). (E) Vridna ledningar som ansluter strömförsörjningen till honans tråd-till-tråd-kontakt.
Kompletterande figur 13: Lödning och isolering av strömförsörjningsanslutningen till en hankontakt för tråd-till-tråd. (A) Den lödda anslutningen mellan strömförsörjningsjord och en honkontakt. (B) Den lödda anslutningen mellan strömförsörjningens positiva terminal och en honkontakt tråd-till-tråd. (C) Krympröret dras över de lödda individuella anslutningarna (röd pil). (D) Båda strömförsörjningsanslutningarna lödda och med värmebehandlat krymprör. (E) Placering av krympröret över enskilda anslutningar (gul pil). (F) Slutförd strömförsörjning.
Kompletterande figur 14: Lödning av strömbrytaren till en hankontakt för tråd-till-kabel. (A) Strömbrytare med strippade ledningar och krymprör placerade över ledningarna (röda pilar). (B) Ledningar som förbinder omkopplaren och hankontakten tråd-till-tråd tvinnade tillsammans före lödning. (C) Placera krympröret över lödanslutningarna. (D) Anslutningar täckta med det värmebehandlade krympröret. (E) En strömbrytare monterad med en hankontakt tråd-till-tråd.
Kompletterande figur 15: Anslutning av en potentiometer till en hankontakt för tråd-till-tråd. (A) Potentiometerns delar. (B) En hane tråd-till-tråd-kontakt vriden och böjd för att haka runt potentiometerns mittterminal. (C) En hankontakt tråd-till-tråd vriden runt potentiometerns mittterminal. (D) Lödda tråd-till-tråd-anslutningar. (E) Röd pil som pekar på metallfliken före borttagning. (F) Potentiometern efter borttagning av metallfliken.
Kompletterande figur 16: Anslutning av mikrokontrolleranslutningen. (A) Ledningar för tråd-till-tråd-anslutningar för kvinnor strippade och kapade som förberedelse för pressning. (B) Placering av pressen på tråd-till-tråd-kontakten. (C) Krympning av tråd-till-tråd-kontakten. (D) Krusad tråd-till-tråd-kontakt. (E) Fullt monterad mikrokontrolleranslutning.
Kompletterande figur 17: Lödtrådar och lysdiod på LED-basen Del 1. (A) Material som behövs för att löda lysdioden till LED-basen. (B) Förtäring av spetsen på den strippade tråden. (C) Applicera flöde på LED-basens kontakt. (D) Lägga till löd till den stora lödspetsen för att försluta LED-basen. (E) Placering av löd på kontakten för att värma LED-basen. (F) LED-basen efter att lödspetsen dragits över kontakten. (G) Samma förfarande för den andra kontakten.
Kompletterande figur 18: Lödtrådar och lysdiod på LED-basen Del 2. (A) En konserverad tråd som fästs vid kontakten med hjälp av en hårklämma. Observera att den svarta ledningen är lödd till katoden "C-". (B) Tillsats av en generös mängd lödning till lödspetsen. (C) Lödspetsen trycker ner tråden, smälter lodet på LED-basen och tråden. (D) Håll ner tråden så att den sitter kvar när lödkolven tas bort. (E) Håll tråden på plats tills lodet härdar.
Kompletterande figur 19: Lödtrådar och lysdiod på LED-basen Del 3. (A) Använd en vass spets för att placera lödpasta på LED-basen för montering av lysdioden. (B) LED-basen med lödpastan på plats. (C) Placering av lysdioden på LED-basen så att LED- och LED-baskontakterna matchar.
Kompletterande figur 20: Lödtrådar och lysdiod på LED-basen Del 4. (A) Den svarta tråden som fortfarande är fastklämd vid kontakten med hårklämman. (B,C) Med hjälp av ett andra hårklämma hålls den röda tråden på plats. Observera att den röda ledningen är lödd till anoden "A +". (D) Tillsats av en generös mängd lödning till lödspetsen. (E) Lödspetsen trycker ner tråden, smälter lodet på LED-basen och tråden samt lödpastan under lysdioden. (F) Den heta LED-baskylningen efter lödning. (G) LED-basen med ledningarna och lysdioden lödda på. (H,I) Röda pilar pekar på lödkuddar. Efter lödningen ser lodet metalliskt/glänsande ut (jämfört med grått före lödning (kompletterande figur 16D)).
Kompletterande figur 21: Ansluta LED-kabeln till en hankontakt för tråd-till-kabel. (A) Avskalade ledningar och hane tråd-till-tråd-kontakt bredvid krympröret skuren i hälften (1/8 tum och 3/16 tum). (B) Krymprörets placering över ledningarna före lödning. (C) Trådar tvinnade ihop före lödning. (D) Den lödda anslutningen från ledningen till tråd-till-kabel-kontakten. (E) Både de röda och svarta ledningarna lödde ihop. (F) Placering av 1/8 tums krympslang över lödanslutningen. (G) Krympröret efter krympning med värmepistolen. (H) Placering av 3/16 tums krympslang över det mindre krympröret. (I) Anslutningen löds och tätas med krympröret.
Kompletterande figur 22: Säkra ledningarna och lysdioderna till LED-basen med epoxi. (A) Använd en träapplikator för att placera epoxi i LED-basen. Ett tejp placeras nedan för att fånga upp droppande epoxi. (B) Epoxi sprids jämnt över hela ytan. (C) Lysdioden lämnas över natten för att härda.
Kompletterande figur 23: Montering av lysdioder inuti ett lådlock. (A) En lysdiod med ett beröringsfäststycke fäst för enkel montering. (B) Olika färglampor monterade på insidan av en svart låda med hjälp av ett pekfäste. (C) Ett hack på den svarta lådans lock tillverkat av ett höghastighetsroterande verktyg för att göra plats för LED-kabeln. (D) En svart låda för att stimulera cellerna med beröringsfästen för montering av lysdioden. (E) Placering av en multiwell-skål inuti LED-boxens version av touchfästelementet.
Kompletterande figur 24: Montering av lysdioder utanför ett lådlock. (A) Hål borrat i den svarta lådans lock med ett hack från höghastighetsroterande verktyg för att göra plats för tråden (röd pil). (B) LED placerad i hålet med tråden i skåran, hålls på plats med elektrisk tejp. (C) Ytterligare två tejpbitar används för att säkra lysdioden. Kylflänsens baksida exponeras för att maximera värmeväxlingen. (D) Sekretessfilm tejpad över hålet där lysdioden kommer att placeras. Den röda pilen pekar på sekretessfilmen. (E) En svart låda för att stimulera cellerna med en lysdiod monterad utanför lådan och med sekretessfilm för att sprida belysningen. (F) Placering av en multiwell-skål inuti den externa LED + sekretessfilmversionen av LED-boxen.
Kompletterande figur 25: Borrning av hål på lådans lock för strömbrytaren och potentiometrar. (A) En CAD-ritning med kommenterade mått på lådans lock. (B) Lådans lock med potentiometern och strömbrytarhålen.
Kompletterande figur 26: Förbereda trådutloppshålet. (A) En CAD-ritning med annoterade mått. (B) Bild av det borrade hålet med borrkronan. (C) Utjämning av utloppshål med höghastighetsroterande verktyg eller arkiveringsverktyg. (D) Placering av genomföring i utloppshål.
Kompletterande figur 27: Placering av mikrokontrollern och kretskortet i lådan. (A) Mikrokontrollerhållaren (orange) och PCB-hållarna inuti lådan. (B) Mikrokontrollern och kretskortet säkras i lådan.
Kompletterande figur 28: Placering av potentiometrar och strömbrytare. (A) En framifrån av ett lådlock med strömbrytare och fyra POT. (B) En framifrån av lådlocket med potentiometerknoppar tillagda. (C) En bakifrån av lådlocket med de bifogade komponenterna.
Kompletterande figur 29: Det monterade LED-styrsystemet. (A) En öppen kontrollbox med ledningarna märkta med en etikettskrivare och dragkedja bunden för organisation. (B) Lådan, när den är helt monterad, med varje POT märkt tillsammans med PIN-koden.
Kompletterande figur 30: Placering av den krusade tråd-till-tråd-kontakten. (A) Bild av de krusade tråd-till-tråd-kontakterna för ett fyra LED-mikrokontrollersystem. (B) Placering av den krusade kontakten i mikrokontrollerportarna.
Kompletterande figur 31: Placering av bygelkablarna. (A) Ett kretskort med koordinaterna för de röda bygelkablarna märkta. (B) Ett kretskort med koordinaterna för de gula bygelkablarna märkta.
Kompletterande figur 32: Placering av bygeltrådarna. Ett kretskort som visar koordinaterna för de gula bygelkablarna.
Kompletterande figur 33: Lägga till spänningsregulatorerna. LM317T spänningsregulatorer läggs till kretsen med sina koordinater märkta i diagrammen.
Kompletterande figur 34: Sätt i 820Ω-motstånden. R1-motstånden läggs till kretsen med sina koordinater märkta i diagrammen.
Kompletterande figur 35: Infoga transistorerna. 2N2222A-transistorerna läggs till kretsen med sina koordinater märkta i diagrammen.
Kompletterande figur 36: Sätta i de kvinnliga tråd-till-kabel-kontakterna och motstånden (tillval) för POT-anslutningen. Ledningarna och motstånden läggs till kretsen med sina koordinater märkta i diagrammen. (A) Sätt i den röda kabeln, följt av R2-motståndet (560Ω) (endast för lågspänningskretsen). (B) Sätt in den andra änden av motståndet i det angivna jordhålet. (C) Sätt in de svarta ledningarna i de markerade hålen för att ansluta till jord. Obs: R2 (560Ω) är parallell med potentiometern.
Kompletterande figur 37: Sätta i hankontakter för tråd-till-tråd för mikrokontrolleranslutning och strömförsörjning. Ledningarna läggs till kretsen med sina koordinater märkta i diagrammen. (A) Sätt in de röda ledningarna i de angivna hålen. (B) Sätt in de svarta ledningarna i de markerade hålen.
Kompletterande bild 38: Lägga till LED-kabel-till-kabel-kontakter. (A) Tråd-till-kabel-honkontakter med de röda ledningskoordinaterna markerade. (B) Tråd-till-tråd-kontakt för kvinnor med de svarta ledningskoordinaterna markerade.
Kompletterande figur 39: Ställa in ett PhyB-PIF3-genväxelexperiment. (A) En exempeltabell över en mastermix som innehåller Renilla för den interna kontrollen. (B) En exempeltabell för att ställa in DNA-blandningen för en Dual-Luciferase Reporter-analys av ett PhyB-PIF3-optogenetiskt experiment. C) En exempeltabell för inställning av PEI-transfektionsreagens och alikvotering av blandningen på celler (droppvis). (D) Placering av ljusmätaren för inställning av LED-ljusstyrkan.
Discussion
LED-systemet som beskrivs här har använts i vårt laboratorium för att optimera, karakterisera och arbeta med flera optogenetiska verktyg. I Kyriakakis et al.4 testade vi många kombinationer av PhyB-PIF-genomkopplare parallellt. Vi använde sedan detta system för att testa ljuspulser vid olika frekvenser för att mäta genomkopplarens kinetik och effektiv ljusintensitet. Detta system användes också för att optimera och karakterisera två optogenetiska system som använder blått ljus för stimulering 5,6. Eftersom endast en lysdiod behövde vara tillräckligt ljus för att aktivera de flesta optogenetiska verktyg är det inte alltid nödvändigt att köpa ett system med ett stort antal lysdioder över varje brunn. Denna installation är billig, pålitlig, lätt att konfigurera om och kräver ingen tidigare elektrisk expertis för att följa monteringsprotokollet.
I de kompletterande kompletterande figurerna 31–38 beskriver vi hur man kan integrera upp till fyra lysdioder i systemet. Även om detta kan begränsa vissa experiment som kräver ett stort antal parallella förhållanden, kan fler lysdioder läggas till genom att ersätta 9 Volt strömförsörjning som används i detta protokoll med en högre watt. På samma sätt kan flera lysdioder med lägre effekt anslutas parallellt med varje krets. I det senare arrangemanget kommer vissa lysdioder inte att styras individuellt, men det kan vara användbart när många lysdioder krävs för att täcka ett större område. När du väl är bekant med elektroniken i detta system finns det många sätt att anpassa det. Ytterligare strategier för att anpassa systemet inkluderar att placera lysdioden längre eller närmare provet och belysa genom filter / diffusorer för homogena belysningsförhållanden eller för att förhindra uppvärmning som i (kompletterande figur 23) och Allen et al.5. En annan anmärkningsvärd egenskap hos vår LED-design är att den är inkapslad i epoxi och har ett beröringsfäste på baksidan; Detta gör att lysdioden enkelt kan placeras säkert praktiskt taget var som helst: i inkubatorer, akvarium, djurburar, väggar etc.
Många experiment som använder optogenetik för att styra gener, signalvägar och annan cellulär aktivitet kräver ofta pulsering, spänner över stora tidsskalor eller behöver utföras i en inkubator, vilket kräver automatisering eller fjärrmanipulation utan mikroskop. Detta LED-system har testats kontinuerligt i flera månader inuti en fuktad CO2-inkubator utan problem. Dessutom, med reversibla system som PhyB-optogenetiska system, kan experimenten behöva programmera specifika pulserande belysningsscheman. I vårt tidigare arbete4 använde vi pulserande program för att testa reversibilitetsdynamiken hos en PhyB-PIF3-switch i däggdjursceller via användargränssnittet. Med hjälp av den metodik som beskrivs i detta manuskript är det enkelt att programmera ett pulserande protokoll, vilket ger den flexibilitet och autonomi som behövs för många typer av optogenetiska experiment på ett användarvänligt sätt.
De mest kritiska stegen för att bygga detta system inkluderar att sätta ihop den elektriska kretsen på kretskortet och ansluta komponenterna, som beskrivs i avsnitt 1 och avsnitt 2. Det är viktigt att noggrant följa varje steg i dessa avsnitt och dubbelkontrollera pinhole-numren rad för rad innan du lödar varje komponent. Avsnitt 2 förklarar hur man ställer in komponenterna som ska anslutas till kretsen. För att komponenterna ska anslutas i rätt riktning är det särskilt viktigt att se till att färgerna på de svarta och röda ledningarna på tråd-till-tråd-kontakterna matchar. Små förbiseenden i dessa två avsnitt kommer sannolikt att påverka systemets funktionalitet. Det första steget i felsökning av denna metod är faktiskt att kontrollera att kretsen byggdes korrekt och att alla anslutningar är på plats. För det andra är det särskilt viktigt att kontrollera lödkvaliteten för lösa anslutningar och ledningarna för blossande trådhår som kan kortsluta kretsen. Ett tredje steg skulle vara att se till att lysdioderna fungerar korrekt, vilket kan göras med hjälp av en strömförsörjning eller ett 1,5 V-batteri genom att klippa lysdiodens två terminaler med alligatorklämmor. Ett annat potentiellt kritiskt övervägande är att förhindra uppvärmning (vid användning av lysdioderna med hög effekt) eller diffusion av ljuset för bredare spridningsbelysning. För att ta itu med dessa överväganden kan lysdioderna monteras utanför en svart låda med "sekretessfilm" på insidan, som beskrivs i kompletterande figur 23 och Allen et al.5. På grund av enkelheten i detta system är det inte svårt att ta isär det för att verifiera, modifiera, uppgradera eller reparera modulära komponenter.
En annan kritisk faktor för inducerbara gensystem är att överväga hur mycket aktivering som krävs eller hur mycket läckage som är acceptabelt för det biologiska systemet som kontrolleras. Som visas i figur 6 kan dessa variera med mängden rapportör-DNA. Dessutom varierar transfektionseffektiviteten och därmed kopieringsantalet rapportörkonstruktioner i varje cell. Det kan vara fördelaktigt för vissa experiment att göra en cellinje med en fast mängd reporter- eller PhyB-genswitchkomponenter och screena för kloner med önskat intervall av inducerat uttryck, vilket vanligtvis görs med läkemedelsinducerbara system. På grund av storleken och instabiliteten hos lentiviral plasmid pPK-2304 gjorde vi också icke-lentivirala plasmidversioner av PhyB-omkopplaren i pcDNA-ryggraden pPK-351 (Addgene #157921) och pPK-352 (Addgene #157922).
Genom att bygga detta LED-belysningssystem enligt detta protokoll, användare har alla komponenter som behövs för att utföra ett brett spektrum av optogenetiska experiment in vitro och in vivo. I kombination med instruktionerna för användning av PhyB-PIF3 i däggdjursceller kommer detta protokoll att göra det möjligt för icke-ingenjörer och biologer att, flexibelt och effektivt, använda PhyB-baserad optogenetik i olika sammanhang.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang och Molly Allen för att ha testat olika versioner av LED-systemet när det utvecklades. Detta arbete stöddes av Kavli Institute for Brain and Mind vid UC San Diego och Salk Institute, National Science Foundation genom NSF Center for Science of Information under Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 och NIH Grant R21DC018237.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18AWG 2pin RED Black wire | Amazon | 15M-28AWG-2468 | Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| 1K Ohm potentiometer | Amazon | 52161500 | 2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| 20 Gauge Silicone JST Connector | Amazon | SIM&NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| 22 AWG solid jumper wires | Amazon | WJW-60B-R | Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| 560 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | a14051600ux0301 | Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN |
| 820 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | TTL-A-8035-50Ea | Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor |
| A Male to B Male Cable (10 Feet) | Amazon | Part# 30-001-10B | The cable that comes with the Arduino doesn't fit well in the box. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Ardiuino UNO equivilent | Amazon | Elegoo EL-CB-001 | UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Arduino holder | Digikey | X000018 | Fits very snug. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632 |
| Black boxes for circuits and light chambers | Amazon | 1591ESBK | Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Blue LED | Digikey | LXML-PB01-0040 | LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134 |
| Cable ties | Amazon | sd027 | Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Command Fridge Clips | Amazon | 17210CLR | Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Cyan LED | Digikey | LXML-PE01-0070 | LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd |
| Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack | Amazon | 03429NA | Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK |
| Farred LED 720nm | Luxeon Star LEDs | LXML-PF01 | Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW |
| Farred LED 740nm | Ushio | EDC740D-1100-S5 | Uses "STAR XP 3535" base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf |
| Farred LED 780nm | Ushio | EDC780D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf |
| Farred LED 810nm | Ushio | EDC810D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf |
| Farred LED 850nm | Ushio | EDC850D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf |
| Grommets | Amazon | Pico 6120D | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G |
| Hair/Alligator Clips | Amazon | 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
|
| LED base | Luxeon Star LEDs | LXB-RS20A | Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds |
| LED PCB fopr Ushio LEDs | Adura LED solutions | STAR XP 3535 Package LED | Fits many other LEDs by Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led |
| Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe | Amazon | 1943587 | Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C |
| NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS | Amazon | B000FIDTYG | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Picture Hanging Velcro Strips | Amazon | PH204-16NA | With these you can hang the LEDs in many places. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H |
| Power supply | Amazon | tb013 | Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Power switch Rocker Switch | Amazon | SIXQJZML | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011 |
| Rectangular Connectors - for crimped wires | Digikey | 2183-1905-ND | 6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100" (2.54mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB |
| Red LED | Digikey | LXM3-PD01 | LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd |
| Sandpaper | Amazon | B002NEV6GS | 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1 |
| Solder for soldering wires and circuit components | Amazon | Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY |
| Solder-able Breadboard for building the circuit | Amazon | GK1007 | Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Spade drill bit | Amazon | Irwin 88811 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit |
| Transistor | Newark | 2N2222A | Can buy from many places. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197 |
| Voltage regulator | Newark | LM317T | Equivilent to NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC |
| Windows 10 tablet | Amazon | B08BYTT79Y | Any Windows 10 PC will do. https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Cell Culture Reagents | |||
| Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 | ATCC | ATCC CRL-1573 | Common Cell line. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose | ThermoFisher | 11965−092 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118 |
| 10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122 |
| White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates | ThermoFisher | 07-200-589 | White plates are preferred. Do not use clear plates. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852 |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | PolySciences | 24765-1 | Can be replaced with another transfection reagent. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/ |
| Name of Equipment | |||
| Diagonal Cutting Plier (110mm) | Amazon | Proskit 1PK-037S | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11 |
| Dremil 3000 with cutting tool and grinder | Amazon | Dremel 3000 | Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3 |
| Dremil cutting and grinding tool | Amazon | Dremel 200-1/15 | Any similar Dremil will work. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Dremil grinding tip | Amazon | Dremel 84922 | Silicon Carbide Grinding Stone. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922 |
| EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT | Amazon | DS017 | For removing solder/mistakes. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI |
| Helping Hand with Magnifying Glass | Amazon | SE MZ101B | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch |
| Pointed Nose Micro Pliers | Amazon | Hakko CHP PN-20-M | Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Small screw drivers | Amazon | Wiha 26197 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set |
| Soldering iron | Amazon | Yihua 939D+ Digital Soldering Station | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR |
| TraceTech No-Clean Flux Pen | Amazon | 2507-N | Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1 |
| Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber | Amazon | WSA350 | For soldering safety. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK |
| Wire strippers | Amazon | CSP-30-7 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG |
| IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG | Amazon | IWS-3220M | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
References
- Klewer, L., Wu, Y. W. Light-induced dimerization approaches to control cellular processes. Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).
- Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms. Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).
- Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology. Advanced Science. 6 (1), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 1800952 (2019).
- Kyriakakis, P., et al. Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (2), electronic resource 706-717 (2018).
- Allen, M. E., et al. An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics. ACS Synthetic Biology. 8 (10), electronic resource 2359-2371 (2019).
- Huang, Z., et al. Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy. Science Advances. 6 (8), (2020).
- Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A.
- Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2). Methods. 164-165, 81-90 (2019).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).
- Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch. Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
- Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nature Communications. 4, 1779 (2013).
- Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J.
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature Communications. 6, 6256 (2015).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K.
- Gong, X., et al. An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques. Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Levskaya, A., et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).
- Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
- Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).
- Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. Engineering an E. coli near-infrared light sensor. ACS Synthetic Biology. 7 (1), electronic resource 240-248 (2018).
- Zhang, W., et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).
- Lee, D., et al. Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).
- Kim, M. W., et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout. eLife. 6, (2017).
