Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בניית מערכת תאורה פשוטה ומגוונת לניסויים אופטוגנטיים

Published: January 12, 2021 doi: 10.3791/61914
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 4, 1, 1
1Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים אופטוגנטיים לבקרת ביטוי גנים באור אדום ואדום רחוק באמצעות PhyB ו-PIF3. כלולות הוראות שלב אחר שלב לבניית מערכת תאורה פשוטה וגמישה, המאפשרת שליטה על ביטוי גנים או אופטוגנטיקה אחרת באמצעות מחשב.

Abstract

שליטה בתהליכים ביולוגיים באמצעות אור הגבירה את הדיוק והמהירות שבהם חוקרים יכולים לתמרן תהליכים ביולוגיים רבים. בקרה אופטית מאפשרת יכולת חסרת תקדים לנתח תפקודים וטומנת בחובה פוטנציאל לאפשר טיפולים גנטיים חדשניים. עם זאת, ניסויים אופטוגנטיים דורשים מקורות אור נאותים עם בקרת מרחב, זמן או עוצמה, לעתים קרובות צוואר בקבוק עבור החוקרים. כאן אנו מפרטים כיצד לבנות מערכת תאורת LED בעלות נמוכה ורב-תכליתית הניתנת להתאמה אישית בקלות עבור כלים אופטוגנטיים זמינים שונים. מערכת זו ניתנת להגדרה עבור שליטה ידנית או מחשב עם עוצמת LED מתכווננת. אנו מספקים מדריך מאויר שלב אחר שלב לבניית המעגל, הפיכתו לנשלט מחשב ובניית נורות ה- LED. כדי להקל על הרכבת מכשיר זה, אנו דנים גם בכמה טכניקות הלחמה בסיסיות ומסבירים את המעגלים המשמשים לשליטה בנורות ה- LED. באמצעות ממשק המשתמש שלנו בקוד פתוח, משתמשים יכולים להפוך תזמון מדויק ופעימת אור לאוטומטיים במחשב אישי (PC) או בטאבלט זול. אוטומציה זו הופכת את המערכת לשימושית עבור ניסויים המשתמשים בנורות LED כדי לשלוט בגנים, מסלולי איתות ופעילויות תאיות אחרות המתפרשות על פני סקאלות זמן גדולות. עבור פרוטוקול זה, אין צורך במומחיות קודמת באלקטרוניקה כדי לבנות את כל החלקים הדרושים או להשתמש במערכת התאורה לביצוע ניסויים אופטוגנטיים.

Introduction

כלים אופטוגנטיים הופכים להיות בכל מקום וטכנולוגיה חדשה מפותחת כל הזמן כדי לשלוט אופטית בתהליכים ביולוגיים כגון ביטוי גנים, איתות תאי, ועודרבים 1,2,3. היכולת לשלוט בתהליכים תאיים באמצעות אור מאפשרת קינטיקה מהירה, שליטה מרחבית הדוקה וויסות תלוי מינון שניתן לשלוט בו על ידי עוצמת האור וזמן החשיפה. כדי להשתמש בכלים אלה, יש צורך במכשיר לשליטה בפרמטרים אלה. לאחרונה פיתחנו מתג גנים של יונקים מקודד גנטית PhyB-PIF3 המפעיל ומנטרל גנים באופן הפיך באמצעות אור אדום/אדום רחוק, בהתאמה4. מערכת זו נבדקה במספר שורות תאים של יונקים ואפשרה השראה חסרת תקדים של ביטוי גנים גם עם כמויות קטנות מאוד של אור, כולל פולסים של אור. חוקרים המעוניינים להשתמש במתג PhyB ובכלים דומים 5,6 מבקשים לעתים קרובות מידע על שיטות לשליטה בעוצמת התאורה ובמשך. לכן, פיתחנו פרוטוקול זה עם הוראות שלב אחר שלב כדי לאפשר אימוץ רחב יותר של כלים אלה עבור אופטוגנטיקה.

לפני השימוש הנרחב בנורות LED, מקורות אור בפס רחב עם מסננים שימשו לחקר חלבונים מגיבי אור כגון פיטוכרום7. לאחרונה, כמה מערכות תאורת LED פורסמו יחד עם כלים אופטוגנטיים 8,9,10,11,12, אבל פרוטוקולים אלה יכולים לדרוש מומחיות משמעותית באלקטרוניקה / תוכנה, דורשים ציוד מיוחד (למשל, מדפסות תלת מימד, מכונות חיתוך לייזר, או מסכות פוטו), או לא לספק את ההוראות שלב אחר שלב כמה החוקרים יצטרכו לפרוס לצרכי המחקר שלהם. בעוד שבקרה עצמאית של בארות בודדות בצלחת מרובת בארות יכולה להיות שימושית, לעתים קרובות היא מיותרת כאשר החוקרים צריכים להשוות רק כמה דגימות שונות באור בהיר ואור כהה או אדום לעומת אור אדום רחוק. כמו כן, מערכות מסחריות קיימות רבות הן יקרות, עם יכולת התאמה אישית מוגבלת. עם זאת, נורות ה- LED המתוארות בפרוטוקול זה הן חסכוניות, בהירות וניתנות להרכבה בדרכים רבות; לכן, הם יכולים לשמש כדי להאיר כמה סוגים שונים של דגימות. עם הפרוטוקול והתוכנה המסופקת, נורות LED החל מאולטרה סגול (UV) ועד NIR ניתן להשתמש ולשלוט עם תוכנה לביצוע ניסויים אופטוגנטיים באמצעות UVR8 13,14, Dronpa 15,16, תחומי LOV 17,18, פונקציית צעד Opsins 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, פיטוכרום חיידקי26,27,28,29 ומערכות אחרות המגיבות לאור 30,31,32.

פרוטוקול זה מהווה הדרכה להרכבת המעגלים וחומרה אחרת הדרושה לשליטה בפרמטרים שונים לגירוי אור, כמו גם בכלים המולקולריים/תאיים לביצוע ניסוי אופטוגנטי. בנוסף, אנו מדווחים על פלסמידים שעברו אופטימיזציה מ- Kyriakakis et al.4 שהם קטנים ויציבים יותר לשיבוט. באמצעות פרוטוקול זה, ביולוגים ללא מומחיות באלקטרוניקה ואופטיקה יכולים לבנות מערכות תאורה גמישות וחזקות. באופן שלב אחר שלב, אנו מראים כיצד לבנות מערכות LED, תוך הסרת צוואר הבקבוק הטכני לאימוץ רחב יותר של כלים אופטוגנטיים. מערכת זו יכולה לשמש בקלות ברוב אינקובטורים תרבית תאים, גם אם הם אינם מכילים יציאות תיל. לדוגמה, שמרנו את מערכת ה- LED באינקובטור CO2 לח ברציפות במשך יותר מ -6 חודשים ללא ירידה בביצועים. אנו גם מסבירים כיצד לחבר את מערכת ה- LED למחשב ולממשק אותה עם תוכנת קוד פתוח שאנו מספקים ב- GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). בניית מערכת באמצעות פרוטוקול זה מספקת לחוקרים את הידע הבסיסי כדי לאתר באגים בבעיות פוטנציאליות, להחליף חלקים ולשפר/להרחיב פונקציונליות.

סקירה כללית של המערכת

בניית מערכת התאורה כוללת (1) בניית המעגל האלקטרוני, (2) בניית הציוד ההיקפי (כבל אספקת חשמל, מתג חשמל וכו'), (3) בניית נורות ה-LED, (4) הרכבת כל הרכיבים הללו, ו-(5) התקנת התוכנה לשליטה בנורות ה-LED באמצעות ממשק משתמש (איור 1A). לאחר השלמתה, מערכת התאורה יכולה לשלוט בעד ארבע נורות LED באופן עצמאי באמצעות ממשק משתמש (איור 1B). ממשק המשתמש מאפשר לכל נורית לדפוק בפרקי זמן מוגדרים ולכבות לאחר זמן מוגדר. יש גם עיכוב התחלה להתחיל תוכניות תאורה בזמן מוגדר. פוטנציומטרים (POTs) מווסתים את עוצמת כל נורית באופן עצמאי או שניתן להשתמש בהם לבקרת LED ידנית ללא מחשב. החוטים לנורות ה-LED יכולים להיות בכל אורך מותאם אישית, מה שמאפשר למקם אותם בקלות באינקובטור או בחלל מעבדה. בשל ההספק הגבוה של נורות אלה, ניתן להשתמש בהן כדי להאיר שטח גדול באמצעות נורית LED אחת מרחוק.

תיאור מנהל התקן LED

כדי להפעיל ולשלוט בעוצמת נורות ה- LED, פרוטוקול זה יעבור שלבים לבניית "מנהל התקן LED". לכל נורית LED יש טווח מתחים שבהם היא פועלת (איור 1C). במהלך הפעולה, מתח היציאה של הרגולטור, השולט על עוצמת האור, יכול להיות מכוון על ידי פוטנציומטר. ה- POT משנה את ההתנגדות ומתאים את מתח / בהירות היציאה. כוונון עם POT של 1kΩ (1 קילו-אוהם) נותן את מה שאנו מכנים "מעגל מתח גבוה" ויש לו טווח של 1.35 וולט עד 2.9 וולט. מאחר ש-2.9 וולט הוא גבוה מדי להפעלת נורות ה-LED של המתח הנמוך יותר (איור 1C), אנו מראים שינוי יחיד (נגד 3 או "R3" משלים איור 1A) שמגביל את הטווח כך שיתאים לנורות המתח הנמוך. R3 משמש להקטנת המתח המרבי המופעל על נורות ה-LED ל-1.85 וולט (הרכבה המפורטת באיור משלים 8) במקביל לפוטנציומטר. על ידי שימוש במתח כדי לשלוט בבהירות במקום בזרם, המערכת גמישה יותר עבור נורות LED עם מתחי הפעלה שונים. איור 1C מכיל רשימה של נורות LED במתח גבוה ונמוך כדי להנחות את בחירת המעגלים האופטימלית. עיצוב זה שומר על מתח מינימלי נמוך מספיק, כך שהנורית כבויה לחלוטין כאשר הפוטנציומטר כבוי ואינו מאפשר למתח לעלות מעל מתח ההפעלה האופייני של נורית ה- LED. עבור אופטוגנטיקה של PhyB, אנו משתמשים בנורות LED אדומות עמוקות ואדומות רחוקות, המשתמשות במעגל מתח נמוך.

תיאור מערכת בקרת מחשב LED

מערכת תאורת LED יכולה לשמש להארה מתמדת ללא מחשב או מיקרו-בקר. עם זאת, עבור תוכניות פועמות ולשליטה בתזמון LED בודד, יש להתקין מיקרו-בקר. כדי להשתמש במיקרו-בקר לשליטה בנורות ה-LED, נדרש טרנזיסטור כדי לחבר את המיקרו-בקר למעגל. טרנזיסטור זה חש מתח מהמיקרו-בקר ועובר מלהיות מוליך או מבודד. כדי לשלוט ב"מופעל" וב"כבוי", אנו משתמשים במה שנקרא "טרנזיסטור מסוג מיתוג NPN" (2N2222) כשאנט נשלט על פני R2 (איור משלים 1A). כאשר המתח מהמיקרו-בקר מוחל על בסיס הטרנזיסטור, הטרנזיסטור הופך למוליך והופך את מתח ה- LED לנמוך, ומכבה את ה- LED. לפיכך, מצבי LED וטרנזיסטור לסירוגין נשלטים ישירות על ידי המיקרו-בקר, הנשלט על ידי התוכנה המותקנת במחשב.

להכנת מערכת התאורה, נדרשים השלבים הבאים: בניית המעגל החשמלי; לבנות את ספק הכוח, מתג ההפעלה הידני, POTs וחיבור מיקרו-בקרים; לבנות את נורות ה- LED; להתאים קופסה שחורה שתתאים למערכת התאורה; לחבר את כל החיווט והמכשירים; להתקין את תוכנת בקרת LED, לעורר את התאים עם אור; למדוד ביטוי גנים באמצעות בדיקת לוציפראז כפולה.

Protocol

1. בנו את המעגל החשמלי

הערה: הפרוטוקול לבניית מעגל יחיד עבור נורית LED זמינה מתואר כאן. הוראות להרחבה זו עד ארבע נוריות LED כלולות במידע המשלים.

  1. הפעל את בולם העשן ואת מגהץ ההלחמה. מוסיפים מים לספוג הניגוב, החזיקו את ההלחמה בהישג יד.
    אזהרה: הקפד לנקוט באמצעי זהירות כדי להסיר עשן ולמנוע כוויות.
  2. התחל להלחם רכיבי מעגל למעגל המודפס (לוח PCB) בסדר המוצג בלוחות המשלימים.
    הערה: השתמש בכמות קטנה של הלחמה על קצה הברזל להלחמה כדי לחמם תחילה את המתכת של הרכיב ואת לוח המעגלים המודפסים ולהמיס הלחמה נוספת ישירות על הרכיבים; שטף יכול לעזור הרבה.
  3. חוטים ורכיבים של מגשר הלחמה (איור משלים 2 ואיור משלים 3).
    1. עבור חוטי המגשרים (החיווט המבודד המחבר בין שתי נקודות בלוח המעגלים), השתמש בשתי חתיכות של חוטים כתומים [7.6 מ"מ (0.3 אינץ')] וצהובים [12 מ"מ (0.4 אינץ')] מערכת המגשר.
    2. חברו את לוח המעגלים המודפסים ל"ידיים המסייעות" והכניסו את חוטי המגשרים לחורי הסיכה הבאים, כופפו את הדקים ב-45 מעלות והוסיפו שטף (איור 2, איור משלים 2 ואיור משלים 3): A1 ו-A3 → הארקה (-) (כתום), A7 → ספק כוח (+) #7 (צהוב), D2 → D6 (צהוב).
    3. הלחמה ולאחר מכן לחתוך את החלק האחורי של החוטים.
    4. הכנס וסת מתח LM317T לחורי הסיכה הבאים, כופף את הפינים והוסף שטף (איור 2 ואיור משלים 4): Adj → e5, Vהחוצה → e6, Vב -→ e7.
    5. הלחמו תחילה את הטרמינל השמאלי והימני, חתכו אותם, ואז הלחמו וחתכו את הטרמינל האמצעי.
    6. כדי להגדיר את טווח המתח הנמוך של המעגל, הכנס נגד 820 Ω כל הדרך למטה לתוך חורי סיכה, הלחמה וחתוך c2 → c5 (איור 2 ואיור משלים 5).
    7. כדי לאפשר שליטה ב-LED על-ידי המיקרו-בקר, הכנס את הטרנזיסטור לתוך b3-b5 (איור 2 ואיור משלים 6): אספן → b3, בסיס → b4, פולט → b5.
      הערה: שים לב לכיוון של הטרנזיסטור כדי להכניס כראוי; בדוק את המפרטים כדי למצוא את ייעוד האספן, הבסיס והפולט.
  4. הלחמת את מחברי חוט לחוט עבור POT, LED, מיקרו-בקר ומקור חשמל.
    הערה: שים לב לצבע החוטים של מחברי חוט לחוט ואם אתה משתמש במחבר חוט לחוט נקבה או זכר.
    1. קבע אם נדרש מעגל "מתח נמוך" או מעגל "מתח גבוה" עבור נורית ה-LED הרצויה (איור 1C).
      הערה: אם נורית ה-LED נמצאת ברשימת "מתח נמוך", נדרש נגד במקביל ל-POT.
    2. עבור מעגל "מתח נמוך" או "מתח גבוה", מקם את החוט ממחבר חוט-לחוט נשי דרך חור a5 (איור משלים 7). אין לרתך למקומו עדיין אם אתה יוצר את מעגל המתח הנמוך.
      הערה: סובב את קצוות החוט החשוף כדי ששערות התיל הקטנות לא יתקלפו. אם החוט נראה עבה מכדי לדחוף דרך חור הסיכה מבלי להישחק, חתכו 2–6 גדילים ואז סובבו אותם בחזרה זה לזה (איור משלים 7B–D).
    3. אם אתה מבצע את מעגל "המתח הגבוה", דלג לשלב 1.4.5. אם אתה יוצר את מעגל "המתח הנמוך", דחוף נגד 560Ω דרך אותו חור (a5) והלחמה עם מוליך מחבר חוט לחוט.
    4. חברו את הקצה השני של הנגד לקרקע (איור משלים 7G).
    5. הכניסו את הקצה השני של מחבר החוט-לחוט הנשי המולחם לתוך חור a5, חברו אותו לאדמה והלחמתו (איור משלים 8A,B).
    6. לחיבור המיקרו-בקר, הכניסו קצה אחד של מחבר חוט-לחוט זכר לתוך חור a4 ואת הקצה השני לתוך חור המחובר לאדמה (איור משלים 9A-C).
    7. לחיבור ה-LED, הכניסו קצה אחד של מחבר חוט-לחוט נקבה לתוך חור a2 ואת הקצה השני לתוך חור המחובר לאדמה (איור משלים 9D,E).

2. בנה ספק כוח, מתג הפעלה ידני, POT וחיבור מיקרו-בקר

  1. בנה את ספק הכוח.
    1. הלחמת מגשר כתום [7.6 מ"מ (0.3 אינץ')] מ-a29 לקרקע (איור משלים 10).
    2. הלחמת מחבר חוט-לחוט נקבה מ-a30 לספק הכוח (+) (איור משלים 11A-C).
    3. הלחמת מחבר חוט-לחוט זכר מ-c29 ל-c30 (איור משלים 11D-F).
    4. נתקו את המחבר מכבל חשמל, חשפו את החוטים והפשיטו אותם (איור משלים 12A–C).
    5. הוסיפו שטף לחוטים לפני ההלחמה באמצעות עט שטף (איור משלים 3G).
    6. הניחו צינור כיווץ בקוטר 3.18 מ"מ (1/8 אינץ') סביב מחבר חוט-לחוט זכר וחתיכה עבה יותר בקוטר 4.76 מ"מ (3/16 אינץ') מעל חוט ספק הכוח (איור משלים 12D).
    7. סובבו את החוטים מספק הכוח ואת מחבר החוט-לחוט הזכר יחד והלחמתו (איור משלים 12E, 13A,B).
    8. הניחו את צינור הכיווץ בקוטר קטן יותר בקוטר 3.18 מ"מ (1/8 אינץ') מעל החיבורים וכיווצו אותם באמצעות אקדח חום (איור משלים 13C,D).
    9. הניחו צינור כיווץ בקוטר גדול יותר 4.76 מ"מ (3/16 אינץ') מעל צינור הכיווץ הקטן יותר 3.18 מ"מ (1/8 אינץ') וחממו שוב (איור משלים 13E,F).
  2. בנה את מתג ההפעלה הידני.
    1. הניחו את צינור הכיווץ 3.18 מ"מ (1/8 אינץ') מעל החוטים של המתג (איור משלים 14A).
    2. סובבו והלחכו את החוטים של מחבר חוט-לחוט זכר (איור משלים 14B,C).
    3. הניחו את צינור הכיווץ 3.18 מ"מ (1/8 אינץ') מעל חלקים מולחמים וכווצו בעזרת אקדח חום (איור משלים 14D,E).
  3. חבר את מחבר החוט לחוט הגברי ל- POT.
    1. לולאה את החוט השחור של מחבר חוט לחוט סביב המסוף האמצעי של ה-POT (איור משלים 15B).
    2. סובבו את החוט שקשור בלולאה בחוזקה סביב הטרמינל והלחכו אותו (איור משלים 15C).
      הערה: צבת קטנה ומדויקת יכולה לסייע בטוויסט הדוק.
    3. חזור על הפעולה עם חיבור החוט האדום לטרמינל, כמו באיור משלים 15D.
    4. השתמשו בצבת כדי לשבור את לשונית המתכת ליד החץ האדום (איור משלים 15E,F).
  4. בנה את חיבור המיקרו-בקר (הכרחי רק עבור נוריות LED הנשלטות על ידי מחשב).
    1. אם אתם יוצרים מנהל התקן LED עבור יותר מנורית LED אחת, נתקו את החוטים השחורים מכל מחבר חוט לחוט מלבד נקבה אחת (איור משלים 16A).
    2. כווץ את הקצוות של מחברי חוט-לחוט, כפי שמוצג (איור משלים 16B-D).
    3. דחפו את הקצוות המכווצים דרך המחבר המלבני (איור משלים 16E).

3. בנו את נורות ה-LED

  1. הפשיטו את קצוות החוט (~5 מ"מ) והחילו שטף באמצעות עט שטף כמו באיור משלים 3G.
    הערה: כדי לרתך ביעילות את החוטים לבסיס ה-LED, יש להוסיף שטף למגעים בבסיס ה-LED ולחוטים.
  2. פח את החוט על-ידי חימום החוט מלמטה והוספת הלחמה מלמעלה (איור משלים 17B).
  3. השתמשו בעט השטף כדי למקם את השטף על מגע פני השטח של בסיס ה-LED (איור משלים 17C).
  4. הניחו כמות נדיבה של הלחמה על קצה הלחמה גדול (~4–5 מ"מ) (איור משלים 17D), השתמשו בו כדי לחמם את בסיס ה-LED במגע (איור משלים 17E). לאחר מספר שניות, גררו את ההלחמה לאורך המגע (איור משלים 17F). חזור על שלבים 3.3-3.4 במגע השני (איור משלים 17G).
    זהירות: בסיס ה-LED עלול להתחמם מאוד במהלך הלחמה. הניחו את בסיס הלד על משטח שלא יימס או יישרף.
  5. הדביקו את החוט השחור למגע "C+" (הקתודה) באמצעות קליפסי השיער (איור משלים 18A).
  6. הניחו כמות נדיבה של הלחמה על קצה ההלחמה הגדול (איור משלים 18B) ולחצו אותה על החוט עד שההלחמה בבסיס ה-LED תימס (איור משלים 18C). החזיקו את החוט (איור משלים 18D) והוציאו את מגהץ ההלחמה בזמן שאתם מחזיקים את החוט במקומו (איור משלים 18E).
  7. הניחו כמות קטנה של משחת הלחמה על הרפידות עבור חיבורי ה-LED (איור משלים 19A,B) והניחו את נורית ה-LED מעל הרפידות באמצעות מלקחיים (איור משלים 19C).
    הערה: אם המיקום הוא קצת כבוי, זה בסדר; הוא ייכנס למקומו ברגע שמשחת ההלחמה תימס.
  8. החזיקו את החוט האדום על ה-"A+" (אנודה) וחתכו אותו בעזרת קליפס לשיער (איור משלים 20A-C).
  9. הניחו כמות נדיבה של הלחמה על קצה ההלחמה הגדול (איור משלים 20D) ולחצו אותה כלפי מטה על החוט עד שההלחמה על בסיס הלד ומשחת ההלחמה מתחת לנורית ה-LED תימס (איור משלים 20E).
    הערה: לאחר משחת ההלחמה נמסה, הצבע הופך לכסף (איור משלים 20H,I).
  10. בחר את אורך החוט הדרוש להגדרה הרצויה. הפשיטו את חוטי ה-LED ומחבר חוט-לחוט זכר (איור משלים 21A) ואז הוסיפו שטף כמו באיור משלים 3G.
  11. מניחים את צינור הכיווץ מעל החוטים. השתמש בצינור כיווץ בקוטר 3.18 מ"מ (1/8 אינץ') מעל מחברי חוט-לחוט ובצינור כיווץ בקוטר 4.76 מ"מ (3/16 אינץ') מעל החוט (איור משלים 21B).
  12. חבר את מחבר חוט לחוט עם "ידיים מסייעות" וסובב את קצה המחבר עם החוט (איור משלים 21C) והלחם אותם. חזור על הפעולה עם החוט השני (איור משלים 21D,E).
  13. הניחו את צינורות הכיווץ בקוטר 3.18 מ"מ (1/8 אינץ') מעל ההלחמה וכיווצו (איור משלים 21F–G).
  14. הניחו את צינור הכיווץ בקוטר 4.76 מ"מ (3/16 אינץ') מעל צינור הכיווץ בקוטר 3.18 מ"מ (1/8 אינץ') וכיווצו (איור משלים 21H–I).
  15. חתכו את חוטי ה-LED של "הידיים המסייעות" בעזרת נייר דבק מתחתיה (איור משלים 22A).
  16. מערבבים אפוקסי בהתאם להוראות היצרן ומפזרים על החלק העליון של נורית ה-LED המולחמת (איור משלים 22B). השאירו למשך הלילה כדי לרפא.
  17. אם ההרכבה מתבצעת באמצעות מהדק מגע, חתכו חתיכה קטנה ממהדק המגע (איור משלים 23A) ולחצו אותה על גב נורית ה-LED למשך 30 שניות.
  18. השתמשו בכלי סיבובי במהירות גבוהה כדי ליצור חריץ במכסה של קופסה שחורה (איור משלים 23C–E).
  19. בנה הרכבה עבור נורית LED יחידה באמצעות סרט פרטיות.
    1. בעזרת מקדח ה-spade, קדח חור בגודל 1.75 ס"מ (11/16 אינץ') דרך החלק העליון של קופסה שחורה שבה תמוקם נורית ה-LED (איור משלים 24A).
    2. באמצעות כלי סיבובי במהירות גבוהה, צרו חריץ בצד אחד של החור כדי לפנות מקום לחוט ה-LED, כפי שמוצג באיור משלים 24A.
    3. גזרו פיסת סרט פרטיות (25–30 מ"מ) והדביקו אותה לחלק הפנימי של הקופסה השחורה המכסה את החור שדרכו תאיר נורית ה-LED (איור משלים 24A).
    4. הניחו את נורית ה-LED מחוץ לקופסה השחורה על גבי החור עם סרט פרטיות וסרט הדבקה במקומם עם סרט חשמלי (איור משלים 24B–E).

4. התאימו קופסה שחורה שתתאים למערכת התאורה

  1. עבור מערכת ארבע נורות LED, קדח ארבעה חורים בגודל 0.83 ס"מ (21/64 אינץ') על המכסה במרחק של 3.81 ס"מ (1.5 אינץ') זה מזה, שם יחוברו הפוטנציומטרים (איור משלים 25).
  2. באמצעות כלי סיבובי במהירות גבוהה, חתכו חור מלבני בגודל 1.19 ס"מ x 1.90 ס"מ (0.47 אינץ' x 0.75 אינץ') בפינה השמאלית העליונה (איור משלים 25).
  3. בעזרת מקדח השפכטל, קדח חור בגודל 1.75 ס"מ (11/16 אינץ') על הקופסה השחורה (איור משלים 26).
  4. תייק את החורים והכנס את הגרומט לתוך החור שנקדח (איור משלים 26).
  5. עבור נוריות LED נשלטות מחשב, נייר זכוכית את האזור שבו המיקרו-בקר יודבק בקופסה שחורה, כמו גם את הצד התחתון של מחזיק המיקרו-בקר.
  6. הצמידו את המיקרו-בקר למחזיק לפני שאתם מאבטחים את המחזיק בקופסה השחורה ואז הניחו אותו אפוקסי במקומו (איור משלים 27A).
  7. השתמשו בנייר זכוכית כדי לחול את החלק התחתון של שני אטבים ואת האזור בקופסה שחורה שבה ימוקם המעגל והדקו את האטבים בתוך הקופסה השחורה עם האפוקסי (איור משלים 27A).
  8. אבטחו את לוח המעגלים המודפסים לקליפסים (איור משלים 27B).
  9. דחפו את מתג ההפעלה דרך החור המרובע במכסה שנוצר באיור משלים 25 והצמידו אותו למקומו (איור משלים 28A).
  10. דחפו את ה-POTs דרך החורים במכסה, הבריגו למקומם (איור משלים 28A), והניחו את הידית על ה-POT (איור משלים 28B).

5. חבר את כל החיווט והמכשירים

  1. תייג את מחברי חוט לחוט (לדוגמה, LED, POT, COM) (איור משלים 29A).
  2. חברו את המחברים המכווצים שנוצרו בשלב 2.4 (איור משלים 16) למחבר חוט-לחוט זכר בין שני המחברים הנקביים (POT ו-LED) (איורים משלימים 7A ו-S37).
  3. חברו את הקצוות המכווצים למיקרו-בקר (איור משלים 30).
  4. משוך את כבל ה- USB דרך הגרומט וחבר אותו למיקרו-בקר.
  5. משכו את החוטים של נורות ה-LED דרך הגרומט והתחברו למחבר הנקבי של חוט-לחוט בצד שמאל של חיבור המיקרו-בקר (איורים משלימים 9D ו-38).
  6. משכו את החוט של ספק הכוח דרך הגרומט וחברו אותו למחבר הזכר-חוט בצד ימין של לוח המעגלים המודפסים (איור משלים 11D).
  7. חברו את מחבר החוט-לחוט הגברי ממתג ההפעלה למחבר הנקבי מימין ללוח המעגלים המודפסים (איור משלים 11A).
  8. חברו את מחברי החוט-לחוט הזכריים מה-POTs שעל המכסה למחברי חוט-לחוט הנקביים בלוח המעגלים המודפסים (איורים משלימים 8 ו-36).
    הערה: אין להפעיל את המעגל מבלי שהפוטנציומטרים מחוברים.

6. התקן את תוכנת בקרת ה- LED

הערה: עיין בהוראות התקנת התוכנה המפורטות בקובץ המשלים ב- Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

  1. הורד והתקן את התוכנה לתכנות המיקרו-בקר
  2. הורד והתקן את מנהל החבילות.
  3. תכנת את המיקרו-בקר.
  4. הורד והתקן את מנוע זמן הריצה.
  5. הורד את ממשק המשתמש.

7. לעורר את התאים עם אור

  1. Transfect HEK293 תאים.
    1. צלחת HEK293 תאים ב 100k תאים לכל באר בצלחת 24 באר.
    2. השתמש בטבלה לדוגמה כדי לחשב מדיה ללא סרום, פוליאתילנימין (PEI) ונפחי DNA (איור משלים 39) וטרנספקט באמצעות פרוטוקול היצרן.
  2. גירוי תאים עם אור.
    הערה: תאים חייבים להישמר בחושך לאחר טרנספקציה או לטפל באמצעות מקור אור שאינו מעורר את המערכת האופטוגנטית.
    1. החליטו איזה סוג של גירוי ישמש על התאים (אור רציף, עוצמת פעימה וכו ').
    2. כאשר ה-POTs כבויים (נגד כיוון השעון), הפעל את ספק הכוח מסוג LED.
    3. הניחו מד אור בתוך הקופסה השחורה שבה ימוקמו התאים והניחו את המכסה עם נורית ה-LED מעל המונה. כוונן את עוצמת האור לפי הצורך.
    4. אם אתה משתמש במחשב כדי לשלוט בנורות ה- LED, פתח את תוכנת ממשק המשתמש.
    5. תכנת את ממשק המשתמש (איור 5A,B).
      1. בלוח השמאלי העליון, בחר את יציאת COM עבור המיקרו-בקר ולחץ על התחבר.
      2. השתמש בלוחות בצד ימין כדי לתכנת כל נורית LED. עבור אור רציף, בחר בכל עת למעט אפס ב "זמן מופעל" ולהגדיר את "זמן כבוי" לאפס.
      3. בלוח הימני התחתון, תכנת את בקרת התזמון הראשית.
        1. כדי לעכב את התאורה, בחר השהיית התחלה (HH:MM).
        2. כדי לכבות את כל נוריות ה- LED לאחר זמן מוגדר, בחר זמן ריצה (HH:MM).
        3. התחילו את תוכנית התאורה על-ידי לחיצה על כפתור ההפעלה (איור 5A).

8. למדוד ביטוי גנים באמצעות בדיקת לוציפראז כפולה

  1. הכן מגיב luciferase על ידי ערבוב 10 מ"ל של חיץ luciferase עם מגיב luciferase ו aliquot בצינורות 1 מ"ל להיות מאוחסן ב -80 °C עד 1 שנה.
  2. הכינו חיץ ליזיס 5x לתוך 1x עבור 100 μL עבור N + 2 בארות. לדוגמה, עבור 30 דגימות, 30 x 20 μL של 5X חיץ ליזיס, ו 30 x 80 μL של MQ H2O.
  3. הכן תמיסת מצע רנילה: 20 מיקרוליטר של מצע רנילה עבור 1 מ"ל של חיץ רנילה (כמות זו מתאימה ל -10 בדיקות).
  4. מוציאים תאים מהאינקובטור, שואפים את המדיה, מוסיפים 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס 1x לכל באר ומניחים אותו על שייקר ב-100 סל"ד למשך 15 דקות.
  5. מניחים ב -20 °C למשך שעה אחת לפחות.
  6. הוסף 100 μL של מגיב luciferase לכל דגימה לתוך באר של צלחת לבנה 96 באר.
  7. הגדר את קורא הלוחות להארה. באמצעות מודול הלומינומטר של קורא הלוחות, הגדר את השילוב עבור 1 שניות.
  8. מוסיפים ליזטים מופשרים בבארות מתחת מגיב luciferase. באמצעות פיפטה רב ערוצית, לערבב 20 μL של דגימה לתוך מגיב luciferase ולמדוד luminescence מיד.
  9. לאחר רמת הקריאות יש להוסיף 100 μL של תמיסת מצע Renilla ולסרוק שוב.
  10. חלק את אות לוציפראז על ידי אות Renilla כדי להסביר את יעילות transfection.
  11. השווה אותות luciferase מנורמל עבור יעילות transfection (למשל, להשוות את האות מדגימות אור אדום מואר אור אדום רחוק).

Representative Results

לאחר הרכבת מעגל החשמל, ספק הכוח, מתג ההפעלה, ה-POTs ונורית LED (עד לאיור משלים 21), ניתן לבדוק את המעגל. עם כל POTs במקום, POT ישלוט בעוצמת LED. לאחר השלמת ההרכבה עד איור משלים 29, ניתן להשתמש במערכת באופן ידני עבור אופטוגנטיקה או יישומים אחרים. ניתן לשלוט ידנית בכל כוח המערכת באמצעות מתג ההפעלה. ניתן לשלוט בעוצמה של כל נורית LED באופן עצמאי באמצעות POT המחובר לכל מעגל.

לאחר התקנת התוכנה ותכנות המיקרו-בקר, ממשק המשתמש יכול לתקשר עם המיקרו-בקר. באמצעות ממשק המשתמש, ניתן לשלוט בנורות ה-LED באופן זמני במספר דרכים: (1) ניתן לתכנת כל נורית LED כך שתישאר דולקת למשך זמן מוגדר, (2) ניתן לתכנת כל נורית LED לפעימה, (3) ניתן לתכנת עיכוב התחלה גלובלי (למשל, בעת העברת אור והארה 24 שעות מאוחר יותר) (איור 6B), (4) הזמן הכולל שבו התוכנית תפעל לאחר ההשהיה. ישנם שני ממשקי משתמש, אחד עם לחצנים גדולים יותר שיכולים לשלוט בשתי נורות LED בכל פעם והשני שיכול לשלוט בארבע נורות LED (איור 5A,B). ממשק המשתמש של שתי נורות LED מותאם לטאבלטים ומספיק כדי לשלוט בנורות LED אדומות ואדומות לניסויים רבים.

עבור ניסויים גדולים יותר, ממשק המשתמש השני יכול לשמש כדי לשלוט עד ארבע נוריות LED. כאשר גורמים לביטוי גנים, התוצאה הצפויה תלויה במספר פרמטרים. אלה כוללים זמן אינדוקציה, רמות אינדוקציה (למשל, כמות אור או תרופה), ומספר העתק של המבנה המושרה בתא. כדי להראות זאת, הדבקנו את מתג הגן PhyB יחד עם כמויות שונות של דנ"א מדווח (pPK-202) (0.5%, 1%, 2%, 4% ו-8% מהדנ"א הנגוע) (איור 6A) והוארנו כפי שמוצג באיור 6B. בדגימות המכילות PhyB, אך ללא פלסמיד לייצור פיקוציאנובילין (כרומופור PCB) (כלומר, שאינו מגיב לאור), ביטוי / דליפה של גן לוציפראז עולה עם כמות הדנ"א המדווח (איור 6C) (P אדום רחוק < 0.0001, רגרסיה ליניארית ואחריה בדיקת Wald), (אדום P < 0.0001, רגרסיה ליניארית ואחריה מבחן Wald). נוסף על כך, כאשר כל מתג הגן PhyB, כולל כרומופור PCB המייצר פלסמיד (תאים רגישים לאור), מוארים לאור אדום רחוק, ביטוי לוציפראז גדל גם הוא ככל שכמויות המבנה של המדווח גדלות בתערובת הטרנספקציה (איור 6C,D) (אור אדום רחוק P < 0.0001, רגרסיה ליניארית ואחריה מבחן Wald). באופן דומה, כאשר התאים הרגישים לאור מוארים באור אדום, ביטוי לוציפראז גדל גם הוא עם כמות המדווח המוגברת (P < 0.0001, רגרסיה ליניארית ואחריה מבחן Wald). כאשר השווינו את רמות האינדוקציה של התאים שטופלו באור אדום לתאים שטופלו באור אדום רחוק, מצאנו ירידה קטנה בהפעלת הקיפול עם כמות מדווחת הולכת וגדלה (איור 6E) (P = 0.0141, רגרסיה ליניארית ואחריה מבחן Wald).

Figure 1
איור 1: מעגל בסיסי עבור נורית LED יחידה. (A) תרשים זרימה המציג סקירה כללית של השלבים הדרושים לבניית מערכת תאורת LED. (B) מערכת בקרת תאורת LED. (משמאל) תיבת בקרה לוויסות עוצמת LED ותזמון. (באמצע) טאבלט PC המריץ ממשק משתמש לשליטה בנורות LED. (ימין) קופסה שחורה להרכבת נורות LED והצבת תאים לגירוי אופטי. (ג) טבלה לקביעה אם נורית ה-LED דורשת מעגל מתח גבוה או נמוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הוראות להלחמת הרכיבים למקומם. (A) דוגמה להוראות מצוירות שלב אחר שלב לבניית המעגל. (ב,ג) הוראות לדוגמה עם תמונות של ההתקן המורכב. (D) הוראות לדוגמה להרכבת מספר מעגלים בו זמנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תצוגות של מערכת בקרת LED מורכבת. (A) מבט חיצוני עליון על המערכת שהורכבה. (B) מבט מבפנים על מערכת תאורת LED שהורכבה בארבע מערכות LED. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הוראות להלחמה חוזרת של נורית ה-LED אל צלעות הקירור. (A) בסיס ה-LED ותקריב של נורית LED אדומה עמוקה. (B) מיקום משחת הלחמה על בסיס ה-LED. (C) תמונה של נורית LED מולחת. חיצים אדומים מצביעים על רפידות הלחמה. לעומת אפור לפני הלחמה (A), לאחר הלחמה, ההלחמה נראית מתכתית/מבריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תוכנה לבקרת ניסויים אופטוגנטיים. (A) ממשק משתמש עם שתי נורות LED עם לחצנים גדולים לשימוש קל עם טאבלט זול. (B) ממשק משתמש בעל ארבע נוריות. שני הממשקים מאפשרים שליטה עצמאית ב-LED. עבור פעימות, נורות LED ניתן לתכנת להפעיל ולכבות עבור רוחב פולס מסוים משכי זמן מוגדרים. לפעימה יכול להיות גם עיכוב התחלה וזמן פעולה כולל שנקבע מראש. (C) טאבלט בקרת LED המורכב על אינקובטור תרביות תאים. (D) איור של מערכת הגנים PhyB כשהיא מוארת באור אדום רחוק. אור אדום רחוק שומר על הגן במצב "כבוי" או "חשוך". (E) המחשה של מערכת הגנים PhyB כשהיא מוארת באור אדום. אור אדום גורם לביטוי גנים על ידי קידום האינטראקציה בין PhyB ו- PIF3. אינטראקציה זו ממקמת את תחום הפעלת הגנים (AD) המאוחה ל-PIF3 למקדם הכטב"מים, ומפעילה את הגן המדווח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תוצאות צפויות באמצעות מערכת LED כדי לשלוט ב-PhyB. (A) פלסמיד המקודד PhyB+PIF3 שותפים דו-היברידיים (pPK-351), אנזימי סינתזה של פלסמיד המקודד פיקוציאנובילין (כרומופור PCB) (pPK-352), ופלסמיד כתב לוציפראז (pPK-202). (B) ציר הזמן של ניסויי השראה לאור עבור C-E. (C) רמות שעתוק בסיסיות (AKA דליפות) עם כמויות הולכות וגדלות של DNA של כתב. דגימות "דליפה" אינן נגועות ב-pPK-352 (כלומר, אינן מגיבות לאור), אלא מוארות באור אדום או אדום רחוק. דגימות מתג האור (LS) כוללות את כל הפלסמידים של מתג גן האור ומוארות באור אדום או אדום רחוק. (D) רמות השראת אור בתגובה לאור אדום ואור אדום רחוק. (LS-Far-Red Light הם אותם נתונים ב-C וב-D.) (E) קפל אינדוקציה של לוציפראז בתאים המוארים באור אדום/אור אדום רחוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

 לחצו כאן להורדת איורים משלימים 1-39.

איור משלים 1: מעגל דרייבר אלקטרוני עבור נורות LED מרובות. (A) תרשים המעגל עבור מערכת LED יחידה. (B) תרשים המעגל עבור מערכת ארבע נוריות.

איור משלים 2: הצבת חיבורי המעגלים. (A) הצמידו את לוח המעגלים המודפסים לידיים המסייעות שלכם. (B) מיקום מגשרי המעגל הראשי לתוך חורי הדרך בתמונה. (C) דיאגרמה של מחברי חוטים הממפים את הקואורדינטות. עבור ארבע מערכות LED, ציירו קווים המחלקים כל מעגל כפי שמוצג (קווים אנכיים שחורים). איור משלים 31–38 מתאר הרכבה של ארבעה מעגלים בו זמנית.

איור משלים 3: הלחמת החוטים על לוח המעגלים המודפסים. (A) כופפו את המגשרים כך שייצרו מגע ישיר עם לוח המעגלים המודפסים ויישארו במקומם בזמן ההלחמה. (B) מבט נוסף על החוטים המכופפים. (ג) חוטים לאחר הלחמה. (D) חוטים גזורים על לוח המעגלים המודפסים. (E) בידוד מכווץ לאחר חימום עם הלחמה. (F) הזזת הבידוד למקומו כדי לכסות את הקרקע דרך חור (חץ כחול) (G) הוספת שטף לקצה חוט או הדקים.

תרשים משלים 4: הלחמת וסת המתח למקומו. (א) מפה של קואורדינטות וסת המתח. (ב) מיקום וסת המתח. (ג) מוליכי וסת מתח כפוף. (ד) הדקי וסת מתח לאחר הלחמה.

איור משלים 5: הלחמת נגד R1 למקומו. (A) מפה של קואורדינטות נגד R1 (820Ω). (B) משיכת הנגד דרך העופרת באמצעות צבת (C) הנגד הנמשך קרוב ל-PCB. (D) הנגד המולחם קרוב ללוח המעגלים המודפסים.

תרשים משלים 6: הלחמת הטרנזיסטור למקומו. (A) מפה של קואורדינטות הטרנזיסטורים והתמצאותם. (ב) שים לב לכיוון הטרנזיסטור; התווית בדגם זה פונה לווסת המתח (LM317T). בדוק שוב את מפרט הטרנזיסטור כדי לוודא שה- "Emitter", "Base" ו- "Collector" נמצאים בחורים הנכונים. (ג) הטרנזיסטור עם הדקים מכופפים לפני ההלחמה.

איור משלים 7: הלחמת מחבר חוט-לחוט עבור הפוטנציומטר למקומו (בתוספת נגד 560Ω למעגל המתח הנמוך). (A) מפה של הקואורדינטות של מחבר חוט-לחוט (בתוספת R3-560Ω אם בונים את מעגל המתח הנמוך, מחבר חוט-לחוט ממוקם בחור שלפני הנגד). (B) מחבר חוט לחוט נקבה. (C) כדי להקל על התאמת הנגד ומחבר החוט לחוט לתוך חור המעבר, 3-5 גדילים של החוט הקלוע מכופפים. (D) חותכים את הגדילים באמצעות חותכי חוטים קרוב ככל האפשר לבידוד. (E) חוט אדום מוכנס של מחבר חוט לחוט נקבה דרך חור a5 דרך חור (עבור מעגל מתח נמוך הכנס R3 דרך אותו חור). (F) מבט מהצד התחתון של הנגד ומחבר חוט-לחוט לפני ההלחמה. (G) תמונה של נגד R3 המולחם המחובר לקרקע (F = נקבה).

איור משלים 8: הלחמת מחבר חוט לחוט עבור הפוטנציומטר לקרקע. (A) מפה של הקואורדינטות של חיבור הארקה עבור מחבר חוט לחוט פוטנציומטר. (B) מבט מלמעלה על מחבר חוט לחוט פוטנציומטר במקביל ל-R3 (F = נקבה).

איור משלים 9: הלחמת המיקרו-בקר ומחברי חוט-לחוט LED. (A) מפה של הקואורדינטות של מחבר חוט-לחוט לחיבור ה-2N222A והארקה למיקרו-בקר. (B) מחבר חוט לחוט זכר מולחם. (C) מבט מלמעלה על (B). (D) מפה של קואורדינטות מחבר חוט-לחוט הנשי לחיבור כניסת המעגל והארקה לנורית ה-LED. (E) מחבר חוט לחוט נקבה מולחם (F = נקבה, M = זכר).

איור משלים 10: הלחמת המגשר למעגל אספקת החשמל. (א) מפת הקואורדינטות של המגשר הכתום לחיבור ספק הכוח לקרקע. (B) הסוודר הכתום מולחם במקומו. (C) המבט התחתון של המגשר מולחם במקומו.

איור משלים 11: הלחמת מתג ההפעלה ומחברי חוט לחוט של מקור החשמל. (A) מפה של הקואורדינטות של מחבר חוט לחוט הנשי לחיבור מתג ההפעלה. (B) מחבר חוט לחוט הנשי המולחם במקומו. (ג) מבט נוסף על (ב). (D) מפה של הקואורדינטות של מחבר חוט לחוט זכר לחיבור מקור החשמל. (E) מחבר חוט לחוט זכר מולחם. (F) מבט נוסף על (E) (F = נקבה, M = זכר).

איור משלים 12: חיבור ספק הכוח למחבר חוט-לחוט זכר. (א) ספק הכוח שלא השתנה. (ב) ניתוק חוטי אספקת החשמל. (ג) חוטי אספקת החשמל הופשטו ועם בידוד עודף נחתכו. (D) מיקום צינור כיווץ סביב חוטי ספק כוח. צינורות המפרידים בין שני החיבורים (חיצים אדומים) וצינורות להחזקת החוטים המופרדים (חץ צהוב). (E) חוטים מפותלים המחברים את ספק הכוח למחבר חוט-לחוט הנשי.

איור משלים 13: הלחמה ובידוד של חיבור ספק הכוח למחבר חוט-לחוט זכר. (A) החיבור המולחם בין הארקת ספק הכוח לבין מחבר חוט לחוט נקבה. (B) החיבור המולחם בין המסוף החיובי של ספק הכוח לבין מחבר חוט לחוט נקבה. (C) צינור כיווץ נמשך מעל החיבורים הבודדים המולחמים (חץ אדום). (D) שני חיבורי ספק הכוח מולחמים ועם צינור כיווץ מטופל בחום. (E) מיקום צינור כיווץ על חיבורים בודדים (חץ צהוב). (ו) אספקת חשמל שהושלמה.

איור משלים 14: הלחמת מתג ההפעלה למחבר חוט-לחוט זכר. (A) מתג הפעלה עם חוטים מופשטים וצינור כיווץ הממוקם מעל החוטים (חיצים אדומים). (B) חוטים המחברים את המתג ומחבר חוט לחוט המחוברים זה לזה לפני ההלחמה. (ג) הנחת צינור הכיווץ מעל החיבורים המולחמים. (D) חיבורים המכוסים בצינור כיווץ שטופל בחום. (E) מתג הפעלה המורכב ממחבר חוט-לחוט זכר.

איור משלים 15: חיווט פוטנציומטר למחבר חוט לחוט זכר. (A) חלקי הפוטנציומטר. (B) מחבר חוט-לחוט זכר מעוות וכפוף כדי להתחבר סביב הקצה האמצעי של הפוטנציומטר. (C) מחבר חוט-לחוט זכר המסובב סביב הקצה האמצעי של הפוטנציומטר. (D) חיבורי חוט לחוט מולחמים. (E) חץ אדום המצביע על לשונית המתכת לפני ההסרה. (ו) הפוטנציומטר לאחר הסרת לשוניות מתכת.

איור משלים 16: חיווט חיבור המיקרו-בקר. (A) חוטים למחברי חוט נקבה שהופשטו ונחתכו לקראת כיווץ. (B) מיקום הכיווץ על מחבר חוט לחוט. (C) כיווץ מחבר חוט לחוט. (D) מחבר חוט לחוט מכווץ. (E) חיבור מיקרו-בקר בהרכבה מלאה.

איור משלים 17: חוטי הלחמה ו-LED על בסיס ה-LED חלק 1. (A) חומרים הדרושים לריתך ה-LED לבסיס ה-LED. (B) צביעת קצה החוט שהופשט. (C) החלת שטף על מגע בסיס ה-LED. (D) הוספת הלחמה לקצה ההלחמה הגדול לציפוי בסיס הלד. (E) מיקום הלחמה על המגע לחימום בסיס ה-LED. (F) בסיס ה-LED לאחר גרירת קצה ההלחמה על פני המגע. (ז) אותו נוהל על איש הקשר השני.

איור משלים 18: חוטי הלחמה ו-LED על בסיס ה-LED חלק 2. (A) חוט משומר שהוצמד למגע באמצעות קליפס לשיער. שים לב כי חוט שחור מולחם לקתודה "C-". (ב) תוספת של כמות נדיבה של הלחמה לקצה ההלחמה. (C) קצה ההלחמה הלוחץ כלפי מטה על החוט, וממיס את ההלחמה על בסיס הלד והחוט. (D) החזקת החוט כך שיישאר במקומו בעת הסרת מגהץ ההלחמה. (E) החזקת החוט במקומו עד להלחמה מתקשה.

איור משלים 19: חוטי הלחמה ו-LED על בסיס ה-LED חלק 3. (A) שימוש בקצה חד להנחת משחת הלחמה על בסיס ה-LED לצורך הרכבת נורית ה-LED. (B) בסיס הלד עם משחת ההלחמה במקומה. (C) מיקום ה-LED על בסיס ה-LED כך שהמגעים של בסיס ה-LED וה-LED יהיו תואמים.

איור משלים 20: חוטי הלחמה ו-LED על בסיס ה-LED חלק 4. (A) החוט השחור שעדיין מחובר למגע על-ידי קליפס השיער. (ב,ג) באמצעות קליפס שיער שני, החוט האדום מוחזק במקומו. שים לב שהחוט האדום מולחם לאנודה "A +". (ד) תוספת של כמות נדיבה של הלחמה לקצה ההלחמה. (E) קצה ההלחמה הלוחץ כלפי מטה על החוט, ממיס את ההלחמה על בסיס הלד והחוט וכן את משחת ההלחמה מתחת לנורית ה-LED. (F) קירור בסיס ה-LED החם לאחר הלחמה. (G) בסיס ה-LED עם החוטים וה-LED מולחמים. (ח,ט) חיצים אדומים מצביעים על רפידות הלחמה. לאחר ההלחמה, ההלחמה נראית מתכתית/מבריקה (בהשוואה לאפור לפני ההלחמה (איור משלים 16D)).

איור משלים 21: חיבור חוט ה-LED למחבר חוט-לחוט זכר. (A) חוטים מופשטים ומחבר חוט-לחוט זכר ליד צינור הכיווץ החתוך לשניים (1/8 אינץ' ו-3/16 אינץ'). (B) כווצו את מיקום הצינור מעל החוטים לפני ההלחמה. (C) חוטים מעוותים זה לזה לפני ההלחמה. (D) החיבור המולחם מהחוט למחבר חוט לחוט. (E) גם החוטים האדומים וגם השחורים מולחמים יחד. (F) מיקום צינור כיווץ בקוטר 1/8 אינץ' מעל החיבור המולחם. (G) צינור הכיווץ לאחר התכווצות עם אקדח החום. (H) מיקום צינור הכיווץ בקוטר 3/16 אינץ' מעל צינור הכיווץ הקטן יותר. (I) החיבור מולחם ואטום באמצעות צינור הכיווץ.

איור משלים 22: אבטחת החוטים ונורות ה-LED לבסיס ה-LED באמצעות אפוקסי. (A) שימוש באפליקטור עץ כדי להכניס אפוקסי לבסיס ה-LED. סרט מונח למטה כדי לתפוס כל אפוקסי נוטף. (B) אפוקסי מפוזר באופן שווה על פני כל פני השטח. (C) נורית ה-LED נשארת למשך הלילה כדי לרפא.

איור משלים 23: התקנת נורות LED בתוך מכסה קופסה. (A) נורית LED עם חתיכת מהדק מגע המחוברת להרכבה קלה. (B) נוריות LED בצבעים שונים המותקנות בחלק הפנימי של קופסה שחורה באמצעות מהדק מגע. (C) חריץ במכסה הקופסה השחורה שנעשה על ידי כלי סיבובי במהירות גבוהה כדי לפנות מקום לחוט ה-LED. (D) קופסה שחורה לגירוי התאים עם מחברי מגע להרכבת נורית ה-LED. (E) מיקום צלחת מרובת בארות בתוך גרסת מהדק המגע של תיבת ה-LED.

איור משלים 24: התקנת נורות LED מחוץ למכסה קופסה. (A) חור שנקדח לתוך מכסה הקופסה השחורה עם חריץ מהכלי הסיבובי המהיר כדי לפנות מקום לחוט (חץ אדום). (B) לד שהוכנס לחור עם החוט בחריץ, מוחזק במקומו באמצעות סרט חשמלי. (C) שתי פיסות נייר דבק נוספות משמשות לאבטחת נורית ה-LED. החלק האחורי של גוף הקירור חשוף כדי למקסם את חילופי החום. (D) סרט פרטיות המודבק מעל החור שבו תוצב נורית ה-LED. החץ האדום מצביע על סרט הפרטיות. (E) קופסה שחורה לגירוי התאים עם נורית המותקנת מחוץ לקופסה ועם סרט פרטיות לפיזור התאורה. (F) מיקום צלחת מרובת בארות בתוך גרסת LED + סרט פרטיות חיצונית של קופסת ה-LED.

איור משלים 25: חורי קידוח במכסה הקופסה עבור מתג ההפעלה והפוטנציומטרים. (A) שרטוט CAD עם מידות מבוארות של מכסה הקופסה. (B) מכסה הקופסה עם חורי הפוטנציומטר ומתג ההפעלה.

תרשים משלים 26: הכנת חור יציאת התיל. (A) שרטוט CAD עם מידות מבוארות. (B) תמונה של החור שנקדח עם המקדח. (C) החלקת חור היציאה באמצעות כלי סיבובי או כלי תיוק במהירות גבוהה. (ד) הנחת גרומט בחור יציאה.

תרשים משלים 27: מיקום המיקרו-בקר וה-PCB בקופסה. (A) מחזיק המיקרו-בקר (כתום) ומחזיקי PCB בתוך הקופסה. (B) המיקרו-בקר וה-PCB המאובטחים בתיבה.

תרשים משלים 28: מיקום הפוטנציומטרים ומתג ההפעלה. (A) מבט קדמי על מכסה קופסה עם מתג הפעלה וארבעה POTs. (B) מבט קדמי על מכסה הקופסה בתוספת ידיות פוטנציומטר. (C) מבט אחורי על מכסה הקופסה עם הרכיבים המחוברים.

תרשים משלים 29: מערכת בקרת LED מורכבת. (A) קופסת בקרה פתוחה עם החוטים מסומנים במדפסת תוויות ואזיקונים עם רוכסן לארגון. (B) התיבה לאחר הרכבתה המלאה עם כל POT מסומן יחד עם קוד PIN.

איור משלים 30: מיקום מחבר חוט לחוט מכווץ. (A) תמונה של מחברי חוט-לחוט מכווצים עבור מערכת מיקרו-בקר LED. (B) מיקום המחבר המכווץ ביציאות המיקרו-בקר.

תרשים משלים 31: הנחת חוטי המגשר. (A) לוח מעגלים עם הקואורדינטות של חוטי המגשר האדומים מסומנים. (B) לוח מעגלים עם הקואורדינטות של חוטי המגשר הצהובים מסומנים.

תרשים משלים 32: הנחת חוטי המגשר. לוח מעגלים המציג קואורדינטות של חוטי המגשר הצהובים.

תרשים משלים 33: הוספת וסתי המתח. וסתי המתח LM317T מתווספים למעגל עם הקואורדינטות שלהם המסומנות בדיאגרמות.

איור משלים 34: הכנסת נגדי 820Ω. נגדי R1 מתווספים למעגל עם הקואורדינטות שלהם המסומנות בדיאגרמות.

תרשים משלים 35: הכנסת הטרנזיסטורים. טרנזיסטורים 2N2222A מתווספים למעגל עם הקואורדינטות שלהם מסומנות בדיאגרמות.

איור משלים 36: הכנסת מחברי חוט לחוט ונגדים נשיים (אופציונלי) לחיבור POT. החוטים והנגדים מתווספים למעגל עם הקואורדינטות שלהם המסומנות בדיאגרמות. (A) הכנס את החוט האדום ואחריו את נגד R2 (560Ω) (עבור מעגל המתח הנמוך בלבד). (B) הכנס את הקצה השני של הנגד לתוך חור הארקה שצוין. (C) הכנס את החוטים השחורים לתוך החורים המסומנים כדי להתחבר לאדמה. הערה: R2 (560Ω) מקביל לפוטנציומטר.

איור משלים 37: הכנסת מחברי חוט-לחוט זכריים לחיבור המיקרו-בקר ולאספקת החשמל. החוטים מתווספים למעגל עם הקואורדינטות שלהם מסומנות בדיאגרמות. (A) הכנס את החוטים האדומים לתוך החורים שצוינו. (B) הכנס את החוטים השחורים לתוך החורים המסומנים.

איור משלים 38: הוספת מחברי חוט לחוט LED. (A) מחברי חוט לחוט נקבה עם קואורדינטות העופרת האדומות מודגשות. (B) מחבר חוט-לחוט נקבה עם קואורדינטות העופרת השחורות מודגשות.

איור משלים 39: הקמת ניסוי מתג גנים PhyB-PIF3. (A) טבלה לדוגמה של תערובת אב המכילה Renilla עבור הבקרה הפנימית. (B) טבלה לדוגמה להגדרת תערובת הדנ"א עבור בדיקת כתב לוציפראז כפול של ניסוי אופטוגנטי PhyB-PIF3. (C) טבלה לדוגמה להגדרת מגיב טרנספקציה PEI וחיבור התערובת לתאים (dropwise). (ד) מיקום מד האור לקביעת בהירות ה-LED.

Discussion

מערכת ה-LED המתוארת כאן שימשה במעבדה שלנו כדי לייעל, לאפיין ולעבוד עם מספר כלים אופטוגנטיים. ב- Kyriakakis et al.4, בדקנו שילובים רבים של מתגי גנים PhyB-PIF במקביל. לאחר מכן השתמשנו במערכת זו כדי לבדוק פולסים של אור בתדרים שונים כדי למדוד את הקינטיקה של מתג הגנים ואת עוצמת האור האפקטיבית. מערכת זו שימשה גם לייעול ואפיון שתי מערכות אופטוגנטיות המשתמשות באור כחול לגירוי 5,6. מכיוון שרק נורית LED אחת צריכה להיות בהירה מספיק כדי להפעיל את רוב הכלים האופטוגנטיים, רכישת מערכת עם מספר רב של נורות LED מעל כל באר אינה תמיד הכרחית. התקנה זו זולה, אמינה, קלה להגדרה מחדש, ואינה דורשת מומחיות חשמלית קודמת כדי לעקוב אחר פרוטוקול ההרכבה.

באיורים המשלימים 31–38 אנו מתארים כיצד לשלב עד ארבע נורות LED במערכת. בעוד שזה עשוי להגביל כמה ניסויים הדורשים מספר רב של תנאים מקבילים, ניתן להוסיף נורות LED נוספות על ידי החלפת ספק הכוח 9 וולט המשמש בפרוטוקול זה בספק גבוה יותר. באופן דומה, ניתן לחבר מספר נורות LED בהספק נמוך יותר במקביל לכל מעגל. בסידור אחרון זה, חלק מנורות ה- LED לא יישלטו בנפרד, אך זה יכול להיות שימושי כאשר נורות LED רבות נדרשות לכסות שטח גדול יותר. לאחר היכרות עם האלקטרוניקה של מערכת זו, ישנן דרכים רבות להתאים אותו אישית. אסטרטגיות נוספות להתאמה אישית של המערכת כוללות הצבת נורית ה-LED רחוק יותר או קרוב יותר לדגימה ותאורה באמצעות מסננים/מפזרי תאורה לתנאי תאורה הומוגניים או למניעת חימום כמו ב-(איור משלים 23) ו-Allen et al.5. תכונה בולטת נוספת בעיצוב ה- LED שלנו היא שהיא עטופה באפוקסי ויש לה מהדק מגע בגב; זה מאפשר למקם את הנורית בצורה מאובטחת בקלות כמעט בכל מקום: באינקובטורים, מיכלי דגים, כלובי בעלי חיים, קירות וכו '.

ניסויים רבים המשתמשים באופטוגנטיקה כדי לשלוט בגנים, מסלולי איתות ופעילות תאית אחרת דורשים לעתים קרובות פעימות, משתרעים על פני טווחי זמן גדולים, או צריכים להתבצע באינקובטור, ולכן דורשים אוטומציה או מניפולציה מרחוק ללא מיקרוסקופ. מערכת LED זו נבדקה ברציפות במשך מספר חודשים בתוך אינקובטור CO2 לח ללא בעיות. בנוסף, עם מערכות הפיכות כגון מערכות אופטוגנטיות PhyB, ייתכן שהנסיין יצטרך לתכנת לוחות זמנים ספציפיים להארה פועמת. בעבודה הקודמת שלנו4, השתמשנו בתוכניות פועמות כדי לבחון את דינמיקת ההפיכות של מתג PhyB-PIF3 בתאי יונקים דרך ממשק המשתמש. באמצעות המתודולוגיה המתוארת בכתב יד זה, תכנות פרוטוקול פועם הוא קל, ומספק את הגמישות והאוטונומיה הדרושות לסוגים רבים של ניסויים אופטוגנטיים באופן ידידותי למשתמש.

השלבים הקריטיים ביותר בבניית מערכת זו כוללים הרכבת המעגל החשמלי בלוח המעגלים המודפסים וחיבור הרכיבים, המפורטים בסעיף 1 ובסעיף 2. חשוב לעקוב בקפידה אחר כל שלב בסעיפים אלה ולבדוק שוב את מספרי חורי הסיכה שורה אחר שורה לפני הלחמה של כל רכיב. סעיף 2 מסביר כיצד להגדיר את הרכיבים שיחוברו למעגל. כדי שהרכיבים יתחברו בכיוון הנכון, חשוב במיוחד לוודא שהצבעים של החוטים השחורים והאדומים במחברי חוט לחוט תואמים. סביר להניח שמחדלים קטנים בשני סעיפים אלה ישפיעו על תפקוד המערכת. ואכן, השלב הראשון בפתרון בעיות בשיטה זו יהיה לבדוק שהמעגל נבנה כראוי ושכל החיבורים נמצאים במקום. שנית, בדיקת איכות ההלחמה לחיבורים רופפים והחוטים לחוטים מתלקחים שעלולים לקצר את המעגל היא בעלת חשיבות מיוחדת. צעד שלישי יהיה לוודא כי נורות LED פועלות כראוי, אשר ניתן לעשות זאת באמצעות ספק כוח או סוללה 1.5 V על ידי חיתוך שני הדקים של LED עם קליפסים תנין. שיקול קריטי נוסף הוא למנוע חימום (בעת שימוש בנורות LED בהספק גבוה) או פיזור האור להארה רחבה יותר. כדי לענות על שיקולים אלה, ניתן להתקין את נורות ה-LED מחוץ לקופסה שחורה עם "סרט פרטיות" מבפנים, כפי שמתואר באיור משלים 23 וב-Allen et al.5. בגלל הפשטות של מערכת זו, פירוק זה כדי לאמת, לשנות, לשדרג או לתקן רכיבים מודולריים אינו קשה.

גורם קריטי נוסף עבור מערכות גנים המושרות הוא לשקול כמה הפעלה נדרשת או כמה דליפה מקובלת עבור המערכת הביולוגית המבוקרת. כפי שניתן לראות באיור 6, אלה יכולים להשתנות עם כמות הדנ"א של המדווח. בנוסף, יעילות ההעברה, ולכן, מספר העותק של מבנים כתב בכל תא ישתנה. זה עשוי להיות יתרון עבור ניסויים מסוימים לעשות קו תאים עם כמות קבועה של כתב או רכיבי מתג הגן PhyB ומסך עבור שיבוטים עם טווח רצוי של ביטוי מושרה, כפי שנעשה בדרך כלל עם מערכות השראת סמים. בשל הגודל וחוסר היציבות של פלסמיד לנטיויראלי pPK-2304, יצרנו גם גרסאות פלסמיד לא לנטיויראלי של מתג PhyB בעמוד השדרה של pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) ו- pPK-352 (Addgene #157922).

על ידי בניית מערכת תאורת LED זו בעקבות פרוטוקול זה, למשתמשים יש את כל הרכיבים הדרושים לביצוע מגוון רחב של ניסויים אופטוגנטיים במבחנה ו- in vivo. בשילוב עם ההוראות לשימוש ב- PhyB-PIF3 בתאי יונקים, פרוטוקול זה יאפשר לאנשים שאינם מהנדסים וביולוגים להשתמש באופטוגנטיקה מבוססת PhyB במגוון הקשרים.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות ליינגשיאו (פיטר) וואנג, זיליאנג הואנג ומולי אלן על בדיקת גרסאות שונות של מערכת LED בזמן פיתוחה. עבודה זו נתמכה על ידי מכון קוולי למוח ונפש באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו ומכון סאלק, הקרן הלאומית למדע באמצעות מרכז NSF למדע המידע תחת מענק CCF-0939370, מענק NIH NS060847 ומענק NIH R21DC018237.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18AWG 2pin RED Black wire Amazon 15M-28AWG-2468 Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit.
https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1
1K Ohm potentiometer Amazon 52161500 2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob.
https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
20 Gauge Silicone JST Connector Amazon SIM&NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
22 AWG solid jumper wires Amazon WJW-60B-R Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length.
https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
560 ohm 1/2watt 1% tolerance Amazon a14051600ux0301 Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W.
https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN
820 ohm 1/2watt 1% tolerance Amazon TTL-A-8035-50Ea Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W).
https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor
A Male to B Male Cable (10 Feet) Amazon Part# 30-001-10B The cable that comes with the Arduino doesn't fit well in the box.
https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Ardiuino UNO equivilent Amazon Elegoo EL-CB-001 UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino.
https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1
Arduino holder Digikey X000018 Fits very snug.
https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632
Black boxes for circuits and light chambers Amazon 1591ESBK Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black.
https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Blue LED Digikey LXML-PB01-0040 LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134
Cable ties Amazon sd027 Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White).
https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Command Fridge Clips Amazon 17210CLR Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used.
https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
Cyan LED Digikey LXML-PE01-0070 LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd
Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack Amazon 03429NA Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft.
https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK
Farred LED 720nm Luxeon Star LEDs LXML-PF01 Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW
Farred LED 740nm Ushio EDC740D-1100-S5 Uses "STAR XP 3535" base
https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf
Farred LED 780nm Ushio EDC780D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf
Farred LED 810nm Ushio EDC810D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf
Farred LED 850nm Ushio EDC850D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf
Grommets Amazon Pico 6120D These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G
Hair/Alligator Clips Amazon 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs.
https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
LED base Luxeon Star LEDs LXB-RS20A Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs
https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds
LED PCB fopr Ushio LEDs Adura LED solutions STAR XP 3535 Package LED Fits many other LEDs by Ushio
http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led
Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe Amazon 1943587 Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe.
https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C
NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS Amazon B000FIDTYG These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Picture Hanging Velcro Strips Amazon PH204-16NA With these you can hang the LEDs in many places.
https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H
Power supply Amazon tb013 Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway.
https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1
Power switch Rocker Switch Amazon SIXQJZML These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011
Rectangular Connectors - for crimped wires Digikey 2183-1905-ND 6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100" (2.54mm)
https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB
Red LED Digikey LXM3-PD01 LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd
Sandpaper Amazon B002NEV6GS 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch.
https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1
Solder for soldering wires and circuit components Amazon Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY
Solder-able Breadboard for building the circuit Amazon GK1007 Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007.
https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1
Spade drill bit Amazon Irwin 88811 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit
Transistor Newark 2N2222A Can buy from many places.
http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197
Voltage regulator Newark LM317T Equivilent to NTE956.
https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC
Windows 10 tablet Amazon B08BYTT79Y Any Windows 10 PC will do.
https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1
Cell Culture Reagents
Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 ATCC ATCC CRL-1573 Common Cell line.
https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose ThermoFisher 11965−092 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118
10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin ThermoFisher 15140122 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122
White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates ThermoFisher 07-200-589 White plates are preferred. Do not use clear plates.
https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) PolySciences 24765-1 Can be replaced with another transfection reagent.
https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/
Name of Equipment
Diagonal Cutting Plier (110mm) Amazon Proskit 1PK-037S These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11
Dremil 3000 with cutting tool and grinder Amazon Dremel 3000 Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver.
https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3
Dremil cutting and grinding tool Amazon Dremel 200-1/15 Any similar Dremil will work.
https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Dremil grinding tip Amazon Dremel 84922 Silicon Carbide Grinding Stone.
https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922
EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT Amazon DS017 For removing solder/mistakes.
https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI
Helping Hand with Magnifying Glass Amazon SE MZ101B These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch
Pointed Nose Micro Pliers Amazon Hakko CHP PN-20-M Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose.
https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Small screw drivers Amazon Wiha 26197 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set
Soldering iron Amazon Yihua 939D+ Digital Soldering Station These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR
TraceTech No-Clean Flux Pen Amazon 2507-N Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL.
https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1
Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber Amazon WSA350 For soldering safety.
https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK
Wire strippers Amazon CSP-30-7 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG
IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG Amazon IWS-3220M These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klewer, L., Wu, Y. W. Light-induced dimerization approaches to control cellular processes. Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).
  2. Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms. Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).
  3. Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology. Advanced Science. 6 (1), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 1800952 (2019).
  4. Kyriakakis, P., et al. Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (2), electronic resource 706-717 (2018).
  5. Allen, M. E., et al. An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics. ACS Synthetic Biology. 8 (10), electronic resource 2359-2371 (2019).
  6. Huang, Z., et al. Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy. Science Advances. 6 (8), (2020).
  7. Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production. Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).
  8. Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2). Methods. 164-165, 81-90 (2019).
  9. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  10. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).
  11. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch. Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).
  12. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  13. Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nature Communications. 4, 1779 (2013).
  14. Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. A light-triggered protein secretion system. The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).
  15. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  16. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).
  17. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  18. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature Communications. 6, 6256 (2015).
  19. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).
  20. Gong, X., et al. An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques. Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).
  21. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  22. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  23. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  24. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).
  25. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
  26. Levskaya, A., et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).
  27. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  28. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).
  29. Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. Engineering an E. coli near-infrared light sensor. ACS Synthetic Biology. 7 (1), electronic resource 240-248 (2018).
  30. Zhang, W., et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).
  31. Lee, D., et al. Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).
  32. Kim, M. W., et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout. eLife. 6, (2017).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 167 אופטוגנטיקה PhyB פיטוכרום LOV CRY2 nMag-pMag מיקרו-בקר LED אלקטרוניקה עשה זאת בעצמך LED תאורה
בניית מערכת תאורה פשוטה ומגוונת לניסויים אופטוגנטיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kyriakakis, P., Fernandez de Cossio, … More

Kyriakakis, P., Fernandez de Cossio, L., Howard, P. W., Kouv, S., Catanho, M., Hu, V. J., Kyriakakis, R., Allen, M. E., Ma, Y., Aguilar-Rivera, M., Coleman, T. P. Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments. J. Vis. Exp. (167), e61914, doi:10.3791/61914 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter