Summary
이 프로토콜은 PhyB 및 PIF3를 사용하여 적색광 및 원적외선으로 유전자 발현을 제어하기 위한 광유전학적 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 간단하고 유연한 조명 시스템을 구축하기 위한 단계별 지침이 포함되어 있어 컴퓨터로 유전자 발현 또는 기타 광유전학을 제어할 수 있습니다.
Abstract
빛을 사용하여 생물학적 과정을 제어하면 연구자가 많은 생물학적 과정을 조작 할 수있는 정확성과 속도가 향상되었습니다. 광학 제어는 전례없는 기능 해부 능력을 허용하고 새로운 유전 요법을 가능하게 할 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 광유전학 실험에는 공간적, 시간적 또는 강도 조절이 가능한 적절한 광원이 필요하며 종종 연구자에게 병목 현상이 발생합니다. 여기에서는 사용 가능한 다양한 광유전 도구에 대해 쉽게 사용자 정의할 수 있는 저비용 다목적 LED 조명 시스템을 구축하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 시스템은 조정 가능한 LED 강도로 수동 또는 컴퓨터 제어를 위해 구성할 수 있습니다. 회로를 구축하고, 컴퓨터로 제어하고, LED를 구성하기 위한 그림이 포함된 단계별 가이드를 제공합니다. 이 장치의 조립을 용이하게 하기 위해 몇 가지 기본 납땜 기술에 대해 논의하고 LED를 제어하는 데 사용되는 회로에 대해서도 설명합니다. 오픈 소스 사용자 인터페이스를 사용하여 사용자는 개인용 컴퓨터(PC) 또는 저렴한 태블릿에서 정확한 타이밍과 빛의 펄스를 자동화할 수 있습니다. 이 자동화를 통해 시스템은 LED를 사용하여 유전자, 신호 경로 및 대규모 규모에 걸친 기타 세포 활동을 제어하는 실험에 유용합니다. 이 프로토콜의 경우 필요한 모든 부품을 제작하거나 조명 시스템을 사용하여 광유전학 실험을 수행하는 데 전자 공학에 대한 사전 전문 지식이 필요하지 않습니다.
Introduction
광유전학적 도구가 보편화되고 있으며 유전자 발현, 세포 신호 전달 등과 같은 생물학적 과정을 광학적으로 제어하기 위한 새로운 기술이 지속적으로 개발되고 있습니다1,2,3. 빛으로 세포 과정을 제어하는 능력은 빠른 동역학, 엄격한 공간 제어 및 광도 및 노출 시간으로 제어할 수 있는 용량 의존적 조절을 허용합니다. 이러한 도구를 사용하려면 이러한 매개 변수를 제어하는 장치가 필요합니다. 우리는 최근에 적색광/원적외선을 사용하여 유전자를 가역적으로 활성화 및 비활성화하는 유전적으로 암호화된 PhyB-PIF3 포유동물 유전자 스위치를 개발했습니다.4. 이 시스템은 여러 포유류 세포주에서 테스트되었으며 빛의 펄스를 포함하여 매우 적은 양의 빛으로도 유전자 발현의 비할 데 없는 유도를 가능하게 했습니다. PhyB 스위치 및 유사한 도구(5,6)를 사용하기를 원하는 연구원들은 조명 강도 및 지속시간을 제어하는 방법에 대한 정보를 자주 요청한다. 따라서 우리는 광유전학을 위한 이러한 도구의 광범위한 채택을 가능하게 하기 위해 단계별 지침과 함께 이 프로토콜을 개발했습니다.
LED가 널리 사용되기 전에는 필터가있는 광대역 광원을 사용하여 피토크롬7과 같은 광 반응 단백질을 연구했습니다. 최근 일부 LED 조명 시스템은 광유전학 도구8,9,10,11,12와 함께 발표되었지만 이러한 프로토콜은 전자/소프트웨어에 대한 상당한 전문 지식이 필요하거나 특수 장비(예: 3D 프린터, 레이저 절단기 또는 포토마스크)가 필요하거나 일부 연구자가 연구 요구 사항을 위해 배포해야 하는 단계별 지침을 제공하지 않을 수 있습니다. 멀티웰 플레이트에서 개별 웰을 독립적으로 제어하는 것이 유용할 수 있지만, 연구자가 빛과 어둠 또는 적색광과 원적외선에서 여러 다른 샘플만 비교하면 되는 경우에는 종종 필요하지 않습니다. 또한 기존의 많은 상용 시스템은 비용이 많이 들고 사용자 정의 기능이 제한됩니다. 그러나 이 프로토콜에 설명된 LED는 비용 효율적이고 밝으며 다양한 방법으로 실장할 수 있습니다. 따라서 여러 가지 유형의 샘플을 조명하는 데 사용할 수 있습니다. 제공된 프로토콜 및 소프트웨어를 통해 자외선(UV)에서 NIR에 이르는 LED를 소프트웨어와 함께 사용 및 제어하여 UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV 도메인 17,18, 스텝 펑션 옵신 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24를 사용하여 광유전학적 실험을 수행할 수 있습니다. ,25, 박테리아 피토크롬26,27,28,29 및 기타 빛에 반응하는 시스템 30,31,32.
이 프로토콜은 광유전학적 실험을 실행하기 위한 분자/세포 도구뿐만 아니라 광 자극을 위한 다양한 매개변수를 제어하는 데 필요한 회로 및 기타 하드웨어의 조립에 대한 자습서를 구성합니다. 또한, 우리는 Kyriakakis et al.4 에서 최적화된 플라스미드가 클로닝을 위해 더 작고 더 안정적이라고 보고합니다. 이 프로토콜을 통해 전자 및 광학에 대한 전문 지식이 없는 생물학자도 유연하고 견고한 조명 시스템을 구축할 수 있습니다. 단계별로 LED 시스템을 구축하는 방법을 보여 주며 광유전 도구의 광범위한 채택을위한 기술적 병목 현상을 제거합니다. 이 시스템은 와이어 포트가 없는 경우에도 대부분의 세포 배양 인큐베이터에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 성능 저하없이 6 개월 이상 가습 된 CO2 인큐베이터에 LED 시스템을 지속적으로 보관했습니다. 또한 LED 시스템을 컴퓨터에 연결하고 GitHub(https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces)에서 제공하는 오픈 소스 소프트웨어와 인터페이스하는 방법도 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 시스템을 구축하면 연구원에게 잠재적인 문제를 디버깅하고, 부품을 교체하고, 기능을 개선/확장할 수 있는 기본 지식을 제공합니다.
시스템 개요
조명 시스템 구축에는 (1) 전자 회로 구축, (2) 주변 장치(전원 공급 코드, 전원 스위치 등) 구축, (3) LED 구축, (4) 이러한 모든 구성 요소 조립 및 (5) 사용자 인터페이스로 LED를 제어하는 소프트웨어 설치가 포함됩니다(그림 1A). 완료되면 조명 시스템은 사용자 인터페이스를 통해 최대 4개의 LED를 독립적으로 제어할 수 있습니다(그림 1B). 사용자 인터페이스를 통해 각 LED는 지정된 시간 간격으로 펄스하고 지정된 시간 후에 차단할 수 있습니다. 지정된 시간에 조명 프로그램을 시작하기 위한 시작 지연도 있습니다. 전위차계(POT)는 각 LED의 강도를 독립적으로 조절하거나 컴퓨터 없이 수동 LED 제어에 사용할 수 있습니다. LED에 대한 전선은 맞춤형 길이일 수 있으므로 인큐베이터 또는 실험실 공간에 쉽게 배치할 수 있습니다. 이러한 LED의 높은 전력으로 인해 멀리서 단일 LED로 넓은 영역을 비추는 데 사용할 수 있습니다.
LED 드라이버 설명
LED의 강도에 전원을 공급하고 제어하기 위해 이 프로토콜은 "LED 드라이버"를 구축하는 단계를 거칩니다. 각 LED에는 작동하는 전압 범위가 있습니다(그림 1C). 작동 중에 광도를 제어하는 레귤레이터의 출력 전압은 전위차계로 조정할 수 있습니다. POT는 저항을 변경하여 출력 전압/밝기를 조정합니다. 1kΩ(1킬로옴) POT로 튜닝하면 "고전압 회로"라고 하는 것이 제공되며 범위는 1.35V에서 2.9V입니다. 2.9V는 저전압 LED를 작동하기에는 너무 높기 때문에(그림 1C) 저전압 LED와 일치하도록 범위를 제한하는 단일 수정(저항기 3 또는 "R3" 보충 그림 1A)을 보여줍니다. R3은 전위차계와 병렬로 연결할 때 LED에 적용되는 최대 전압을 1.85V( 추가 그림 8에 자세히 설명되어 있음)로 낮추는 역할을 합니다. 전류 대신 전압을 사용하여 밝기를 제어함으로써 시스템은 작동 전압이 다른 LED에 대해 더 유연합니다. 그림 1C 에는 최적의 회로 선택을 안내하는 고전압 및 저전압 LED 목록이 포함되어 있습니다. 이 설계는 전위차계가 꺼져 있을 때 LED가 완전히 꺼지고 전압이 LED의 일반적인 작동 전압 이상으로 올라가지 않도록 최소 전압을 충분히 낮게 유지합니다. PhyB 광유전학의 경우, 우리는 저전압 회로를 사용하는 진한 적색 및 원적색 LED를 사용한다.
LED 컴퓨터 제어 시스템 설명
LED 조명 시스템은 컴퓨터나 마이크로 컨트롤러 없이 일정한 조명에 사용할 수 있습니다. 그러나 프로그램 펄스 및 개별 LED 타이밍 제어를 위해서는 마이크로 컨트롤러를 설치해야 합니다. 마이크로 컨트롤러를 사용하여 LED를 제어하려면 마이크로 컨트롤러를 회로에 연결하기 위해 트랜지스터가 필요합니다. 이 트랜지스터는 마이크로 컨트롤러의 전압을 감지하고 전도성 또는 절연성으로부터 전환합니다. "켜짐" 및 "꺼짐"을 제어하기 위해 R2에서 제어 가능한 션트로 "NPN 스위칭 유형 트랜지스터"(2N2222)를 사용합니다(보충 그림 1A). 마이크로 컨트롤러의 전압이 트랜지스터베이스에 적용되면 트랜지스터가 전도성이되어 LED 전압을 낮게 만들어 LED를 끕니다. 따라서 LED 및 트랜지스터 켜기 및 끄기 상태는 PC에 설치된 소프트웨어에 의해 제어되는 마이크로 컨트롤러에 의해 직접 제어됩니다.
조명 시스템을 만들려면 다음 단계가 필요합니다. 전기 회로를 구축하십시오. 전원 공급 장치, 수동 전원 스위치, POT 및 마이크로 컨트롤러 연결을 구축합니다. LED를 구축하십시오. 조명 시스템에 맞는 블랙 박스를 수용하고; 모든 배선과 장치를 연결하십시오. LED 제어 소프트웨어를 설치하고 빛으로 세포를 자극하십시오. 이중 루시퍼라아제 분석을 사용하여 유전자 발현을 측정합니다.
Protocol
1. 전기 회로 구축
알림: 사용 가능한 LED에 대한 단일 회로를 구축하기 위한 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 최대 4개의 LED를 확장하는 지침은 추가 정보에 포함되어 있습니다.
- 연기 흡수기와 납땜 인두를 켭니다. 닦는 스폰지에 물을 넣고 땜납을 준비하십시오.
주의 : 연기를 제거하고 화상을 방지하기 위해 안전 예방 조치를 취하십시오. - 회로 구성 요소를 인쇄 회로 기판(PCB 보드)에 보충 패널에 표시된 순서대로 납땜하기 시작합니다.
알림: 납땜 인두 팁에 소량의 땜납을 사용하여 구성 요소와 PCB 보드의 금속을 먼저 가열하고 추가 땜납을 구성 요소에 직접 녹입니다. 플럭스는 많은 도움이 될 수 있습니다. - 납땜 점퍼 와이어 및 구성 요소(보충 그림 2 및 보충 그림 3).
- 점퍼 와이어(회로 기판의 두 지점을 연결하는 절연 배선)의 경우 점퍼 키트에서 주황색[7.6mm(0.3인치)] 및 노란색[12mm(0.4인치)] 와이어 두 개를 사용합니다.
- PCB 보드를 "도움의 손길"에 끼우고 점퍼 와이어를 다음 핀홀에 삽입하고 단자를 45도 구부린 다음 플럭스를 추가합니다(그림 2, 보충 그림 2 및 보충 그림 3): a1 및 a3 → 접지(-)(주황색), a7 → 전원 공급 장치(+) #7(노란색), d2 → d6(노란색).
- 납땜 한 다음 전선 뒷면을 다듬습니다.
- LM317T 전압 조정기를 다음 핀홀에 삽입하고 핀을 구부린 다음 플럭스를 추가합니다(그림 2 및 보조 그림 4): 조정 → e5, V출력 → e6, V 입력 → e7.
- 왼쪽 및 오른쪽 단자를 먼저 납땜하고 다듬은 다음 중간 단자를 납땜하고 다듬습니다.
- 회로의 저전압 범위를 설정하려면 820 Ω 저항기를 핀홀, 납땜 및 트림 c2 → c5에 끝까지 삽입합니다(그림 2 및 보충 그림 5).
- 마이크로 컨트롤러로 LED 제어를 활성화하려면 트랜지스터를 b3–b5(그림 2 및 보충 그림 6)에 삽입합니다(컬렉터 → b3, 베이스 → b4, 이미터 → b5).
알림: 올바르게 삽입하려면 트랜지스터의 방향에 유의하십시오. 스펙을 확인하여 컬렉터, 베이스, 이미터 지정을 찾습니다.
- POT, LED, 마이크로 컨트롤러 및 전원용 전선 간 커넥터를 납땜합니다.
알림: 전선 간 커넥터의 전선 색상과 암 또는 수 전선 간 커넥터를 사용하는지 여부에 주의하십시오.- 원하는 LED에 "저전압" 회로가 필요한지 또는 "고전압" 회로가 필요한지 확인합니다(그림 1C).
알림: LED가 "저전압" 목록에 있는 경우 POT와 병렬로 연결된 저항이 필요합니다. - "저전압" 또는 "고전압" 회로의 경우 암 전선 간 커넥터의 전선을 구멍 a5를 통해 배치합니다(보충 그림 7). 저전압 회로를 만드는 경우 아직 제자리에 납땜하지 마십시오.
알림: 작은 와이어 머리카락이 벗겨지지 않도록 노출된 와이어 끝을 비틀십시오. 와이어가 너무 두꺼워서 닳지 않고 핀홀을 통과할 수 없는 것 같으면 2-6가닥을 자른 다음 다시 함께 비틀십시오(보충 그림 7B-D). - "고전압" 회로를 만드는 경우 1.4.5단계로 건너뜁니다. "저전압" 회로를 만드는 경우 동일한 구멍(a5)을 통해 560Ω 저항을 밀어 넣고 전선 간 커넥터 리드로 납땜하십시오.
- 저항의 다른 쪽 끝을 접지에 연결합니다(보충 그림 7G).
- 납땜된 암 전선 간 커넥터의 다른 쪽 끝을 접지에 연결하는 a5 구멍에 삽입하고 납땜합니다(보충 그림 8A,B).
- 마이크로 컨트롤러 연결의 경우 수 전선 간 커넥터의 한쪽 끝을 구멍 a4에 삽입하고 다른 쪽 끝을 접지에 연결된 구멍에 삽입합니다(보충 그림 9A–C).
- LED 연결의 경우 암 전선 간 커넥터의 한쪽 끝을 구멍 a2에 삽입하고 다른 쪽 끝을 접지에 연결된 구멍에 삽입합니다(보충 그림 9D,E).
- 원하는 LED에 "저전압" 회로가 필요한지 또는 "고전압" 회로가 필요한지 확인합니다(그림 1C).
2. 전원 공급 장치, 수동 전원 스위치, POT 및 마이크로 컨트롤러 연결 구축
- 전원 공급 장치를 구축합니다.
- 주황색[7.6mm(0.3인치)] 점퍼를 a29에서 지면에 납땜합니다(보충 그림 10).
- 암 전선 간 커넥터를 a30에서 전원 공급 장치(+)에 납땜합니다(보충 그림 11A–C).
- 수 전선 간 커넥터를 c29에서 c30으로 납땜합니다(보충 그림 11D–F).
- 전원 공급 장치 코드에서 커넥터를 자르고 전선을 노출시킨 다음 벗겨냅니다(보충 그림 12A–C).
- 플럭스 펜을 사용하여 납땜하기 전에 와이어에 플럭스를 추가하십시오(보충 그림 3G).
- 수 전선 간 커넥터 주위에 3.18mm(1/8인치) 수축 튜브를 놓고 전원 공급 장치 와이어 위에 두꺼운 조각 4.76mm(3/16인치)를 놓습니다(보충 그림 12D).
- 전원 공급 장치와 수 전선 간 커넥터의 전선을 함께 꼬고 납땜합니다(보충 그림 12E, 13A, B).
- 더 작은 직경의 수축 튜브를 연결부 위에 3.18mm(1/8인치)로 놓고 히트 건으로 축소합니다(보충 그림 13C,D).
- 더 작은 수축 튜브 4.76mm(3/16인치) 위에 더 큰 직경의 수축 튜브 3.18mm(1/8인치)를 놓고 다시 가열합니다(보충 그림 13E, F).
- 수동 전원 스위치를 만듭니다.
- 수축 튜브를 스위치용 와이어 위에 3.18mm(1/8인치) 놓습니다(보충 그림 14A).
- 수 전선 간 커넥터의 전선을 꼬고 납땜합니다(보충 그림 14B,C).
- 납땜 섹션 위에 수축 튜브를 3.18mm(1/8인치)로 놓고 히트 건으로 수축합니다(보충 그림 14D,E).
- 수 전선 간 커넥터를 POT에 연결합니다.
- 전선 간 커넥터의 검은색 선을 POT의 중간 단자에 감습니다(보충 그림 15B).
- 단자 주위에 단단히 감겨 있는 와이어를 꼬아 납땜합니다(보충 그림 15C).
알림: 소형 정밀 플라이어는 단단한 비틀림을 도울 수 있습니다. - 보충 그림 15D와 같이 단자에 빨간색 와이어 연결을 반복합니다.
- 플라이어를 사용하여 빨간색 화살표 근처의 금속 탭을 끊습니다(보충 그림 15E,F).
- 마이크로 컨트롤러 연결을 구축합니다(컴퓨터 제어 LED에만 필요).
- 둘 이상의 LED용 LED 드라이버를 만드는 경우 하나의 암 전선 간 커넥터를 제외한 모든 커넥터에서 검은색 전선을 차단합니다(보충 그림 16A).
- 그림과 같이 전선 간 커넥터의 끝을 압착합니다(보충 그림 16B–D).
- 직사각형 커넥터를 통해 압착된 끝을 밀어 넣습니다(보충 그림 16E).
3. LED 구축
- 와이어 끝(~5mm)을 벗기고 보충 그림 3G와 같이 플럭스 펜을 사용하여 플럭스를 적용합니다.
알림: 전선을 LED 베이스에 효율적으로 납땜하려면 LED 베이스와 전선의 접점에 플럭스를 추가해야 합니다. - 아래에서 와이어를 가열하고 상단에서 땜납을 추가하여 와이어를 주석 처리합니다(보충 그림 17B).
- 플럭스 펜을 사용하여 LED 베이스의 표면 접점에 플럭스를 배치합니다(보충 그림 17C).
- 큰 납땜 팁(~4–5mm)에 충분한 양의 납땜을 놓고(보충 그림 17D), 이를 사용하여 접점에서 LED 베이스를 가열합니다(보충 그림 17E). 몇 초 후 접점을 가로질러 납땜을 땜납합니다(보충 그림 17F). 다른 접점에 대해 3.3–3.4단계를 반복합니다(보충 그림 17G).
주의 : 납땜 중에 LED 받침대가 매우 뜨거워 질 수 있습니다. 녹거나 타지 않는 표면에 LED 베이스를 놓습니다. - 헤어 클립을 사용하여 접점 "C+"(음극)에 검은색 와이어를 클립합니다(보충 그림 18A).
- 큰 납땜 팁(보충 그림 18B)에 충분한 양의 납땜을 놓고 LED 베이스의 납땜이 녹을 때까지 와이어를 아래로 누릅니다(보충 그림 18C). 와이어를 누른 채(보충 그림 18D) 와이어를 제자리에 고정한 상태에서 납땜 인두를 제거합니다(보충 그림 18E).
- LED 연결을 위해 패드에 소량의 솔더 페이스트를 놓고(보충 그림 19A,B) 집게를 사용하여 패드 위에 LED를 놓습니다(보충 그림 19C).
알림: 배치가 약간 어긋나면 괜찮습니다. 솔더 페이스트가 녹으면 제자리에 들어갑니다. - "A+"(양극)의 빨간색 선을 잡고 헤어 클립으로 클립합니다(보충 그림 20A–C).
- 큰 납땜 팁(보충 그림 20D)에 충분한 양의 납땜을 놓고 LED 베이스의 납땜과 LED 아래의 납땜 페이스트가 녹을 때까지 와이어에 누릅니다(보충 그림 20E).
참고: 솔더 페이스트가 녹은 후 색상은 은색이 됩니다(보충 그림 20H, I). - 원하는 설정에 필요한 와이어 길이를 선택합니다. LED 전선과 수전선 간 커넥터(보충 그림 21A)를 벗긴 다음 보충 그림 3G와 같이 플럭스를 추가합니다.
- 와이어 위에 수축 튜브를 놓습니다. 전선 간 커넥터 위에 3.18mm(1/8인치) 수축 튜브를 사용하고 전선 위에 4.76mm(3/16인치) 수축 튜브를 사용합니다(보충 그림 21B).
- 전선 간 커넥터를 "도움의 손길"로 자르고 전선으로 커넥터 끝을 비틀고(보충 그림 21C) 납땜합니다. 다른 와이어로 반복합니다(보충 그림 21D,E).
- 3.18mm(1/8인치) 수축 튜브를 납땜 위에 놓고 수축합니다(보충 그림 21F–G).
- 4.76mm(3/16인치) 수축 튜브를 3.18mm(1/8인치) 수축 튜브 위에 놓고 수축합니다(보충 그림 21H–I).
- LED 전선 아래에 테이프로 "도움의 손길"을 끼웁니다(보충 그림 22A).
- 제조업체의 지침에 따라 에폭시를 혼합하고 납땜된 LED 상단에 펴 바릅니다(보충 그림 22B). 치료를 위해 밤새 방치하십시오.
- 터치 패스너를 사용하여 장착하는 경우 터치 패스너의 작은 조각(보충 그림 23A)을 자르고 LED 뒷면에 30초 동안 누릅니다.
- 고속 회전 도구를 사용하여 블랙 박스 뚜껑에 노치를 만듭니다(보충 그림 23C–E).
- 프라이버시 필름을 통해 단일 LED용 마운팅을 구축합니다.
- 스페이드 드릴 비트를 사용하여 LED가 배치될 블랙박스 상단에 1.75cm(11/16인치) 구멍을 뚫습니다(보충 그림 24A).
- 고속 회전 도구를 사용하여 구멍의 한쪽에 노치를 만들어 보조 그림 24A와 같이 LED 와이어를 위한 공간을 만듭니다.
- 프라이버시 필름(25–30mm) 조각을 자르고 LED가 비출 구멍을 덮는 블랙박스 내부에 테이프를 붙입니다(보충 그림 24A).
- 블랙박스 외부의 LED를 프라이버시 필름으로 구멍 위에 놓고 테이프를 전기 테이프로 제자리에 놓습니다(보충 그림 24B–E).
4. 조명 시스템에 맞는 블랙 박스 수용
- 4개의 LED 시스템의 경우 전위차계를 부착할 3.81cm(1.5인치) 간격으로 뚜껑에 0.83cm(21/64인치) 구멍 4개를 뚫습니다(보충 그림 25).
- 고속 회전 도구를 사용하여 왼쪽 상단 모서리에 1.19cm x 1.90cm(0.47인치 x 0.75인치) 직사각형 구멍을 자릅니다(보충 그림 25).
- 스페이드 드릴 비트를 사용하여 블랙박스에 1.75cm(11/16인치) 구멍을 뚫습니다(보충 그림 26).
- 구멍을 정리하고 그로밋을 드릴링된 구멍에 삽입합니다(보충 그림 26).
- 컴퓨터 제어 LED의 경우 마이크로 컨트롤러가 블랙 박스에 접착 될 영역과 마이크로 컨트롤러 홀더의 바닥면을 사포질합니다.
- 홀더를 블랙 박스에 고정하기 전에 마이크로 컨트롤러를 홀더에 끼운 다음 에폭시를 제자리에 고정합니다(보충 그림 27A).
- 사포를 사용하여 두 클립의 바닥과 회로가 배치 될 블랙 박스의 영역을 샌딩하고 에폭시로 블랙 박스 내부의 클립을 고정합니다 (보충 그림 27A).
- PCB 보드를 클립에 고정합니다(보충 그림 27B).
- 보조 그림 25에서 만든 덮개의 사각형 구멍을 통해 전원 스위치를 누르고 제자리에 끼웁니다(보충 그림 28A).
- 뚜껑의 구멍을 통해 POT를 밀고 나사로 고정하고(보충 그림 28A) 손잡이를 POT에 놓습니다(보충 그림 28B).
5. 모든 배선 및 장치 연결
- 전선 간 커넥터(예: LED, POT, COM)에 레이블을 지정합니다(보충 그림 29A).
- 2.4단계에서 만든 압착된 커넥터(보충 그림 16)를 두 개의 암 커넥터(POT 및 LED) 사이의 수 전선 간 커넥터에 연결합니다(보충 그림 7A 및 S37).
- 압착된 끝을 마이크로 컨트롤러에 연결합니다(보충 그림 30).
- 그로밋을 통해 USB 케이블을 당겨 마이크로 컨트롤러에 연결합니다.
- 그로밋을 통해 LED용 전선을 당기고 마이크로 컨트롤러 연결의 왼쪽에 있는 암 전선 간 커넥터에 연결합니다(보충 그림 9D 및 38).
- 그로밋을 통해 전원 공급 장치의 와이어를 당겨 PCB 보드의 오른쪽에 있는 수 와이어-와이어 커넥터에 연결합니다(보충 그림 11D).
- 수 전선 간 커넥터를 전원 스위치에서 PCB 보드 오른쪽에 있는 암 전선 간 커넥터에 연결합니다(보충 그림 11A).
- 덮개의 POT에서 PCB 보드의 암 전선 간 커넥터로 수 전선 간 커넥터를 연결합니다(보충 그림 8 및 36).
알림: 전위차계가 연결되지 않은 상태에서 회로를 켜지 마십시오.
6. LED 제어 소프트웨어 설치
참고: Github의 보충 파일에서 자세한 소프트웨어 설치 지침을 참조하십시오. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces
- 마이크로 컨트롤러 프로그래밍을 위한 소프트웨어 다운로드 및 설치
- 패키지 관리자를 다운로드하여 설치합니다.
- 마이크로 컨트롤러를 프로그래밍합니다.
- 런타임 엔진을 다운로드하여 설치합니다.
- 사용자 인터페이스를 다운로드합니다.
7. 빛으로 세포를 자극하십시오
- HEK293 세포를 형질주입합니다.
- HEK293 세포를 24-웰 플레이트에서 웰당 100k 세포로 플레이트한다.
- 예제 표를 사용하여 무혈청 배지, 폴리에틸렌이민(PEI) 및 DNA 부피(보충 그림 39)를 계산하고 제조업체의 프로토콜을 사용하여 형질주입합니다.
- 빛으로 세포를 자극합니다.
참고: 세포는 형질주입 후 어둠 속에 보관하거나 광유전학을 자극하지 않는 광원을 사용하여 처리해야 합니다.- 세포에 어떤 유형의 자극을 사용할 것인지 결정하십시오 (연속 빛, 맥동 강도 등).
- POT를 끈 상태에서(시계 반대 방향) LED 전원 공급 장치를 켭니다.
- 셀을 놓을 블랙 박스 안에 라이트 미터를 놓고 LED가있는 뚜껑을 미터 위에 놓습니다. 필요에 따라 광도를 조정합니다.
- 컴퓨터를 사용하여 LED를 제어하는 경우 사용자 인터페이스 소프트웨어를 엽니다.
- 사용자 인터페이스를 프로그래밍합니다(그림 5A, B).
- 왼쪽 상단 패널에서 마이크로 컨트롤러의 COM 포트를 선택하고 연결을 클릭합니다.
- 오른쪽 패널을 사용하여 각 LED를 프로그래밍합니다. 연속 조명의 경우 "Time On"에서 0을 제외한 시간을 선택하고 "Time Off"를 0으로 설정합니다.
- 오른쪽 하단 패널에서 기본 타이밍 컨트롤을 프로그래밍합니다.
- 조명을 지연하려면 시작 지연(HH:MM)을 선택합니다.
- 지정된 시간 후에 모든 LED를 끄려면 런타임(HH:MM)을 선택합니다.
- 실행 단추를 클릭하여 조명 프로그램을 시작합니다(그림 5A).
8. 이중 루시퍼라아제 분석을 사용한 유전자 발현 측정
- 1mL 튜브에 10mL의 루시퍼라아제 완충액과 루시퍼라아제 시약 및 분취액을 혼합하여 루시퍼라아제 시약을 준비하여 -80°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
- 용해 완충액 5x를 N + 2 웰에 대해 100 μL에 대해 1x로 준비합니다. 예를 들어, 30개의 샘플에 대해, 30 x 20 μL의 5X 용해 완충액, 및 30 x 80 μL의 MQH2O.
- Renilla 기질 용액 준비 : 1mL의 Renilla 완충액에 대해 20μL의 Renilla 기질 (이 양은 10 개의 분석에 적합 함).
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 배지를 흡인하고 웰당 1x 용해 버퍼 100μL를 추가하고 100RPM의 셰이커에 15분 동안 놓습니다.
- -20°C에서 최소 1시간 동안 두십시오.
- 샘플당 100μL의 루시페라아제 시약을 흰색 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다.
- 발광을 위해 플레이트 리더를 설정합니다. 플레이트 리더의 광도계 모듈을 사용하여 통합을 1 초 동안 설정합니다.
- 루시페라아제 시약 아래의 웰에 해동된 용해물을 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 20μL의 샘플을 루시퍼라아제 시약에 혼합하고 발광을 즉시 측정합니다.
- 판독 고원 후 100μL의 Renilla 기질 용액을 추가하고 다시 스캔합니다.
- 루시페라아제 신호를 Renilla 신호로 나누어 형질감염 효율을 설명합니다.
- 형질주입 효율에 대해 정규화된 루시퍼라아제 신호를 비교한다(예를 들어, 적색광 조명된 샘플과 원적색광 조명된 샘플로부터의 신호 비교).
Representative Results
전원 회로, 전원 공급 장치, 전원 스위치, POT 및 LED가 조립되면( 보충 그림 21까지) 회로를 테스트할 수 있습니다. 모든 POT가 제자리에 있으면 POT가 LED 강도를 제어합니다. 보충 그림 29까지 조립이 완료되면 시스템을 광유전학 또는 기타 응용 분야에 수동으로 사용할 수 있습니다. 전체 시스템 전원은 전원 스위치로 수동으로 제어할 수 있습니다. 각 LED의 강도는 각 회로에 연결된 POT를 사용하여 독립적으로 제어할 수 있습니다.
소프트웨어를 설치하고 마이크로 컨트롤러를 프로그래밍한 후 사용자 인터페이스는 마이크로 컨트롤러와 통신할 수 있습니다. 사용자 인터페이스를 이용하여, LED들은 여러 가지 방법들로 시간적으로 제어될 수 있다: (1) 각각의 LED는 지정된 시간 동안 계속 켜져 있도록 프로그래밍될 수 있고, (2) 각각의 LED는 펄스하도록 프로그래밍될 수 있고, (3) 글로벌 시작 지연(예를 들어, 24시간 후에 형질주입 및 빛을 비출 때)을 프로그래밍할 수 있다(도 6B), (4) 지연 후에 프로그램이 실행되는 총 시간. 두 개의 사용자 인터페이스가 있는데, 하나는 한 번에 두 개의 LED를 제어할 수 있는 큰 단추가 있고 다른 하나는 네 개의 LED를 제어할 수 있습니다(그림 5A,B). 두 개의 LED 사용자 인터페이스는 태블릿에 최적화되어 있으며 많은 실험에서 적색 및 원적색 LED를 제어하기에 충분합니다.
대규모 실험의 경우 두 번째 사용자 인터페이스를 사용하여 최대 4개의 LED를 제어할 수 있습니다. 유전자 발현을 유도 할 때 예상되는 결과는 여러 매개 변수에 따라 다릅니다. 이들은 유도 시간, 유도 수준 (예를 들어, 광 또는 약물의 양), 및 세포 내의 유도성 구축물의 카피 수를 포함한다. 이를 보여주기 위해, 우리는 상이한 양의 리포터 DNA (pPK-202) (형질감염된 DNA의 0.5%, 1%, 2%, 4%, 및 8%)와 함께 PhyB 유전자 스위치를 형질감염시키고(도 6A) 도 6B에 도시된 바와 같이 조명하였다. PhyB를 함유하지만 피코시아노빌린(PCB-발색단)을 생성하는 플라스미드가 없는 샘플에서(즉, 빛에 반응하지 않음), 루시퍼라아제 유전자 발현/누출은 리포터 DNA의 양에 따라 증가한다(도 6C)(원적색 P < 0.0001, 선형 회귀 후 Wald 검정), (적색 P < 0.0001, 선형 회귀 후 Wald 검정). 또한, PCB-발색단 생산 플라스미드 (광-민감성 세포)를 포함하는 전체 PhyB 유전자 스위치가 원적외선광에 대해 조명될 때, 루시퍼라아제 발현은 또한 형질감염 혼합물에서 증가하는 리포터 구축물의 양에 따라 증가한다 (도 6C,D) (원적색광 P < 0.0001, 선형 회귀 후 Wald 검정). 유사하게, 빛-민감성 세포가 적색광으로 조명될 때, 루시퍼라아제 발현은 또한 증가된 리포터 양에 따라 증가한다 (P < 0.0001, 선형 회귀 후 Wald 검정). 적색광 처리된 세포의 유도 수준을 원적외선 처리된 세포와 비교할 때, 리포터 양이 증가함에 따라 폴드 활성화가 약간 감소하는 것을 발견했습니다(그림 6E)(P = 0.0141, 선형 회귀 후 Wald 테스트).
그림 1: 단일 LED의 기본 회로. (A) LED 조명 시스템을 구축하는 데 필요한 단계의 개요를 보여주는 순서도. (B) LED 조명 제어 시스템. (왼쪽) LED 강도와 타이밍을 조절하기 위한 컨트롤 박스. (가운데) LED를 제어하기 위한 사용자 인터페이스를 실행하는 PC 태블릿입니다. (오른쪽) LED를 장착하고 광학 자극을 위한 셀을 배치하기 위한 블랙박스입니다. (C) LED에 고전압 또는 저전압 회로가 필요한지 여부를 결정하기 위한 표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 구성 요소를 제자리에 납땜하기 위한 지침. (A) 회로 구축을위한 단계별 만화 지침의 예. (ᄃ,씨) 조립되는 장치의 사진이 포함 된 예제 지침. (D) 여러 회로를 동시에 조립하기위한 예제 지침. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 조립된 LED 제어 시스템의 모습. (A) 조립된 시스템의 상단 외부 보기. (B) 조립된 4개의 LED 조명 시스템의 내부 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: LED를 방열판에 리플로우 납땜하기 위한 지침. (A) LED 베이스와 진한 빨간색 LED의 클로즈업. (B) LED 베이스에 솔더 페이스트 배치. (C) 납땜 된 LED의 그림. 빨간색 화살표는 납땜 패드를 가리킵니다. 납땜 전의 회색(A)과 비교하여 납땜 후 땜납은 금속성/광택으로 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 광유전학 실험을 제어하기 위한 소프트웨어. (A) 저렴한 태블릿에서 쉽게 사용할 수 있도록 큰 버튼이있는 두 개의 LED 사용자 인터페이스. (B) 4 개의 LED 사용자 인터페이스. 두 인터페이스 모두 독립적인 LED 제어가 가능합니다. 펄스의 경우 특정 펄스 폭 및 지정된 지속 시간 동안 LED를 켜고 끄도록 프로그래밍할 수 있습니다. 펄스는 또한 시작 지연 및 미리 결정된 총 실행 시간을 가질 수 있다. (c) 세포 배양 배양기에 장착 된 LED 제어 정제. (D) 원적외선으로 조명될 때의 PhyB 유전자 시스템의 그림. 원적외선은 유전자를 "꺼짐" 또는 "어두운" 상태로 유지합니다. (E) 적색광으로 조명되었을 때의 PhyB 유전자 시스템의 그림. 적색광은 PhyB와 PIF3 사이의 상호작용을 촉진함으로써 유전자 발현을 유도한다. 이러한 상호작용은 PIF3에 융합된 유전자 활성화 도메인(AD)을 UAS 프로모터에 국한시켜 리포터 유전자를 활성화시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PhyB를 제어하기 위해 LED 시스템을 사용한 예상 결과. (A) PhyB+PIF3 2-하이브리드 파트너를 코딩하는 플라스미드 (pPK-351), 피코시아노빌린 (PCB-발색단) 합성 효소를 코딩하는 플라스미드 (pPK-352), 및 루시페라아제 리포터 플라스미드 (pPK-202). (B) C-E에 대한 광 유도 실험의 타임 라인. (C) 리포터 DNA의 양이 증가함에 따라 기초 전사 수준 (일명 누출). "누출" 샘플은 pPK-352로 형질감염되지 않지만(즉, 빛에 반응하지 않음) 적색 또는 원적외선으로 조명됩니다. 조명 스위치(LS) 샘플은 모든 광-유전자 스위치 플라스미드를 포함하며 적색 또는 원적색광으로 조명됩니다. (D) 적색광 및 원적외선에 대한 반응의 광 유도 수준. (LS-원적외선은 C와 D에서 동일한 데이터입니다.) (E) 적색광/원적외선으로 조명된 세포에서 루시페라아제의 폴드 유도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1-39를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 다중 LED용 전자 구동기 회로. (A) 단일 LED 시스템의 회로도. (B) 4 개의 LED 시스템에 대한 회로도.
보충 그림 2: 회로 상호 연결 배치. (A) PCB 보드를 도움의 손에 끼웁니다. (B) 그림의 관통 구멍에 주 회로 점퍼의 위치. (C) 좌표를 매핑하는 와이어 커넥터의 다이어그램. 4개의 LED 시스템의 경우 그림과 같이 각 회로를 나누는 선(검은색 수직선)을 그립니다. 보충 그림 31–38에서는 4개의 회로를 동시에 조립하는 방법을 설명합니다.
보충 그림 3: 전선을 PCB에 납땜. (A) 점퍼가 PCB와 직접 접촉하고 납땜하는 동안 제자리에 유지되도록 구부립니다. (B) 구부러진 전선의 또 다른 모습. (C) 납땜 후 전선. (D) PCB의 잘린 전선. (E) 땜납으로 가열 한 후 수축 된 절연. (F) 접지 관통 구멍을 덮을 위치로 절연체 이동 (파란색 화살표) (G) 와이어 끝 또는 단자에 플럭스 추가.
보충 그림 4: 전압 조정기를 제자리에 납땜. (A) 전압 조정기 좌표의 지도. (B) 전압 조정기의 배치. (C) 구부러진 전압 조정기 리드. (D) 납땜 후 전압 조정기 단자.
보충 그림 5: R1 저항기를 제자리에 납땜. (A) R1 저항(820Ω) 좌표의 지도. (B) 펜치를 사용하여 리드로 저항을 당기기 (C) 당겨진 저항을 PCB에 가깝게 당깁니다. (D) PCB에 가까운 납땜 저항.
보충 그림 6: 트랜지스터를 제자리에 납땜 (A) 트랜지스터 좌표 및 방향의 맵. (b) 트랜지스터의 방향에 유의하십시오. 이 모델의 라벨은 전압 조정기 (LM317T)를 향하고 있습니다. 트랜지스터의 사양을 다시 확인하여 "이미 터", "베이스"및 "컬렉터"가 올바른 구멍에 있는지 확인하십시오. (C) 납땜 전에 단자가 구부러진 트랜지스터.
보충 그림 7: 전위차계용 전선 간 커넥터를 제자리에 납땜(저전압 회로용 560Ω 저항기 포함). (A) 전선 간 커넥터의 좌표지도 (저전압 회로를 구축하는 경우 R3-560Ω 포함, 전선 간 커넥터는 저항 앞의 구멍에 배치됩니다). (B) 암 전선 간 커넥터. (C) 저항과 전선 간 커넥터를 관통 구멍에 쉽게 끼울 수 있도록 편조 전선의 3-5 가닥이 구부러집니다. (D) 가닥은 가능한 한 단열재에 가까운 와이어 커터로 절단됩니다. (E) a5 관통 구멍을 통해 암 전선 간 커넥터의 적색 선을 삽입합니다 (저전압 회로의 경우 동일한 관통 구멍을 통해 R3을 삽입). (F) 납땜 전 저항기 및 전선 간 커넥터의 밑면도. (G) 접지에 연결된 납땜 된 R3 저항의 이미지 (F = 암).
보충 그림 8: 전위차계용 전선 간 커넥터를 접지에 납땜. (A) 전위차계 전선 간 커넥터의 접지 연결 좌표지도. (B) R3과 병렬로 연결된 전위차계 전선 간 커넥터의 평면도(F = 암).
보충 그림 9: 마이크로 컨트롤러 및 LED 전선 간 커넥터 납땜. (A) 2N222A와 접지를 마이크로 컨트롤러에 연결하기위한 전선 간 커넥터의 좌표지도. (B) 납땜 된 남성 와이어 대 와이어 커넥터. (C) (B)의 평면도. (D) 회로의 입력과 접지를 LED에 연결하기 위한 암 전선 간 커넥터 좌표의 지도. (E) 납땜 된 암 전선 간 커넥터 (F = 암, M = 수).
보충 그림 10: 전원 공급 장치 회로용 점퍼 납땜 (A) 전원 공급 장치를 접지에 연결하기위한 주황색 점퍼의 좌표지도. (B) 제자리에 납땜 된 주황색 점퍼. (C) 제자리에 납땜 된 점퍼의 밑면도.
보충 그림 11: 전원 스위치 및 전원 전선 간 커넥터 납땜. (A) 전원 스위치를 연결하기 위한 암 전선 간 커넥터의 좌표 지도. (B) 제자리에 납땜된 암 전선 간 커넥터. (C) (B)의 또 다른 견해. (D) 전원을 연결하기 위한 수전선 대 전선 커넥터의 좌표 지도. (E) 납땜 된 남성 와이어 대 와이어 커넥터. (F) (E)의 또 다른 견해 (F = 여성, M = 남성).
보충 그림 12: 전원 공급 장치를 수 전선 간 커넥터에 연결. (A) 수정되지 않은 전원 공급 장치. (B) 전원 공급 장치 와이어를 차단합니다. (C) 전원 공급 장치 와이어가 벗겨지고 과도한 절연이 절단되었습니다. (D) 전원 공급 장치 와이어 주위에 수축 튜브 배치. 두 연결을 분리하는 튜빙(빨간색 화살표)과 분리된 와이어를 고정하는 튜빙(노란색 화살표). (E) 전원 공급 장치를 암 전선 간 커넥터에 연결하는 꼬인 전선.
보충 그림 13: 수 전선 간 커넥터에 대한 전원 공급 장치 연결부의 납땜 및 절연. (A) 전원 공급 장치 접지와 암 전선 간 커넥터 사이의 납땜 연결. (B) 전원 공급 장치의 양극 단자와 암 전선 간 커넥터 사이의 납땜 연결. (C) 납땜 된 개별 연결 위로 당겨진 수축 튜브 (빨간색 화살표). (D) 납땜 된 전원 공급 장치 연결부와 열처리 된 수축 튜브가있는 전원 공급 장치 연결부. (E) 개별 연결부 위에 수축 튜브 배치 (노란색 화살표). (F) 전원 공급 장치가 완료되었습니다.
보충 그림 14: 전원 스위치를 수 전선 간 커넥터에 납땜. (A) 전선 위에 벗겨진 전선과 수축 튜브가 있는 전원 스위치(빨간색 화살표). (B) 납땜 전에 스위치와 수 전선 간 커넥터를 연결하는 전선이 함께 꼬여 있습니다. (C) 납땜 된 연결 위에 수축 튜브를 배치합니다. (D) 열처리 된 수축 튜브로 덮인 연결부. (E) 수 전선 간 커넥터로 조립 된 전원 스위치.
보충 그림 15: 전위차계를 수 전선 간 커넥터에 배선. (A) 전위차계 부품. (B) 전위차계의 중간 단자 주위에 걸리도록 꼬이고 구부러진 수 전선 간 커넥터. (C) 전위차계의 중간 단자 주위에 꼬인 수 전선 간 커넥터. (D) 납땜 된 전선 간 연결. (E) 제거하기 전에 금속 탭을 가리키는 빨간색 화살표. (F) 금속 탭 제거 후 전위차계.
보충 그림 16: 마이크로 컨트롤러 연결 배선. (A) 압착을 준비하기 위해 벗겨지고 절단된 암 전선 간 커넥터용 전선. (B) 전선 간 커넥터에 크림프 배치. (C) 전선 간 커넥터의 압착. (D) 압착 전선 간 커넥터. (E) 완전히 조립 된 마이크로 컨트롤러 연결.
보충 그림 17: LED 베이스에 전선 및 LED 납땜 부품 1. (A) LED를 LED 베이스에 납땜하는 데 필요한 재료. (B) 벗겨진 와이어의 끝을 주석 도금합니다. (C) LED 베이스의 접점에 플럭스를 적용합니다. (D) LED 베이스를 주석 도금하기 위해 큰 납땜 팁에 땜납을 추가합니다. (E) LED 베이스를 가열하기 위해 접점에 땜납을 배치합니다. (F) 접점을 가로 질러 납땜 팁을 드래그 한 후 LED베이스. (G) 다른 접점에서도 동일한 절차.
보충 그림 18: LED 베이스에 전선 및 LED 납땜 부품 2. (A) 헤어 클립을 사용하여 접점에 클립 된 주석 도금 와이어. 검은 색 선은 음극 "C-"에 납땜됩니다. (B) 납땜 팁에 충분한 양의 땜납 추가. (C) 납땜 팁이 와이어를 눌러 LED 베이스와 와이어의 땜납을 녹입니다. (D) 납땜 인두를 제거 할 때 와이어가 그대로 유지되도록 와이어를 누르고 있습니다. (E) 땜납이 경화 될 때까지 와이어를 제자리에 고정합니다.
보충 그림 19: LED 베이스에 전선 및 LED 납땜 부품 3. (A) 날카로운 팁을 사용하여 LED를 장착하기 위해 LED베이스에 솔더 페이스트를 놓습니다. (B) 납땜 페이스트가 제자리에 있는 LED 베이스. (C) LED와 LED 베이스의 접점이 일치하도록 LED 베이스에 LED 배치.
보충 그림 20: LED 베이스에 전선 및 LED 납땜 부품 4. (A) 검은 색 선이 여전히 헤어 클립으로 접촉에 잘립니다. (ᄃ,씨) 두 번째 헤어 클립을 사용하여 빨간색 와이어가 제자리에 고정됩니다. 빨간색 와이어는 양극 "A +"에 납땜됩니다. (D) 납땜 팁에 충분한 양의 땜납 추가. (E) 납땜 팁이 와이어를 아래로 눌러 LED 베이스와 와이어의 땜납과 LED 아래의 솔더 페이스트를 녹입니다. (F) 납땜 후 뜨거운 LED베이스 냉각. (G) 전선과 LED가 납땜 된 LED베이스. (H, I) 빨간색 화살표는 납땜 패드를 가리킵니다. 납땜 후 땜납은 금속성/광택으로 보입니다(납땜 전의 회색과 비교(보충 그림 16D)).
보충 그림 21: LED 와이어를 수 와이어-와이어 커넥터에 연결. (A) 수축 튜브 옆에있는 벗겨진 전선 및 수 전선 간 커넥터가 절반으로 자릅니다 (1/8 인치 및 3/16 인치). (B) 납땜하기 전에 와이어 위에 수축 튜브 배치. (C) 납땜 전에 함께 꼬인 와이어. (D) 와이어에서 와이어 대 와이어 커넥터로의 납땜 연결. (E) 빨간색과 검은색 전선이 함께 납땜되었습니다. (F) 납땜 연결 위에 1/8 인치 수축 튜브 배치. (G) 히트 건으로 수축 한 후의 수축 튜브. (H) 더 작은 수축 튜브 위에 3/16 인치 수축 튜브를 배치합니다. (I) 수축 튜브로 납땜 및 밀봉 된 연결부.
보충 그림 22: 에폭시를 사용하여 전선과 LED를 LED 베이스에 고정. (A) 목재 어플리케이터를 사용하여 에폭시를 LED 베이스에 넣습니다. 떨어지는 에폭시를 잡기 위해 테이프가 아래에 배치됩니다. (B) 에폭시는 전체 표면에 고르게 퍼집니다. (C) LED를 경화를 위해 밤새 방치합니다.
보충 그림 23: 상자 덮개 내부에 LED 장착 (A) 쉽게 장착할 수 있도록 터치 패스너 조각이 부착된 LED입니다. (B) 터치 패스너를 사용하여 블랙 박스 내부에 장착 된 다른 색상의 LED. (C) LED 와이어를위한 공간을 만들기 위해 고속 회전 도구로 만든 블랙 박스 뚜껑의 노치. (d) LED를 장착하기 위한 터치 체결구로 세포를 자극하기 위한 블랙박스. (E) LED 박스의 터치 패스너 버전 내부에 멀티웰 접시 배치.
보충 그림 24: 상자 덮개 외부에 LED 장착. (A) 와이어를위한 공간을 만들기 위해 고속 회전 도구의 노치로 블랙 박스의 뚜껑에 구멍을 뚫습니다 (빨간색 화살표). (B) LED는 전기 테이프로 제자리에 고정되어 있는 노치에 와이어가 있는 구멍에 배치됩니다. (C) LED를 고정하기 위해 두 개의 테이프가 더 사용됩니다. 방열판의 뒷면은 열 교환을 최대화하기 위해 노출됩니다. (D) LED가 놓일 구멍 위에 테이프로 붙인 프라이버시 필름. 빨간색 화살표는 프라이버시 필름을 가리킵니다. (e) 박스 외부에 장착된 LED 및 조명을 확산시키기 위한 프라이버시 필름으로 세포를 자극하기 위한 블랙박스. (F) LED 박스의 외부 LED + 프라이버시 필름 버전 내부에 멀티웰 접시 배치.
보충 그림 25: 전원 스위치와 전위차계용 상자 덮개에 구멍을 뚫는 것. (A) 상자 뚜껑의 주석이 달린 치수가 있는 CAD 도면. (B) 전위차계와 전원 스위치 구멍이있는 상자 뚜껑.
보충 그림 26: 전선 출구 구멍 준비. (A) 주석이 달린 치수가 있는 CAD 도면. (B) 드릴 비트로 뚫린 구멍의 이미지. (C) 고속 회전 공구 또는 파일링 공구로 출구 구멍의 평활화. (D) 그로밋을 출구 구멍에 넣습니다.
보충 그림 27: 상자에 마이크로 컨트롤러와 PCB를 배치합니다. (A) 상자 안의 마이크로 컨트롤러 홀더(주황색) 및 PCB 홀더. (B) 마이크로 컨트롤러와 PCB가 상자에 고정되어 있습니다.
보충 그림 28: 전위차계와 전원 스위치의 배치. (A) 전원 스위치와 4개의 POT가 있는 박스 뚜껑의 전면 모습. (B) 전위차계 손잡이가 추가 된 상자 뚜껑의 정면도. (C) 부착된 구성 요소가 있는 상자 뚜껑의 후면 모습.
보충 그림 29: 조립된 LED 제어 시스템. (A) 라벨 프린터로 라벨이 붙은 전선과 정리를 위해 지퍼를 묶은 열린 컨트롤 박스. (B) PIN과 함께 레이블이 지정된 각 POT로 완전히 조립된 상자.
보충 그림 30: 압착된 전선 간 커넥터의 배치. (A) 4개의 LED 마이크로 컨트롤러 시스템을 위한 압착된 전선 간 커넥터의 그림. (B) 압착된 커넥터를 마이크로 컨트롤러 포트에 배치합니다.
보충 그림 31: 점퍼 와이어 배치 (A) 빨간색 점퍼 와이어의 좌표가 표시된 회로 기판. (B) 노란색 점퍼 와이어의 좌표가 표시된 회로 기판.
보충 그림 32: 점퍼 와이어 배치 노란색 점퍼 와이어의 좌표를 표시하는 회로 기판입니다.
보충 그림 33: 전압 조정기 추가. LM317T 전압 조정기는 다이어그램에 표시된 좌표와 함께 회로에 추가됩니다.
보충 그림 34: 820Ω 저항 삽입 R1 저항은 다이어그램에 표시된 좌표와 함께 회로에 추가됩니다.
보충 그림 35: 트랜지스터 삽입. 2N2222A 트랜지스터는 다이어그램에 표시된 좌표와 함께 회로에 추가됩니다.
보충 그림 36: POT 연결을 위한 암 전선 간 커넥터 및 저항기(옵션) 삽입 전선과 저항은 다이어그램에 표시된 좌표와 함께 회로에 추가됩니다. (A) 빨간색 선을 삽입한 다음 R2 저항(560Ω)을 삽입합니다(저전압 회로 전용). (B) 저항의 다른 쪽 끝을 표시된 접지 구멍에 삽입합니다. (C) 표시된 구멍에 검은색 전선을 삽입하여 접지에 연결합니다. 참고 : R2 (560Ω)는 전위차계와 평행합니다.
보충 그림 37: 마이크로 컨트롤러 연결 및 전원 공급 장치를 위한 수형 전선 간 커넥터 삽입. 와이어는 다이어그램에 표시된 좌표와 함께 회로에 추가됩니다. (A) 표시된 구멍에 빨간색 선을 삽입합니다. (B) 표시된 구멍에 검은색 선을 삽입합니다.
보충 그림 38: LED 전선 간 커넥터 추가 (A) 빨간색 리드 좌표가 강조 표시된 암 전선 간 커넥터. (B) 검은색 리드 좌표가 강조 표시된 암 전선 간 커넥터.
보충 그림 39: PhyB-PIF3 유전자 스위치 실험 설정. (A) 내부 대조군을 위한 Renilla를 포함하는 마스터 믹스의 예시 표. (b) PhyB-PIF3 광유전학 실험의 이중-루시퍼라제 리포터 분석을 위한 DNA 혼합물을 설정하기 위한 예시 표. (C) PEI 형질주입 시약을 설정하고 혼합물을 세포 상에 분취하기 위한 예시 표(적가). (D) LED 밝기 설정을위한 조도계 배치.
Discussion
여기에 설명된 LED 시스템은 당사 실험실에서 여러 광유전학 도구를 최적화, 특성화 및 사용하는 데 사용되었습니다. Kyriakakis et al.4에서, 우리는 PhyB-PIF 유전자 스위치의 많은 조합을 병렬로 시험하였다. 그런 다음이 시스템을 사용하여 유전자 스위치 역학과 효과적인 광도를 측정하기 위해 다른 주파수에서 빛의 펄스를 테스트했습니다. 이 시스템은 또한 자극 5,6에 청색광을 사용하는 두 개의 광유전학적 시스템을 최적화하고 특성화하는 데 사용되었습니다. 대부분의 광유전학 도구를 활성화할 수 있을 만큼 충분히 밝은 LED는 하나만 필요했기 때문에 각 우물에 많은 수의 LED가 있는 시스템을 구입하는 것이 항상 필요한 것은 아닙니다. 이 설정은 저렴하고 안정적이며 재구성하기 쉽고 어셈블리 프로토콜을 따르기 위해 사전 전기 전문 지식이 필요하지 않습니다.
보충 보충 그림 31–38에서는 최대 4개의 LED를 시스템에 통합하는 방법을 설명합니다. 이로 인해 많은 수의 병렬 조건이 필요한 일부 실험이 제한될 수 있지만 이 프로토콜에 사용되는 9V 전원 공급 장치를 더 높은 와트 전원 공급 장치로 교체하여 더 많은 LED를 추가할 수 있습니다. 마찬가지로 여러 개의 저전력 LED를 각 회로에 병렬로 연결할 수 있습니다. 이 후자의 배열에서, 일부 LED들은 개별적으로 제어되지 않을 것이지만, 이것은 많은 LED들이 더 넓은 영역을 커버하기 위해 요구될 때 유용할 수 있다. 이 시스템의 전자 장치에 익숙해지면 사용자 정의하는 방법이 많이 있습니다. 시스템을 사용자 정의하기 위한 추가 전략에는 LED를 샘플에 더 멀리 또는 더 가깝게 배치하고 균일한 조명 조건을 위해 필터/디퓨저를 통해 조명하거나 (보충 그림 23) 및 Allen et al.5에서와 같이 가열을 방지하는 것이 포함됩니다. LED 디자인의 또 다른 주목할만한 특징은 에폭시로 캡슐화되어 있고 뒷면에 터치 패스너가 있다는 것입니다. 이를 통해 LED를 인큐베이터, 어항, 동물 케이지, 벽 등 거의 모든 곳에 쉽게 안전하게 배치 할 수 있습니다.
광유전학을 사용하여 유전자, 신호 경로 및 기타 세포 활동을 제어하는 많은 실험은 종종 맥동이 필요하거나 큰 시간 규모에 걸쳐 있거나 인큐베이터에서 수행해야 하므로 현미경 없이 자동화 또는 원격 조작이 필요합니다. 이 LED 시스템은 가습 된 CO2 인큐베이터 내부에서 문제없이 몇 달 동안 지속적으로 테스트되었습니다. 추가적으로, PhyB 광유전학적 시스템과 같은 가역적 시스템을 이용하여, 실험자는 특정 펄스 조명 스케줄을 프로그래밍할 필요가 있을 수 있다. 우리의 이전 연구4에서, 우리는 사용자 인터페이스를 통해 포유동물 세포에서 PhyB-PIF3 스위치의 가역성 역학을 테스트하기 위해 펄싱 프로그램을 사용했다. 이 원고에 설명된 방법론을 사용하면 펄스 프로토콜을 쉽게 프로그래밍할 수 있어 사용자 친화적인 방식으로 다양한 유형의 광유전학 실험에 필요한 유연성과 자율성을 제공합니다.
이 시스템을 구축하는 가장 중요한 단계는 PCB 보드에 전기 회로를 조립하고 구성 요소를 연결하는 것입니다., 섹션 1 및 섹션 2에 자세히 설명되어 있습니다. 이 섹션의 각 단계를 주의 깊게 따르고 각 구성 요소를 납땜하기 전에 핀홀 번호를 한 줄씩 다시 확인하는 것이 중요합니다. 섹션 2에서는 회로에 연결할 구성 요소를 설정하는 방법을 설명합니다. 구성 요소가 올바른 방향으로 연결되도록 전선 간 커넥터의 검은색 및 빨간색 전선 색상이 일치하는지 확인하는 것이 특히 중요합니다. 이 두 섹션의 작은 실수는 시스템의 기능에 영향을 미칠 가능성이 큽니다. 실제로이 방법 문제를 해결하는 첫 번째 단계는 회로가 올바르게 구축되었고 모든 연결이 제자리에 있는지 확인하는 것입니다. 둘째, 느슨한 연결에 대한 납땜 품질과 회로를 단락시킬 수 있는 플레어링 와이어헤어에 대한 와이어를 확인하는 것이 특히 중요합니다. 세 번째 단계는 LED가 올바르게 작동하는지 확인하는 것이며, 전원 공급 장치 또는 1.5V 배터리를 사용하여 LED의 두 단자를 악어 클립으로 클리핑하여 수행할 수 있습니다. 잠재적으로 중요한 또 다른 고려 사항은 가열(고전력에서 LED를 사용할 때) 또는 더 넓은 확산 조명을 위해 빛을 확산시키는 것을 방지하는 것입니다. 이러한 고려사항을 해결하기 위해, LED는 보충 도 23 및 Allen et al.5에 설명된 바와 같이, 내부에 "프라이버시 필름"이 있는 블랙박스 외부에 실장될 수 있다. 이 시스템의 단순성으로 인해 모듈식 구성 요소를 확인, 수정, 업그레이드 또는 수리하기 위해 분해하는 것은 어렵지 않습니다.
유도성 유전자 시스템에 대한 또 다른 중요한 요소는 제어되는 생물학적 시스템에 얼마나 많은 활성화가 필요한지 또는 얼마나 많은 누출이 허용되는지를 고려하는 것입니다. 도 6에 도시된 바와 같이, 이들은 리포터 DNA의 양에 따라 달라질 수 있다. 또한, 형질감염 효율 및 따라서, 각 세포에서 리포터 구축물의 카피 수는 다양할 것이다. 일부 실험에서는 약물 유도성 시스템에서 일반적으로 수행되는 것처럼 고정된 양의 리포터 또는 PhyB 유전자-스위치 성분을 갖는 세포주를 만들고 원하는 범위의 유도 발현을 갖는 클론을 스크리닝하는 것이 유리할 수 있다. 렌티바이러스 플라스미드 pPK-2304의 크기와 불안정성으로 인해 pcDNA 백본 pPK-351(애드진 #157921) 및 pPK-352(애드진 #157922)에서 PhyB 스위치의 비렌티바이러스 플라스미드 버전도 만들었습니다.
이 프로토콜에 따라 이 LED 조명 시스템을 구축함으로써 사용자는 시험관 내 및 생체 내에서 다양한 광유전학 실험을 수행하는 데 필요한 모든 구성 요소를 갖게 됩니다. 포유동물 세포에서 PhyB-PIF3를 사용하기 위한 지침과 결합하여, 이 프로토콜은 비엔지니어 및 생물학자가 다양한 맥락에서 PhyB 기반 광유전학을 유연하고 효과적으로 사용할 수 있게 할 것이다.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
개발 중인 LED 시스템의 다양한 버전을 테스트해 주신 Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang 및 Molly Allen에게 감사드립니다. 이 연구는 UC 샌디에고의 Kavli Brain and Mind 연구소와 Salk Institute, National Science Foundation이 보조금 CCF-0939370, NIH Grant NS060847 및 NIH Grant R21DC018237에 따라 NSF 정보 과학 센터를 통해 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18AWG 2pin RED Black wire | Amazon | 15M-28AWG-2468 | Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| 1K Ohm potentiometer | Amazon | 52161500 | 2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| 20 Gauge Silicone JST Connector | Amazon | SIM&NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| 22 AWG solid jumper wires | Amazon | WJW-60B-R | Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| 560 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | a14051600ux0301 | Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN |
| 820 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | TTL-A-8035-50Ea | Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor |
| A Male to B Male Cable (10 Feet) | Amazon | Part# 30-001-10B | The cable that comes with the Arduino doesn't fit well in the box. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Ardiuino UNO equivilent | Amazon | Elegoo EL-CB-001 | UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Arduino holder | Digikey | X000018 | Fits very snug. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632 |
| Black boxes for circuits and light chambers | Amazon | 1591ESBK | Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Blue LED | Digikey | LXML-PB01-0040 | LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134 |
| Cable ties | Amazon | sd027 | Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Command Fridge Clips | Amazon | 17210CLR | Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Cyan LED | Digikey | LXML-PE01-0070 | LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd |
| Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack | Amazon | 03429NA | Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK |
| Farred LED 720nm | Luxeon Star LEDs | LXML-PF01 | Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW |
| Farred LED 740nm | Ushio | EDC740D-1100-S5 | Uses "STAR XP 3535" base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf |
| Farred LED 780nm | Ushio | EDC780D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf |
| Farred LED 810nm | Ushio | EDC810D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf |
| Farred LED 850nm | Ushio | EDC850D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf |
| Grommets | Amazon | Pico 6120D | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G |
| Hair/Alligator Clips | Amazon | 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
|
| LED base | Luxeon Star LEDs | LXB-RS20A | Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds |
| LED PCB fopr Ushio LEDs | Adura LED solutions | STAR XP 3535 Package LED | Fits many other LEDs by Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led |
| Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe | Amazon | 1943587 | Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C |
| NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS | Amazon | B000FIDTYG | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Picture Hanging Velcro Strips | Amazon | PH204-16NA | With these you can hang the LEDs in many places. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H |
| Power supply | Amazon | tb013 | Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Power switch Rocker Switch | Amazon | SIXQJZML | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011 |
| Rectangular Connectors - for crimped wires | Digikey | 2183-1905-ND | 6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100" (2.54mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB |
| Red LED | Digikey | LXM3-PD01 | LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd |
| Sandpaper | Amazon | B002NEV6GS | 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1 |
| Solder for soldering wires and circuit components | Amazon | Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY |
| Solder-able Breadboard for building the circuit | Amazon | GK1007 | Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Spade drill bit | Amazon | Irwin 88811 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit |
| Transistor | Newark | 2N2222A | Can buy from many places. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197 |
| Voltage regulator | Newark | LM317T | Equivilent to NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC |
| Windows 10 tablet | Amazon | B08BYTT79Y | Any Windows 10 PC will do. https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Cell Culture Reagents | |||
| Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 | ATCC | ATCC CRL-1573 | Common Cell line. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose | ThermoFisher | 11965−092 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118 |
| 10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122 |
| White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates | ThermoFisher | 07-200-589 | White plates are preferred. Do not use clear plates. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852 |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | PolySciences | 24765-1 | Can be replaced with another transfection reagent. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/ |
| Name of Equipment | |||
| Diagonal Cutting Plier (110mm) | Amazon | Proskit 1PK-037S | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11 |
| Dremil 3000 with cutting tool and grinder | Amazon | Dremel 3000 | Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3 |
| Dremil cutting and grinding tool | Amazon | Dremel 200-1/15 | Any similar Dremil will work. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Dremil grinding tip | Amazon | Dremel 84922 | Silicon Carbide Grinding Stone. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922 |
| EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT | Amazon | DS017 | For removing solder/mistakes. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI |
| Helping Hand with Magnifying Glass | Amazon | SE MZ101B | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch |
| Pointed Nose Micro Pliers | Amazon | Hakko CHP PN-20-M | Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Small screw drivers | Amazon | Wiha 26197 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set |
| Soldering iron | Amazon | Yihua 939D+ Digital Soldering Station | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR |
| TraceTech No-Clean Flux Pen | Amazon | 2507-N | Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1 |
| Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber | Amazon | WSA350 | For soldering safety. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK |
| Wire strippers | Amazon | CSP-30-7 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG |
| IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG | Amazon | IWS-3220M | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
References
- Klewer, L., Wu, Y. W. Light-induced dimerization approaches to control cellular processes. Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).
- Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms. Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).
- Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology. Advanced Science. 6 (1), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 1800952 (2019).
- Kyriakakis, P., et al. Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (2), electronic resource 706-717 (2018).
- Allen, M. E., et al. An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics. ACS Synthetic Biology. 8 (10), electronic resource 2359-2371 (2019).
- Huang, Z., et al. Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy. Science Advances. 6 (8), (2020).
- Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A.
- Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2). Methods. 164-165, 81-90 (2019).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).
- Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch. Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
- Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nature Communications. 4, 1779 (2013).
- Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J.
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature Communications. 6, 6256 (2015).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K.
- Gong, X., et al. An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques. Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Levskaya, A., et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).
- Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
- Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).
- Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. Engineering an E. coli near-infrared light sensor. ACS Synthetic Biology. 7 (1), electronic resource 240-248 (2018).
- Zhang, W., et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).
- Lee, D., et al. Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).
- Kim, M. W., et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout. eLife. 6, (2017).
