Summary
このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。
Abstract
筋ジストロフィーにおける病態生理学と治療標的の両方に関する調査は、ヒト近母細胞の限られた増殖能力によって妨げられている。いくつかのマウスモデルが作成されましたが、彼らは本当に病気の人間の生理病理学を表していないか、ヒトに見られる突然変異の広いスペクトルを代表していません。ヒトの原発筋細胞の不死化は、この制限に代わるものである。しかし、それはまだ侵襲的で簡単に利用できない筋肉生検に依存しています。対照的に、皮膚生検は患者に対して入手しやすく、侵襲性が低い。皮膚生検に由来する線維芽細胞は、不死化し、筋芽細胞にトランスファノファナイズすることができ、優れた筋形成電位を有する細胞の供給源を提供する。ここでは、線維芽細胞を筋原性系統に迅速かつ直接的にリプログラミングする方法について述べている。線維芽細胞は2つのレンチウイルスでトランスタイブされる:一次培養を不滅にする hTERT とテト誘導性 MYODは、ドキシサイクリンの添加時に線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その後、後期分化マーカーを発現する成熟した筋芽細胞の変換を誘導する。この迅速なトランスセ分化プロトコルは、病理学的メカニズムを調査し、神経筋疾患に対する革新的な遺伝子ベースまたは薬理学的生物療法を調査するための強力なツールを表しています。
Introduction
ヒト組織から直接得られた細胞モデルは、元のゲノムコンテキストを有し、多くの場合、患者に観察された同じ分子および細胞の特徴を再現するという利点を有する多くのヒト遺伝性疾患をモデル化するのに有用である。神経筋疾患の分野では、筋肉生検はヒト重芽細胞の大きな源であり、病理学的メカニズムの解明に役立っています。さらに、それらは、薬物および遺伝子治療のインビボ試験のための重要なツールである。一方で、筋断片からの筋芽細胞の導出は比較的容易である。一方、プライマリ・ミオブラテストの培養や維持は、その増殖速度が限られており、vitro1では老化が反復的であるため、困難である。これらの制限の代替は、骨格筋特徴4の保存を伴うヒトテロメラーゼ(hTERT)および/またはサイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)遺伝子2、3を挿入して筋芽細胞を不死化させることである。それにもかかわらず、原発性筋芽細胞の鈍化は、多くの場合、進行した変性において筋肉を有する患者に不利益を伴う外科的処置である筋肉生検に依然として依存している。したがって、これらの患者の筋肉は、線維性および/または脂肪組織の有意な割合で構成され、より少ない筋肉細胞を生み出し、以前は不死化に細胞の精製を必要とする。
筋肉生検とは対照的に、皮膚生検はよりアクセスしやすく、患者にとって有害性が低い。原発性線維芽細胞は、 インビトロの皮膚断片に由来する。線維芽細胞は主に神経筋障害を引き起こす突然変異の影響を受けませんが、筋芽細胞にトランス分化することができます。これは 、ミオド 遺伝子の挿入によって達成され得る、筋原性調節転写因子5.本稿では、線維芽細胞培養の確立から分化された筋管の隠れにまで、トランス分化された筋芽細胞を得るためのプロトコルについて述べる(この方法の代表的な要約は 図1に示されている)。
治療戦略の前臨床検査は、ヒト患者に見られる突然変異と同様の突然変異を運ぶ細胞および動物モデルに依存する。CRISPR/Cas96などの遺伝子編集技術の進歩により、動物モデルの開発は実現可能になりましたが、依然として困難でコストがかかります。したがって、患者由来細胞株は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)などの疾患の突然変異の大きなスペクトルをカバーするモデルを有するアクセス可能な選択肢である。細胞モデルの隠れと作成は、このような病理のためのパーソナライズされた治療法の開発に不可欠です。
調査されたパーソナライズされた治療法の中で、エキソンスキップ戦略は、異なる筋ジストロフィー7、8のための有望なものの一つです。この戦略は、より短いが機能的なタンパク質を産生する。これは、最終的なメッセンジャーから変異したエキソンを除外して、スプライセソームにエキソン定義を隠すことによって実行されます。これは、DMDのためのFDAによって承認されている非常に有望な技術です.したがって、我々はまた、このプロトコル、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)およびU7snRNA-アデノ関連ウイルス(AAV)の2つの異なるエキソンスキップ関連技術を有するミコールトをトランスフェクトする方法を記述する。AONトランスフェクションは、エキソンスキップ9を促進するように設計されたいくつかの配列の初期スクリーニングのための良いツールです。ただし、AnIN のアクティビティは一時的なものです。アンチセンス配列の持続的発現を得るために、我々はまた、AAVと結合した小型核RNA(snRNA)を探索し、核の局在化およびスプライシング機構10への包含を可能にした。U7は、スプライセソームにリダイレクトし、アンチセンス配列11を送達するタンパク質を結合するように操作することができるヒストンmRNAの処理に関与するsnRNAである。AAVベクターと組み合わせて修飾されたU7 snRNAを使用すると、AINの継続的な発現および関心のある組織の優れた伝達をもたらすAOの限界を克服する。このプロトコルにはDMD患者由来の細胞を使用して、エキサボッピング戦略を説明します。
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Protocol
すべての実験と生検は、全国小児病院機関審査委員会の承認を受けて、関係する機関の倫理規則に従って行われました。
1. 皮膚線維芽細胞培養の開始
- 線維芽細胞培養の確立
- 15 mL円錐管中の線維芽細胞培地のアリコート10 mL(表1)。皮膚生検を配置し、この培地で輸送する必要があります。生検は、処理されるまで4°Cで、同じ日に優先的に保存することができる。
注:汚染の潜在的な成長を避けるために24-36時間以内に皮膚生検を使用してください。 - チューブから培地を吸引し、10 mL 1X PBS(室温)で生検を3回洗い上げ。3回目の洗浄後、PBSをチューブに残します。
- PBSと皮を10cm2 皿に注ぎます。
- 無菌メスを使用して、生検をできるだけ小さな断片に切り込む。
- ピペットを使用して、個々の皮膚の断片を移し、きれいな10cm2 皿に落とします。1皿あたり10~12個の断片を入れます。
- 各フラグメントの周りからPBSの過剰を吸引する。破片を吸引しないように注意してください。
- 蓋で皿を部分的に覆い、皮片を5〜20分間乾燥させます。断片が過度に乾燥しないようにしてください。
- 断片が乾燥したら、皿を45度傾け、ゆっくりと12mLの線維芽細胞培地を隅に加えます。皿を下ろし、断片がメディアによって持ち上がないように慎重にメディアを配布します。
- 食器をインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。5~7日で交換し、その後週に1回交換してください。
- 断片(図2)から出てくる線維芽細胞を観察し、一度コンフルエントになると、細胞を75cm2フラスコに通過させる。培地を取り出し、PBSで細胞をすすいで、1 mL 0.25%トリプシンを加えます。37°Cで5分間、またはすべての細胞が持ち上げられるまでインキュベートします。10 mLの線維芽細胞増殖培地を加えてトリプシンを阻害し、細胞を新しいフラスコに移す。
注:通過数の命名法については、P1は、皮膚生検から出現した最初の線維芽細胞が増殖のために新しいフラスコに移されたときに確立される。
- 15 mL円錐管中の線維芽細胞培地のアリコート10 mL(表1)。皮膚生検を配置し、この培地で輸送する必要があります。生検は、処理されるまで4°Cで、同じ日に優先的に保存することができる。
- 原発性線維芽細胞線の凍結保存
- 75 cm2 フラスコがコンフルエントになったら、10 mL 1X PBSと吸気PBSでリンスします。
- セル表面に0.25%トリプシンの3 mLを加えます。フラスコをインキュベーターに5分間置きます。顕微鏡下のフラスコを調べて、細胞が持ち上がっているかどうかを確認します。それ以外の場合は、フラスコをインキュベーターに戻してさらに5分間置きます。
- 細胞が剥離したら、フラスコに7mLの線維芽細胞培地を加え、ピペットを上下に加え、細胞を再懸濁させます。50 mL円錐形のチューブに細胞を集めます。
- トリパンブルーの100 μLアリコートを用意し、凍結保存されているサンプルから100μLを取り出し、トリパンブルーと混ぜます。数えるためにヘモサイトメーターにミックスをロードします。顕微鏡下で、ヘモサイトメーターの4つの異なる分野の細胞を数えます。セルの総数を計算するには、(セル数/100を数える)*培養量の式を使用します。
- 円錐形のチューブを室温または4°Cで10分間300 x gで回転させます。
- 培地を吸引し、適切な量の凍結培地で細胞を再懸濁する:各100万個の細胞/バイアルあたり1 mL。ピペットを上下にして均質化し、ラベル付けされた各クライボビアルに1 mLを分配します。
- バイアルを冷凍ボックスに入れ、バイアルを-80°C冷凍庫で一晩1°C/分の速度で凍結させます。
- 翌日、バイアルを液体窒素タンクまたは-150°C冷凍庫に移します。
2. 線維筋芽細胞(FM)細胞株の確立
- 翌日の12ウェルプレート(2 x 104 細胞/ウェル)の2つのウェルで、一次線維芽細胞の約30%で一次線維芽細胞を播種します。
- レンチウイルス伝達の場合、線維芽細胞培地の400 μLにhTERT-プロロマイシンレンチウイルスの2〜5 x 109 vg(ウイルスゲノム粒子)を加える。第2の井戸に、線維芽細胞培地のちょうど400 μLを加える。翌日に1mLのメディアを追加します。
注:レンチウイルス産生用プラスミドは、2009年論文「チャウチ ら」を発表したグループから入手した。また、Aure ら,200713 用hTERTプラスミド及びバルデ ら,200614 年にMyoDプラスミドの設計に利用されるテトオン系についても個別に記載されている。彼らは、フランスのジェネソンとの物質移転契約のおかげで得られました(これらのプラスミドを得るためにヴィンセント・ムーリー博士に連絡してください - vincent.mouly@upmc.fr)。簡単に言えば、hTERTはCMVプロモーターによって駆動されるhTERTバリアント1から構成され、ピューロマイシンはPGKプロモーターによって駆動される。MyoDプラスミドは、リプレッサーrtTA2の制御下でCMVプロモーターによって駆動されるMyoDバリアント1を含む。このプラスミドには、SV40プロモーターに対する表現されたハイグロマイシン選択も含まれています。
レンチウイルスは、通常のレンチウイルス産生を用いて産生された(WangおよびMcManus JoVeプロトコル15を参照)。簡単に言えば、MDLヘルパー、Rev-ヘルパー、SVS-Gヘルパーは、hTERTまたはMyoDプラスミドの塩化カルシウム沈殿物を介してトランスフェクションされた。48時間後、上清を回収し、さらに3日間回収した。その後、全ての上清を超遠心分離によって濃縮した。ペレットは、次いでトリス-HCL+NaCl+EDTAバッファーに再懸濁した。Titer推定は、標準レンチウイルスqPCRアッセイによって評価した。 - 1、2日後、細胞を6ウェルプレートに移し、60〜70%の合流に達するまで増殖させます。
- 1 μg/mL のピューロマイシンで繊維芽細胞培地を補い、各ウェルに 2 mL を加えます。
- コントロールウェル内のすべてのセルが死んで(最大12日)、2〜3日ごとにメディアを変更するまで、セルを選択したままにします。6ウェルプレートから2つの10cm2 皿に細胞を通過させ、さらなる増殖を行います。
- 選択後の線維芽細胞の凍結バイアル。F(hTer) としてラベルを付けます。
- 種子hTERT発現線維芽細胞(F(hTer))は、線維芽細胞培地中で約30%合流で、12ウェルプレートの2つのウェルにおいて、翌日に約50%の合流を有する。
- レンチウイルスの導入の場合は、400 μlの線維芽細胞培地に2〜5 x 109 vgのMyoD-hygromycinBレンチウイルスを混ぜ、それぞれのウェルに加えます。3番目の井戸に400 μlの線維芽細胞培地を加える。翌日に1mLの培地を加えます。
- 1〜2日後に細胞を6ウェルプレートに移し、60〜70%の合流まで成長する。
- 繊維芽細胞の成長培地をハイグロマイシンB(400 μg/mL)で補い、各ウェルに2 mLを加えます。
- コントロールウェル内のすべてのセルが死んで(最大12日)、2〜3日ごとにメディアを変更するまで、セルを選択したままにします。
- 選択後の線維芽細胞の凍結バイアル。FM のラベルの後にセルの識別番号/名前を付けます。
3. トランスセ分化プロトコル
- 種子は30-40%の合流と10 cm2 皿にFMを移す。12ウェルプレートでは、シード6 x 104 細胞(これは個々の細胞株に依存します)。
注:免疫染色のために、ガラスカバーリップまたはマトリゲルでコーティングされたチャンバースライドに細胞をシード。DMEM培地で1:10にマトリゲルを希釈し、表面を覆うのに十分な体積を加え、スライドを室温で1時間座らせます。細胞を播種する直前に吸引する。 - 筋芽細胞誘導のために、線維芽細胞が70%合流に達すると(図3A)、PBSで細胞表面をすすい、新鮮な8μg/mLのドキシサイクリンを補充した新鮮な筋芽細胞培地を加える。
注: 差別化の成功は、80% の合流を超えて危険にさらされます。 - 2~3日後、細胞は90~95%コンフルエント化し、その形態は変化します(図3B)。細胞表面をPBSでリンスし、新鮮な8 μg/mLのドキシサイクリンを添加した新鮮な分化培地を加えます。
- ミオチューブが確立されるまで、2~3日ごとにパスを出さずにメディアを変更し続ける(形態を介して確認する) (図3C)。
- myotube の分化を開始してから 7 ~ 10 日、 細胞は完全に分化され、脱離または死に始める可能性があります。これが起こる前に、さらなる分析のためにミオチューブを収穫してください。
注:ミオチューブ形成の時間経過は細胞株によって異なります。筋肉関連タンパク質の変異は、筋形成の可能性に干渉する可能性があります。myotubesが明るく見え始め、国境を白く見ると、それは彼らが取り外し始めている信号です(図4)。 - ミオチューブを収穫するには、メディアを収集し、50 mL円錐管に移します。媒体は、剥離したミオチューブを含んでいてもよい。
- 5 mL PBS でミオチューブをリンスし、PBS を 50 mL チューブに移します。
- セル表面に0.25%トリプシンの3 mLを加えます。皿をインキュベーターに5分間置きます。顕微鏡の下で皿をチェックして、細胞が持ち上がっているかどうかを確認します。それ以外の場合は、さらに5分間インキュベーターに戻します。
- 細胞が取り外されたら、7 mLの線維芽細胞培地を皿に加え、ピペットを上下に加えて細胞を再中断します。50 mL円錐管に細胞を集めます。
- 遠心分離機 1,200 x g で 4 °C で 7 分間
- ペレットを邪魔することなく、慎重に液体を吸引します。ペレットは、さらに処理されるまで-80 °Cで保管してください。
4. 分化されたミオチューブの免疫染色
注:免疫染色の場合、上記のようにガラスカバーリップまたはチャンバースライドで細胞を成長させます。
- myotubeが完全に差別化されたら、培地を吸引し、PBSでスライドを慎重にすすいだ。PBSを吸引します。
- 新鮮な4%PFA(12ウェルプレートのウェルあたり500 μL)を加え、室温で10分間インキュベートします。PFAを吸引します。
- 1 mL PBS でリンスします。
- 室温で0.2 Mグリシンをインキュベートし、10分間培養します。吸引グリシンオフ。
- PBS 0.5%TritonX-100(12ウェルプレートの300 μL/ウェル)で10分間、穏やかな攪拌で透過します。
- 300 μL/ウェルのブロッキング溶液を使用して、10分間、穏やかな攪拌でブロックします。
- 一次抗体を300 μLのブロッキング溶液で1:50希釈し、室温で2時間、穏やかな揺れをしてインキュベートします。
- PBSの1mL/ウェルで5分間3回、穏やかな揺れで3回すすいでください。
- 2次抗体を300 μLのブロッキング溶液で1:500希釈してインキュベートし、1時間室温で穏やかな揺れをします。プレートをアルミホイルで覆います。
- PBSの1mL/ウェルで5分間3回、穏やかな揺れで3回すすいでください。
- DAPIを10分間PBSで希釈してインキュベートする。PBSの1 mL/ウェルで3回リンスします。
- 取り付け媒体をガラススライドに追加します。鉗子でカバースリップを取り外し、取り付け媒体のドロップに下向きに置きます。
- ペーパータオルに滑り込み、軽く押して泡や過剰な取り付け媒体を取り除きます。
- マニキュアでスライドを密封し、イメージングまで4°Cで保管します。
5. アンチセンスオリゴヌクレオチドトランスフェクション
注: 以下のプロトコルは、6 ウェルプレートのトランスフェクション用です。小さいか大きい版のために適宜音量を調節しなさい。細胞が分化ステップの準備ができたら、トランスフェクションは100%コンフルエント筋芽細胞で行われます。
- 筋芽細胞増殖培地を吸引し、1 mL PBSで細胞をすすいだ。
- OptiMEM培地を500μL/ウェルに加え、37°Cで1時間インキュベートします。
- オプティメムのアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)を所望の最終濃度(すなわち50 nM、100 nM、200 nM、500 nM)に希釈します。室温で5分間インキュベートします。
注: このプロトコルは、2'oメチルホスロチオエート AONs 用に最適化されています。 - リポフェクタミンとOptiMEM(最終体積100μL)を混合し、最終比1:1(μG DNA:μLリポフェクタミン)を与えます。室温で5分間インキュベートします。
- 希釈したリポフェクタミンと希釈したAONを組み合わせます。ピペットで軽く混ぜ、室温で20分間インキュベートして複雑な形成を可能にします。気泡を避けてください。
- それぞれのウェルにリポフェクタミンとAONミックスの200 μLを加えます。細胞を37°C、5%CO2で一晩インキュベートする。
- 翌日トランスフェクションミックスを除去し、ドキシサイクリンを添加した温かい分化培地2 mLを加える。
- 少なくとも3日後にRNA抽出のために細胞を収集し、タンパク質分析の場合には7〜21日。
注:RNAやタンパク質発現を検出するために必要な分化の日は、目的の遺伝子や細胞株に応じて異なる場合があります。 DMDの場合、3日以内にそのmRNAを検出することが可能です。ジストロフィンタンパク質の検出には、少なくとも7日間必要です。これは、セルラインによって異なります。高濃度のAONおよびトランスフェクション試薬は、トランスセ分化に影響を与える可能性があります。
6. AAV1-U7のトランスダクション
注: このプロトコルは、6 ウェル プレート用に最適化されました。カルチャの表面積に比例して、ボリュームを調整します。細胞が分化ステップの準備ができたら、伝達は100%コンフルエント筋芽細胞で行われます。AAV1は、培養された筋芽細胞の中で最も優れた伝達能力を有するAAV血清型である。
- 筋芽細胞の成長培地を吸引し、1 mL PBSで細胞をすすいだ。
- 0.5-1 x 1011 のAAV1-U7のウイルス粒子を700 μLの温かい分化培地に、ドキシサイクリンを補充した。
注: ウイルス濃度を決定するために qPCR を使用します。使用するウイルスの量は定量方法によって異なる場合があり、レポーターアッセイを使用して事前に決定する必要があります。 - 均質に落とすことによって、ウェルにウイルスミックスを追加します。
- 翌日、ドキシサイクリンを添加した温かい分化培地を1.3mL加える。
- 少なくとも3日後にRNA抽出のために、またはタンパク質分析の場合には7〜21日の細胞を収集する。
7. RNA抽出
注: このステップで使用される材料はすべて RNase フリーである必要があります。
- ペレットあたりTRIzolを500 μL加え、上下に数回ピペットを加え、細胞が均質に分解されるようにします。
- 細胞ライセートを1.5mLチューブに移し、室温で5分間インキュベートします。
- クロロホルムを100μL加え、手動で15秒振ります。室温で5分間インキュベートします。
- 遠心分離機 12,000 x g で 4 °C で 15 分 水相(上の1)を収集し、新しい1.5 mLチューブに移します。
- 水相の1体積については、1液のエタノール100%を加え、ピペットで混ぜます。
注:カラムの精製と濃縮をお勧めします。 - サンプルをコレクションチューブのZymo-Spin ICカラムに移し、遠心分離機を12,000 x gで30 sに転送します。フロースルーを破棄します。
- インカラムDNase I消化の場合は、400 μL RNAウォッシュバッファーでカラムを事前洗浄します。遠心分離機は12,000 x gで30s。フロースルーを破棄します。
- サンプルごとに40 μLのDNase反応ミックスを準備します。5 μL DNase I と 35 μL の DNA 消化バッファーを混合します。
- ミックスを列行列に直接追加します。室温で15分間インキュベートします。
- カラムに400 μLのRNA準備バッファーを加え、遠心分離機を12,000 x gで30 sにします。フロースルーを破棄します。
- カラムに700 μLのRNA洗浄バッファーを加え、遠心分離機を12,000 x gで30 sで追加します。フロースルーを破棄します。
- 400 μL RNA ウォッシュ バッファーをカラムに加え、遠心分離機を 12,000 x g で 2 分間追加し、洗浄バッファーを完全に除去します。カラムをRNaseフリーの1.5mLチューブに慎重に移します。
- カラムマトリックスに15μLのヌクレアーゼを含まない水を直接加えます。5分間インキュベートし、12,000 x gで遠心分離機を1分間インキュベートします。
注:溶出したRNAを収集し、収量を増加させるためにカラムに再度適用してください。12,000 x gで1分間の遠心分離機。 - サンプルを氷の上に置き、ナノドロップでサンプルを定量化します。
- サンプルは-80°Cで保存してください。
8. RT-PCR 分析
注:このステップでは、ジストロフィンmRNAの発現を検出するための試薬の提案を提示しますが、他の選択した試薬に簡単に適応させることができます。
- 逆転写
- すべての試薬を解凍し、氷の上に保管してください。
- 4 μL の 5x 反応バッファー、2 μL の dNTP ミックス (10 mM)、リボロック RNase 阻害剤の 1 μL、および 1 μL の RevertAid RT を使用してミックスを準備します。
- チューブを軽く混ぜ、遠心分離機を少し混ぜます。
- 0.2 mL PCRチューブで、反応ごとに1μgを持つために十分な量のRNAを追加します。ヌクレアーゼを含まない水q.s.p 12 μL.負のコントロールとして逆転写酵素のないチューブを1つとRNAの代わりにヌクレアーゼを含まない水を1つ含めます。
- チューブあたり8 μLの反応ミックスを分配します。総容積は20 μLである。
- チューブをサーモサイクラーに入れ、25°Cで5分間インキュベートし、42°Cで60分ずつインキュベートします。 70°Cで5分間加熱して反応を停止する。
- チューブを氷の上または-20 °Cに置き、より長く保管します。
- PCR
注:エキソン接合部でプライマーを設計することが好ましい。- ボルテックス試薬とスピンダウンを使用前に。
- 0.5 μLフォワードプライマー(25 μM)、0.5 μLリバースプライマー(25 μM)、12.5 μL 2x PCRマスターミックス、および8.5 μLのヌクレアーゼフリー水をサンプルあたり使用してマスターミックスを準備します。
- アリコート22 μLのマスターは、各サンプルのチューブに混合します。
- 3 μL の cDNA (150 ng) をそれぞれの PCR チューブに加えます。PCR陰性対照チューブにヌクレアーゼを含まない水を3μL加えます。
- ボルテックスとPCRチューブをスピンダウン。
- 95°Cのサーモサイクラーで3分間、30秒で95°C、30秒で(Tm-5)°C、(1分/kb)72°C(1分/kb)34回、72°Cで5分間インキュベートします。
注:最適なアニーリング温度は経験的に決定することができます。推奨マスターミックスの場合は、プライマー溶融温度から5°Cを差し引きます。 - アガロースゲルにPCR反応の12 μLをロードし、-20°Cでサンプルを凍結します。
9. ウェスタンブロッティングによるジストロフィン発現の検出
注:このプロトコルは、大きな膜タンパク質であるジストロフィンに最適化されています。異なるタンパク質に対して特定の条件が必要な場合があります。
- タンパク質抽出
- 分化の7-21日後、100 μL 0.5 M EDTA、および50 μLプロテアーゼ阻害剤を用いた5 mLのPBSを用いて細胞を採取します。細胞が外れるまで37°Cでインキュベートする。遠心分離機 1,200 x g で 5 分 4 °C. 液体窒素にチューブを浸すことによってペレットを凍結スナップします。ペレットを-80°Cで保存するか、またはリシスステップに進みます。
- ジジトニン1%、プロテアーゼ阻害剤1%、ホスファターゼ阻害剤10%、ベースバッファーを総容積(細胞ペレット当たり60μL)に添加して、リシスバッファーを調製します。
- 60 μL のリシスバッファーを氷の上の細胞ペレットに加えます。5 sのためのソニッケート。8 sの氷の上に座りましょう。超音波処理を繰り返し、ステップを2回残します。
- 氷上でサンプルを30分間インキュベートします。
- 遠心分離機 14,000 x g で 20°C で 20 分.
- 上清をきれいな管に移す。
- 製造者の指示に従って、ビシンホニン酸(BCA)アッセイでサンプルを定量化します。
- 適切な量のレムリバッファーとタンパク質溶液を混合します。100 μgのアリコートを作ります。必要に応じて、塩基のリシスバッファーで25μlにボリュームを調整します。サンプルは-80°Cで保存してください。
- ウェスタンブロッティング
- 氷の上のサンプルを解凍します。
- 100°Cでサンプルを5分間変性させ、氷の中で冷やし、スピンダウンします。
- 200 mL dH2Oで20Xトリス酢酸SDSランニングバッファを希釈し、500 μLの抗酸化物質を加えます。
- 3-8%トリス-アセテートポリアクリルアミドゲルをdH2Oでくすいで調製し、電気泳動装置にゲルを組み立てます。ランニングバッファで内部チャンバーを充填します。
- 5 μLのタンパク質ラダーと25 μLのサンプルをゲルに入れ込みます。ランニングバッファで外の部屋を充填します。
- 4°Cで1時間80Vで実行します。 その後、4°Cで2時間120Vで。
- 150 mLの10Xメタノール、150 mLの20X転送バッファー、および2,700 mLのdH2O.を4°Cまで冷却して、3 Lの1X転送バッファーを調製します。
- 濾紙4枚とニトロセルロース膜1枚をカットします。紙フィルターと膜を転送バッファ付きトレイに浸します。
- ゲルをケースからそっと取り出し、フィルターペーパー、膜、スポンジで転写装置に組み立てます。ゲルは、ネガティブ側に、膜を正の側に配置します。
- 300mAで転写を行い、攪拌しながら、4°Cで、一晩実行する。
- 穏やかな攪拌で1時間、室温でブロッキングバッファーの10 mLで膜をブロックします。
- 10 mLのブロッキングバッファーと50 μLのジストロフィン抗体を用いた一次抗体溶液を調製します(1:200)。
- ブロッキングバッファーを廃棄し、一次抗体溶液を添加します。室温で少なくとも2時間、または4°Cで一晩穏やかな攪拌でインキュベートする。
- 膜を0.1%のトゥイーンPBSで3回リンスし、穏やかな攪拌で5分間リンスします。
- 10 mLのブロッキング溶液、抗ウサギ抗体2 μL(1:5000)、20 μLの0.2%Tweenを用いて二次抗体溶液を調製します。
- 二次抗体溶液を膜に加えます。光から保護するためにアルミ箔で覆われた穏やかな攪拌で1時間インキュベート。
- 抗体溶液を廃棄し、膜を0.1%Tween PBSで3回リンスし、穏やかな攪拌で5分間、光から保護します。
- 露光および画像化装置上の膜を画像化する。
- メーカーの指示に従って、700総タンパク質染色を戻して全タンパク質の膜を染色します。
注:ウェスタンブロッティングによるジストロフィン検出は、患者の年齢/突然変異、および十分なジストロフィンを蓄積するのに十分な時間を融合し、接着し続ける細胞の能力に依存します。
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Representative Results
このプロトコルは、ヒト皮膚由来線維芽細胞培養を確立し、それらを筋芽細胞に変換し、次に分化された筋管に変換する方法を示しています。このタイプの細胞株は、神経筋障害の研究や潜在的な治療法の インビトロ試験に非常に 有用である。
線維芽細胞変換の概略図を図1に示す。図2Aは、皮膚の断片とそれから出てくる線維芽細胞を示す。合流に達したら、線維芽細胞を新しい皿に渡す必要があります(図2B)。図3Aは、ドキシサイクリンを補充した筋芽細胞増殖培地に変化する前の線維芽細胞の理想的な合流点を示す。細胞は変換プロセス中にまだ増殖するため、約70%のコンフルエントである必要があります。細胞が80%以上のコンフルエントである場合、分化が損なわれる可能性があります。筋芽細胞への変換には2~4日かかり、形態の観察によって確認されます。図 3Bに示すように、セルは細長く平行に向きます。分化培地を添加した後、筋芽細胞は分裂を停止し、多核化ミオチューブを形成するために融合し始める(図3C)。myotubes の境界線が白く明るく見えると、それらは取り外されようとしています(図4)。この時点で、セルを収集または固定します。
分化の成功は、異なる細胞株/突然変異によって異なります。成熟した筋管によって発現される筋タンパク質の免疫染色は、変換された線維芽細胞の筋形成電位を確認する(図5)。FMミオチューブと骨格筋を比較したRNA-Seq分析は、胚性(MYH3)および新生児(MYH8)ミオシン鎖遺伝子からの転写産物の高レベル発現を示し、筋との全体的な転写全体の相関が良好である(図6)。巨大肉体タンパク質チチン(TTN)、ネブリン(NEB)、およびオブスクリン(OBSCN)の転写産物もFMミオチューブによって発現され、筋肥形成に関与するこれらの大きな転写産物のアップレギュレーションを示す。したがって、FM細胞は筋肉特異的発現プロファイルを有し、筋肉由来細胞株の有用で信頼性の高いサロゲートであることを実証する。
エクソンスキップを説明するために 、DMD 遺伝子の中で最も頻繁なエキソン重複の1つでこのプロトコルを使用しました。エキソン2の複製は、DMD読み取りフレームの破壊を招き、従って、エキソンスキップに続くリーディングフレームの復元は、全長のジストロフィンの発現につながるはずである。 しかしながら、エキソン2のスキップが非常に効率的であり、フレーム外転写を生じる可能性もある。それにもかかわらず、この場合、エキソン2の両方のコピーをスキップすると、エキソン5に存在する代替内部リボソームエントリ部位(IRES)の利用を誘発し、それによって70代12の患者に同定された機能的なN切り捨てられたジストロフィンを産生する。 図7A は、エキソン2重複を有するFM細胞のRT-PCRの代表的な結果を示す。FM細胞は、エキソン2をスキップするアンチセンス配列を運ぶAONまたはAAV1-U7のいずれかで処理した。 図7Bにおいて、免疫ブロットは、AAV1-U7で処理されたFM細胞におけるN切り捨てられたジストロフィンの検出を示す。FM細胞の インビトロ 治療は、エキサクスト戦略の概念実証として機能します。
図1:線維芽細胞の筋芽細胞への変換の模式図表 皮膚生検はヒトの被験者から得られる。皮膚の破片は、文化の料理に置かれています。1週間以内に、線維芽細胞が出現し始める。線維芽細胞は、まず hTERT 遺伝子で形質転換され、次に ミオド 遺伝子を用いてレンチウイルスベクターを用いる。感染細胞の抗生物質選択後、筋芽細胞への変換は、筋芽細胞増殖培地にドキシサイクリンを添加することによって誘導される。2~4日以内に、細胞は細長くなり、平行に向きが付きます。分化培地に切り替えた後、筋芽細胞は互いに融合し、多核化ミオチューブを形成する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:培養における皮膚生検断片 (A) 皮膚断片から最初に線維芽細胞が出現する。(B) 皮膚断片からコンフルエント線維芽細胞が出現した。スケールバー:50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:線維芽細胞のトランスセ分化 (A) 70%コンフルエント線維芽細胞の代表的な画像。(B)変換された筋芽細胞は細長い形態を有し、並行して組織化されている。(C)ミオチューブを7日間分化した。スケールバー:50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: ミオチューブの取り外しの代表的な画像 矢印は、ミオチューブの白と明るいエッジが切り離され始めているのを示しています。スケールバー:50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:分化ミオチューブの蛍光免疫健康に由来する筋管内のミオシン重鎖の免疫染色(A)個人および神経筋障害患者(BおよびC).Bでは、230CTGを繰り返し運ぶ筋緊張性ジストロフィー1型(DM1)からの細胞が示され、Cでは900CTG反復を有するDM1細胞である。スケールバー:100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:骨格筋と比較したFMミオチューブのトランスクリプトームパターン 骨格筋と比較したFMミオチューブのトランスクリプトームパターン。FMミオチューブとヒト骨格筋生検から調製されたイルミナRNA-Seqライブラリに対する12,134のトランスクリプトに対する100万回のマッピング読み取りあたりの読み取り数が示されています。2つのライブラリー間のトランスクリプトレベルはピアソン相関が0.71、スピアマン順位相関は0.73でした。発達筋重鎖および大きな肉体タンパク質の転写産物は赤色で強調表示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:代表RT-PCRおよびウェスタンブロットはFM細胞におけるDMDエキソンスキップを示す。 DMDエキソン2の重複を有する患者からの線維芽細胞をFM細胞に変換した。筋生検から抽出したRNAをコントロールとして用い、FM未治療細胞が同じ複製転写産物を発現することを示す。AONで処理されたFM細胞はエキソン2重複の部分的なスキップを有し、AAV1-U7処理細胞は、エキソン2重複がスキップされた転写物の優位性を示した。(B)AAV1-U7で処理したFM細胞の代表的な免疫ブロット。より小さいN切り捨てられたジストロフィンは、処置の14日後に検出された(矢印で示される)。以前にWeinらで公開されたデータ。DMD exon 5 IRES からの翻訳は、ヒトおよびマウスのジストロフィーノパシーを減衰させる機能性ジストロフィンアイソフォームをもたらします。自然医学.2014. 2020 スプリンガーネイチャーリミテッド.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 線維芽細胞増殖培地 | 20%FBS、1%抗生物質抗ミコティックを有するDMEM |
| 凍結媒体 | 10% DMSO、 90% 線維芽細胞培地 |
| ドキシサイクリンストック溶液1000X | 1 mL超純水中の8mgのドキシサイクリン。0.22 μmシリンジフィルターでフィルター。PCRチューブのアリコート。光から保護された-20°Cで保管してください。 |
| ミオブラスト培地 | 骨格筋細胞増殖培地(上記のリストを参照)サプリメント、8 μg/mLドキシサイクリン。例えば:1000xのストック溶液の100のμLの100 mL。 |
| 分化媒体 | 骨格筋細胞分化培地(上記のリストを参照)、8 μg/mLドキシサイクリン。例えば:1000xのストック溶液の100のμLの100 mL。 |
| IF染色のためのブロッキングソリューション | 1X PBSで10%ヤギ血清(または二次抗体が上昇した動物の血清) |
| タンパク質抽出用のベースバッファー | NaCl 150 mM、トリス50 mM、0.05 % NP-40。pH を 7.4 に調整します。4 °Cで保管。 |
表 1: 中程度のレシピ
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Discussion
良質のFM細胞株を得るためには、いくつかのステップが重要です。皮膚生検が早く処理されるほど、健康な線維芽細胞を得る可能性が高くなります。線維芽細胞培養の通過数も重要である。原発細胞は増殖能力が限られており、多くの通過後、それらは複製老化に入る。したがって、できるだけ早い通路で低い通過数で線維芽細胞のストックを有し、細胞を変換する方が良い。
もう一つの重要なステップはまた、最大の純度と正確な定量を有するウイルス産生を有することです。例えば、qPCRを用いたウイルスゲノム定量は合理的な測定を提供するが、ddPCR(デジタル液滴PCR)による定量はより正確である。
さらに、筋芽細胞変換のための線維芽細胞の適切な合流点が重要である。細胞が70%以下または80%以上のコンフルエントである場合、筋原性分化が損なわれる可能性がある。細胞があまりにもコンフルエントである場合、染色およびイメージングを妨げる筋管の層の重ね合わせがあります。ドキシサイクリンの濃度は、 ミオド 遺伝子の正確な活性化および持続的な発現のために重要である。メディアの変更を行う前に、常にドキシサイクリンを培地に添加することが非常に重要です。 ストックは-20°Cで1000Xの濃度で保存し、光から保護する必要があります。解凍したアリコートを再凍結しないでください。再現性のある実験を確実にし、技術的な問題から遺伝子変異による分化の障害を識別するために、これらの詳細に従うことが非常に重要です。それにもかかわらず、突然変異または疾患の種類によっては、良好な分化が不可能である。信頼できる結果を得るためには、同様の通過番号で実験を複製することが非常に重要です。
私たちの経験では、分化能力は、特に野生型のコントロールにおいて、少なくとも25-27を通過まで持続する。同じことが、いくつかの病気の細胞株に有効かもしれないが、それは細胞株に依存する。一部のDMD細胞株は、P20以上の筋形成電位を依然として保持している。反対に、筋緊張性ジストロフィー1型(DM1)細胞株はP8後に減少した筋原性を示した。しかし、DM1の場合、DM1の変異が間接的に筋肉分化16に役割を果たしていることが実証されているので、これは驚くべきことではない。筋原性分化能力の保持は個別に対処する必要がありますが、一般的に、ほとんどの細胞株はP20-25まで保持します。
要約すると、線維芽細胞の筋芽細胞への変換は、神経筋疾患の治療戦略を研究し、テストするための強力なツールです。これは、筋肉生検の複雑な妨害を回避することにより、ヒト細胞モデルへのアクセスを容易にし、患者のための筋肉生検の不便を軽減します.
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Disclosures
全国小児病院は、オーデンテス・セラピューティクスにここに記載されているエクソン2スキッププログラムをライセンスしています。K.M.F.とN.W.は、このライセンスの結果としてロイヤリティ支払いを受け取りました。
Acknowledgments
過去にモデルに関する知識を共有してくれたヴィンセント・ムーリー博士に感謝したいと思います。この研究は、米国国立衛生研究所神経障害・脳卒中研究所(R01 NS043264(K.M.F.、 R.B W.))、米国国立国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS)(P50 AR070604-01(K.M.F.、K.M、R.N.、N.W.)。N.W.は、オハイオ州立大学/全国小児病院マッスルグループとフィリップ財団からフェローシップサポートを受けています。この作品はまた、内部の裁量資金によってサポートされ、エキソン2スキップ作業の一部は、CureDuchenne(K.M.F.)とアソシエーションフランセーズコントレミオパシーによってもサポートされています。IRB 番号: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 および IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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