Summary
Detta protokoll beskriver omvandlingen av huden fibroblaster till myoblaster och deras differentiering till myotubes. Cellinjerna kommer från patienter med neuromuskulära sjukdomar och kan användas för att undersöka patologiska mekanismer och testa terapeutiska strategier.
Abstract
Undersökningar av både patofysiologi och terapeutiska mål i muskulösa dystrophies har hämmats av den begränsade proliferative kapaciteten hos mänskliga myoblaster. Flera musmodeller har skapats men de representerar antingen inte riktigt sjukdomens mänskliga fysiopatologi eller är inte representativa för det breda spektrumet av mutationer som finns hos människor. Odödlighet av mänskliga primära myoblaster är ett alternativ till denna begränsning; det är dock fortfarande beroende av muskelbiopsier, som är invasiva och inte lätt tillgängliga. Däremot är hudbiopsier lättare att få och mindre invasiva för patienter. Fibroblaster som härrör från hudbiopsier kan förevigas och transdifferentieras till myoblaster, vilket ger en källa till celler med utmärkt myogen potential. Här beskriver vi en snabb och direkt omprogrammeringsmetod för fibroblast till en myogen härstamning. Fibroblaster transduceras med två lentivirus: hTERT för att föreviga den primära kulturen och en tet-inducerbar MYOD, som vid tillsats av doxycyklin inducerar omvandlingen av fibroblaster till myoblaster och sedan mogna myotuber, som uttrycker sena differentieringsmarkörer. Detta snabba transdifferentieringsprotokoll representerar ett kraftfullt verktyg för att undersöka patologiska mekanismer och för att undersöka innovativa genbaserade eller farmakologiska bioterapier för neuromuskulära sjukdomar.
Introduction
Cellulära modeller som erhålls direkt från mänskliga vävnader är användbara för att modellera många mänskliga genetiska störningar, med fördelen att ha det ursprungliga genomiska sammanhanget och i många fall reproducera samma molekylära och cellulära kännetecken som observerats hos patienterna. Inom området neuromuskulära störningar har muskelbiopsier varit en stor källa till mänskliga myoblaster och har hjälpt till att belysa patologiska mekanismer. Dessutom är de ett viktigt verktyg för in vivo-testning av läkemedel och genterapier. Å ena sidan är härledning av myoblaster från muskelfragment relativt lätt. Å andra sidan är kulturen och underhållet av primära myoblaster utmanande, på grund av deras begränsade spridningshastighet och replikatoriska senescens in vitro1. Ett alternativ för dessa begränsningar är att föreviga myoblaster med införandet av de mänskliga telomeraserna (hTERT) och / eller cyklinberoende kinas 4 (CDK4) gener2,3, med bevarande av skelettmuskulaturfunktioner4. Obtention av primära myoblaster är dock fortfarande beroende av muskelbiopsi, ett kirurgiskt ingrepp med nackdelar för patienterna, som i många fall har sina muskler i avancerad degeneration. Således består muskeln hos dessa patienter av en betydande andel fibrotisk och/eller fettvävnad och ger färre muskelceller, vilket kräver rening av cellerna tidigare till odödlighet.
I motsats till muskelbiopsier är hudbiopsier mer tillgängliga och mindre skadliga för patienter. Primära fibroblaster kan härledas från hudfragment in vitro. Även om fibroblaster inte främst påverkas av mutationer som orsakar neuromuskulära störningar, kan de överföras till myoblaster. Detta kan uppnås genom införandet av Myod-genen, en myogen regulatorisk transkriptionsfaktor5. I detta manuskript beskriver vi protokollet för att erhålla transdifferentierade myoblaster, från upprättandet av fibroblastkulturer till obtention av differentierade myotuber (en representativ sammanfattning av metoden visas i figur 1).
Preklinisk testning av terapeutiska strategier är beroende av cellulära och animaliska modeller som bär mutationer som liknar de mutationer som finns hos mänskliga patienter. Även om utvecklingen av djurmodeller har blivit mer genomförbar med utvecklingen av genredigeringsteknik som CRISPR / Cas96, är det fortfarande utmanande och kostsamt. Således är patientbaserade cellinjer ett tillgängligt alternativ att ha modeller, som täcker det stora spektrumet av mutationer av sjukdomar som Duchennes muskeldystrofi (DMD). Obtention och skapande av cellmodeller är avgörande för utvecklingen av personliga terapier för sådana patologier.
Bland personliga terapier som har undersökts är exon hoppstrategier en av de lovande för olika muskulösa dystroféer7,8. Denna strategi består av att producera ett kortare men funktionellt protein. Detta utförs genom att dölja exondefinitionen för skapliceosomen, vilket utesluter den muterade exon från den slutliga budbäraren. Detta är en mycket lovande teknik som har godkänts av FDA för DMD. Således beskriver vi också i detta protokoll, metoder för att transfect myoblaster med två olika exon hoppa över relaterade tekniker: antisense oligonucleotides (AON) och U7snRNA-adeno-associerade virus (AAV). AON transfection är ett bra verktyg för den första screeningen av flera sekvenser utformade för att främja exon hopparöver 9. AONs verksamhet är dock övergående. För att få ett ihållande uttryck för antisenssekvenser utforskade vi också små kärn-RNAs (snRNAs) i kombination med AAV, vilket möjliggör kärnlokalisering och inkludering i skarvmaskineriet10. U7 är ett snRNA som är involverat i bearbetningen av histon mRNA som kan konstrueras för att binda proteiner som kommer att omdirigera det till skapliceosomen och leverera antisensesekvenser11. Användningen av modifierade U7 snRNAs i kombination med AAV vektorer övervinner begränsningar av AONs vilket resulterar i ett fortsatt uttryck av AONs och bättre transduktion av vävnader av intresse12. Vi använder celler som härrör från DMD patienter för detta protokoll för att illustrera exon-hoppa strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment och tarmbiopsier utfördes enligt de berörda institutionernas etiska regler under godkännande av Nationalwide Children's Hospital Institutional Review Board.
1. Initiering av dermal fibroblasts kultur
- Etablering av fibroblaster kultur
- Alikvot 10 ml fibroblastmedium(tabell 1)i 15 ml koniska rör. Hudbiopsin ska placeras och transporteras i detta medium. Biopsin kan förvaras vid 4 °C tills den bearbetas, företrädesvis samma dag.
OBS: Använd hudbiopsin inom 24-36 timmar för att undvika potentiell tillväxt av kontaminering. - Aspirera mediet från röret och skölj biopsin med 10 ml 1X PBS (rumstemperatur) tre gånger. Efter den tredje tvätten, lämna PBS i röret.
- Häll ut PBS och huden på en 10 cm2 skål.
- Använd sterila skalpeller och skär biopsin i så små fragment som möjligt.
- Använd en pipett, överför ett individuellt hudfragment och släpp det i en ren 10 cm2 maträtt. Placera 10 till 12 fragment per maträtt.
- Aspirera överskottet av PBS från varje fragment. Var noga med att inte aspirera fragmentet.
- Täck disken delvis med locket och låt hudfragmenten torka i 5-20 min. Låt inte fragmenten torka för mycket.
- När fragmenten är torra, luta skålen i 45 grader och tillsätt långsamt 12 ml fibroblastmedium till hörnet. Sänk ner skålen och fördela försiktigt mediet så att fragmenten inte lyfts av media.
- Placera disken i inkubatorn (37 °C, 5 % CO2). Byt ut mediet om 5-7 dagar och en gång i veckan efteråt.
- Observera de fibroblaster som kommer ut ur fragmentet(figur 2)och passage cellerna i 75 cm2 flaskor när de har sammanflöde. Ta bort mediet, skölj cellerna med PBS och tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin. Inkubera vid 37 °C i 5 minuter eller tills alla celler lyfts. Tillsätt 10 ml fibroblasttillväxtmedium för att hämma trypsinet och överföra cellerna till en ny kolv.
OBS: För passagenummer nomenklaturen fastställs P1 när de första fibroblasterna som uppstod från hudbiopsin överförs till en ny kolv för spridning.
- Alikvot 10 ml fibroblastmedium(tabell 1)i 15 ml koniska rör. Hudbiopsin ska placeras och transporteras i detta medium. Biopsin kan förvaras vid 4 °C tills den bearbetas, företrädesvis samma dag.
- Cryopreservation av primära fibroblast linjer
- När kolven på 75 cm2 har konfluent sköljs den med 10 ml 1X PBS och aspirera PBS.
- Tillsätt 3 ml 0,25 % trypsin till cellytan. Placera kolven i inkubatorn i 5 minuter. Kontrollera kolvarna under mikroskopet för att se om cellerna lyfts. Om inte, placera tillbaka kolven i inkubatorn i ytterligare 5 minuter.
- När cellerna har lossnat, tillsätt 7 ml fibroblastmedier till kolven och pipetten upp och ner för att återanvända cellerna. Samla cellerna i ett 50 ml koniskt rör.
- Förbered 100 μL alikvot trypanblått och ta bort 100 μL från provet som kryopreserveras, blanda med trypanblått. Ladda blandningen på hemocytometern för att räkna. Räkna cellerna i fyra olika fält i hemocytometern under mikroskopet. Om du vill beräkna det totala antalet celler använder du formeln: (räknade celler/100) * kulturvolym.
- Snurra de koniska rören vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur eller 4 °C.
- Aspirera av mediet och återanvänd cellerna i tillräcklig volym av frysmedel: 1 ml per varje 1 miljon celler/injektionsflaska. Pipett upp och ner för att homogenisera och fördela 1 ml till varje märkt kryovial.
- Placera injektionsflaskan i frysboxen och låt injektionsflaskan frysa med en hastighet av 1 °C/min vid -80 °C frys över natten.
- Följande dag överför injektionsflaskan till en flytande kvävetank eller -150 °C frys.
2. Upprättande av FibroMyoblasts (FM) cellinje
- Frö primära fibroblaster vid cirka 30% av sammanflödet i två brunnar av en 12-brunnsplatta (2 x 104 celler / brunn) för att ha cirka 50% av confluency nästa dag.
- För lentiviral transduktion, tillsätt 2 till 5 x 109 vg (virala genompartiklar) av hTERT-puromycin lentivirus i 400 μL fibroblastmedium. Till den andra brunnen, tillsätt bara 400 μL fibroblastmedium. Lägg till 1 ml media följande dag.
OBS: Plasmider för lentivirusproduktion erhölls från gruppen som publicerade Chaouch et al, 2009 papper. De beskrivs också individuellt i Aure et al, 200713 för hTERT plasmid och Barde et al, 200614 för Tet-on systemet som används för utformningen av MyoD plasmid. De erhölls tack vare ett materialöverföringsavtal med Genethon, Frankrike (vänligen kontakta Dr Vincent Mouly för att få dessa plasmider - vincent.mouly@upmc.fr). Kort, hTERT består av hTERT variant 1 drivs av en CMV promotor medan puromycin drivs av en PGK promotor. MyoD-plasmiden innehåller en MyoD-variant 1 som drivs av en CMV-promotor under kontroll av förtrycket rtTA2. Denna plasmid innehåller också hygromycinvalet uttryckt tack vare SV40-promotorn.
Lentivirus producerades med regelbunden lentiviral produktion (se Wang och McManus JoVe protokoll15). Kort, MDL-hjälpare, Rev-Helper, SVS-G-hjälpare transfected via kalciumklorid nederbörd också av antingen hTERT eller MyoD plasmider. Efter 48 h samlades supernaten in, och sedan i ytterligare tre dagar. Alla supernatant koncentrerades sedan av ultracentrifugation. Pelleten återanvändes sedan till Tris-HCL+NaCl+EDTA-buffert. Titer uppskattning utvärderades av standard lentivirus qPCR analys. - En eller två dagar senare överför du cellerna till en 6-brunnsplatta och odlar dem tills de når 60-70% sammanflöde.
- Komplettera fibroblastmediet med 1 μg/ml puromycin och tillsätt 2 ml till varje brunn.
- Håll cellerna under markering tills alla celler i kontrollbrunnen är döda (upp till 12 dagar), ändra media var 2-3 dagar. Passage cellerna från 6-brunnsplattan i två 10 cm2 rätter för ytterligare spridning.
- Frys injektionsflaskan med fibroblaster efter valet. Etikett som F(hTer).
- Frö hTERT-uttrycker fibroblaster (F(hTer)) vid ca 30% sammanflöde i fibroblast medium, i två brunnar av en 12-brunnsplatta, för att ha ca 50% sammanflöde nästa dag.
- För lentivirustransduktion, blanda 2 till 5 x 109 vg MyoD-hygromycinB lentivirus i 400 μl fibroblastmedium och lägg till respektive brunnar; till den tredje brunnen tillsätt 400 μl fibroblastmedium. Tillsätt 1 ml medium nästa dag.
- En eller två dagar senare överföra cellerna till en 6-brunnsplatta och växa tills 60-70% sammanflöde.
- Komplettera fibroblast tillväxtmediet med hygromycin B (400 μg/mL) och tillsätt 2 ml till varje brunn.
- Håll cellerna under markering tills alla celler i kontrollbrunnen är döda (upp till 12 dagar), ändra media var 2-3 dagar.
- Frys injektionsflaskan med fibroblaster efter valet. Etikett som FM följt av cellidentifieringsnumret/namnet.
3. Transdifferentieringsprotokoll
- Frötransducerad FM på 10 cm2 rätter med 30-40% sammanflöde. I en 12-brunnsplatta frö 6 x 104 celler (detta är beroende av den enskilda cellinjen).
OBS: För immunostaining, fröceller på glasöverdrag eller kammarrrutschbanor belagda med Matrigel. Späd matrigel vid 1:10 i DMEM medium, tillsätt en volym som är tillräckligt för att täcka ytan och låt bilderna sitta vid rumstemperatur i en timme. Aspirera av precis innan du sår cellerna. - För myoblaster induktion, när fibroblasterna nådde 70% sammanflöde (Figur 3A), skölj cellytan med PBS och tillsätt färska myoblast media kompletteras med färska 8 μg/mL doxycyklin.
OBS: Framgången med differentiering äventyras efter 80% sammanflöde. - Efter två till tre dagar senare är cellerna 90-95% konfluenta och deras morfologi kommer att ha förändrats (Figur 3B). Skölj cellytan med PBS och tillsätt färska differentieringsmedier kompletterade med färskt 8 μg/mL doxycyklin.
- Fortsätt att byta media var 2-3 dagar utan att passa tills myotuber har etablerats (bekräfta via morfologi) (Figur 3C).
- Sju till tio dagar efter start av myotube differentiering, celler bör vara helt differentierade och kan börja lossna eller dö. Innan detta händer, skörda myotuber för vidare analys.
Obs: Tidsförbanan för myotubebildning beror på cellinjen. Mutationer i muskelrelaterade proteiner kan störa den myogena potentialen. När myotuber börjar verka ljusa och ser vita ut vid gränserna är det en signal som de börjar lossna (Bild 4). - För att skörda myotuber, samla media och överföra det till ett 50 ml koniskt rör. Mediet kan innehålla myotuber som har lossnat.
- Skölj myotuben med 5 ml PBS och överför PBS till 50 ml-röret.
- Tillsätt 3 ml 0,25 % trypsin till cellytan. Placera skålen i inkubatorn i 5 minuter. Kontrollera skålen under mikroskopet för att se om cellerna lyfts. Om inte, placera tillbaka den i inkubatorn i ytterligare 5 minuter.
- När cellerna har lossnat, tillsätt 7 ml fibroblastmedel till skålen och pipetten upp och ner för att återanvända cellerna. Samla cellerna i det koniska röret på 50 ml.
- Centrifug vid 1 200 x g i 7 min vid 4 °C.
- Aspirera försiktigt av vätskan, utan att störa pelleten. Förvara pelletsen vid -80 °C tills den bearbetas vidare.
4. Immunostaining av differentierade myotuber
OBS: För immunostaining, odla cellerna i glaslock eller kammarrglas som nämnts ovan.
- När myotuber är helt differentierade, aspirera av media och skölj försiktigt bilderna med PBS. Aspirera pbs av.
- Tillsätt färsk 4% PFA (500 μL per brunn på en 12-brunnsplatta) och inkubera vid rumstemperatur i 10 min. Aspirera bort PFA.
- Skölj med 1 ml PBS.
- Inkubera med 0,2 M glycin vid rumstemperatur, i 10 min. Aspirera av glycin.
- Permeabilisera med PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/brunn på en 12-brunnsplatta), i 10 min med mild agitation.
- Blockera med 300 μL/brunn blockeringslösning i 10 min med mild omrörning.
- Inkubera med primär antikropp utspädd 1:50 i 300 μL blockeringslösning, i 2 timmar vid rumstemperatur, med skonsam skakning.
- Skölj tre gånger med 1 ml/brunn PBS i 5 min, med skonsam skakning.
- Inkubera med sekundär antikropp utspädd 1:500 i 300 μL blockeringslösning, i 1 timme, vid rumstemperatur, med mild skakning. Täck plattan med aluminiumfolie.
- Skölj tre gånger med 1 ml/brunn PBS i 5 min, med skonsam skakning.
- Inkubera med DAPI utspädd i PBS i 10 minuter. Skölj tre gånger med 1 ml/brunn PBS.
- Tillsätt en droppe monteringsmedium till en glasrutschbana. Ta bort täcket med tång och placera det med ansiktet nedåt på droppen av monteringsmediet.
- Vänd in på en pappershandduk och tryck försiktigt för att ta bort bubblor och överskott av monteringsmedium.
- Försegla rutschkanorna med nagellack och förvara vid 4 °C tills avbildningen.
5. Antisens oligonukleotid transfection
OBS: Protokollet nedan är för transfection av en 6-brunnsplatta. Justera volymerna därefter för mindre eller större plattor. Transfekten görs i 100% konfluenta myoblaster när cellerna är redo för differentieringssteget.
- Aspirera myoblast tillväxtmediet och skölj cellerna med 1 ml PBS.
- Tillsätt 500 μL/brunn OptiMEM-media och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Späd ut antisens oligonukleotid (AON) i 100 μL OptiMEM till önskad slutlig koncentration (dvs. 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
OBS: Detta protokoll är optimerat för 2'ometyl-fosforothioate AONs. - Blanda lipofectaminet med OptiMEM (slutlig volym på 100 μL) för att ge ett slutligt förhållande på 1:1 (μg DNA: μL lipofectamin). Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
- Kombinera det utspädda lipofectaminet med den utspädda AON. Blanda försiktigt genom pipetting och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur för att möjliggöra komplex bildning. Undvik luftbubblor.
- Tillsätt 200 μL lipofectamin och AON-blandning till respektive brunnar. Inkubera cellerna över natten vid 37 °C, 5 % CO2.
- Följande dag ta bort transfection mixen och tillsätt 2 ml varmt differentieringsmedier kompletterat med doxycyklin.
- Samla in celler minst tre dagar senare för RNA-extraktion eller sju till 21 dagar vid proteinanalys.
OBS: De dagar av differentiering som krävs för att upptäcka RNA och/eller proteinuttryck kan variera i enlighet med den gen som är av intresse eller cellinjen. När det gäller DMDär det möjligt att upptäcka dess mRNA inom tre dagar. Dystrofiproteindetektering kräver minst sju dagar. Detta varierar beroende på cellinjen. Höga koncentrationer av AON och transfection reagens kan påverka transdifferentieringen.
6. AAV1-U7 transduktion
Obs: Detta protokoll var optimerat för 6-brunnsplattor. Justera volymerna proportionellt mot kulturytan. Transduktionen görs i 100% konfluenta myoblaster när cellerna är redo för differentieringssteget. AAV1 är AAV-serotypen med den bästa transduktionskapaciteten hos odlade myoblaster.
- Aspirera av myoblast tillväxtmediet och skölj cellerna med 1 ml PBS.
- Späd 0,5-1 x 1011 viruspartiklar av AAV1-U7 i 700 μL av varma differentieringsmedier kompletterade med doxycyklin.
OBS: Vi använder qPCR för att bestämma viruskoncentrationen. Mängden virus som ska användas kan variera beroende på kvantifieringsmetoden och bör bestämmas tidigare med hjälp av en reporteranalys. - Tillsätt virusblandningen till brunnen genom att släppa den homogent.
- Följande dag, tillsätt 1,3 ml varmt differentieringsmedier kompletterat med doxycyklin.
- Samla cellerna minst tre dagar senare för RNA-extraktion eller sju till 21 dagar vid proteinanalys.
7. RNA-extraktion
OBS: Allt material som används under detta steg ska vara RNase gratis.
- Tillsätt 500 μL TRIzol per pellet och rör upp och ner flera gånger för att säkerställa att cellerna är homogent lysade.
- Överför celllysatet i ett 1,5 ml-rör och inkuberat i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 100 μL kloroform och skaka manuellt i 15 s. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifug vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C. Samla vattenfasen (övre) och överför den till ett nytt 1,5 ml-rör.
- För 1 volym av vattenfasen, tillsätt 1 volym etanol 100% och blanda genom pipetting.
OBS: Vi rekommenderar kolonnrening och koncentration. - Överför provet till en Zymo-Spin IC-kolonn i ett uppsamlingsrör och centrifugera vid 12 000 x g i 30 s. Kassera genomflödet.
- För matsmältningen I i kolumn DNase I, förtvätta kolonnen med 400 μL RNA-tvättbuffert. Centrifug vid 12 000 x g för 30 s. Kassera genomflödet.
- Förbered 40 μL DNase reaktionsblandning per prov. Blanda 5 μL DNase I med 35 μL DNA-rötningsbuffert.
- Lägg till blandningen direkt i kolumnmatrisen. Inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt 400 μL RNA Prep Buffer till kolonnen och centrifugera vid 12 000 x g i 30 s. Kassera genomflödet.
- Tillsätt 700 μL RNA-tvättbuffert i kolonnen och centrifug vid 12 000 x g i 30 s. Kassera genomflödet.
- Tillsätt 400 μL RNA-tvättbuffert i kolonnen och centrifug vid 12 000 x g i 2 minuter för att säkerställa fullständig borttagning av tvättbufferten. Överför kolonnen försiktigt till ett RNase-fritt 1,5 mL-rör.
- Tillsätt 15 μL nukleasfritt vatten direkt till kolumnmatrisen. Inkubera i 5 min och centrifugera vid 12 000 x g i 1 minut.
OBS: Samla in det eluterade RNA och applicera det igen på kolumnen för att öka avkastningen. Centrifug vid 12 000 x g i 1 minut. - Placera prover på is och kvantifiera proverna i en Nanodrop.
- Förvara prover vid -80 °C.
8. RT-PCR-analys
OBS: I detta steg presenterar vi ett förslag på reagenser för att upptäcka uttrycket av dystrofi mRNA, men det kan enkelt anpassas till andra reagenser av val.
- Omvänd transkription
- Tina upp alla reagenser och håll dem på is.
- Förbered en blandning med 4 μL 5x reaktionsbuffert, 2 μL dNTP-blandning (10 mM), 1 μL RiboLock RNase-hämmare och 1 μL RevertAid RT.
- Blanda röret försiktigt och centrifugera kort.
- I 0,2 ml PCR-rör, tillsätt tillräcklig volym RNA för att ha 1 μg per reaktion. Tillsätt nukleasfritt vatten q.s.p 12 μL. Inkludera ett rör utan omvänd transkriptas som negativ kontroll och ett rör med nukleasfritt vatten istället för RNA.
- Fördela 8 μL reaktionsblandning per rör. Den totala volymen är 20 μL.
- Placera rören i en termocyklist och inkubera i 5 minuter vid 25 °C följt av 60 min vid 42 °C. Stoppa reaktionen genom att värma vid 70 °C i 5 minuter.
- Placera rören på is eller vid -20 °C för längre förvaring.
- Pcr
OBS: Designa primers vid exons korsningar helst.- Vortex reagenser och snurra ner före användning.
- Förbered en huvudblandning med 0,5 μL framåtprimer (25 μM), 0,5 μL omvänd primer (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix och 8,5 μL nukleasfritt vatten per prov.
- Alikvot 22 μL master mix i ett rör för varje prov.
- Tillsätt 3 μL cDNA (150 ng) till respektive PCR-rör. Tillsätt 3 μL nukleasfritt vatten till PCR-minuskontrollröret.
- Virvel och snurra ner PCR-rören.
- Inkubera rören i en termocyklist vid 95 °C i 3 min, 95 °C i 30 s (Tm-5) °C i 30 s, 72 °C i (1 min/kb) 34 gånger, 72 °C i 5 min.
OBS: Den optimala glödgningstemperaturen kan bestämmas empiriskt. För den föreslagna huvudblandningen, subtrahera 5 °C från primer smälttemperaturen. - Ladda 12 μL PCR-reaktionen på en agarosgel och frys proverna vid -20 °C.
9. Upptäckt av dystrofiuttryck av västra Blotting
OBS: Detta protokoll är optimerat för dystrofi, ett stort membranprotein. Särskilda tillstånd kan behövas för olika proteiner.
- Protein extraktion
- Efter 7-21 dagars differentiering, samla celler med 5 ml PBS med 100 μL 0,5 M EDTA och 50 μL proteashämmare. Inkubera vid 37 °C tills cellerna lossnar. Centrifug vid 1 200 x g i 5 min vid 4 °C. Snäpp ihop pelleten genom att doppa röret i flytande kväve. Förvara pelleten vid -80 °C eller fortsätt till lyssteget.
- Förbered lysbufferten genom att tillsätta 1% av digitonin, 1% proteashämmare, 10% fosfatashämmare och basbuffert till total volym (60 μL per cellpellet).
- Tillsätt 60 μL lysbuffert till cellpelleten på is. Sonicate för 5 s. Låt sitta på isen i 8 s. Upprepa ultraljudsbehandling och vila steg två gånger.
- Inkubera prover på is i 30 minuter.
- Centrifug vid 14 000 x g i 20 min vid 4 °C.
- Överför supernaten till rena rör.
- Kvantifiera prover med bicinchoninicsyra (BCA) enligt tillverkarens instruktioner.
- Blanda proteinlösningen med lämplig volym Laemmli-buffert. Gör alikvoter på 100 μg. Justera vid behov volymen till 25 μl med baslysbuffert. Förvara prover vid -80 °C.
- Västra blotting
- Tina prover på is.
- Denaturera proverna vid 100 °C i 5 min, kyl sedan ner dem i is, snurra ner.
- Späd 20X Tris-acetat SDS-körbufferten i 200 ml dH2O och tillsätt 500 μL antioxidant.
- Förbered 3-8% Tris-acetat polyakrylamidgelen genom att ta bort kammen och skölja med dH2O. Montera gelén i elektroforesapparaten. Fyll den inre kammaren med löpbuffert.
- Ladda 5 μL proteinstege och 25 μL prov i gelén. Fyll ytterkammaren med löpbuffert.
- Kör vid 80 V i 1 timme vid 4 °C. Sedan vid 120 V för 2 h vid 4 °C.
- Förbered 3 L 1X överföringsbuffert med 150 ml 20X metanol, 150 ml 20X överföringsbuffert och 2 700 ml dH2O. Kyl ner den till 4 °C.
- Skär 4 bitar filterpapper och ett nitrocellulosamembran. Blötlägg pappersfiltret och membranet i en bricka med överföringsbuffert.
- Ta försiktigt bort gelén från fodralet och montera den i överföringsapparaten med filterpapper, membran och svampar. Gelén placeras på den negativa sidan och membranet på den positiva sidan.
- Kör överföring vid 300 mA, omrörning, vid 4 °C, över natten.
- Blockera membranet i 10 ml blockeringsbuffert i 1 timme med mild omrörning vid rumstemperatur.
- Bered primär antikroppslösning med 10 ml blockeringsbuffert och 50 μL dystrofiantikropp (1:200).
- Kassera blockeringsbufferten och lägg till den primära antikroppslösningen. Inkubera med mild omrörning i minst 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
- Skölj membranet tre gånger med 0,1% Tween PBS, i 5 min med mild agitation.
- Bered sekundär antikroppslösning med 10 ml blockeringslösning, 2 μL antikaninantikropp (1:5000) och 20 μL 0,2 % interpolering.
- Tillsätt den sekundära antikroppslösningen i membranet. Inkubera i 1 h med mild omrörning, täckt med aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
- Kassera antikroppslösningen och skölj membranet 3 gånger med 0,1% Tween PBS, i 5 minuter med mild omrörning, skyddad mot ljus.
- Exponering och avbilda membranet på en bildbehandlingsenhet.
- Färga membranet för totalt protein med Revert 700 Total Protein fläck, enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Dystrofi detektion genom västra blotting beror på patientens ålder/mutation och cellens förmåga att smälta och hålla sig fäst tillräckligt med tid för att ackumulera tillräckligt med dystrofi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll visar hur man etablerar mänskliga hudbaserade fibroblastkulturer och omvandlar dem till myoblaster och sedan till differentierade myotuber. Denna typ av cellinje är extremt användbar för studier av neuromuskulära störningar och in vitro-testning av potentiella terapier.
En schematisk representation av fibroblastomvandlingen visas i figur 1. Figur 2A visar ett fragment av huden och fibroblasterna som kommer ut ur den. Fibroblasterna ska överföras till en ny maträtt när sammanflödet uppnås (figur 2B). Figur 3A visar den idealiska sammanflödet av fibroblaster innan du byter till myoblast tillväxt medium kompletterat med doxycyklin. Cellerna bör vara cirka 70% konfluenta eftersom de fortfarande förökar sig under omvandlingsprocessen. Om cellerna är över 80% konfluenta kan differentieringen äventyras. Omvandlingen till myoblaster tar två till fyra dagar, och det bekräftas av observation av morfologi. Cellerna blir långsträckta och parallellorienterade, vilket visas i figur 3B. Efter tillsats av differentieringsmediet slutar myoblasterna att dela sig och börjar smälta för att bilda flerkärniga myotuber (Figur 3C). När myotubesgränserna ser vita och ljusa ut är de på väg att lossna (figur 4). Samla eller åtgärda cellerna vid denna tidpunkt.
Differentieringsframgången varierar mellan olika cellinjer/mutationer. Immunostaining av muskelproteiner uttryckta av mogna myotuber bekräftar den myogena potentialen hos konverterade fibroblaster (Figur 5). RNA-Seq-analys som jämförde FM myotuber och skelettmuskel visade hög nivå uttryck av transkriptioner från embryonala (MYH3) och neonatal (MYH8) myosin kedjan gener och bra övergripande transkriptom-wide korrelation med muskler (Figur 6). Transkript för de gigantiska sarkomiska proteinerna titin (TTN), nebulin (NEB) och obscurin (OBSCN) uttrycks också av FM myotuber, vilket indikerar uppreglering av dessa stora transkriptioner som är involverade i myofibrillogenes. Således har FM-celler en muskelspecifik uttrycksprofil, vilket visar att de är en användbar och pålitlig surrogat för muskelbaserade cellinjer.
För att illustrera exon hoppa, använde vi detta protokoll i en av de vanligaste exon dupliceringar i DMD genen. Duplicering av exon 2 leder till störningar i DMD-läsramen, vilket innebär att restaureringen av läsramen efter exonhoppning bör leda till uttrycket av full längd dystrofi. Det är dock också möjligt att hoppa över exon 2 är mycket effektivt vilket resulterar i en out-of-frame transkription. I detta fall, hoppa över båda kopior av exon 2 inducerar användningen av en alternativ inre ribosom ingång webbplats (IRES) närvarande i exon 5, vilket producerar funktionella N-trunkerade dystrofin som identifierades hos patienter fortfarande ambulant i deras 70s12. Figur 7A visar representativa resultat av RT-PCR för FM-celler med exon 2 duplicering. FM-celler behandlades antingen med AON eller AAV1-U7 som bär en antisense sekvens för att hoppa över exon 2. I figur 7Bvisar en immunoblot detektion av N-trunkerad dystrofin i FM-celler behandlade med AAV1-U7. In vitro-behandling av FM-celler fungerar som konceptbevis för exon-hoppningsstrategier.
Figur 1:Schematisk representation av fibroblaster omvandlas till myogena celler. En hudbiopsi erhålls från människor. Hudfragment placeras på kulturrätter. Inom en vecka börjar fibroblaster dyka upp. Fibroblaster transducerades först med hTERT-genen, och sedan med Myod-genen, med hjälp av lentivirala vektorer. Efter antibiotiska urval av infekterade celler induceras omvandlingen till myoblaster genom tillsats av doxycyklin till myoblast tillväxtmediet. Inom två till fyra dagar blir cellerna långsträckta och parallellt orienterade. Efter byte till differentieringsmedium smälter myoblasten med varandra och bildar flernukleära myotuber. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Hudbiopsifragment i kulturen. A)De första fibroblasterna kommer från hudfragmentet. B)Konfluenta fibroblaster uppstod ur hudfragmentet. Skalbar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fibroblaster transdifferentiering. (A) Representativ bild av 70% konfluenta fibroblaster. (B) Konverterade myoblaster har långsträckt morfologi och är parallellt organiserade. (C) Myotubes var differentierade i 7 dagar. Skalbar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativ bild av att ta bort myotuber. Pilarna indikerar att myotubens vita och ljusa kanter börjar lossna. Skalbar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Immunofluorescens av differentierade myotuber. Immunostaining av myosin tunga kedjan i myotubes härrör från en friska(A)individ och patienter med neuromuskulära störningar(B och C). I B visas celler från myotonic dystrofi typ 1 (DM1) som bär 230 CTG repetitioner, och i C är DM1 celler med 900 CTG repetitioner. Skalbar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Transkriptommönster för FM-myotuber jämfört med skelettmuskulatur. Transkriptom mönster av FM myotubes jämfört med skelettmuskulatur. Läsräkningen per miljon kartlagda läsningar för 12 134 transkriptioner visas för Illumina RNA-Seq-bibliotek som är förberedda från FM-myotuber och en mänsklig skelettmuskelbiopsi. Transkriptionsnivåer mellan de två biblioteken hade en Pearson korrelation på 0,71 och en Spearman rank korrelation på 0,73. Transkript för de utvecklingsmässiga myosin tunga kedjorna och de stora sarkomiska proteinerna markeras i rött. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Representativ RT-PCR och Western blot som visar DMD-exon som hoppar över i FM-celler. Fibroblaster från en patient som hyser en duplicering av DMD exon 2 omvandlades till FM-celler. RNA extraheras från muskel biopsi användes som kontroll, visar att FM obehandlade celler uttrycker samma duplicerade transkription. FM-celler som behandlats med AON har en partiell överhoppning av exon 2 duplicering, medan AAV1-U7 behandlade celler visade en dominans av transkriptioner med exon 2 duplicering hoppas över. B) Representativ immunoblot av FM-celler som behandlats med AAV1-U7. Mindre N-trunkerade dystrofin upptäcktes 14 dagar efter behandling (indikeras av pilen). Uppgifter som tidigare publicerats i Wein et al. Översättning från en DMD exon 5 IRES resulterar i en funktionell dystrofi isoform som dämpar dystroinopati hos människor och möss. Naturmedicin. 2014. Springer Nature Limited 2020. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Fibroblast tillväxt medium | DMEM med 20% FBS, 1% antiantimicotisk |
| Frysning medium | 10% DMSO, 90% fibroblast medium |
| Doxycyklin lagerlösning 1000X | 8 mg doxycyklin i 1 ml ultrarent vatten. Filtrera i 0,22 μm sprutfilter. Aliquot i PCR-rör. Förvara vid -20 °C, skyddad mot ljus. |
| Myoblast medium | Skelettmuskulaturcellstillväxtmedium (se listan ovan) med kosttillskott, 8 μg/mL doxycyklin. Till exempel: 100 μL 1000X lagerlösning i 100 ml. |
| Differentieringsmedium | Skelettmuskelcellsdistanseringsmedium med kosttillskott (se listan ovan), 8 μg/mL doxycyklin. Till exempel: 100 μL 1000X lagerlösning i 100 ml. |
| Blockeringslösning för IF-färgning | 10% getserum (eller serum av djur där sekundär antikropp höjdes) i 1X PBS |
| Basbuffert för proteinutvinning | NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 0,05 % NP-40. Justera pH till 7,4. Förvaras vid 4 °C. |
Tabell 1: Medelstora recept
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att få FM-cellinjer med god kvalitet är vissa steg kritiska. Ju tidigare huden biopsi bearbetas, desto större är chansen att få friska fibroblaster. Passagenumret av fibroblastkulturer är också viktigt. Primära celler har begränsad proliferativ kapacitet och efter många passager kommer de in i replikativ senescens. Således är det bättre att ha ett lager av fibroblaster vid ett lågt passagenummer och omvandla celler så snart som möjligt.
Ett annat viktigt steg är också att ha virusproduktion som har maximal renhet och noggrann kvantifiering. Till exempel ger viral genom kvantifiering med qPCR rimliga mätningar, men kvantifiering av ddPCR (digital droplet PCR) är mer exakt.
Dessutom är det adekvata sammanflödet av fibroblaster för myoblast omvandling avgörande. Om cellerna är under 70% eller över 80% konfluent kan den myogena differentieringen försämras. Om cellerna är för konfluenta kommer det att finnas en superposition av lager av myotuber, vilket stör färgning och avbildning. Koncentrationen av doxycyklin är avgörande för korrekt aktivering och ihållande uttryck av Myod genen. Det är mycket viktigt att alltid tillsätta doxycyklin till mediet precis innan du gör medieförändringar, eftersom det bryts ned snabbt efter att ha spädts ut i medium och lagrats vid 4 °C. Beståndet ska förvaras vid -20 °C vid en koncentration av 1000X och skyddas mot ljus. Frys inte upp tinade alikvoter igen. Det är mycket viktigt att följa dessa detaljer för att säkerställa reproducerbara experiment och diskriminera en nedsatt differentiering på grund av en genetisk mutation från tekniska problem. Ändå, beroende på mutationen eller typen av sjukdom, en bra differentiering kanske inte är möjlig. För att säkerställa pålitliga resultat är det mycket viktigt att replikera experiment med liknande passagenummer.
Enligt vår erfarenhet kvarstår differentieringskapaciteten åtminstone fram till passage 25-27, särskilt i vilda kontroller. Detsamma kan gälla för vissa sjuka cellinjer, men det beror på cellinjen. Vissa DMD-cellinjer behåller fortfarande den myogena potentialen över P20. I opposition, en myotonic dystrofi typ 1 (DM1) cellinje presenteras minskade myogenicitet efter P8. När det gäller DM1 är detta dock inte förvånande eftersom det har visat sig att mutationer i DM1 indirekt spelar en roll i muskel differentiering16. Bibehållandet av den myogena differentieringskapaciteten bör åtgärdas individuellt, men i allmänhet behåller de flesta cellinjer den upp till P20-25.
Sammanfattningsvis är omvandlingen av fibroblaster till myoblaster ett kraftfullt verktyg för att studera och testa terapeutiska strategier för neuromuskulära störningar. Det underlättar tillgången till mänskliga cellmodeller genom att undvika komplicerad obtention av muskelbiopsier och minska besväret med en muskelbiopsi för patienterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Rikstäckande barnsjukhus har licensierat det exon 2 hoppprogram som beskrivs häri till Audentes Therapeutics. K.M.F. och N.W. har fått royaltybetalningar som ett resultat av denna licens.
Acknowledgments
Vi vill tacka dr Vincent Mouly för att han tidigare har delat med sig av sin kunskap om modellen. Detta arbete har stötts av US National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., och R.B.W.)), US National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., och N.W.). N.W. har fått stipendiestöd från Ohio State University/Nationwide Children's Hospital Muscle Group och Philippe Foundation. Detta arbete stöddes också av interna diskretionära medel och en del av exon 2-hopparbetet har också stötts av CureDuchenne (K.M.F.) och Association Francaise Contre Les Myopathies. IRB-nummer: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 och IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M.
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
