Summary
Denne protokollen beskriver konvertering av hudfibroblaster til myoblaster og deres differensiering til myotubes. Cellelinjene er avledet fra pasienter med nevromuskulære lidelser og kan brukes til å undersøke patologiske mekanismer og for å teste terapeutiske strategier.
Abstract
Undersøkelser av både patofysiologi og terapeutiske mål i muskeldystrofier har blitt hindret av den begrensede proliferative kapasiteten til menneskelige myoblaster. Flere musemodeller er opprettet, men de representerer enten ikke virkelig sykdommens menneskelige fysipatologi eller er ikke representative for det brede spekteret av mutasjoner som finnes hos mennesker. Udødeliggjøringen av menneskelige primære myoblaster er et alternativ til denne begrensningen; Det er imidlertid fortsatt avhengig av muskelbiopsier, som er invasive og ikke lett tilgjengelige. I motsetning er hudbiopsier lettere å oppnå og mindre invasive for pasienter. Fibroblaster avledet fra hudbiopsier kan udødeliggjøres og transdifferentiated i myoblaster, noe som gir en kilde til celler med utmerket myogent potensial. Her beskriver vi en rask og direkte omprogrammeringsmetode for fibroblast til en myogen avstamning. Fibroblaster transduced med to lentivirus: hTERT å udødeliggjøre den primære kulturen og en tet-induserbar MYOD, som ved tillegg av doxycyklin induserer konvertering av fibroblaster til myoblaster og deretter modne myotubes, som uttrykker sen differensiering markører. Denne raske transdifferentiation protokollen representerer et kraftig verktøy for å undersøke patologiske mekanismer og å undersøke innovative genbaserte eller farmakologiske biotherapies for nevromuskulære lidelser.
Introduction
Cellulære modeller hentet direkte fra menneskelig vev er nyttige for å modellere mange menneskelige genetiske lidelser, med fordelen av å ha den opprinnelige genomiske konteksten og i mange tilfeller reprodusere de samme molekylære og cellulære kjennetegnene observert hos pasientene. Innen nevromuskulære lidelser har muskelbiopsier vært en stor kilde til humane myoblaster og har hjulpet til med belysning av patologiske mekanismer. I tillegg er de et viktig verktøy for in vivo testing av legemidler og genterapi. På den ene siden er avledningen av myoblaster fra muskelfragmenter relativt enkelt. På den annen side er kulturen og vedlikeholdet av primære myoblaster utfordrende, på grunn av deres begrensede spredningshastighet og repliktiv senescence in vitro1. Et alternativ for disse begrensningene er å udødeliggjøre myoblaster med innsetting av human telomerase (hTERT) og/ eller sylinavhengig kinase 4 (CDK4) gener2,3, med bevaring av skjelettmuskulatur funksjoner4. Likevel er obtensjon av primære myoblaster fortsatt avhengig av muskelbiopsi, en kirurgisk prosedyre med ulemper for pasientene, som i mange tilfeller har musklene i avansert degenerasjon. Dermed består muskelen til disse pasientene av en betydelig andel fibrotisk og / eller fettvev og gir færre muskelceller, som krever rensing av cellene tidligere til udødeliggjøring.
I motsetning til muskelbiopsier er hudbiopsier mer tilgjengelige og er mindre skadelige for pasientene. Primære fibroblaster kan avledet fra hudfragmenter in vitro. Selv om fibroblaster ikke primært påvirkes av mutasjoner som forårsaker nevromuskulære lidelser, kan de transdifferentiated til myoblaster. Dette kan oppnås ved innsetting av Myod genet, en myogen regulatorisk transkripsjon faktor5. I dette manuskriptet beskriver vi protokollen for å få transdifferentiated myoblaster, fra etablering av fibroblaster kulturer til obtensjon av differensierte myotubes (en representativ oppsummering av metoden er avbildet i figur 1).
Preklinisk testing av terapeutiske strategier er avhengig av cellulære og dyremodeller som bærer mutasjoner som ligner mutasjonene som finnes hos menneskelige pasienter. Selv om utviklingen av dyremodeller har blitt mer gjennomførbart med forkant av genredigeringsteknologier som CRISPR/Cas96,er det fortsatt utfordrende og kostbart. Dermed er pasientavledede cellelinjer et tilgjengelig alternativ for å ha modeller, som dekker det store spekteret av mutasjoner av sykdom som Duchenne muskeldystrofi (DMD). Obtensjon og opprettelse av cellemodeller er avgjørende for utviklingen av personlige terapier for slike patologier.
Blant personlige terapier som har blitt undersøkt, exon hoppe strategier er en av de lovende for ulike muskeldystrofier7,8. Denne strategien består av å produsere et kortere, men funksjonelt protein. Dette utføres ved å skjule exon definisjonen til skjøteosomet, derfor unntatt mutert exon fra den endelige budbringeren. Dette er en svært lovende teknologi som har blitt godkjent av FDA for DMD. Dermed beskriver vi også i denne protokollen, metoder for å transfect myoblaster med to forskjellige exon hoppe relaterte teknologier: antisense oligonucleotides (AON) og U7snRNA-adeno-assosiert virus (AAV). AON transfection er et godt verktøy for den første screening av flere sekvenser designet for å fremme exon hoppe9. Aktiviteten til AONer er imidlertid forbigående. For å oppnå et vedvarende uttrykk for antisense-sekvenser, utforsket vi også små kjernefysiske RNA-er (snRNAs) kombinert med AAV, slik at kjernefysisk lokalisering og inkludering i skjøtemaskineriet10. U7 er en snRNA involvert i behandlingen av histone mRNA som kan konstrueres for å binde proteiner som vil omdirigere den til spleissomet og levere antisense sekvenser11. Bruken av modifiserte U7 snRNAs i kombinasjon med AAV vektorer overvinner begrensninger av AONer som resulterer i et fortsatt uttrykk for AONer og bedre transduksjon av vev av interesse12. Vi bruker celler avledet fra DMD-pasienter for denne protokollen for å illustrere exon-skipping strategien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter og biopsier ble utført etter de etiske reglene til institusjonene som var involvert under godkjenning av Nationwide Children's Hospital Institutional Review Board.
1. Initiering av dermal fibroblasts kultur
- Etablering av fibroblaster kultur
- Aliquot 10 ml fibroblast medium (Tabell 1) i 15 ml koniske rør. Hudbiopsien skal plasseres og transporteres i dette mediet. Biopsien kan lagres ved 4 °C til den behandles, fortrinnsvis på samme dag.
MERK: Bruk hudbiopsien innen 24-36 timer for å unngå potensiell vekst av forurensning. - Aspirer mediet fra røret og skyll biopsien med 10 ml 1X PBS (romtemperatur) tre ganger. Etter den tredje vasken, la PBS i røret.
- Hell ut PBS og huden på en 10 cm2 tallerken.
- Bruk sterile skalpeller, kutt biopsien i så små som mulig fragmenter.
- Bruk en pipette til å overføre et individuelt hudfragment og slipp det i en ren 10 cm2-tallerken. Plasser 10 til 12 fragmenter per tallerken.
- Aspirer det overskytende av PBS fra rundt hvert fragment. Vær forsiktig så du ikke aspirerer fragmentet.
- Dekk oppvasken delvis med lokket og la hudfragmentene tørke i 5-20 min. Ikke la fragmentene tørke for mye.
- Når fragmentene er tørre, vipp parabolen ved 45 grader og legg sakte til 12 ml fibroblastmedium til hjørnet. Senk ned parabolen, forsiktig distribuere media slik at fragmentene ikke løfte av media.
- Plasser rettene i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2). Bytt ut media om 5-7 dager, og en gang i uken etterpå.
- Vær oppmerksom på fibroblastene som kommer fra fragmentet (figur 2) og når de er samløpet,pass cellene i 75 cm2 flasker. Fjern mediet, skyll cellene med PBS og tilsett 1 ml 0,25 % trypsin. Inkuber ved 37 °C i 5 min eller til alle cellene løftes. Tilsett 10 ml fibroblastvekstmedium for å hemme trypsin og overføre cellene til en ny kolbe.
MERK: For passasjenummer nomenklatur etableres P1 når de første fibroblastene som kom ut av hudbiopsien overføres til en ny kolbe for spredning.
- Aliquot 10 ml fibroblast medium (Tabell 1) i 15 ml koniske rør. Hudbiopsien skal plasseres og transporteres i dette mediet. Biopsien kan lagres ved 4 °C til den behandles, fortrinnsvis på samme dag.
- Kryopreservation av primære fibroblast linjer
- Når den 75 cm2 kolben er samløpet, skyll den med 10 ml 1X PBS og aspirer PBS.
- Tilsett 3 ml 0,25 % trypsin til celleoverflaten. Legg kolben i inkubatoren i 5 min. Kontroller kolben under mikroskopet for å se om cellene løftes. Hvis ikke, plasser kolben tilbake i inkubatoren i ytterligere 5 min.
- Når cellene er løsrevet, legg til 7 ml fibroblastmedia til kolben og pipetten opp og ned for å gjenbruke cellene. Samle cellene i et 50 ml konisk rør.
- Forbered 100 μL aliquot av trypan blå, og fjern 100 μL fra prøven blir kryopreservert, bland med trypan blå. Legg blandingen på hemocytometeret for å telle. Telle cellene i fire forskjellige felt av hemocytometeret under mikroskopet. Hvis du vil beregne totalt antall celler, bruker du formelen: (talte celler/100) * kulturvolum.
- Spinn de koniske rørene ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur eller 4 °C.
- Aspirer av mediet og resuspend cellene i tilstrekkelig volum av frysing medium: 1 ml per hver 1 million celler / hetteglass. Pipette opp og ned for å homogenisere og distribuere 1 ml til hver merket kryovial.
- Plasser hetteglassene i fryseboksen, og la hetteglassene fryse med en hastighet på 1 °C/min ved -80 °C fryser over natten.
- Dagen etter overfører du hetteglassene til en flytende nitrogentank eller -150 °C fryser.
2. Etablering av FibroMyoblasts (FM) cellelinje
- Frø primære fibroblaster på ca 30% av samløpet i to brønner av en 12-brønns plate (2 x 104 celler / brønn) for å ha ca 50% av samløpet neste dag.
- For lentiviral transduksjon, tilsett 2 til 5 x 109 vg (virale genompartikler) av hTERT-puromycin lentivirus i 400 μL fibroblast medium. Til den andre brønnen, tilsett bare 400 μL fibroblast medium. Legg til 1 ml medier dagen etter.
MERK: Plasmider for lentivirusproduksjon ble hentet fra gruppen som publiserte Chaouch et al, 2009 papir. De er også beskrevet individuelt i Aure et al, 200713 for hTERT plasmid og Barde et al, 200614 for Tet-on-systemet som brukes til utformingen av MyoD plasmid. De ble innhentet takket være en materialoverføringsavtale med Genethon, Frankrike (vennligst kontakt Dr. Vincent Mouly for å få disse plasmids - vincent.mouly@upmc.fr). Kort sagt består hTERT av hTERT-variant 1 drevet av en CMV-promotor mens puromycin drives av en PGK-promotor. MyoD plasmid inneholder en MyoD-variant 1 drevet av en CMV-promotor under kontroll av repressor rtTA2. Denne plasmid inneholder også hygromycin utvalg uttrykt takket være SV40 arrangør.
Lentivirus ble produsert ved hjelp av vanlig lentiviral produksjon (se Wang og McManus JoVe protokoll15). Kort sagt, MDL-hjelper, Rev-Helper, SVS-G-hjelper ble transfected via kalsiumklorid nedbør også av enten hTERT eller MyoD plasmider. Etter 48 timer ble supernatanten samlet inn, og deretter i ytterligere tre dager. Alle supernatant ble deretter konsentrert av ultracentrifugation. Pellet ble deretter gjenbrukt til Tris-HCL + NaCl + EDTA buffer. Titer estimering ble evaluert ved standard lentivirus qPCR-analyse. - En eller to dager senere, overføre cellene til en 6-brønns plate og vokse dem til de når 60-70% samløpet.
- Supplere fibroblastmediet med 1 μg/ml puromycin og tilsett 2 ml til hver brønn.
- Hold cellene under valg til alle cellene i kontrollbrønnen er døde (opptil 12 dager), endre medier hver 2-3 dager. Pass cellene fra 6-brønnsplaten i to 10 cm2 retter for videre spredning.
- Frys hetteglass med fibroblaster etter valg. Merk som F(hTer).
- Frø hTERT-uttrykkende fibroblaster (F(hTer)) ved ca 30% samløpet i fibroblast medium, i to brønner av en 12-brønns plate, for å ha ca 50% samløpet neste dag.
- For lentivirustransduksjon, bland 2 til 5 x 109 vg av MyoD-hygromycinB lentivirus i 400 μl fibroblast medium og legg til respektive brønner; til den tredje brønnen legge 400 μl fibroblast medium. Tilsett 1 ml medium neste dag.
- En eller to dager senere overføre cellene til en 6-brønns plate og vokse til 60-70% samløpet.
- Supplere fibroblast vekstmedium med hygromycin B (400 μg / ml) og tilsett 2 ml til hver brønn.
- Hold cellene under valg til alle cellene i kontrollbrønnen er døde (opptil 12 dager), endre medier hver 2-3 dager.
- Frys hetteglass med fibroblaster etter valg. Etikett som FM etterfulgt av celleidentifikasjonsnummeret/-navnet.
3. Transdifferentiation protokoll
- Frø transdusert FM på 10 cm2 retter med 30-40% samløpet. I en 12-brønns plate, frø 6 x 104 celler (dette er avhengig av den enkelte cellelinjen).
MERK: For immunstaining, frøceller på glassdeksler eller kammer lysbilder belagt med Matrigel. Fortynn Matrigel på 1:10 i DMEM medium, tilsett et volum nok til å dekke overflaten, og la lysbildene sitte ved romtemperatur i en time. Aspirer av rett før seeding cellene. - For myoblaster induksjon, når fibroblastene nådde 70% samløpet (figur 3A), skyll celleoverflaten med PBS og tilsett friske myoblastmedier supplert med frisk 8 μg / ml doxycyklin.
MERK: Suksessen til differensiering er kompromittert forbi 80% samløpet. - Etter to til tre dager senere, cellene er 90-95% samløpet og deres morfologi vil ha endret seg (Figur 3B). Skyll celleoverflaten med PBS og tilsett ferske differensieringsmedier supplert med fersk 8 μg/ml doxycyklin.
- Fortsett å endre media hver 2-3 dager uten passaging til myotubes er etablert (bekreft via morfologi) (Figur 3C).
- Syv til ti dager etter at myotube-differensieringen er startet, bør cellene være helt differensiert og kan begynne å løsne eller dø. Før dette skjer, høst myotubes for videre analyse.
MERK: Tidsforløpet for myotubedannelsen avhenger av cellelinjen. Mutasjoner i muskelrelaterte proteiner kan forstyrre det myogene potensialet. Når myotubes begynner å vises lyse og ser hvitt på grensene er det et signal de begynner å løsne (Figur 4). - For å høste myotubes, samle media og overføre den til et 50 ml konisk rør. Mediet kan inneholde myotubes som har løsnet.
- Skyll myorørene med 5 ml PBS og overfør PBS til 50 ml-røret.
- Tilsett 3 ml 0,25 % trypsin til celleoverflaten. Plasser fatet i inkubatoren i 5 min. Kontroller parabolen under mikroskopet for å se om cellene løftes. Hvis ikke, plasser den tilbake i inkubatoren i ytterligere 5 min.
- Når cellene er løsrevet, legg til 7 ml fibroblastmedia til parabolen og pipetten opp og ned for å gjenbruke cellene. Samle cellene til 50 ml konisk rør.
- Sentrifuge ved 1200 x g i 7 min ved 4 °C.
- Aspirer forsiktig av væsken, uten å forstyrre pelleten. Oppbevar pellets ved -80 °C til videre behandling.
4. Immunstaining av differensierte myotuber
MERK: For immunstaining, vokse cellene i glassdeksler eller kammersklier som nevnt ovenfor.
- Når myotubes er helt differensiert, aspirer av media og skyll lysbildene forsiktig med PBS. Aspirer PBS av.
- Tilsett frisk 4% PFA (500 μL per brønn av en 12-brønns plate) og inkuber ved romtemperatur i 10 min. Aspirere PFA av.
- Skyll med 1 ml PBS.
- Inkuber med 0,2 M glycin ved romtemperatur, i 10 min. Aspirere glycin av.
- Permeabilize med PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL / brønn av en 12-brønns plate), i 10 min med mild agitasjon.
- Blokker med 300 μL/brønn med blokkeringsløsning, i 10 min med mild agitasjon.
- Inkuber med primært antistoff fortynnet 1:50 i 300 μL blokkerende løsning, i 2 timer ved romtemperatur, med mild risting.
- Skyll tre ganger med 1 ml/brønn pbs i 5 min, med skånsom risting.
- Inkuber med sekundært antistoff fortynnet 1:500 i 300 μL blokkerende løsning, i 1 time, ved romtemperatur, med mild risting. Dekk platen med aluminiumsfolie.
- Skyll tre ganger med 1 ml/brønn pbs i 5 min, med skånsom risting.
- Inkuber med DAPI fortynnet i PBS i 10 minutter. Skyll tre ganger med 1 ml/brønn med PBS.
- Legg til en dråpe monteringsmedium til et glasssklie. Fjern dekkslippen med tang og plasser den med forsiden ned på dråpe monteringsmediet.
- Inverter skyv på et papirhåndkle og trykk forsiktig for å fjerne bobler og overskudd av monteringsmedium.
- Forsegle lysbildene med neglelakk og oppbevar ved 4 °C til bildebehandling.
5. Antisense oligonukleotid transfection
MERK: Protokollen nedenfor er for transinfeksjon av en 6-brønns plate. Juster volumene tilsvarende for mindre eller større plater. Transfection gjøres i 100% samløpet myoblaster når cellene er klare for differensieringstrinnet.
- Aspirer myoblastvekstmediet og skyll cellene med 1 ml PBS.
- Tilsett 500 μL/brønn optimem media og inkuber ved 37 °C i 1 time.
- Fortynn antisense oligonukleotid (AON) i 100 μL OptiMEM til ønsket endelig konsentrasjon (det vil si 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
MERK: Denne protokollen er optimalisert for 2'ometyl-fosforetioat AONer. - Bland lipofectamine med OptiMEM (endelig volum på 100 μL) for å gi et endelig forhold på 1:1 (μg DNA: μL lipofectamine). Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Kombiner fortynnet lipofectamine med fortynnet AON. Bland forsiktig ved å pipettere og inkubere i 20 min ved romtemperatur for å tillate kompleks dannelse. Unngå luftbobler.
- Tilsett 200 μL lipofectamine og AON-blanding til respektive brønner. Inkuber cellene over natten ved 37 °C, 5 % CO2.
- Neste dag fjerner du transfeksjonsblandingen og tilsett 2 ml varme differensieringsmedier supplert med doxycyklin.
- Samle celler minst tre dager senere for RNA ekstraksjon eller syv til 21 dager i tilfelle proteinanalyse.
MERK: Dagene med differensiering som er nødvendige for å oppdage RNA og/eller proteinuttrykk, kan variere i henhold til interessens gen eller cellelinjen. Når det gjelder DMD,er det mulig å oppdage mRNA innen tre dager. Dystrophin protein deteksjon krever minst syv dager. Dette vil variere avhengig av cellelinjen. Høye konsentrasjoner av AON og transfeksjonsreagens kan påvirke transdifferentiasjonen.
6. AAV1-U7 transduksjon
MERK: Denne protokollen ble optimalisert for 6-brønnsplater. Juster volumene proporsjonalt med kulturoverflaten. Transduksjonen gjøres i 100% samløpet myoblaster når cellene er klare for differensieringstrinnet. AAV1 er AAV serotypen med den beste transduksjonskapasiteten til kultiverte myoblaster.
- Aspirer av myoblastvekstmediet og skyll cellene med 1 ml PBS.
- Fortynn 0,5-1 x 1011 viruspartikler av AAV1-U7 i 700 μL varme differensieringsmedier supplert med doxycyklin.
MERK: Vi bruker qPCR til å bestemme viruskonsentrasjonen. Mengden virus som skal brukes kan variere avhengig av kvantifiseringsmetoden og bør bestemmes tidligere ved hjelp av en reporteranalyse. - Legg viral blanding til brønnen ved å slippe den homogent.
- Dagen etter legger du til 1,3 ml varme differensieringsmedier supplert med doxycyklin.
- Samle cellene minst tre dager senere for RNA ekstraksjon eller syv til 21 dager i tilfelle proteinanalyse.
7. RNA ekstraksjon
MERK: Alt materiale som brukes i løpet av dette trinnet, skal være RNase gratis.
- Tilsett 500 μL TRIzol per pellet og pipet opp og ned flere ganger for å sikre at cellene er homogent lysed.
- Overfør cellelysatet i et 1,5 ml rør og inkubert i 5 min ved romtemperatur.
- Tilsett 100 μL kloroform og rist manuelt i 15 s. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 12 000 x g i 15 min ved 4 °C. Samle vandig fase (øvre) og overføre den til en ny 1,5 ml rør.
- For 1 volum av vandig fase, tilsett 1 volum etanol 100% og bland ved pipettering.
MERK: Vi anbefaler kolonnerensing og konsentrasjon. - Overfør prøven til en Zymo-Spin IC-kolonne i et oppsamlingsrør og sentrifuge på 12 000 x g for 30 s. Kast gjennomstrømningen.
- For in-column DNase I fordøyelsen, pre-vask kolonnen med 400 μL RNA Wash Buffer. Sentrifuge ved 12 000 x g for 30 s. Kast gjennomstrømningen.
- Forbered 40 μL DNase reaksjonsblanding per prøve. Bland 5 μL DNase I med 35 μL DNA Digestion Buffer.
- Legg blandingen direkte til kolonnematrisen. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Legg til 400 μL RNA Prep Buffer i kolonnen og sentrifuge på 12.000 x g for 30 s. Kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 700 μL RNA-vaskebuffer i kolonnen og sentrifuge ved 12 000 x g for 30 s. Kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 400 μL RNA Vaskebuffer i kolonnen og sentrifuge ved 12 000 x g i 2 min for å sikre fullstendig fjerning av vaskebufferen. Overfør kolonnen nøye til et RNase-fritt 1,5 ml rør.
- Tilsett 15 μL kjernefritt vann direkte til kolonnematrisen. Inkuber i 5 min og sentrifuge på 12.000 x g i 1 minutt.
MERK: Samle eluted RNA og bruke den igjen til kolonnen for å øke utbyttet. Sentrifuge på 12.000 x g i 1 minutt. - Plasser prøver på is og kvantifisere prøvene i en Nanodrop.
- Oppbevar prøvene ved -80 °C.
8. RT-PCR-analyse
MERK: I dette trinnet presenterer vi et forslag til reagenser for å oppdage uttrykket av dystrophin mRNA, men det kan enkelt tilpasses andre reagenser av valget.
- Omvendt transkripsjon
- Tin alle reagensene og hold dem på is.
- Forbered en blanding med 4 μL 5x reaksjonsbuffer, 2 μL dNTP Mix (10 mM), 1 μL RiboLock RNase Inhibitor og 1 μL med ReverstAid RT.
- Bland røret forsiktig og sentrifuge kort.
- I 0,2 ml PCR-rør, tilsett tilstrekkelig volum av RNA for å ha 1 μg per reaksjon. Tilsett kjernefritt vann q.s.p 12 μL. Inkluder ett rør uten omvendt transkripsjon som en negativ kontroll og ett rør med kjernefritt vann i stedet for RNA.
- Fordel 8 μL reaksjonsblanding per rør. Det totale volumet er 20 μL.
- Plasser rørene i en termocycler og inkuber i 5 min ved 25 °C etterfulgt av 60 min ved 42 °C. Stopp reaksjonen ved oppvarming ved 70 °C i 5 minutter.
- Plasser rørene på is eller ved -20 °C for lengre oppbevaring.
- Pcr
MERK: Design primere ved exons veikryss fortrinnsvis.- Vortex reagenser og spinne ned før bruk.
- Klargjør en masterblanding med 0,5 μL fremover primer (25 μM), 0,5 μL revers primer (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix, og 8,5 μL kjernefritt vann per prøve.
- Aliquot 22 μL master mix i et rør for hver prøve.
- Tilsett 3 μL cDNA (150 ng) i det respektive PCR-røret. Tilsett 3 μL kjernefritt vann til PCR negativt kontrollrør.
- Vortex og spinne ned PCR-rørene.
- Inkuber rørene i en termocycler ved 95 °C i 3 min, 95 °C i 30 s, (Tm-5) °C for 30 s, 72 °C i (1 min/kb) 34 ganger, 72 °C i 5 min.
MERK: Den optimale glødetemperaturen kan bestemmes empirisk. For den foreslåtte masterblandingen trekker du 5 °C fra primerens smeltetemperatur. - Legg 12 μL av PCR-reaksjonen på en agarosegel og frys prøvene ved -20 °C.
9. Påvisning av dystrophin uttrykk av Western Blotting
MERK: Denne protokollen er optimalisert for dystrophin, et stort membranprotein. Spesifikke forhold kan være nødvendig for forskjellige proteiner.
- Protein utvinning
- Etter 7-21 dager med differensiering, samle celler med 5 ml PBS med 100 μL 0,5 M EDTA, og 50 μL proteasehemmere. Inkuber ved 37 °C til cellene løsner. Sentrifuge ved 1200 x g i 5 min ved 4 °C. Fest pelleten ved å dyppe røret i flytende nitrogen. Oppbevar pelleten ved -80 °C eller gå videre til lysistrinnet.
- Forbered lysisbufferen ved å tilsette 1 % av digitonin, 1 % proteasehemmer, 10 % fosfatasehemmer og basebuffer til totalt volum (60 μL per cellepellet).
- Tilsett 60 μL lysisbuffer til cellepellet, på is. Sonicate for 5 s. La sitte på is i 8 s. Gjenta sonikering og hviletrinn to ganger.
- Inkuber prøver på is i 30 min.
- Sentrifuge ved 14 000 x g i 20 min ved 4 °C.
- Overfør det overnaturlige til rene rør.
- Kvantifisere prøver ved bicinchonininsyre (BCA) analyse, følg produsentens instruksjoner.
- Bland proteinoppløsningen med riktig volum laemmlibuffer. Lag aliquots av 100 μg. Juster eventuelt volumet til 25 μl med baselysbuffer. Oppbevar prøvene ved -80 °C.
- Vestlig blotting
- Tin prøver på is.
- Denature prøvene ved 100 °C i 5 min, og deretter kjøle dem ned i is, spinne ned.
- Fortynn 20X Tris-acetat SDS kjører buffer i 200 ml dH2O og tilsett 500 μL antioksidant.
- Forbered 3-8% Tris-acetat polyakrylamidgelen ved å fjerne kammen og skylle med dH2O. Monter gelen i elektroforeseapparatet. Fyll det indre kammeret med løpebuffer.
- Legg 5 μL proteinstige og 25 μL prøve i gelen. Fyll det ytre kammeret med løpebuffer.
- Kjør ved 80 V i 1 t ved 4 °C. Deretter, ved 120 V i 2 t ved 4 °C.
- Forbered 3 L 1X overføringsbuffer med 150 ml 20X metanol, 150 ml 20X overføringsbuffer og 2700 ml dH2O. Avkjøl den ned til 4 °C.
- Klipp 4 stykker filterpapir og ett stykke nitrocellulosemembran. Bløtlegg papirfilteret og membranen i en skuff med overføringsbuffer.
- Fjern gelen forsiktig fra etuiet og monter den i overføringsapparatet med filterpapir, membran og svamper. Gelen er plassert på den negative siden og membranen på den positive siden.
- Kjør overføring ved 300 mA under omrøring, ved 4 °C, over natten.
- Blokker membranen i 10 ml blokkeringsbuffer i 1 time med mild omrøring ved romtemperatur.
- Forbered primær antistoffoppløsning med 10 ml blokkerende buffer og 50 μL dystrophin antistoff (1:200).
- Kast blokkeringsbufferen og legg til den primære antistoffløsningen. Inkuber med mild agitasjon i minst 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
- Skyll membranen tre ganger med 0,1% Tween PBS, i 5 min med mild agitasjon.
- Forbered sekundær antistoffoppløsning ved hjelp av 10 ml blokkeringsløsning, 2 μL antikaninantistoff (1:5000) og 20 μL på 0,2 % Tween.
- Tilsett den sekundære antistoffløsningen til membranen. Inkuber i 1 time med mild agitasjon, dekket med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
- Kast antistoffoppløsningen og skyll membranen 3 ganger med 0,1% Tween PBS, i 5 min med mild agitasjon, beskyttet mot lys.
- Eksponering og bilde membranen på en bildeenhet.
- Beis membranen for totalt protein med Tilbake 700 Total Protein flekk, følg produsentens instruksjoner.
MERK: Dystrophindeteksjon ved vestlig blotting avhenger av pasientens alder/mutasjon og cellens evne til å smelte og holde seg festet nok tid til å samle nok dystrophin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen viser hvordan man etablerer menneskelige hudavledede fibroblastkulturer og konverterer dem til myoblaster og deretter til differensierte myotuber. Denne typen cellelinje er svært nyttig for studiet av nevromuskulære lidelser og in vitro-testing av potensielle terapier.
En skjematisk representasjon av fibroblastkonverteringen vises i figur 1. Figur 2A viser et fragment av huden og fibroblastene som kommer fra den. Fibroblastene skal sendes til en ny rett når samløpet er nådd (figur 2B). Figur 3A viser den ideelle samløpet av fibroblaster før du bytter til myoblastvekstmedium supplert med doxycyklin. Cellene skal være rundt 70% samløpet fordi de fortsatt sprer seg under konverteringsprosessen. Hvis cellene er over 80% samløpet, kan differensieringen bli kompromittert. Konverteringen til myoblaster tar to til fire dager, og det bekreftes ved observasjon av morfologien. Cellene blir langstrakte og parallelt orienterte, som vist i figur 3B. Etter tilsetning av differensieringsmediet slutter myoblastene å dele seg og begynner å smelte for å danne multinukleerte myotuber (figur 3C). Når myotubes grenser ser hvit og lys, de er i ferd med å løsne (Figur 4). På dette punktet, samle inn eller fikse cellene.
Differensieringssuksessen vil variere mellom ulike cellelinjer/mutasjoner. Immunstaining av muskelproteiner uttrykt av modne myotubes bekrefter det myogene potensialet til konverterte fibroblaster (figur 5). RNA-Seq analyse sammenligne FM myotubes og skjelettmuskulatur viste høyt nivå uttrykk for transkripsjoner fra embryonale (MYH3) og neonatal (MYH8) myosin kjede gener og god total transkripsjon-bred korrelasjon med muskel (Figur 6). Transkripsjoner for de gigantiske sarkomeriske proteinene titin (TTN), nebulin (NEB) og obscurin (OBSCN) uttrykkes også av FM-myotuber, noe som indikerer oppregulering av disse store transkripsjonene involvert i myofibrillogenesis. Dermed har FM-celler en muskelspesifikk uttrykksprofil, som viser at de er et nyttig og pålitelig surrogat for muskelavledede cellelinjer.
For å illustrere exon hoppe, brukte vi denne protokollen i en av de hyppigste exon dupliseringer i DMD genet. Duplisering av exon 2 fører til forstyrrelse av DMD leserammen, og dermed restaurering av leserammen etter exon hoppe bør føre til uttrykk for full lengde dystrophin. Det er imidlertid også mulig at å hoppe over exon 2 er svært effektivt, noe som resulterer i en ut-av-ramme transkripsjon. Likevel, i dette tilfellet, hoppe av begge kopier av exon 2 induserer utnyttelsen av en alternativ intern ribosom oppføringsstedet (IRES) tilstede i exon 5, og dermed produsere funksjonell N-avkortet dystrophin som ble identifisert hos pasienter fortsatt ambulant i 70-årene12. Figur 7A viser representative resultater av RT-PCR av FM-celler med exon 2 duplisering. FM-celler ble behandlet enten med AON eller AAV1-U7 bærer en antisense sekvens for å hoppe exon 2. I figur 7Bviser en immunoblot påvisning av N-avkortet dystrophin i FM-celler behandlet med AAV1-U7. In vitro behandling av FM-celler fungerer som bevis på konsept for exon-skipping strategier.
Figur 1: Skjematisk representasjon av fibroblaster konvertering til myogene celler. En hudbiopsi er hentet fra menneskelige. Hudfragmenter er plassert på kulturretter. Innen en uke begynner fibroblaster å dukke opp. Fibroblaster transduseres først med hTERT-genet, og deretter med Myod-genet, ved hjelp av lentiviralvektorer. Etter antibiotikavalg av infiserte celler induseres konverteringen til myoblaster ved tilsetning av doxycyklin til myoblastvekstmediet. Innen to til fire dager blir cellene langstrakte og parallelt orienterte. Etter å ha byttet til differensieringsmedium, smelter myoblastsikringen med hverandre og danner multinukleerte myotubes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hudbiopsifragmenter i kultur. (A)Første fibroblaster som kommer fra hudfragment. (B)Samtidige fibroblaster dukket opp fra hudfragmentet. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fibroblaster transdifferentiation. (A) Representativt bilde av 70% samtidige fibroblaster. (B) Konverterte myoblaster har langstrakt morfologi og er parallelt organisert. (C)Myotubes ble differensiert i 7 dager. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativt bilde av å løsne myotubes. Pilene indikerer de hvite og lyse kantene på myotubes begynner å løsne. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Immunofluorescence av differensierte myotubes. Immunstaining av myosin tung kjede i myotubes avledet fra en sunn (A) individ og pasienter med nevromuskulære lidelser (B og C). I B er vist celler fra myotonisk dystrofi type 1 (DM1) bærer 230 CTG repetisjoner, og i C er DM1 celler med 900 CTG repetisjoner. Skala bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Transkripsjonsmønster av FM-myorør sammenlignet med skjelettmuskulatur. Transkripsjonsmønster av FM-myorør sammenlignet med skjelettmuskulatur. Lesetallene per million kartlagte leser for 12 134 transkripsjoner er vist for Illumina RNA-Seq biblioteker utarbeidet fra FM myotubes og en menneskelig skjelettmuskulaturbiopsi. Transkripsjon nivåer mellom de to bibliotekene hadde en Pearson korrelasjon på 0,71 og en Spearman rang korrelasjon på 0,73. Transkripsjoner for utviklings myosin tunge kjeder og de store sarkomeriske proteiner er uthevet i rødt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representativ RT-PCR og western blot som viser DMD exon hoppe i FM-celler. (A) Uttrykk DMD av RT-PCR. Fibroblaster fra en pasient som huser en duplisering av DMD exon 2 ble konvertert til FM-celler. RNA ekstrahert fra muskelbiopsi ble brukt som kontroll, som viser at FM ubehandlede celler uttrykker samme dupliserte transkripsjon. FM-celler behandlet med AON har en delvis hoppe av exon 2 duplisering, mens AAV1-U7 behandlede celler viste en overvekt av transkripsjoner med exon 2 duplisering hoppet over. (B) Representativ immunoblot av FM-celler behandlet med AAV1-U7. Mindre N-avkortet dystrophin ble oppdaget 14 dager etter behandling (indikert med pilen). Data tidligere publisert i Wein et al. Oversettelse fra en DMD exon 5 IRES resulterer i en funksjonell dystrophin isoform som demper dystrofinopati hos mennesker og mus. Naturmedisin. 2014. 2020 Springer Nature Limited. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Fibroblast vekst medium | DMEM med 20% FBS, 1% antibiotika-antimikrotisk |
| Frysing medium | 10% DMSO, 90% fibroblast medium |
| Doxycycline lagerløsning 1000X | 8 mg doxycyklin i 1 ml ultra rent vann. Filtrer i sprøytefilter på 0,22 μm. Aliquot i PCR-rør. Oppbevares ved -20 °C, beskyttet mot lys. |
| Myoblast medium | Skjelettmuskulaturcellevekstmedium (se liste over) med kosttilskudd, 8 μg/ml doxycyklin. For eksempel: 100 μL μL 1000X lagerløsning i 100 ml. |
| Differensieringsmedium | Skjelettmuskelcelledilateringsmedium med kosttilskudd (se listen ovenfor), 8 μg/ml doxycyklin. For eksempel: 100 μL μL 1000X lagerløsning i 100 ml. |
| Blokkeringsløsning for IF-farging | 10 % geiteserum (eller serum av dyr der sekundært antistoff ble hevet) hos 1X PBS |
| Basisbuffer for proteinekstraksjon | NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 0,05 % NP-40. Juster pH til 7,4. Oppbevares ved 4 °C. |
Tabell 1: Middels oppskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å få FM-cellelinjer med god kvalitet, er noen trinn kritiske. Jo før hudbiopsien behandles, desto større er sjansene for å oppnå sunne fibroblaster. Passasjen antall fibroblaster kulturer er også viktig. Primærceller har begrenset proliferativ kapasitet, og etter mange passasjer går de inn i replikerativ senescence. Dermed er det bedre å ha et lager av fibroblaster ved et lavt passasjenummer og forvandle celler tidligst som mulig.
Et annet viktig skritt er også å ha viral produksjon som har maksimal renhet og nøyaktig kvantifisering. For eksempel gir viral genom kvantifisering ved hjelp av qPCR rimelige målinger, men kvantifisering av ddPCR (digital dråpe PCR) er mer nøyaktig.
I tillegg er tilstrekkelig samløpet av fibroblaster for myoblastkonvertering kritisk. Hvis cellene er under 70% eller over 80% samløpet, kan myogen differensiering bli svekket. Hvis cellene er for samløpet, vil det være superposisjon av lag av myotuber, som forstyrrer flekker og bildebehandling. Konsentrasjonen av doxycyklin er avgjørende for korrekt aktivering og vedvarende uttrykk for Myod-genet. Det er svært viktig å alltid legge doxycyklin til mediet rett før du gjør medieendringer, da det forringes raskt etter fortynnet i medium og lagret ved 4 ° C. Bestanden skal oppbevares ved -20 °C i en konsentrasjon på 1000X og beskyttes mot lys. Ikke fryse opptinte aliquots. Det er svært viktig å følge disse detaljene for å sikre reproduserbare eksperimenter og diskriminere en nedsatt differensiering på grunn av en genetisk mutasjon fra tekniske problemer. Likevel, avhengig av mutasjonen eller typen sykdom, kan en god differensiering ikke være mulig. For å sikre pålitelige resultater, er det svært viktig å replikere eksperimenter på lignende passasjenumre.
Etter vår erfaring vedvarer differensieringskapasiteten minst opp til passering 25-27, spesielt i villtypekontroller. Det samme kan være gyldig for noen syke cellelinjer, men det avhenger av cellelinjen. Noen DMD cellelinjer fortsatt beholde myogen potensial over P20. I opposisjon, en myotonisk dystrofi type 1 (DM1) cellelinje presentert redusert myogenitet etter P8. Men i tilfelle av DM1, Dette er ikke overraskende som det har blitt vist at mutasjoner i DM1 indirekte spille en rolle i muskel differensiering16. Oppbevaring av myogen differensieringskapasitet bør løses individuelt, men generelt beholder de fleste cellelinjene det opp til P20-25.
Oppsummert er konvertering av fibroblaster til myoblaster et kraftig verktøy for å studere og teste terapeutiske strategier for nevromuskulære lidelser. Det letter tilgangen til menneskelige cellemodeller ved å unngå komplisert obtensjon av muskelbiopsier og redusere ulempen med en muskelbiopsi for pasientene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nationwide Children's Hospital har lisensiert exon 2 hoppeprogrammet beskrevet her til Audentes Therapeutics. K.M.F. og N.W. har mottatt royalty-betalinger som følge av denne lisensen.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Vincent Mouly for å dele sin kunnskap tidligere om modellen. Dette arbeidet har blitt støttet av US National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., og R.B.W.)), US National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N. og N.W.). N.W. har fått støtte fra Ohio State University/Nationwide Children's Hospital Muscle Group og Philippe Foundation. Dette arbeidet ble også støttet av interne skjønnsmessige midler og en del av exon 2 hoppearbeid har blitt støttet også av CureDuchenne (K.M.F.) og Association Francaise Contre Les Myopathies. IRB-nummer: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 og IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M.
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
