Summary
Vi har utvecklat en ny metod för förlust av funktion som involverar introduktion och genomisk integration av artificiella mikro-RNA-sekvenser i kycklingembryon genom att använda ovo-elektroporering och Tol2-transposonsystemet. Denna teknik ger en robust och stabil metod för att studera genernas funktion under utvecklingen.
Abstract
Kycklingnäthinnan har länge varit ett viktigt modellsystem inom utvecklingsneurobiologin, med fördelar som dess stora storlek, snabba utveckling och tillgänglighet för visualisering och experimentella manipulationer. Dess största tekniska begränsning hade dock varit bristen på robusta metoder för att förlora funktionen för analys av genfunktioner. Detta protokoll beskriver en metod för nedtystning av gener i den växande kycklingnäthinnan som involverar transgent uttryck av artificiella mikroRNA (miRNA) med hjälp av Tol2-transposonsystemet. I detta tillvägagångssätt introduceras en Tol2-transposonplasmid som innehåller en expressionskassett för EmGFP-markören (smaragdgrönt fluorescerande protein) och artificiella pre-miRNA-sekvenser mot en målgen i den embryonala kycklingnäthinnan med en Tol2-transposasuttryckskonstruktion genom in ovo-elektroporering . I de transfekterade näthinnecellerna katalyserar transposaset excisionen av expressionskassetten från transposonvektorn och dess integration i värdkromosomerna, vilket leder till ett stabilt uttryck av miRNA och EmGFP-proteinet. I vår tidigare studie har vi visat att uttrycket av Nel, ett glykoprotein som utövar flera funktioner i neural utveckling, kan undertryckas signifikant i den växande kycklingens näthinna genom att använda denna teknik. Våra resultat indikerar att denna metodik inducerar en stabil och robust hämning av genuttryck och därmed ger en effektiv metod för att förlora funktionen för studier av näthinnans utveckling.
Introduction
Näthinnan hos ryggradsdjur är ett viktigt modellsystem för att studera neural utveckling. Trots sitt perifera läge är näthinnan anatomiskt och utvecklingsmässigt en förlängning av det centrala nervsystemet, och synnerven, som består av axoner av retinala ganglieceller, representerar en kanal i det centrala nervsystemet. Kycklingnäthinnan har betydande fördelar som modellsystem för att studera den molekylära mekanismen för neural utveckling: Den är stor och utvecklas snabbt; Den har strukturella och funktionella likheter med den mänskliga näthinnan; Den är mycket tillgänglig för visualisering och experimentella manipulationer. Molekylära mekanismer för cellproliferation och differentiering, morfogenes och axonstyrning under neural utveckling har studerats utförligt med hjälp av kycklingnäthinnan.
Under de senaste två decennierna har elektroporation använts framgångsrikt för att föra in ektopiska gener i celler i det växande kycklingembryot. Denna teknik möjliggör märkning av celler under utveckling, spårning av cellers öde och spårning av cellmigration och axonvägar, samt ektopiskt genuttryck för in vivo-analys av genfunktion. Förutsättningarna för in ovo-elektroporering för effektivt ektopiskt genuttryck i kycklingembryon är väl etablerade 1,2,3.
Trots dessa fördelar hade avsaknaden av en stabil teknik för studier av genernas funktion varit en stor teknisk begränsning för kycklingembryot. Medan kycklingembryon som elektroporerats med små interfererande RNA (siRNA)4 eller expressionsvektorer för korta hårnåls-RNA (shRNA)5 uppvisar nedbrytning av den riktade genen, är gensuppression i dessa metoder övergående eftersom effekterna försvinner när cellerna förlorar de introducerade RNA eller DNA:erna. En mer stabil gensuppression kan uppnås genom att leverera siRNA till kycklingembryon med ett RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor) retrovirussystem6. Virusvektorn integreras i värdgenomet och de ektopiska generna uttrycks stabilt. Retroviruset kan dock endast integreras i genomet hos celler som delar sig under den mitotiska fasen (M) av cellcykeln, vilket kan medföra en begränsning av de utvecklingsstadier och/eller celltyper för vilka denna metod för funktionsförlust kan tillämpas. Dessutom verkar uttrycket av transgener av RCAS långsammare och mindre robust än det som induceras av in ovo-elektroporering 7.
Transposoner är genetiska element som rör sig från en plats på genomet till en annan. Tol2-elementet är en medlem av hAT-familjen för transposabla element och innehåller en intern gen som kodar för ett transposas som katalyserar transposonreaktionen av Tol2-elementet8. När en plasmidvektor som bär en genuttryckskassett flankerad av sekvenserna i vänster och höger ände av Tol2-elementen (200 bp respektive 150 bp) förs in i celler hos ryggradsdjur med en Tol2-transposasuttryckskonstruktion, skärs expressionskassetten ut från plasmiden och integreras i värdgenomet, vilket stöder ett stabilt uttryck av den ektopiska genen (Figur 1). Det har visat sig att det transposabla Tol2-elementet kan inducera gentransponering mycket effektivt i olika ryggradsdjur, inklusive zebrafisk9,10, grodor11, kycklingar12 och möss13, och därmed är en användbar metod för transgenes och insertionsmutagenes. Tol2-transposonsystemet har framgångsrikt använts för betingad knockdown av en målgen genom genomisk integration av siRNA som bearbetas från långt dubbelsträngat RNA14.
Detta protokoll beskriver en funktionsförlust i kycklingembryot som involverar införandet av artificiella mikroRNA (miRNA) av Tol2-transposonsystemet15,16. I detta tillvägagångssätt klonas en expressionskassett för EmGFP-markören (emerald green fluorescent protein) och artificiella miRNA mot en målgen till en Tol2-transposonvektor. Tol2-transposonkonstruktionen introduceras sedan i den embryonala kycklingnäthinnan med en Tol2-transposasuttryckskonstruktion genom in ovo-elektroporation. I de transfekterade näthinnecellerna katalyserar transposaset excisionen av expressionskassetten från transposonvektorn och dess integration i värdkromosomerna, vilket leder till ett stabilt uttryck av miRNA och EmGFP-proteinet. I våra tidigare studier har vi lyckats slå ner uttrycket av Nel, ett extracellulärt glykoprotein som främst uttrycks i nervsystemet, i den växande näthinnan hos kycklingar (se representativa resultat). Våra resultat tyder på att stabil och effektiv gensuppression kan uppnås i ovo med denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion av miRNA-uttrycksvektorer
OBS: Procedurerna för att konstruera miRNA-uttrycksvektorer (steg 1.1-1.3, 1.5-1.6.) är optimerade för miRNA-uttryckssatsen, Block-iT Pol II miR RNA-uttryckskit med EmGFP, som tidigare beskrivits15,16. Satsen tillhandahåller expressionsvektorn som är utformad för att tillåta miRNA-uttryck (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), en kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativ kontrollplasmid), accessoriska reagenser och instruktioner för att producera miRNA-uttrycksvektorer (se materialtabell)17.
- Designa enkelsträngade DNA-oligos som kodar för pre-miRNA mot målgenen: Designa enkelsträngade DNA-oligos ("top strand"-oligos (target pre-miRNAs) och "bottom strand"-oligos (komplement till top strand-oligos)) med hjälp av online-verktyget RNAi Designer (se Materialförteckning). Se figur 2 för de egenskaper som krävs hos de enkelsträngade oligos (figur 2A) och exempel på målsekvenser (figur 2B).
OBS: Det rekommenderas att 5-10 pre-miRNA-sekvenser genereras för en given målgen och screenas för knockdown-aktiviteter in vitro (steg 1.4). - Glödgning av de övre och nedre oligos för att generera en dubbelsträngad oligo
- Ställ in följande glödgningsreaktion (tabell 1) i ett sterilt 0.5 ml mikrocentrifugrör.
- Inkubera reaktionsblandningen vid 95 °C i 4 minuter. Glödga de övre och nedre oligos för att generera en dubbelsträngad oligo genom att låta reaktionsblandningen svalna till rumstemperatur (RT) i 5-10 minuter. Centrifugera provet kort (~5 s).
OBS: De glödgade oligos kan förvaras vid -20 °C utan nedbrytning i minst ett år.
- Kloning av de dubbelsträngade oligos till miRNA-uttrycksvektorn (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (medföljer miRNA-uttryckssatsen)): Klona enskilda dubbelsträngade oligos till den linjäriserade miRNA-uttrycksvektorn, enligt tillverkarens manual17.
- Utvärdering av knockdown-effekter
OBS: Det rekommenderas att enskilda miRNA-sekvenser testas för gensuppressionseffektivitet in vitro innan de appliceras i ovo. Knockdown-effektiviteten kan testas genom att transfektera miRNA-uttrycksplasmider till en cellinje som uttrycker målgenen. Alternativt kan enskilda miRNA-uttrycksplasmider samtransfekteras till cellinjer med en uttryckskonstruktion för målgenen. För målgener som kodar för proteiner som inte är membranförankrade i sitt naturliga tillstånd (t.ex. lösliga proteiner) kan ett alkaliskt fosfatasfusionsprotein (AP) användas för att övervaka uttrycket av målproteinet. En cDNA-sekvens som kodar för målproteinet kan fusioneras i ram till humant alkaliskt fosfatas i moderkakan i AP-taggvektorer (APtag-1- APtag-5; se materialförteckning) och introduceras i celler18. När det uttrycks i odlingsceller (t.ex. HEK293T-celler) utsöndras det AP-märkta målproteinet i höga nivåer i odlingsmedier, och därmed kan knockdown-effekter av miRNA-sekvenser utvärderas genom att mäta minskningen av AP-aktiviteten i odlingsmediet i miRNA-transfekterade celler (delsteg 1.4.1-1.4.4).- Odling HEK293T celler i en 24-brunnars platta (8 x 104 celler/brunn) över natten. Transfekterar transfektera cellerna med individuella miRNA-uttryckskonstruktioner med en expressionsplasmid av ett AP-märkt målprotein. Använd pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativ kontrollplasmiden (medföljer i miRNA-uttryckssatsen) som kontroll. (Om cellinjer som stabilt uttrycker ett AP-märkt målprotein används, transfekteras cellerna endast med individuella miRNA-uttryckskonstruktioner.)
OBS: Ett konventionellt lipofektionsreagens (se materialtabell) används för transfektion. - Samla upp det konditionerade mediet 48-72 timmar efter transfektionen och värm inaktiverar den endogena AP-aktiviteten i ett 65 °C vattenbad i 5 minuter. Spinout-skräp i en stationär mikrocentrifug med maximal hastighet i 5 minuter.
- Buffra supernatanten med 10 mM HEPES, pH 7,0 och låt den passera genom ett 0,45 μm filter.
- Ta 100 μl (för mätning i en plattläsare) eller 500 μl (för en spektrofotometer) av supernatanten och tillsätt en lika stor mängd 2x AP-substratbuffert (tabell 2). Kontrollera AP-aktiviteten genom att mäta OD405 i en plattläsare eller en spektrofotometer.
OBS: Om AP-aktiviteten hos det konditionerade mediet är för hög för noggrann mätning, späd den med HBAH-buffert (Hanks balanserade saltlösning (HBSS), 0.5 mg/ml bovint serumalbumin, 20 mM HEPES (pH 7.0)) eller annan buffert som innehåller ett bärarprotein. Använd inte fosfathaltiga buffertar (t.ex. PBS) eftersom oorganiskt fosfat fungerar som en kompetitiv hämmare av AP.
- Odling HEK293T celler i en 24-brunnars platta (8 x 104 celler/brunn) över natten. Transfekterar transfektera cellerna med individuella miRNA-uttryckskonstruktioner med en expressionsplasmid av ett AP-märkt målprotein. Använd pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativ kontrollplasmiden (medföljer i miRNA-uttryckssatsen) som kontroll. (Om cellinjer som stabilt uttrycker ett AP-märkt målprotein används, transfekteras cellerna endast med individuella miRNA-uttryckskonstruktioner.)
- Kedja av miRNA-sekvens
OBS: Knockdown-effekter kan förstärkas genom att kedja olika miRNA mot samma målgen eller upprepa samma miRNA. MiRNA-uttrycksvektorn stöder kedjekopplingen av flera pre-miRNA-sekvenser och deras co-cistroniska uttryck17.- Kedja två olika pre-miRNA-sekvenser (mot samma målgen) som visar högst knockdown-aktivitet i in vitro-analyser (steg 1.4), enligt tillverkarens instruktioner17.
- Utvärdera gensuppressionseffektiviteten hos de kedjade konstruktörerna med hjälp av in vitro-analyser enligt beskrivningen i steg 1.4. Om tre eller fler pre-miRNA-sekvenser uppvisar liknande höga knockdown-aktiviteter, testa olika kombinationer av två sekvenser och använd de kombinationer som visar den högsta knockdown-aktiviteten (se Representativa resultat).
- Överföring av EmGFP-pre-miRNA-uttryckskassetten till Tol2-transposonvektorn
OBS: Expressionskassetten som innehåller EmGFP cDNA och två pre-miRNA-sekvenser överförs till Tol2-transposonvektorn (pT2K-CAGGS-vektor, se materialtabell). För detta ändamål PCR-amplifieras expressionskassetten (som omfattar från 3'-änden av CMV-promotorn till miRNA-primrarplatsen för miRNA-uttrycksvektorn) med hjälp av primers med hjälp av primrar med ett artificiellt restriktionsenzymställe, och PCR-produkten klonas till Tol2-transposonvektorn. Tol2-transposonvektorn innehåller den allestädes närvarande CAGGS-promotorn, som driver uttrycket för den infogade uttryckskassetten. CAGGS-promotorn och expressionskassetten flankeras av Tol2-sekvenserna (figur 1).- PCR-amplifiering av EmGFP-pre-miRNA-uttryckskassetten: Följ reaktionsinställningen och termocykelförhållandena som beskrivs i tabell 3.
- Ligate den gelrenade PCR-produkten (ca 1,3 kb) i den restriktionsenzymupplösta Tol2-transposonvektorn. Elektroporera plasmiden till kompetenta E. coli-celler (se materialtabell) och välj rekombinanter (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-konstruktioner).
- Bered plasmiden med hjälp av ett konventionellt maxiprep-kit (se Materialförteckning). Kontrollera plasmidens struktur och sekvens genom restriktionsmappning respektive genom att använda de primrar som används för PCR.
2. Lagring och ruvning av ägg
- Köp befruktade ägg av Gallus gallus (Gallus gallus) från lokala gårdar eller kommersiella försäljare.
OBS: Ägg kan förvaras vid 12-16 °C eller vid 4 °C i upp till 1 vecka före ruvning utan betydande förlust av livsduglighet eller försenad utveckling under ruvningen. - Märk äggen med startdatum för ruvningen och markera ovansidan av ägget (där embryot kommer att placeras). Ruva befruktade ägg horisontellt vid 38 °C tills embryona har nått Hamburger och Hamilton (HH) stadierna 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)19.
3. I ovo elektroporation
- Förberedelse för elektroporering i ovo
- Beredning av 0,25 % snabb grön lösning: Lös upp 25 mg Fast Green FCF i 10 ml PBS. Filtrera lösningen med ett 0,2 μm sprutfilter. Lösningen kan förvaras på RT.
- DNA-cocktail: Bered injektionslösningen genom att blanda de enskilda pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-plasmiderna (delsteg 1.6.3) med Tol2-transposasuttrycksplasmiden (pCAGGS-T2TP-vektor; se materialtabell) (5 μg/μl vardera) i förhållandet 2:1. Tillsätt 1/10 volym 0,25 % snabb grön lösning för att visualisera det injicerade området.
OBS: Den optimala DNA-koncentrationen kan variera beroende på konstruktionerna. - Uppställning av mikroinjektionsapparaten (Figur 3A,B): Mikroinjektionsapparaten består av följande (se materialförteckning): Hamilton-spruta, 18 G nål (nållängd = 2"), PVC-slang (polyvinylklorid) (2 cm längd), mikropipettnål (kan tillverkas genom att dra i kapillärrör med omega-punktfiber (1 mm OD X 0,75 mm ID) med en mikropipettavdragare).
- Fyll en Hamiltonspruta med tung mineralolja. Fäst en 18 G nål på sprutan och fyll nålens inre utrymme med olja genom att trycka in sprutkolven.
- Fäst en bit 2 cm lång PVC-slang i änden av nålen och fyll slangen med oljan.
- Fäst en utdragen mikropipettnål på slangen. Bryt av spetsen på mikropipettnålen till en diameter på 10-20 μm med en fin pincett för att göra en liten öppning. Fyll hela nålen med olja.
OBS: Försiktighet bör iakttas så att inga luftbubblor fångas i systemet, eftersom de skulle hämma flödet av DNA-lösningen.
- Häll 5 μl av den färgade DNA-cocktailen (delsteg 3.1.2) på en steril petriskål. Placera spetsen på mikropipettnålen i DNA-lösningen på den sterila petriskålen under dissekeringsmikroskopet och dra långsamt in lösningen i nålen.
- Vänta tills trycket är i jämvikt inuti och utanför nålen (för att undvika att luft går in i nålen) och ta ut nålspetsen ur DNA-lösningen. Håll nålspetsen nedsänkt i steril PBS i en liten bägare tills injektionen.
- Installation av elektroporationsapparaten (Figur 3A,C):
- Sätt ett par platinaelektroder med en elektrodhållare på en mikromanipulator. Justera avståndet mellan elektrodernas spets till 2 mm (Figur 3C,E).
- Anslut elektroderna till en fyrkantsvågspulsgenerator med kablar (se materialförteckning).
- Mikroinjektion av DNA-lösning (figur 3D)
- Ta ut ett hönsägg ur inkubatorn och torka av äggets yta med ett silkespapper indränkt i 70 % etanol.
- Fäst en 18 G nål på en 10 ml spruta. För nålen genom den trubbiga änden av ägget, vinklad nedåt (45°) för att undvika att skada äggulan.
- Dra ut 2-3 ml albumin från ägget. Täta hålet med en bit tejp. Bekräfta att embryot och vitellinmembranet är lossnade från skalet genom att "genomlysa" ägget med ljus.
- Ta bort en bit äggskal (cirkel med en diameter på 2-3 cm) från toppen av ägget med en sax och pincett för att exponera embryot. Placera inte fler än fem ägg åt gången för att förhindra att embryona torkar ut under elektroporeringen.
OBS: Om det är svårt att öppna ett fönster utan att knäcka ägget kan hela toppen av ägget täckas med Sellotape eller Scotch tejp innan man tar bort en bit äggskal. - För in nålspetsen i synblåsan från dess proximala sida i 45° vinkel och injicera DNA-cocktailen genom att långsamt trycka in (eller knacka på) kolven tills den blåfärgade lösningen fyller lumen (Figur 3D).
OBS: Alternativt kan ett tryckmikroinjektionssystem (se materialtabell) användas för injektion av DNA-lösningar. - Dra ut nålen och sätt tillbaka spetsen i PBS.
- Elektroporering (Figur 3E)
- Ställ in pulsparametrarna för elektroporatorn enligt följande: Voltage: 15 V, Pulslängd: 50 ms, Pulsintervall: 950 ms, Pulsnummer: 5
- Tillsätt några droppar HBSS på vitellinmembranet över embryot. Sänk ner elektroderna i HBSS med hjälp av mikromanipulatorn, vinkelrätt mot embryots främre-bakre axel.
OBS: Alternativt kan denna procedur göras utan att tillsätta HBSS, eftersom albumin är en bra elektrisk ledare som möjliggör effektiv elektroporering. - Placera elektroderna på vardera sidan (främre (nasala) sidan och bakre (temporala) sidan) av synblåsan (Figur 3E). Se till att elektroderna inte vidrör embryot eller blodkärlen. Applicera pulserande elektriska fält.
- Ta bort elektroderna och rengör dem försiktigt med en vattendränkt steril bomullspinne för att undvika ansamling av albumin.
- Försegla fönstret med tejp och inkubera embryot på nytt tills det önskade utvecklingsstadiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktion av Tol2-transposonkonstruktioner för uttryck av artificiella miRNA mot Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; även känd som Nell2) är ett extracellulärt glykoprotein. Det har strukturella likheter med trombospondin-1 och uttrycks främst i nervsystemet20,21. Vi har tidigare visat att Nel reglerar differentiering och överlevnad av retinala ganglieceller15 och fungerar som en hämmande vägledning för näthinneaxoner22,23,24. I den växande kycklingnäthinnan detekteras Nel-uttryck i det presumtiva pigmentepitelet vid HH15 (embryonal dag (E) 2,5). Vid HH20 (E3.5) observeras Nel-uttryck också i nyligen differentierade retinala ganglieceller. Starkt uttryck av Nel i pigmentepitelet och retinala ganglieceller fortsätter åtminstone fram till E1815.
För att undersöka Nels funktion i utvecklingen av retinala ganglieceller slogs uttrycket av Nel-genen ner genom att introducera artificiella miRNA i den utvecklande näthinnan med hjälp av ovo-elektroporering och Tol2-transposonsystemet15,16. Först designades par av enkelsträngade DNA-oligonukleotider för 10 potentiella målsekvenser i den proteinkodande regionen av kycklingens Nel-cDNA (GenBank-anslutningsnummer: NM_001030740.1) med hjälp av online-RNAi-designverktyget (se materialförteckning). Oligonukleotidparen glödgades och klonades individuellt till miRNA-uttrycksvektorn. Därefter transfekterades enskilda konstrukter till HEK293T celler som stabilt uttrycker Nel-AP, och deras knockdown-effektivitet utvärderades genom att mäta AP-aktivitet i odlingsmediet. Den pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativa kontrollplasmiden användes som kontroll (Figur 4A).
Tre Nel pre-miRNA-sekvenser som visade högst knock down-effekter valdes ut (mot nukleotiderna 482-502, 910-930 respektive 2461-2481 av kyckling Nel cDNA), och två pre-miRNA-sekvenser klonades tandemly in i miRNA-uttrycksvektorn (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA), enligt tillverkarens instruktioner17. Expressionskassetterna som kodar för de två pre-miRNA och EmGFP amplifierades med PCR med en konstgjord EcoRI-plats i båda ändar (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ och 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) och klonades in i pT2K-CAGGS-vektorn (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). Sekvensen för expressionskassetten bekräftades med hjälp av de primers som användes för PCR. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruktioner samtransfekterades individuellt med Tol2-transposasuttrycksvektorn (pCAGGS-T2TP) till HEK293T celler som stabilt uttrycker Nel-AP, och hämmande effekter på Nel-AP-uttryck utvärderades genom att mäta AP-aktiviteterna i odlingsmediet. Som visas i figur 4B förbättrades knockdown-effektiviteten signifikant genom sammanlänkningen av två miRNA-sekvenser. Robust hämning av Nel-AP-uttryck (mer än 90 %) observerades åtminstone fram till 13 dagar efter transfektion (figur 4B).
Stabil undertryckning av Nel-uttryck i den växande kycklingens näthinna
En pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruktion (innehållande målsekvenser för nukleotiderna 482-502 och 2461-2481 i kycklingens Nel cDNA) samtransfekterades med transposasuttrycksvektorn (pCAGGS-T2TP) till den temporala eller nasala sidan av kycklingens näthinna genom in ovo-elektroporering vid HH9-11 (Figur 3, Figur 5A). Sektioner framställdes från E4.5 eller E8 näthinna, och effekter på Nel-uttryck utvärderades genom immunhistokemi med anti-Nel-antikropp22. Vid E4,5 var uttrycket av Nel i näthinnans pigmentepitel signifikant reducerat i EmGFP-uttryckande celler (Figur 5B-D). Vid E8 observerades också tydligt minskningar av Nel-uttrycket i retinala ganglieceller (Figur 5E-I). Signifikant hämning av Nel-uttrycket fortsatte åtminstone fram till E18 (data visas inte). Införandet av kontroll-miRNA påverkade inte Nel-uttrycket i näthinnan (Figur 5J-O).
Figur 1: Transponering av Tol2-flankerade cDNA genom transposas. En schematisk bild av transponering av en Tol2-flankerad expressionskassett för EmGFP och kedjad två pre-miRNA-sekvenser (2x pre-miRNA) med transposas. När en Tol2-transposonvektor som innehåller expressionskassetten (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-konstruktion) förs in i celler med en Tol2-transposasuttryckskonstruktion (pCAGGS-T2TP), skärs den Tol2-flankerade expressionskassetten ut från vektorn och integreras i värdgenomet av transposasaktiviteten. Uttrycket av EmGFP och miRNA drivs av den allestädes närvarande promotorn CAGGS. Denna siffra har modifierats från Nakamoto et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Struktur för det konstruerade pre-miRNA. (A) Den designade pre-miRNA-sekvensen är baserad på den murina miR-155-sekvensen17. Den övre strängoligo innehåller (från 5'-änden till 3'-änden) ett överhäng med fyra nukleotider (TGCT (blått)), antisensmålsekvens (21 nukleotider), terminalslingsekvens (röd) och avkänningsmålsekvens (19 nukleotider). Antisensmålsekvensen representerar den mogna miRNA-sekvensen. Den nedre strängoligo innehåller ett överhäng med fyra nukleotider på 5' (CCTG (blå)) och den omvända komplementsekvensen av den övre strängoligo, men saknar överhänget med fyra nukleotider i 3'-änden (AGCA-3': omvänt komplement av 5'-TGCT i den övre strängoligo). Målsekvensen saknar nukleotider 9 och 10 i målsekvensen. De "extra" två nukleotiderna i antisensmålsekvensen bildar en intern slinga i stamslingestrukturen hos den mogna miRNA-molekylen, vilket resulterar i en högre knockdown-hastighet17. (B) Ett exempel på målsekvens mot kyckling Nel. Sens- och antisenssekvenser i de övre och nedre strängarna för en målsekvens av kyckling-Nel-genen (GenBank-accessionsnummer NM_001030740.1, nukleotider 482-502) visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mikroinjektion och elektroporering i ovo. (A) Arbetsstation för mikroinjektion och elektroporering i ovo. (1) Dissekerande mikroskop. (2) Apparat för insprutning. (3) Apparater för elektroporering. (4) Dubbel svanhalsmikroskopbelysning. (5) Elektroporator. B) Apparat för insprutning. En Hamilton-spruta (6) med en 18 G nål (7) ansluts till PVC-slangen (8) och till en utdragen mikropipettnål (9) och sätts på en mikromanipulator (10). Apparatens inre utrymme är fyllt med tung mineralolja. C) Apparater för elektroporering. En uppsättning platinaelektroder (11) med en elektrodhållare (12) är inställda på en mikromanipulator (13). Elektroderna ansluts till elektroporatorn med kablar (14). (D) Mikroinjektion av DNA-cocktaillösning i synblåsan vid HH 10-11. Den utdragna mikropipettnålen förs in i synblåsan från dess proximala sida. DNA-cocktaillösning med fast green (blå) injiceras i synblåsan tills färgämnet fyller hela lumen. (E) Elektroporering i synblåsan. Elektroder placeras parallellt (avståndet mellan elektroderna är 2 mm) och på ett sätt så att den injicerade synblåsan är placerad mellan elektroderna: En elektrod är placerad nära den främre (nasala) ytan av synblåsan, och den andra är i den bakre delen av embryot på nivån för bakhjärnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: In vitro-utvärdering av individuella eller kedjade pre-miRNA-sekvenser med avseende på Nel-gensuppressionseffektivitet. (A) Knockdown-effekter av enskilda pre-miRNA-sekvenser. Resultaten av fem representativa konstruktioner (Antisense-målsekvenser motsvarande nukleotidnummer 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 och 2461-2481 av kyckling Nel cDNA (GenBank-anslutningsnummer: NM_001030740.1)) visas. Individuella miRNA-uttryckskonstruktioner (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA) transfekterades till HEK293T celler som stabilt uttrycker Nel-AP. Den pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativa kontrollplasmiden användes som kontroll. Uttrycket av Nel-AP utvärderades genom att mäta AP-aktiviteterna i odlingsmediet 48-96 timmar efter transfektion. Tre Nel-pre-miRNA-uttryckskonstruktioner (mot nukleotiderna 482-502, 910-930 respektive 2461-2481) visade signifikant hämning av Nel-uttrycket. (B) Knockdown-effekter av kedjade pre-miRNA-sekvenser. Två av de tre mest potenta pre-miRNA-sekvenserna (mot nukleotiderna 482-502, 910-930 och 2461-2481) klonades tandemly in i pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-vektorn, och expressionskassetten (innehållande de två pre-miRNA-sekvenserna och EmGFP cDNA) överfördes till pT2K-CAGGS-vektorn (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruktionerna samtransfekterades individuellt med expressionsvektorer för Tol2-transposas (pCAGGS-T2TP) till HEK293T celler som stabilt uttrycker Nel-AP, och uttrycket av Nel-AP utvärderades genom att mäta AP-aktiviteterna i odlingsmediet från 2 till 13 dagar efter transfektion. Alla tre kombinationerna (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) visade förstärkta suppressionsaktiviteter jämfört med okedjade individuella pre-miRNA-sekvenser. Signifikant hämning av Nel-AP-uttryck observerades från dag 2 till åtminstone dag 13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Stabil nedbrytning av Nel-uttryck i den utvecklande kycklingnäthinnan genom Tol2-transposonmedierad integration av miRNA-transgenen. En Tol2-transposonkonstruktion innehållande en expressionskassett med två Nel pre-miRNA-sekvenser och EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) eller en kontrollkonstruktion som uttrycker ett obesläktat miRNA och EmGFP (J-O) samtransfekterades med en transposasuttrycksvektor (pCAGGS-T2TP) in i den temporala eller nasala halvan av synvesikeln genom in ovo elektroporering vid HH9-HH11 (E1.5). Retinala snitt preparerades vid E4.5 (B-D, J-L) eller E8 (E-I, M-O), och effektiviteten av Nel-gensuppression undersöktes med immunhistokemi med hjälp av anti-Nel-antikropp (röd). Eftersom DNA är negativt laddat, elektroporeras transgenerna in i vävnaden på anodsidan; således var endast hälften av näthinnan märkt med EmGFP (transfektionssidan (TF), grön). (A) Uttryck av EmGFP-markörgenen i den temporala halvan av näthinnan vid E4.5. Den optiska sprickan (vit pil) representerar gränsen mellan transfekterade och icke-transfekterade (kontroll) sidor. (B-I) RNAi-knockdown av Nel-uttryck i den växande kycklingens näthinna. (B-D) Vid E4,5 är Nel-uttrycket signifikant reducerat (B,D) i retinala pigmentepitelceller (PE) som uttrycker EmGFP (C,D). Notera det komplementära mönstret av Nel-immunfärgning och EmGFP-uttryck i D. NR, neural näthinna. (E–I) Vid E8 minskar Nel-uttrycket (E,G) i näthinnans pigmentepitel och gangliecellskiktet (GCL) på transfektionssidan (F,G). (H, I) Högre förstoring av ett transfektionsområde respektive ett motsvarande kontrollområde i E (indikerat med små rektanglar). (D,G) Sammanfogade bilder av de två vänstra bilderna. (J-O) Uttryck av kontroll-miRNA. Införandet av den negativa kontrollkonstruktionen påverkar inte uttrycket av Nel i E4.5 (J-L) eller E8 (M-O) näthinnan. (L,O) Sammanfogade bilder av de två vänstra bilderna. Gränsen mellan transfektions- och kontrollsidan indikeras med en streckad linje i C-, F-, K- och N-skalstrecken, 50 μm. (A) och (B-I) har modifierats från Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 respektive Nakamoto et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Inställning av glödgningsreaktion | |
| Toppsträngad oligo (200 μM i TE-buffert) | 5 μL (slutlig koncentration 50 μM) |
| Bottensträng oligo (200 μM i TE-buffert) | 5 μL (slutlig koncentration 50 μM) |
| 10x Oligo glödgningsbuffert* | 2 μL |
| DNase/RNasfritt vatten* | 8 μL |
| Total | 20 μL |
| * Ingår i miRNA-uttryckssatsen (se materialförteckning) | |
Tabell 1: Inställning av glödgningsreaktion
| 2x AP-substratbuffert | |
| 10 M Dietanolamin (pH 9,8) | 4 ml |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-homoarginin | 45 mg filmdragerade tabletter |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 10 mg filmdragerade tabletter |
| p-nitrofenylfosfat | 63 mg filmdragerade tabletter |
| H2O | Tillsätt för att få en total volym på 20 ml |
Tabell 2: 2x AP-substratbuffert. Lösningen ska förvaras i alikvoter vid -20 °C och skyddas från ljus eftersom p-nitrofenylfosfat är ljuskänsligt.
| Inställning av reaktion | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x pre-miRNA-plasmid (från avsnitt 1.5) eller pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativ kontrollplasmid* (0,1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x Pfu-buffert | 5 μL | ||
| dNTP-blandning (10 mM vardera av dATP, dCTP, dGTP och dTTP) | 1 μL | ||
| EmGFP framåt primer* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| omvänd miRNA-primer* (5'-CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA-polymeras (5 enheter/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Total volym | 50 μL | ||
| * Ingår i miRNA-uttryckssatsen. | |||
| Termocykliska förhållanden | |||
| 94 °C | 5 minuter | ||
| 30 cykler av följande: | |||
| 94 °C | 45 sek | ||
| 58 °C | 1 minut | ||
| 72 °C | 2 minuter | ||
| 72 °C | 10 minuter | ||
Tabell 3: Reaktionsuppställning och termocykelförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en detaljerad guide till nedtystning av gener i den utvecklande kycklingnäthinnan genom transgent uttryck av artificiella miRNA med hjälp av ovo-elektroporering och Tol2-transposonsystemet.
Följande faktorer är av avgörande betydelse för att utföra denna teknik framgångsrikt. För det första är det viktigt att använda miRNA-sekvenser som är bekräftade att utöva robusta knockdown-effekter. Innan du applicerar dem för in ovo-elektroporering , testa individuella pre-miRNA-sekvenser för gensuppressionseffektivitet i in vitro-analyser (steg 1.4) och kedja två pre-miRNA-sekvenser som visar de högsta knockdown-aktiviteterna (steg 1.5). För det andra är det viktigt att inte skada synblåsan och omgivande nervvävnader när man för in mikropipettnålen för injektion av DNA-lösningen. Alltför stora skador på embryon kan leda till missbildningar och död. För att undvika vävnadsskador, för in mikropipetten i synblåsan i rätt riktning. Mindre och vassare spetsar på mikropipettnålen skulle göra penetrationen av synblåsan smidigare och resultera i mindre vävnadsskador. Nålar med mycket små spetsar har dock svårt att ladda och frigöra DNA-lösningen. I studien som beskrivs här användes nålar med en spetsöppning med en diameter på 10-20 μm. För det tredje, se till att fylla hela synvesikeln med DNA-lösningen (som visualiseras av spridningen av snabbt grönt). För det fjärde, placera elektroderna i de optimala positionerna för att rikta in DNA i det önskade området av den optiska vesikeln (t.ex. temporalsidan, nasalsidan). Negativt laddade DNA-molekyler kommer att röra sig mot anodsidan; Därför påverkar elektrodernas exakta placering och orientering slutresultatet på ett avgörande sätt. Slutligen, använd de optimala DNA-koncentrationerna och elektroporeringsparametrarna.
Om ingen fluorescerande signal observeras efter 24 timmars elektroporering, bör följande övervägas: (1) Bekräfta att de elektroporerade plasmiderna har korrekta sekvenser. (2) Kontrollera koncentrationen och renheten hos enskilda plasmider på nytt. (3) Se till att DNA-lösningen fyller synvesikelns lumen och att den inte diffunderar bort i neuralröret. (4) Kontrollera att elektroporationsparametrarna som används är korrekta. (5) Kontrollera att elektroderna är i kontakt med vitellinmembranet medan de elektriska pulserna appliceras.
Kombinationen av in ovo-elektroporering och en transposonmedierad genintegrationsmetod i detta protokoll ger flera tydliga fördelar. För det första stöder det en stabil produktion av miRNA och därmed en ihållande undertryckning av målgener. Utvecklingen av kycklingens näthinna börjar vid E1,5 och fortsätter fram till kläckningen (retinala ganglieceller produceras under perioden från E2 till E9). För analys av genfunktion bör uttrycket av artificiella miRNA bibehållas stabilt under denna period. Uttryck av RNAi-sekvenser med hjälp av konventionella expressionsvektorer är i allmänhet övergående eftersom expressionskonstruktionen misslyckas med att effektivt integreras i kromosomer. I den metod som beskrivs här medieras dock kromosomal integration av expressionskassetten av aktiviteten hos co-elektroporerat transposas, vilket resulterar i ett stabilt uttryck av transgenerna.
För det andra, i denna metod, inducerar samma CAGGS-promotor co-cistroniskt uttryck av flera miRNA-sekvenser och EmGFP-markören i transfekterade celler, vilket kringgår risken för promotorinterferens, vilket är en av de vanligaste komplikationerna med retrovirala vektorer som innehåller två promotorer för att uppnå dubbelt genuttryck25.
Slutligen, till skillnad från replikationskompetenta retrovirala vektorer, överförs inte transgenen som elektroporeras med denna metod till närliggande celler. Därför kan transfektionsområdet kontrolleras mer exakt genom att använda lämpliga typer av elektroder och genom att placera dem i rätt positioner.
Trots de fördelar som beskrivs ovan har den nuvarande metoden också begränsningar som är inneboende i ovo-elektroporering . Till exempel kan transfektionshastigheten och gensuppressionen variera mellan embryon, och ett relativt stort antal embryon kan behöva transfekteras för analys. Dessutom har elektroporering i den embryonala näthinnan i ovo i senare utvecklingsstadier (t.ex. E4-E5) experimentella svårigheter eftersom ögonen är placerade i nära anslutning till hjärtat i dessa stadier, vilket ökar risken för hjärtstopp efter elektroporering.
Det system som beskrivs här möjliggör snabb och robust gensuppression i den växande näthinnan hos kycklingar. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på andra delar av kycklingembryot, inklusive neurala och icke-neurala vävnader. Vi förväntar oss därför att detta system kan bidra till att belysa molekylära mekanismer för kycklingars utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vektorerna pT2K-CAGGS och pCAGGS-T2TP tillhandahölls av Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) respektive Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). Vi tackar Michael Berberoglu för hans avgörande läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av anslag från Royal Society och Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Storbritannien) till M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
