Summary
İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.
Abstract
Civciv retinası, büyük boyutu, hızlı gelişimi ve görselleştirme ve deneysel manipülasyonlar için erişilebilirliği gibi avantajları ile gelişimsel nörobiyolojide uzun zamandır önemli bir model sistem olmuştur. Bununla birlikte, en büyük teknik sınırlaması, gen fonksiyon analizleri için sağlam fonksiyon kaybı yaklaşımlarının olmamasıydı. Bu protokol, Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikroRNA'ların (miRNA'lar) transgenik ekspresyonunu içeren, gelişmekte olan civciv retinasında bir gen susturma metodolojisini açıklar. Bu yaklaşımda, EmGFP (zümrüt yeşili floresan protein) markörü için bir ekspresyon kaseti ve bir hedef gene karşı yapay pre-miRNA dizileri içeren bir Tol2 transpozon plazmidi, in ovo elektroporasyon ile bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı ile embriyonik civciv retinasına sokulur. Transfekte retinal hücrelerde, transpozaz, transpozon vektöründen ekspresyon kasetinin eksizyonunu ve konakçı kromozomlara entegrasyonunu katalize ederek miRNA'ların ve EmGFP proteininin kararlı ekspresyonuna yol açar. Daha önceki çalışmamızda, nöral gelişimde birden fazla işlevi yerine getiren bir glikoprotein olan Nel'in ekspresyonunun bu tekniği kullanarak gelişmekte olan civciv retinasında önemli ölçüde baskılanabileceğini göstermiştik. Sonuçlarımız, bu metodolojinin gen ekspresyonunun kararlı ve sağlam bir şekilde baskılanmasına neden olduğunu ve böylece retina gelişimi çalışmaları için etkili bir fonksiyon kaybı yaklaşımı sağladığını göstermektedir.
Introduction
Omurgalı retinası, nöral gelişimi incelemek için önemli bir model sistemdir. Periferik konumuna rağmen, retina anatomik ve gelişimsel olarak merkezi sinir sisteminin bir uzantısıdır ve retina ganglion hücrelerinin aksonlarından oluşan optik sinir, merkezi sinir sistemi içindeki bir yolu temsil eder. Civciv retinası, nöral gelişimin moleküler mekanizmasını incelemek için bir model sistem olarak önemli avantajlara sahiptir: Büyüktür ve hızla gelişir; İnsan retinası ile yapısal ve işlevsel benzerlikleri vardır; Görselleştirme ve deneysel manipülasyonlar için son derece erişilebilirdir. Nöral gelişim sırasında hücre proliferasyonu ve farklılaşması, morfogenez ve akson rehberliğinin moleküler mekanizmaları, tavuk retinası kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.
In ovo elektroporasyon, gelişmekte olan civciv embriyosundaki hücrelere ektopik genleri sokmak için son yirmi yılda başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik, gelişmekte olan hücrelerin etiketlenmesine, hücre kaderinin izlenmesine ve hücre göçü ve akson yollarının izlenmesine ve ayrıca gen fonksiyonunun in vivo analizi için ektopik gen ekspresyonuna izin verir. Civciv embriyolarında etkili ektopik gen ekspresyonu için in ovo elektroporasyonun koşulları iyi belirlenmiştir 1,2,3.
Bu avantajlara rağmen, gen fonksiyonu çalışmaları için kararlı bir fonksiyon kaybı tekniğinin olmaması, civciv embriyosunun önemli bir teknik sınırlaması olmuştur. Küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar)4 veya kısa firkete RNA'ları (shRNA'lar) için ekspresyon vektörleri5 ile elektroporasyonlu civciv embriyoları, hedeflenen genin yıkıldığını gösterirken, bu yaklaşımlarda gen baskılanması geçicidir, çünkü hücreler eklenen RNA'ları veya DNA'ları kaybettiğinde etkiler ortadan kalkar. SiRNA'ların bir RCAS (Replication Copetent Avian sarkom-lökoz virüsü (ASLV) uzun terminal tekrarı (LTR) ile bir Splice alıcısı ile civciv embriyolarına verilmesiyle daha kararlı bir gen baskılanması sağlanabilir6. Viral vektör, konakçı genomuna entegre olur ve ektopik genler kararlı bir şekilde eksprese edilir. Bununla birlikte, retrovirüs yalnızca hücre döngüsünün mitotik (M) fazı sırasında bölünen hücrelerin genomuna entegre olabilir, bu da bu işlev kaybı yaklaşımının uygulanabileceği gelişim aşamaları ve/veya hücre tipleri üzerinde bir sınırlama getirebilir. Ek olarak, transgenlerin RCAS tarafından ekspresyonu, in ovo elektroporasyon7 tarafından indüklenenden daha yavaş ve daha az sağlam görünmektedir.
Transpozonlar, genom üzerinde bir konumdan diğerine hareket eden genetik elementlerdir. Tol2 elementi, hAT transpoze edilebilir element ailesinin bir üyesidir ve Tol2 elementi8'in transpozon reaksiyonunu katalize eden bir transpozazı kodlayan dahili bir gen içerir. Tol2 elementlerinin sol ve sağ uçlarının dizileri (sırasıyla 200 bp ve 150 bp) ile çevrili bir gen ekspresyon kaseti taşıyan bir plazmit vektörü, bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısına sahip omurgalı hücrelerine sokulduğunda, ekspresyon kaseti plazmitten çıkarılır ve ektopik genin kararlı bir ekspresyonunu destekleyen konakçı genomuna entegre edilir (Şekil 1). Tol2 transpoze elementinin, zebra balığı 9,10, kurbağalar11, civcivler 12 ve fareler 13 dahil olmak üzere farklı omurgalı türlerinde gen transpozisyonunu çok verimli bir şekilde indükleyebildiği ve bu nedenle yararlı bir transgenez ve insersiyonel mutajenez yöntemi olduğu gösterilmiştir. Tol2 transpozon sistemi, uzun çift sarmallı RNA14'ten işlenen siRNA'nın genomik entegrasyonu ile bir hedef genin koşullu yıkımı için başarıyla kullanılmıştır.
Bu protokol, civciv embriyosunda Tol2 transpozon sistemi15,16 tarafından yapay mikroRNA'ların (miRNA'lar) eklenmesini içeren bir fonksiyon kaybı yaklaşımını açıklar. Bu yaklaşımda, EmGFP (zümrüt yeşili floresan protein) belirteci ve bir hedef gene karşı yapay miRNA'lar için bir ekspresyon kaseti, bir Tol2 transpozon vektörüne klonlanır. Tol2 transpozon yapısı daha sonra in ovo elektroporasyon ile bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı ile embriyonik civciv retinasına sokulur. Transfekte retinal hücrelerde, transpozaz, transpozon vektöründen ekspresyon kasetinin eksizyonunu ve konakçı kromozomlara entegrasyonunu katalize ederek miRNA'ların ve EmGFP proteininin kararlı ekspresyonuna yol açar. Önceki çalışmalarımızda, gelişmekte olan civciv retinasında, ağırlıklı olarak sinir sisteminde eksprese edilen hücre dışı bir glikoprotein olan Nel'in ekspresyonunu başarıyla düşürdük (bkz. Sonuçlarımız, bu teknikle ovoda stabil ve etkili gen baskılanmasının sağlanabileceğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. miRNA ekspresyon vektörlerinin oluşturulması
NOT: miRNA ekspresyon vektörleri oluşturma prosedürleri (adım 1.1-1.3, 1.5-1.6.), daha önce açıklandığı gibi emGFP'li miRNA ekspresyon kiti, Block-iT Pol II miR RNA ekspresyon kiti için optimize edilmiştir15,16. Kit, miRNA ekspresyonuna (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), bir kontrol vektörüne (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidi), aksesuar reaktiflerine ve miRNA ekspresyon vektörleri üretme talimatlarına izin vermek için tasarlanmış ekspresyon vektörünü sağlar (bkz.
- Hedef gene karşı pre-miRNA'ları kodlayan tek sarmallı DNA oligolarının tasarlanması: Tek sarmallı DNA oligoları ("üst iplikçik" oligoları (hedef pre-miRNA'lar) ve "alt iplikçik" oligoları (üst iplikçik oligolarının tamamlayıcıları)) çevrimiçi aracı kullanarak tasarlayın, RNAi Designer (bkz. Tek sarmallı oligoların gerekli özellikleri (Şekil 2A) ve hedef dizilerin örnekleri (Şekil 2B) için Şekil 2'ye bakın.
NOT: Belirli bir hedef gen için 5-10 pre-miRNA dizisinin oluşturulması ve in vitro olarak knockdown aktiviteleri için taranması önerilir (adım 1.4). - Çift sarmallı bir oligo oluşturmak için üst ve alt iplikçik oligolarının tavlanması
- Aşağıdaki tavlama reaksiyonunu (Tablo 1) steril bir 0.5 mL mikrosantrifüj tüpünde ayarlayın.
- Reaksiyon karışımını 95 °C'de 4 dakika inkübe edin. Reaksiyon karışımının 5-10 dakika oda sıcaklığına (RT) soğumasına izin vererek çift sarmallı bir oligo oluşturmak için üst ve alt iplikçik oligolarını tavlayın. Numuneyi kısaca santrifüjleyin (~5 s).
NOT: Tavlanmış oligolar -20 °C'de bozulmadan en az bir yıl saklanabilir.
- Çift sarmallı oligoların miRNA ekspresyon vektörüne klonlanması (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (miRNA ekspresyon kitinde sağlanır)): Üreticinin kılavuzuna göre tek tek çift sarmallı oligoları doğrusallaştırılmış miRNA ekspresyon vektörüne klonlayın17.
- Knockdown etkilerinin değerlendirilmesi
NOT: Bireysel miRNA dizilerinin, ovo'da uygulanmadan önce in vitro gen baskılama etkinliği açısından test edilmesi önerilir. Knockdown verimliliği, miRNA ekspresyon plazmitlerinin hedef geni eksprese eden bir hücre hattına transfekte edilmesiyle test edilebilir. Alternatif olarak, bireysel miRNA ekspresyon plazmitleri, hedef gen için bir ekspresyon yapısı ile hücre hatlarına birlikte transfekte edilebilir. Doğal hallerinde zara bağlı olmayan proteinleri kodlayan hedef genler için (örneğin, çözünür proteinler), hedef proteinin ekspresyonunu izlemek için bir alkalin fosfataz (AP) füzyon proteini kullanılabilir. Hedef proteini kodlayan bir cDNA dizisi, AP-tag vektörlerinde (APtag-1- APtag-5; Malzeme Tablosuna bakınız) insan plasental alkalen fosfataza çerçeve içinde kaynaştırılabilir vehücrelere 18 verilebilir. Kültür hücrelerinde (örneğin, HEK293T hücreleri) eksprese edildiğinde, AP etiketli hedef protein, kültür ortamına yüksek seviyelerde salgılanır ve böylece miRNA dizilerinin yıkım etkileri, miRNA ile transfekte edilmiş hücrelerin kültür ortamındaki AP aktivitesindeki azalma ölçülerek değerlendirilebilir (alt adımlar 1.4.1-1.4.4).- Gece boyunca 24 oyuklu bir plakada (8 x 104 hücre / kuyucuk) kültür HEK293T. AP etiketli bir hedef proteinin bir ekspresyon plazmidi ile bireysel miRNA ekspresyon yapılarına sahip hücreleri geçici olarak transfekte edin. Kontrol olarak pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidini (miRNA ekspresyon kitinde sağlanır) kullanın. (AP etiketli bir hedef proteini kararlı bir şekilde ifade eden hücre hatları kullanılıyorsa, hücreleri yalnızca bireysel miRNA ekspresyon yapılarıyla transfekte edin.)
NOT: Transfeksiyon için geleneksel bir lipofeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılır. - Transfeksiyondan 48-72 saat sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve 65 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca endojen AP aktivitesini ısıtın. Bir masaüstü mikrosantrifüjünde 5 dakika boyunca maksimum hızda spinout kalıntısı.
- Süpernatanı 10 mM HEPES, pH 7.0 ile tamponlayın ve 0.45 μm'lik bir filtreden geçirin.
- Süpernatantın 100 μL'sini (bir plaka okuyucuda ölçüm için) veya 500 μL'sini (bir spektrofotometre için) alın ve eşit miktarda 2x AP substrat tamponu ekleyin (Tablo 2). Bir plaka okuyucuda veya spektrofotometrede OD405'i ölçerek AP aktivitesini kontrol edin.
NOT: Şartlandırılmış ortamın AP aktivitesi doğru ölçüm için çok yüksekse, HBAH tamponu (Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS), 0.5 mg / mL sığır serum albümini, 20 mM HEPES (pH 7.0)) veya bir taşıyıcı protein içeren başka bir tampon. Fosfat içeren tamponlar (örneğin, PBS) kullanmayın çünkü inorganik fosfat rekabetçi bir AP inhibitörü görevi görür.
- Gece boyunca 24 oyuklu bir plakada (8 x 104 hücre / kuyucuk) kültür HEK293T. AP etiketli bir hedef proteinin bir ekspresyon plazmidi ile bireysel miRNA ekspresyon yapılarına sahip hücreleri geçici olarak transfekte edin. Kontrol olarak pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidini (miRNA ekspresyon kitinde sağlanır) kullanın. (AP etiketli bir hedef proteini kararlı bir şekilde ifade eden hücre hatları kullanılıyorsa, hücreleri yalnızca bireysel miRNA ekspresyon yapılarıyla transfekte edin.)
- MiRNA dizisinin zincirlenmesi
NOT: Knockdown etkileri, farklı miRNA'ları aynı hedef gene karşı zincirleyerek veya aynı miRNA'yı tekrarlayarak artırılabilir. miRNA ekspresyon vektörü, çoklu pre-miRNA dizilerinin zincirlenmesini ve bunların ko-sistronik ekspresyonunudestekler 17.- Üreticinin talimatlarına göre in vitro deneylerde (adım 1.4) en yüksek yıkım aktivitelerini gösteren iki farklı pre-miRNA dizisini (aynı hedef gene karşı) zincirleyin17.
- Adım 1.4'te açıklandığı gibi in vitro tahliller kullanarak zincirli yapıların gen baskılama verimliliğini değerlendirin. Üç veya daha fazla pre-miRNA dizisi benzer şekilde yüksek yıkım aktiviteleri gösteriyorsa, iki dizinin farklı kombinasyonlarını test edin ve en yüksek yıkım aktivitesini gösteren kombinasyonları kullanın (bkz.
- EmGFP-pre-miRNA ekspresyon kasetinin Tol2 transpozon vektörüne aktarılması
NOT: EmGFP cDNA ve iki pre-miRNA dizisi içeren ekspresyon kaseti, Tol2 transpozon vektörüne aktarılır (pT2K-CAGGS vektörü , bkz. Bu amaçla, ekspresyon kaseti (CMV promotörünün 3' ucundan miRNA ekspresyon vektörünün miRNA ters dizileme primer bölgesine kadar uzanan) yapay bir kısıtlama enzim bölgesine sahip primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir ve PCR ürünü Tol2 transpozon vektörüne klonlanır. Tol2 transpozon vektörü, eklenen ifade kasetinin ifadesini yönlendiren her yerde bulunan CAGGS promotörünü içerir. CAGGS promotörü ve ekspresyon kaseti, Tol2 dizileri ile çevrilidir (Şekil 1).- EmGFP-pre-miRNA ekspresyon kasetinin PCR amplifikasyonu: Tablo 3'te açıklanan reaksiyon kurulumunu ve termodöngü koşullarını takip edin.
- Jel ile saflaştırılmış PCR ürününü (c. 1.3 kb) restriksiyon enzimi ile sindirilmiş Tol2 transpozon vektörüne bağlayın. Plazmiti yetkin E. coli hücrelerine elektropoze edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve rekombinantları seçin (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA yapıları).
- Plazmidi geleneksel bir maxiprep kiti kullanarak hazırlayın (bkz. Sırasıyla restriksiyon haritalaması ve PCR için kullanılan primerleri kullanarak plazmidin yapısını ve dizisini kontrol edin.
2. Yumurta saklama ve kuluçka
- Yerel çiftliklerden veya ticari satıcılardan döllenmiş Beyaz Leghorn (Gallus gallus) yumurtaları satın alın.
NOT: Yumurtalar, kuluçka sırasında önemli bir canlılık kaybı veya gelişimde gecikme olmaksızın kuluçkadan önce 1 haftaya kadar 12-16 °C'de veya 4 °C'de tutulabilir. - Yumurtaları kuluçka başlangıç tarihi ile etiketleyin ve yumurtanın üst tarafını (embriyonun yerleştirileceği yer) işaretleyin. Embriyolar Hamburger ve Hamilton (HH) evreleri 10 (33-38 saat) -11 (40-45 saat)19'a ulaşana kadar döllenmiş yumurtaları 38 °C'de yatay konumda kuluçkaya yatırın.
3. Ovo elektroporasyonda
- Yumurta içi elektroporasyon için hazırlık
- % 0.25 hızlı yeşil çözeltinin hazırlanması: 25 mg Hızlı Yeşil FCF (Hızlı Yeşil FCF) 10 mL PBS içinde çözün. Çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Çözüm RT'de saklanabilir.
- DNA kokteyli: Tek tek pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA plazmitlerini (alt adım 1.6.3) Tol2 transpozaz ekspresyon plazmidi (pCAGGS-T2TP vektörü; Malzeme Tablosuna bakınız) (her biri 5 μg/μL) 2:1 oranında karıştırarak enjeksiyon çözeltisini hazırlayın. Enjekte edilen alanı görselleştirmek için 1/10 hacimce %0.25 hızlı yeşil solüsyon ekleyin.
NOT: Optimum DNA konsantrasyonu yapılara bağlı olarak değişebilir. - Mikroenjeksiyon aparatının kurulması (Şekil 3A,B): Mikroenjeksiyon aparatı aşağıdakilerden oluşur (bkz. Malzeme Tablosu): Hamilton şırınga, 18 G iğne (İğne uzunluğu = 2"), PVC (Polivinil klorür) boru (2 cm uzunluk), Mikropipet iğnesi (Omega nokta lifli kılcal tüpler (1 mm OD X 0,75 mm İç Çap) mikropipet çektirme ile çekilerek yapılabilir).
- Bir Hamilton şırıngasını ağır mineral yağ ile doldurun. Şırıngaya 18 G'lik bir iğne takın ve şırınga pistonuna bastırarak iğnenin iç boşluğunu yağla doldurun.
- İğnenin ucuna 2 cm uzunluğunda bir PVC boru parçası takın ve boruyu yağla doldurun.
- Hortuma çekilmiş bir mikropipet iğnesi takın. Küçük bir açıklık oluşturmak için mikropipet iğnesinin ucunu ince forseps ile 10-20 μm çapında kırın. İğnenin tamamını yağ ile doldurun.
NOT: DNA çözeltisinin akışını engelleyeceği için sistemde herhangi bir hava kabarcığı sıkışmamasına dikkat edilmelidir.
- 5 μL renkli DNA kokteylini (alt adım 3.1.2) steril bir Petri kabına koyun. Diseksiyon mikroskobu altında, mikropipet iğnesinin ucunu steril Petri kabı üzerindeki DNA çözeltisine yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça iğneye çekin.
- İğnenin içindeki ve dışındaki basınç dengelenene kadar bekleyin (iğnenin içine hava girmesini önlemek için) ve iğnenin ucunu DNA çözeltisinden çıkarın. İğnenin ucunu enjeksiyona kadar küçük bir beherde steril PBS'ye batırılmış halde tutun.
- Elektroporasyon aparatının kurulması (Şekil 3A,C):
- Bir mikromanipülatörde bir elektrot tutucu ile bir çift platin elektrot ayarlayın. Elektrotların ucu arasındaki boşluğu 2 mm'ye ayarlayın (Şekil 3C,E).
- Elektrotları kablolarla bir kare dalga puls üretecine bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
- DNA çözeltisinin mikroenjeksiyonu (Şekil 3D)
- Bir tavuk yumurtasını inkübatörden çıkarın ve yumurtanın yüzeyini% 70 etanole batırılmış bir kağıt mendille silin.
- 10 mL'lik bir şırıngaya 18 G'lik bir iğne takın. Sarısına zarar vermemek için iğneyi yumurtanın kör ucundan aşağı doğru açılı (45°) geçirin.
- Yumurtadan 2-3 mL albümin çekin. Deliği bir parça Scotch bantla kapatın. Yumurtayı ışıkla "kandallayarak" embriyo ve vitellin zarının kabuktan ayrıldığını onaylayın.
- Embriyoyu ortaya çıkarmak için makas ve forseps kullanarak yumurtanın üstünden bir parça yumurta kabuğu (2-3 cm çapında daire) çıkarın. Elektroporasyon sırasında embriyoların kurumasını önlemek için herhangi bir zamanda beşten fazla yumurtayı pencereye koymayın.
NOT: Yumurtayı kırmadan bir pencere açmak zorsa, bir parça yumurta kabuğu çıkarılmadan önce yumurtanın tüm üst kısmı Sellotape veya Scotch bant ile kaplanabilir. - İğnenin ucunu proksimal tarafından optik veziküle 45°'lik bir açıyla sokun ve mavi renkli çözelti lümeni doldurana kadar pistona yavaşça bastırarak (veya üzerine vurarak) DNA kokteylini enjekte edin (Şekil 3D).
NOT: Alternatif olarak, DNA çözeltilerinin enjeksiyonu için bir basınçlı mikroenjeksiyon sistemi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılabilir. - İğneyi geri çekin ve ucunu tekrar PBS'ye yerleştirin.
- Elektroporasyon (Şekil 3E)
- Elektroporatörün darbe parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Voltaj: 15 V, Darbe uzunluğu: 50 ms, Darbe aralığı: 950 ms, Darbe sayısı: 5
- Embriyo üzerindeki vitellin membranına birkaç damla HBSS ekleyin. Embriyonun ön-arka eksenine dik olan mikromanipülatörü kullanarak elektrotları HBSS'ye indirin.
NOT: Alternatif olarak, albümin verimli elektroporasyona izin veren iyi bir elektrik iletkeni olduğundan, bu prosedür HBSS eklenmeden yapılabilir. - Elektrotları optik vezikülün her iki tarafına (ön (nazal) tarafı ve arka (temporal) tarafı) yerleştirin (Şekil 3E). Elektrotların embriyoya veya kan damarlarına temas etmediğinden emin olun. Darbeli elektrik alanları uygulayın.
- Elektrotları çıkarın ve albümin birikimini önlemek için elektrotları suya batırılmış steril bir pamuklu çubukla nazikçe temizleyin.
- Pencereyi Scotch bantla kapatın ve embriyoyu istenen gelişim aşamasına kadar yeniden inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nel'e karşı yapay miRNA'ların ekspresyonu için Tol2 transpozon yapılarının yapımı
Nel (Neural Epidermal büyüme faktörü (EGF)-Like; Nell2 olarak da bilinir) hücre dışı bir glikoproteindir. Trombospondin-1 ile yapısal benzerlikleri vardır ve ağırlıklı olarak sinir sistemindeeksprese edilir 20,21. Nel'in retinal ganglion hücrelerinin15 farklılaşmasını ve sağkalımını düzenlediğini ve retinal aksonlar 22,23,24 için inhibitör bir kılavuz ipucu görevi gördüğünü daha önce göstermiştik. Gelişmekte olan civciv retinasında, HH15'te (embriyonik gün (E) 2.5) varsayımsal pigment epitelinde Nel ekspresyonu tespit edilir. HH20'de (E3.5), yeni farklılaşmış retinal ganglion hücrelerinde Nel ekspresyonu da gözlenir. Pigment epiteli ve retinal ganglion hücrelerinde Nel'in güçlü ekspresyonu en azından E1815'e kadar devam eder.
Nel'in retinal ganglion hücrelerinin gelişimindeki işlevini incelemek için, in ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemi kullanılarak gelişmekte olan retinaya yapay miRNA'lar sokularak Nel geninin ekspresyonu düşürüldü15,16. İlk olarak, tek sarmallı DNA oligonükleotid çiftleri, çevrimiçi RNAi tasarım aracı kullanılarak tavuk Nel cDNA'sının protein kodlayan bölgesinde (GenBank erişim numarası: NM_001030740.1) 10 potansiyel hedef dizi için tasarlandı (bkz. Oligonükleotid çiftleri tavlandı ve ayrı ayrı miRNA ekspresyon vektörüne klonlandı. Daha sonra, bireysel yapılar, Nel-AP'yi kararlı bir şekilde ifade eden HEK293T hücrelere aktarıldı ve bunların yıkım etkinlikleri, kültür ortamındaki AP aktivitesi ölçülerek değerlendirildi. Kontrol olarak pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidi kullanıldı (Şekil 4A).
En yüksek yıkım etkilerini gösteren üç Nel pre-miRNA dizisi seçildi (sırasıyla tavuk Nel cDNA'sının 482-502, 910-930 ve 2461-2481 nükleotidlerine karşı) ve iki pre-miRNA dizisi, üreticinin talimatlarına göre miRNA ekspresyon vektörüne (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA) tandem olarak klonlandı17. İki pre-miRNA ve EmGFP'yi kodlayan ekspresyon kasetleri, her iki uçta yapay bir EcoRI bölgesi (5′-GGGAATTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ ve 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) ile PCR ile amplifiye edildi ve pT2K-CAGGS vektörüne klonlandı (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). Ekspresyon kasetinin sekansı, PCR için kullanılan primerler kullanılarak doğrulandı. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA yapıları, Tol2 transpozaz ekspresyon vektörü (pCAGGS-T2TP) ile Nel-AP'yi stabil bir şekilde eksprese eden HEK293T hücrelere ayrı ayrı birlikte transfekte edildi ve Nel-AP ekspresyonu üzerindeki inhibitör etkiler, kültür ortamındaki AP aktiviteleri ölçülerek değerlendirildi. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, iki miRNA dizisinin zincirlenmesiyle yıkım verimliliği önemli ölçüde artırıldı. Transfeksiyondan en az 13 gün sonrasına kadar Nel-AP ekspresyonunun (% 90'dan fazla) güçlü bir şekilde baskılanması gözlenmiştir (Şekil 4B).
Gelişmekte olan civciv retinasında Nel ekspresyonunun stabil baskılanması
Bir pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA yapısı (tavuk Nel cDNA'sının 482-502 ve 2461-2481 nükleotidleri için hedef dizileri içeren), transpozaz ekspresyon vektörü (pCAGGS-T2TP) ile birlikte transfekte edildi civciv retinasının temporal veya nazal tarafına, HH9-11'de in ovo elektroporasyon ile (Şekil 3, Şekil 5A). Kesitler E4.5 veya E8 retinadan hazırlandı ve anti-Nelantikoru 22 kullanılarak immünohistokimya ile Nel ekspresyonu üzerine etkileri değerlendirildi. E4.5'te, retina pigment epitelinde Nel'in ekspresyonu, EmGFP eksprese eden hücrelerde önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 5B-D). E8'de, retinal ganglion hücrelerinde Nel ekspresyonunda da azalmalar açıkça gözlenmiştir (Şekil 5E-I). Nel ekspresyonunun önemli ölçüde baskılanması en azından E18'e kadar devam etti (veriler gösterilmemiştir). Kontrol miRNA'sının eklenmesi retinadaki Nel ekspresyonunu etkilemedi (Şekil 5J-O).
Şekil 1: Tol2 ile çevrili cDNA'ların transpozaz ile transpozisyonu. EmGFP için Tol2 ile çevrili bir ekspresyon kasetinin transpozisyonunu gösteren ve transpozaz ile zincirlenmiş iki pre-miRNA dizisinin (2x pre-miRNA) transpozisyonunu gösteren bir şema. Ekspresyon kasetini (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA yapısı) içeren bir Tol2 transpozon vektörü, bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı (pCAGGS-T2TP) ile hücrelere sokulduğunda, Tol2 kanatlı ekspresyon kaseti vektörden çıkarılır ve transpozaz aktivitesi ile konakçı genomuna entegre edilir. EmGFP ve miRNA'ların ekspresyonu, her yerde bulunan promotör CAGGS tarafından yönlendirilir. Bu rakam Nakamoto ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tasarlanmış pre-miRNA'nın yapısı. (A) Tasarlanan pre-miRNA dizisi, murin miR-155 dizisi17'ye dayanmaktadır. Üst iplikçik oligosu (5' uçtan 3' ucuna kadar) dört nükleotid çıkıntısı (TGCT (mavi)), antisens hedef dizisi (21 nükleotid), terminal döngü dizisi (kırmızı) ve duyu hedef dizisi (19 nükleotid) içerir. Antisens hedef dizisi, olgun miRNA dizisini temsil eder. Alt iplikçik oligo, dört nükleotid 5' çıkıntı (CCTG (mavi)) ve üst iplikçik oligosunun ters kompleman dizisini içerir, ancak 3' ucunda dört nükleotid çıkıntısından yoksundur (AGCA-3': üst iplikçik oligosunun 5'-TGCT'sinin ters tamamlayıcısı). Duyu hedef dizisi, hedef dizinin 9 ve 10 nükleotidlerinden yoksundur. Antisens hedef dizisindeki "ekstra" iki nükleotid, olgun miRNA molekülünün kök döngü yapısında bir iç döngü oluşturur ve bu da daha yüksek bir yıkım oranı17 ile sonuçlanır. (B) Tavuk Nel'e karşı bir hedef dizisi örneği. Tavuk Nel geninin (GenBank erişim numarası NM_001030740.1, nükleotidler 482-502) bir hedef dizisi için üst ve alt iplikçiklerdeki anlam ve antisens dizileri gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Yumurta mikroenjeksiyon ve elektroporasyonda. (A) Yumurta mikroenjeksiyon ve elektroporasyon için iş istasyonu. (1) Diseksiyon mikroskobu. (2) Enjeksiyon aparatı. (3) Elektroporasyon aparatı. (4) Çift deveboynu mikroskobu aydınlatıcısı. (5) Elektroporatör. (B) Enjeksiyon aparatı. 18 G iğneli (7) bir Hamilton şırıngası (6), PVC boruya (8) ve çekilmiş bir mikropipet iğnesine (9) bağlanır ve bir mikromanipülatöre (10) yerleştirilir. Aparatın iç boşluğu ağır mineral yağ ile doldurulur. (C) Elektroporasyon aparatı. Bir elektrot tutucuya (11) sahip bir dizi platin elektrot (12), bir mikromanipülatöre (13) yerleştirilir. Elektrotlar elektroporatöre kablolarla (14) bağlanır. (D) DNA kokteyl çözeltisinin HH 10-11'de optik veziküle mikroenjeksiyonu. Çekilen mikropipet iğnesi, optik keseciğin proksimal tarafından içine sokulur. Hızlı yeşil (mavi) ile DNA kokteyl çözeltisi, boya tüm lümeni doldurana kadar optik veziküle enjekte edilir. (E) Optik veziküle elektroporasyon. Elektrotlar paralel olarak (Elektrotlar arasındaki mesafe 2 mm'dir) ve enjekte edilen optik vezikül elektrotların arasına yerleşecek şekilde yerleştirilir: Elektrotlardan biri optik vezikülün ön (burun) yüzeyine yakın, diğeri ise embriyonun arka kısmında arka beyin seviyesinde bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nel geni baskılama verimliliği için bireysel veya zincirlenmiş pre-miRNA dizilerinin in vitro değerlendirmesi. (A) Bireysel pre-miRNA dizilerinin yıkım etkileri. Beş temsili yapının sonuçları (tavuk Nel cDNA'sının 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 ve 2461-2481 nükleotid numaralarına karşılık gelen antisens hedef dizileri (GenBank erişim numarası: NM_001030740.1)) gösterilmektedir. Bireysel miRNA ekspresyon yapıları (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA), Nel-AP'yi stabil bir şekilde eksprese eden HEK293T hücrelere transfekte edildi. Kontrol olarak pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidi kullanıldı. Nel-AP ekspresyonu, transfeksiyondan 48-96 saat sonra kültür ortamındaki AP aktiviteleri ölçülerek değerlendirildi. Üç Nel pre-miRNA ekspresyon yapısı (sırasıyla 482-502, 910-930 ve 2461-2481 nükleotidlerine karşı) Nel ekspresyonunun önemli ölçüde baskılandığını gösterdi. (B) Zincirleme pre-miRNA dizilerinin yıkım etkileri. En güçlü üç pre-miRNA dizisinden ikisi (482-502, 910-930 ve 2461-2481 nükleotidlerine karşı) pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR vektörüne tandem olarak klonlandı ve ekspresyon kaseti (iki pre-miRNA dizisini ve EmGFP cDNA'yı içeren) pT2K-CAGGS vektörüne (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA) aktarıldı. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA yapıları, Tol2 transpozaz (pCAGGS-T2TP) için ekspresyon vektörleri ile Nel-AP'yi stabil bir şekilde eksprese eden HEK293T hücrelere ayrı ayrı birlikte transfekte edildi ve Nel-AP'nin ekspresyonu, transfeksiyondan 2 ila 13 gün sonra kültür ortamındaki AP aktiviteleri ölçülerek değerlendirildi. Her üç kombinasyon da (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481), zincirsiz bireysel pre-miRNA dizilerine kıyasla gelişmiş baskılama aktiviteleri gösterdi. 2. günden en az 13. güne kadar Nel-AP ekspresyonunun önemli ölçüde baskılanması gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: MiRNA transgeninin Tol2 transpozon aracılı entegrasyonu ile gelişmekte olan civciv retinasında Nel ekspresyonunun kararlı yıkımı. İki Nel pre-miRNA dizisinin bir ekspresyon kaseti ve EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) içeren bir Tol2 transpozon yapısı veya ilgisiz bir miRNA ve EmGFP (JO) eksprese eden bir kontrol yapısı, bir transpozaz ekspresyon vektörü (pCAGGS-T2TP) ile optik vezikülün temporal veya nazal yarısına in ovo ile birlikte transfekte edildi HH9-HH11'de (E1.5) elektroporasyon. Retina kesitleri E4.5 (B-D, J-L) veya E8 (E-I, M-O) olarak hazırlandı ve anti-Nel antikoru (kırmızı) kullanılarak immünohistokimya ile Nel geni baskılanmasının etkinliği incelendi. DNA negatif yüklü olduğundan, transgenler anot tarafındaki dokuya elektropore edilir; bu nedenle, retinanın sadece yarısı EmGFP (transfeksiyon (TF) tarafı, yeşil) ile etiketlendi. (A) E4.5'te retinanın temporal yarısında EmGFP marker geninin ekspresyonu. Optik fissür (beyaz ok), transfekte edilmiş ve transfekte edilmemiş (kontrol) taraflar arasındaki sınırı temsil eder. (B-I) Gelişmekte olan civciv retinasında Nel ekspresyonunun RNAi yıkımı. (B-D) E4.5'te, EmGFP'yi (C,D) eksprese eden retinal pigment epitel (PE) hücrelerinde Nel ekspresyonu önemli ölçüde azalır (B,D). D'de Nel immün boyama ve EmGFP ekspresyonunun tamamlayıcı modeline dikkat edin. NR, nöral retina. (E-I) E8'de retina pigment epitelinde ve ganglion hücre tabakasında (GCL) Nel ekspresyonu (E,G) transfeksiyon tarafında (F,G) azalır. (H, I) Bir transfeksiyon alanının ve E'de karşılık gelen bir kontrol alanının (küçük dikdörtgenlerle gösterilir) sırasıyla daha yüksek büyütme görünümleri. (D,G) Soldaki iki görüntünün birleştirilmiş görüntüleri. (J-O) Kontrol miRNA'sının ekspresyonu. Negatif kontrol yapısının tanıtılması, E4.5 (JL) veya E8 (MO) retinada Nel ekspresyonunu etkilemez. (L,O) Soldaki iki görüntünün birleştirilmiş görüntüleri. Transfeksiyon ve kontrol tarafları arasındaki sınır, C, F, K ve N'de noktalı bir çizgi ile gösterilir. Ölçek çubukları, 50 μm. (A) ve (B-I) sırasıyla Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 ve Nakamoto et al.15'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tavlama reaksiyonu kurulumu | |
| Üst iplikçik oligo (TE tamponunda 200 μM) | 5 μL (Son konsantrasyon 50 μM) |
| Alt iplikçik oligo (TE tamponunda 200 μM) | 5 μL (Son konsantrasyon 50 μM) |
| 10x Oligo tavlama tamponu* | 2 μL |
| DNase/RNaz içermeyen su* | 8 μL |
| Toplam | 20 μL |
| * miRNA ekspresyon kitinde sağlanır (Malzeme Tablosuna bakınız) | |
Tablo 1: Tavlama reaksiyonu kurulumu
| 2x AP substrat tamponu | |
| 10 M Dietanolamin (pH 9.8) | 4 mL |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-Homoarginin | 45 mg |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | 10 mg |
| p-Nitrofenilfosfat | 63 mg |
| H2O | Toplam 20 mL'lik bir hacim oluşturmak için ekleyin |
Tablo 2: 2x AP substrat tamponu. Çözelti -20 °C'de alikotlarda saklanmalı ve p-nitrofenilfosfat ışığa duyarlı olduğundan ışıktan korunmalıdır.
| Reaksiyon kurulumu | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x pre-miRNA plazmidi (Bölüm 1.5'ten) veya pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidi* (0.1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x Pfu tamponu | 5 μL | ||
| dNTP karışımı (dATP, dCTP, dGTP ve dTTP'nin her biri 10 mM) | 1 μL | ||
| EmGFP ileri astar* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| miRNA ters primer* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA polimeraz (5 birim/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Toplam hacim | 50 μL | ||
| * miRNA ekspresyon kitinde sağlanır. | |||
| Termosiklasyon koşulları | |||
| 94 °C | 5 dk | ||
| Aşağıdakilerin 30 döngüsü: | |||
| 94 °C | 45 saniye | ||
| 58 °C | 1 dk | ||
| 72 °C | 2 dk | ||
| 72 °C | 10 dk | ||
Tablo 3: Reaksiyon kurulumu ve termodöngü koşulları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, in ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemi kullanılarak yapay miRNA'ların transgenik ekspresyonu ile gelişmekte olan civciv retinasında gen susturma için ayrıntılı bir kılavuz sağlar.
Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanmasında aşağıdaki faktörler kritik öneme sahiptir. İlk olarak, sağlam yıkım etkileri uyguladığı onaylanan miRNA dizilerini kullanmak çok önemlidir. Bunları in ovo elektroporasyon için uygulamadan önce, in vitro deneylerde gen baskılama etkinliği için ayrı pre-miRNA dizilerini test edin (adım 1.4) ve en yüksek yıkım aktivitelerini gösteren iki pre-miRNA dizisini zincirleyin (adım 1.5). İkincisi, DNA çözeltisinin enjeksiyonu için mikropipet iğnesini yerleştirirken optik veziküle ve çevresindeki sinir dokularına zarar vermemek önemlidir. Embriyolarda aşırı hasar, embriyonik malformasyona ve ölüme yol açabilir. Doku hasarlarını önlemek için, mikropipeti optik veziküle doğru yönde yerleştirin. Mikropipet iğnesinin daha küçük ve daha keskin uçları, optik vezikülün penetrasyonunu daha pürüzsüz hale getirir ve daha az doku hasarına neden olur. Bununla birlikte, çok küçük uçlu iğneler, DNA solüsyonunu yüklemekte ve serbest bırakmakta zorlanırlar. Burada anlatılan çalışmada 10-20 μm çapında uç açıklığına sahip iğneler kullanılmıştır. Üçüncüsü, tüm optik vezikülü DNA çözeltisiyle doldurduğunuzdan emin olun (hızlı yeşilin yayılmasıyla görselleştirildiği gibi). Dördüncüsü, DNA'ları optik vezikülün istenen bölgesine (örneğin, temporal taraf, burun tarafı) hedeflemek için elektrotları en uygun konumlara yerleştirin. Negatif yüklü DNA molekülleri anot tarafına doğru hareket edecektir; Bu nedenle, elektrotların hassas yerleşimi ve oryantasyonu, nihai sonuçları kritik bir şekilde etkiler. Son olarak, optimal DNA konsantrasyonlarını ve elektroporasyon parametrelerini kullanın.
24 saatlik elektroporasyondan sonra floresan sinyali gözlenmezse, aşağıdakiler dikkate alınmalıdır: (1) Elektroporasyonlu plazmitlerin doğru dizilere sahip olduğunu onaylayın. (2) Tek tek plazmitlerin konsantrasyonunu ve saflığını tekrar kontrol edin. (3) DNA çözeltisinin optik vezikülün lümenini doldurduğundan ve nöral tüpe yayılmadığından emin olun. (4) Kullanılan elektroporasyon parametrelerinin doğru olup olmadığını kontrol edin. (5) Elektrik darbeleri uygulanırken elektrotların vitellin membranı ile temas halinde olup olmadığını kontrol edin.
Bu protokolde in ovo elektroporasyon ve transpozon aracılı gen entegrasyon yönteminin kombinasyonu birçok farklı avantaj sunar. İlk olarak, miRNA'ların kararlı üretimini ve dolayısıyla hedef genlerin kalıcı olarak baskılanmasını destekler. Civciv retinasının gelişimi E1.5'te başlar ve yumurtadan çıkana kadar devam eder (Retinal ganglion hücreleri E2'den E9'a kadar olan dönemde üretilir). Gen fonksiyonunun fonksiyon kaybı analizi için, yapay miRNA'ların ekspresyonu bu süre boyunca stabil bir şekilde korunmalıdır. Geleneksel ekspresyon vektörleri kullanılarak RNAi dizilerinin ekspresyonu genellikle geçicidir, çünkü ekspresyon yapısı kromozomlara verimli bir şekilde entegre edilemez. Bununla birlikte, burada tarif edilen yöntemde, ekspresyon kasetinin kromozomal entegrasyonuna, transgenlerin stabil ekspresyonu ile sonuçlanan ko-elektroporasyonlu transpozazın aktivitesi aracılık eder.
İkincisi, bu yöntemde, aynı CAGGS promotörü, transfekte edilmiş hücrelerde çoklu miRNA dizilerinin ve EmGFP markörünün ko-sistronik ekspresyonunu indükler, böylece çift gen ekspresyonunu elde etmek için iki promotör içeren retroviral vektörlerle yaygın komplikasyonlardan biri olan promotör girişimi riskini ortadan kaldırır25.
Son olarak, replikasyona yetkin retroviral vektörlerin aksine, bu yöntemle elektropore edilen transgen komşu hücrelere aktarılmaz. Bu nedenle, transfeksiyon alanı, uygun tipte elektrotlar kullanılarak ve doğru pozisyonlara yerleştirilerek daha hassas bir şekilde kontrol edilebilir.
Yukarıda açıklanan avantajlara rağmen, mevcut yöntemin in ovo elektroporasyona özgü sınırlamaları da vardır. Örneğin, transfeksiyon ve gen baskılama oranları embriyolar arasında değişebilir ve analiz için nispeten çok sayıda embriyonun transfekte edilmesi gerekebilir. Ek olarak, daha sonraki gelişim aşamalarında (örneğin, E4-E5) yumurtadaki embriyonik retinaya elektroporasyonun deneysel zorlukları vardır, çünkü gözler bu aşamalarda kalbe yakın konumdadır ve bu da elektroporasyondan sonra kalp durması riskini artırır.
Burada tarif edilen sistem, gelişmekte olan civciv retinasında hızlı ve sağlam gen baskılanmasına izin verir. Bu yaklaşım, nöral ve nöral olmayan dokular da dahil olmak üzere civciv embriyosunun diğer kısımlarına da uygulanabilir. Bu nedenle, bu sistemin civciv gelişiminin moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına katkıda bulunabileceğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
pT2K-CAGGS ve pCAGGS-T2TP vektörleri sırasıyla Yoshiko Takahashi (Kyoto Üniversitesi, Kyoto, Japonya) ve Koichi Kawakami (Ulusal Genetik Enstitüsü, Mishima, Japonya) tarafından sağlanmıştır. Michael Berberoğlu'na makaleyi çok önemli bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Royal Society ve Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi'nden (BBSRC) (İngiltere) MN'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
