Summary
Disse protokollene gir metodikken som brukes til å vurdere den enzymatiske aktiviteten til individuelle medlemmer av protein arginin metyltransferase (PRMT) familien i celler. Detaljerte retningslinjer for vurdering av PRMT-aktivitet ved hjelp av endogene og eksogene biomarkører, metyl-arginin som gjenkjenner antistoffer, og inhibitorverktøyforbindelser er beskrevet.
Abstract
Proteinmetyltransferaser (PRMTs) katalyserer overføringen av en metylgruppe til argininrester av substratproteiner. PRMT-familien består av ni medlemmer som kan monometylat eller symmetrisk/asymmetrisk dimetylat argininrester. Flere antistoffer som gjenkjenner ulike typer argininmetylering av ulike proteiner er tilgjengelige; dermed gi verktøy for utvikling av PRMT aktivitet biomarkør analyser. PRMT antistoffbaserte analyser er utfordrende på grunn av overlappende substrater og motivbaserte antistoffspesifikasjoner. Disse problemene og det eksperimentelle oppsettet for å undersøke argininmetylering bidratt av individuelle PRMT-er diskuteres. Gjennom nøye utvelgelse av de representative substratene som er biomarkører for åtte av ni PRMT-er, ble det designet et panel av PRMT-aktivitetsanalyser. Her rapporteres protokollene for cellulære analyser kvantitativt å måle den enzymatiske aktiviteten til individuelle medlemmer av PRMT-familien i celler. Fordelen med de beskrevne metodene er deres enkle ytelse i ethvert laboratorium med cellekultur og fluorescerende vestlige flekker. Substratets spesifisitet og valgt antistoffpålitelighet ble fullstendig validert med knockdown og overekspression tilnærminger. I tillegg til detaljerte retningslinjer for analysebiomarkører og antistoffer, gis det også informasjon om bruk av en hemmerverktøysammensetning for PRMTs.
Introduction
Argininmetylering er en viktig post-translasjonell modifikasjon som regulerer proteinprotein- og protein-RNA-interaksjoner, og dermed spiller en viktig rolle i ulike cellulære prosesser som pre-mRNA skjøting, DNA-skade, transkripsjonsrespons og vekstfaktormediert transduksjon1,2. Arginin metyleres av protein arginin metyltransferaser (PRMTs) som resulterer i monometyl arginin (Rme1), asymmetrisk dimetylarginin (Rme2a), eller symmetrisk dimetylenginin (Rme2s)3. Basert på metyleringstypen er PRMTs klassifisert i tre grupper: Type I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 og 8), som katalyserer mono- og asymmetrisk dimetylering; Type II (PRMT5 og PRMT9), som katalyserer mono- og symmetrisk dimetylering; og Type III (PRMT7), som bare kan monometylat arginin3.
På grunn av et økende antall kommersielt tilgjengelige argininmetyleringsspesifikke antistoffer, kan PRMT-aktivitet måles ved hjelp av vestlig blotting. Fluorescerende-basert vestlig blot er den foretrukne teknikken over chemiluminescent deteksjon på grunn av et større dynamisk område og linearitet, høyere følsomhet og muliggjør multipleksing4. For å kvantifisere proteinmetyleringsnivåene er det nødvendig med normalisering av metyleringssignalet til totale proteinnivåer. Ved å velge antistoffer for totalt og metylert protein oppdratt i forskjellige vertsarter (f.eks. mus og kanin), kan sekundære antistoffer merket med forskjellige fluoroforer brukes, og signalet for begge antistoffene kan bestemmes i samme prøvebånd. Metyl-arginin antistoffer ble utviklet for å identifisere og karakterisere monometylerte, asymmetrisk eller symmetrisk dimetylerte proteiner der metyl-arginin finnes i en bestemt sammenheng. Siden flertallet av PRMTs metylate glycin- og argininrike motiver i deres substrater5, ble flere antistoffer reist for peptider som inneholder monometyl eller asymmetrisk, symmetrisk dimetyl-arginin-glycin repetisjoner som D5A12, ASYM24 eller ASYM25, og SYM11, henholdsvis. Andre metyl-arginin antistoffer ble generert mot et peptidbibliotek som inneholder asymmetrisk, symmetrisk dimetyl- og monometyl arginin i en gjentatt kontekst som letter påvisning av metyl-arginin i disse spesielle sammenhengene6. Det er også et økende antall antistoffer som gjenkjenner spesifikt argininmerke på et enkelt protein som muliggjør selektiv deteksjon av metylering som histone H4R3me2a eller BAF155-R1064me2a.
Det finnes flere kommersielt tilgjengelige PRMT-hemmere, som kan brukes som verktøy for PRMT cellulære analyser. Imidlertid er ikke alle av dem grundig karakterisert for selektivitet og off-target effekter, og noen bør brukes med forsiktighet. Det strukturelle genomiske konsortiet, i samarbeid med akademiske laboratorier og farmasøytiske partnere, har utviklet godt karakteriserte potente, selektive og cellegjennomtrengelige PRMT-hemmere (kjemiske sonder) som kan brukes uten begrensninger fra det vitenskapelige samfunnet. Informasjon om disse inhibitorene finnes på https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics og https://www.chemicalprobes.org/. Kjemiske sonder er småmolekylhemmere med in vitro IC50 eller Kd < 100 nM, over 30 ganger selektivitet over proteiner i samme familie, og betydelig cellulær aktivitet ved 1 μM. I tillegg har hver kjemiske sonde en nær kjemisk analog som er inaktiv mot det tiltenkte målet7,8,9,10,11,12.
Målet med denne protokollen er å måle cellulær aktivitet av individuelle PRMT-familiemedlemmer ved hjelp av fluorescerende vestlig blot-metoden. Her gis detaljert informasjon om validerte analysebiomarkører, antistoffer og potente celleaktive hemmere samt verdifulle strategier for vellykket implementering av analyser.
Protocol
1. Cellekultur og plating
MERK: Kulturceller med anbefalte medier og test rutinemessig for mykoplasmaforurensning. HEK293T-, MCF7- og C2C12-celler ble valgt som eksempler siden disse cellelinjene ble brukt i PRMT-analyser.
- Kultur HEK293T, MCF7 og C2C12 i DMEM supplert med 10% foster bovint serum (FBS), penicillin (100 U ml−1), og streptomycin (100 μg ml−1) i 10 cm vevskulturbehandlede (TC) retter.
- For PRMT8-analysen vokser du PRMT1 induserbare knockdown HEK293T-celler i medier som inneholder doksycyklin (2 μg/ml) i 3 dager før analysen starter.
- For å plate cellene, fjern og kast medier fra platen.
- Tilsett 10 ml PBS (uten Ca+2 og Mg+2 ioner) for å vaske celler og kaste oppløsningen.
- Tilsett 1 ml Trypsin-EDTA (0,25%), inkuber i 1 min ved romtemperatur (RT), og kast deretter løsningen. Inkuber til cellene blir runde og løsner fra platen. Trykk på platen for å løsne celler om nødvendig. For celler som er vanskelige å prøve å prøve, for eksempel C2C12, inkuberer du platen i 1-2 min ved 37 °C.
MERK: Unngå celleeksponering for trypsinoppløsning i lengre perioder (>10 min), da det vil redusere celle levedyktigheten. - Tilsett 1 ml forhåndsvarslet medium på platen, og rør forsiktig celler opp og ned til oppbruddscelleklumper. Overfør celler til et 15 ml rør, og tilsett 3-5 ml medier.
- For å måle cellenummer blander du 10 μL celler med 10 μL Trypan blå og overfører 10 μL til hemocytometer eller bruker en annen celletellingsmetode.
- Fortynn celler til anbefalt celletetthet og legg 500 μL/brønn i 24-brønns TC-plater (Tabell 1). For endogene analyser (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 og PRMT9) går du til trinn 3.1.
2. Celletransfeksjon
- For eksogene analyser (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfekterte HEK293T-celler med anbefalt mengde DNA (tabell 2). HEK293T-celler er enkle å transfekter slik at ethvert transfeksjonsreagens kan brukes, etter produsentens instruksjon.
3. Sammensatt behandling
MERK: Ikke overskrid 0,1% endelig dimetylsulfoksid (DMSO) konsentrasjon i kulturmedier. Oppbevar samme DMSO-konsentrasjon i hver brønn. De selektive PRMT-hemmerne (kjemiske sonder) og deres nært beslektede inaktive analoger finnes i tabell 3.
- For endogene analyser (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 og PRMT9), fjern medier fra celler og erstatt med 500 μL medier med forbindelse eller DMSO alene (kontroll).
MERK: Det tar vanligvis 2 dager å observere over 80% reduksjon i R metyleringsnivåer. - For eksogene analyser (PRMT3, PRMT6, PRMT8), fjern medier 4 timer etter transfeksjon, tilsett 500 μL medier med forbindelse eller DMSO alene (kontroll), og inkuber i 20-24 timer.
4. Celle lysat forberedelse
- Fjern alle medier fra brønner, vask med 100 μL PBS for å fjerne gjenværende medier, og tilsett 60 μL lysisbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM etylendiamintetraacetic acid (EDTA), 10 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 12,5 U ml−1 benzonase, komplett EDTA-fri proteasehemmercocktail) til hver brønn.
- Inkuber i mindre enn 1 min på RT, gynge platen for å distribuere lysisbufferen over cellene. Tilsett deretter 3 μL 20% m/v natriumddecylsulfat (SDS), til en endelig 1 % konsentrasjon, og bland ved å riste forsiktig. Overfør lysat til mikrosenterrør og hold det på is.
MERK: Tilsett benzonase og proteinhemmercocktail friskt før bruk. Tilsetningen av benzonase hydrolyserer raskt nukleinsyrer som reduserer cellelyseviskositeten.
- Inkuber i mindre enn 1 min på RT, gynge platen for å distribuere lysisbufferen over cellene. Tilsett deretter 3 μL 20% m/v natriumddecylsulfat (SDS), til en endelig 1 % konsentrasjon, og bland ved å riste forsiktig. Overfør lysat til mikrosenterrør og hold det på is.
- Bestem proteinkonsentrasjonen av prøvene ved hjelp av BCA Protein Assay Kit eller bruk en annen metode som tåler 1% SDS i oppløsning.
- Tilsett 2 μL lysat- og proteinstandarder (0, 1, 2, 4 og 8 μg/ml BSA i lysisbuffer) i brønnene på den 96-brønns klare platen.
- Bland reagens A med reagens B ved 50:1-forhold og tilsett 200 μL per brønn. Inkuber i 20 min ved 37 °C og les absorbansen.
- Juster proteinkonsentrasjonen med lysisbuffer for å være lik på tvers av prøvene.
- Tilsett 20 μL 4x lastebuffer til 60 μL cellelys og varm ved 95 °C i 5 minutter. Etter varme denaturering kan lysatene lagres ved -20 °C.
5. Vestlig blotanalyse
- Last 5-20 μg total cellelysat for analyse av histoneproteiner og 20-100 μg for andre proteiner i en 4-12% Bis-Tris proteingel.
- Kjør gelen i MOPS SDS løpebuffer (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS m/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) i ca. 2 timer ved 100 V eller til fargefronten når bunnen av gelen.
- Hvis du utfører en våt overføring, monterer du overføringssmørbrødet i iskald Tris-Glycine-overføringsbuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20 % v/v metanol og 0,05 % m/v SDS).
- Plasser svamper, filterpapir, PVDF-membran og gel i henhold til produsentens instruksjoner. Aktiver PVDF-membranen ved å suge i metanol og likevektsgel i overføringsbuffer i 30 s før montering.
MERK: Bruk anbefalt PVDF vestlig blotting membran siden den har lav autofluorescence og egnethet for proteiner med lav molekylvekt, for eksempel histoner (Tabell over materialer).
- Plasser svamper, filterpapir, PVDF-membran og gel i henhold til produsentens instruksjoner. Aktiver PVDF-membranen ved å suge i metanol og likevektsgel i overføringsbuffer i 30 s før montering.
- Overfør proteiner fra gelen til PVDF-membranen i Tris-Glycine overføringsbuffer ved 70 V i 1,5 timer på is.
- Blokkmembran i 30 min i blokkeringsbuffer (5% m/v melk i fosfatbufret saltvann, PBS). Skyll med vaskebuffer (PBST: 0,1 % v/v Tween-20 i PBS), og inkuber med primære antistoffer i bovint serumalbumin (BSA) oppløsning (5 % BSA i PBST) over natten ved 4 °C (tabell 3).
MERK: For lengre lagring, filtersterilisere BSA-oppløsning, tilsett 0,02% m/v natriumazid, og hold ved 4 °C. - Vask membranen 3 x 5 min med PBST. Inkuber deretter med geit-anti-kanin (IR800) og esel antimus (IR680) antistoffer i anbefalt blokkeringsbuffer (Tabell over materialer, Tabell 3) i 30 min ved RT og vask 3 x 5 min med PBST.
- Les signalet på en fluorescerende vestlig blot imager på 800 og 700 nm. Bruk fortrinnsvis instrumentet som gjør det mulig å se sterke og svake bånd tydelig i et enkelt bilde med høy følsomhet og dynamisk område, høyt signal-til-støy-forhold, en advarsel når en bildemetning nås, samt multipleksing av to fluorescerende farger i samme prøvebånd.
- Bestem båndintensiteter for vestlig blotanalyse ved hjelp av passende programvare for fluorescerende vestlig bildebehandling.
Representative Results
Eksempler på vestlige blot resultater for cellulære analyser av individuelle PRMTs er presentert nedenfor. Analysedetaljer er også oppsummert i Tabell 4.
PRMT1-analyse
PRMT1 er den viktigste bidragsyteren til histone 4 arginin 3 asymmetrisk dimetylering (H4R3me2a) i celle13. Ved tap av PRMT1-aktivitet øker de globale Rme1- og Rme2s-nivåene betydelig13. Som vist i figur 1A og 1B, kan flere antistoffer brukes til å overvåke globale endringer i Rme1, Rme2a, Rme2s, samt H4R3me2a. En betydelig nedgang i globale Rme2a- og H4R3me2a-nivåer og økninger i Rme1- og Rme2-er kan observeres etter 3 dager med PRMT1-nedslag (figur 1A, B). Cellelinjer varierer i basal H4R3me2a-signal, derfor, for å lette overvåkingen av tap av PRMT1-aktivitet, kan cellelinjer som MCF7 med høye basale metyleringsnivåer brukes (Figur 1C). Den optimale tiden for å observere effekten av PRMT1-hemming, for eksempel ved behandling med type I PRMT-hemmer MS0238, er 2 dager (figur 1D,1E). Lengre behandling resulterer i redusert celle levedyktighet og vekst.
PRMT3-analyse
For PRMT3 cellulær analyse kan det ikke påvise selektive biomarkørproteiner som metyleringsendringer i vestlig flekk ved PRMT3-nedslag eller overekspression. PRMT3 ble vist å asymmetrisk dimetylat H4R3 in vitro14, men merket er overveiende deponert av PRMT1, og derfor ble en eksogen analyse med overekspressert PRMT3 designet. I samsvar med in vitro-funn førte overekspresjon av villtype PRMT3, men ikke det katalytiske mutanten (E338Q) til en økning i H4R3me2a-nivåer (figur 2A). HEK293T-celler ble brukt siden de har lav basal metylering av dette merket (Figur 1C). Analysen ble ytterligere validert med PRMT3 selektiv hemmer SGC7077, som hemmet PRMT3-avhengig H4R3 asymmetrisk metylering (Figur 2B).
PRMT4-analyse
PRMT4 asymmetrisk dimethylates BAF155 ved arginin 106415. Siden antistoffet som oppdager BAF165-R1064me2a er kommersielt tilgjengelig, kan PRMT4-aktiviteten i celler overvåkes av vestlig blot ved å oppdage endringene i R1064me2a-merkenivåene. Tap av PRMT4-protein eller hemming av katalytisk aktivitet med PRMT4 selektiv hemmer, TP-06410, resulterer i en reduksjon i BAF165-R1064me2a nivåer (Figur 3). En 2-dagers behandling er vanligvis tilstrekkelig til å fjerne det meste av metyleringssignalet.
PRMT5-analyse
PRMT5 er ansvarlig for det meste av protein arginin symmetrisk dimetylering. Det har tidligere blitt rapportert at de ulike SMN-komplekse proteinene, inkludert SmBB', er PRMT5-substrater16. PRMT5-aktivitet kan overvåkes ved å se på endringer i globale nivåer av symmetrisk arginin dimetylering eller symmetrisk dimetylering av SmBB'-proteiner. Nedslag av PRMT5, men ikke PRMT1, 3, 4, 6 og 7 resulterer i en nedgang i globale Rme2s-nivåer (figur 4A). I de fleste cellelinjer undertrykte behandlingen av celler med PRMT5 selektive hemmere LLY-28311 og GSK591 i 2-3 dager det meste av SmBB'Rme2s-signalet (Figur 4B). De fleste celler er følsomme for PRMT5-hemming, noe som resulterer i en reduksjon i celleproliferasjon og celledød med langvarig inhibitoreksponering.
PRMT6-analyse
Det har blitt rapportert at PRMT6 er den viktigste bidragsyteren til histone H3 arginin 2 asymmetrisk dimetylering (H3R2me2a) i celle17. I HEK293T-celler var PRMT6-knockdown i 3 dager ikke tilstrekkelig til å observere en betydelig reduksjon i H3R2me2a-nivåer. Overekspressering av villtype PRMT6, men ikke det katalytiske mutanten (V86K/D88A) øker imidlertid nivåene av H3R2me2a, samt H3R8me2a og H4R3me2a (figur 5A). Det finnes flere hemmere som hemmer PRMT6-aktivitet med forskjellig styrke og selektivitet: selektiv, allosterisk PRMT6-hemmer SGC687018, PRMT type I-hemmer MS0238og PRMT4/6-hemmer MS0499. Alle disse hemmet PRMT6 avhengig H3R2 (Figur 5B), samt H4R3 og H3R8 asymmetrisk dimetylering (data ikke vist).
PRMT7-analyse
PRMT7 monometylater arginin 469 i både konstitutive og induserbare former for HSP70 (henholdsvis HSPA8 og HSPA1/6)12. Selv om det ikke finnes kommersielt tilgjengelige antistoffer, som oppdager HSP70-R469me1-nivåer, kan merket påvises med panmonometylantistoffer. Tap av PRMT7-protein eller hemming av katalytisk aktivitet med PRMT7 selektiv hemmer, SGC302712, resulterer i reduserte nivåer av HSP70-R469me1 (Figur 6A, B). SGC3027 er en cellegjennomtrengelig prodrug, som i celler konverteres ved reduktaser til PRMT7 selektiv hemmer SGC8158, derfor kan cellulær styrke variere mellom cellelinjer. Flere kreftcellelinjer uttrykker inducible HSP70-isoformer på høye nivåer, og metylering kan være vanskelig å oppdage på grunn av et overlappende uspesifisert bånd av kjernefysisk opprinnelse (Figur 6C). Derfor, for PRMT7 cellulær analyse, anbefales cellelinjer som for det meste uttrykker HSPA8 som C2C12, eller siden HSP70 lokaliserer hovedsakelig i cytoplasma, bestemme HSP70-R469me1 nivåer i den cytoplasmatiske brøkdelen av foretrukne cellelinjer.
PRMT8-analyse
PRMT8 er den eneste PRMT med et vevsbegrenset uttrykksmønster - i stor grad uttrykt i hjernen19. Den deler 80% sekvenslikhet og har en lignende substratpreferanse som PRMT119. Det adskiller seg fra PRMT1 hovedsakelig ved N-terminus, hvor myristoylering resulterer i foreningen av PRMT8 med plasmamembranen20. Det har blitt rapportert at PRMT8 sammen med PRMT1 metylater RNA-bindende protein EWS21. Siden PRMT8-aktiviteten er lav i ikke-nevronale cellelinjer, og EWS også kan metyleres av PRMT1, ble det utviklet en analyse der PMRT8 er undertrykt sammen med EWS i PRMT1 knockdown-celler. Siden PRMT1 er et essensielt gen og dets langsiktige tap resulterer i celledød, ble et inducible system der PRMT1 slås ned i 3 dager før bruk i PRMT8-analysen ble brukt (Figur 7A). Samuttrykk av wild-type PRMT8, men ikke katalytisk inaktiv mutant (E185Q), sammen med EWS resulterte i økte nivåer av EWS asymmetrisk dimetylering (Figur 7B). Flere asymmetriske dimetylargininantistoffer ble testet og metylering ble bare påvist med Asym25 antistoff. Analysen ble ytterligere validert med en PRMT type I selektiv kjemisk sonde, MS0238, som reduserte PRMT8-avhengig asymmetrisk dimetylering av eksogen EWS (figur 7B). Selv om MS023 er svært potent i å hemme PRMT8 i in vitro-analyser, kreves det i celler med høye konsentrasjoner av MS023 for å se metyleringshemming21.
PRMT9-analyse
PRMT9 ble vist å symmetrisk dimetylat SAP145 ved arginin 50822. Dessverre kan ingen kommersielt tilgjengelige antistoffer gjenkjenne merket. For PRMT9-analysen ble antistoffer som var vennlig begavet av Dr. Yanzhong Yang (Beckman Research Institute of City of Hope) brukt. Når overekspressert, vill type, men ikke R508K mutant SAP145 metyleres av PRMT9 (Figur 8A). Analysen ble designet for å overvåke nivåene av endogene SAP145-R508me2s og ble validert med Compound X, en prototype PRMT9-hemmer (arbeid pågår, ennå ikke publisert), som potent hemmer PRMT9 in vitro med nanomolar styrke. Compound X reduserte SAP145-R508me2s nivåer på en doseavhengig måte (Figur 8B).
Figur 1. PRMT1 cellulær analyse. (A) PRMT1 knockdown resulterer i en reduksjon av global asymmetrisk arginin dimetylering (Rme2a) og økte nivåer av symmetrisk arginin dimetylering (Rme2s) og monometylering (Rme1). Prmt1 knockdown effektivitet er presentert i panel B. (B) PRMT1 knockdown reduserer asymmetrisk dimetylering av histone H4R3 (H4R3me2a). (C) De basale H4R3me2a-nivåene varierer på tvers av forskjellige cellelinjer. (D) Type I PRMT-hemmer MS023 reduserer H4R3me2a-nivåene på en doseavhengig måte. MCF7-celler ble behandlet med MS023 i 2 dager. (E) Grafen representerer den ikke-lineære passformen til H4R3me2a-signalintensiteter normalisert til total histone H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. PRMT3 mobilanalyse. (A) Overekspressjonen av wild-type (WT), men ikke E338Q katalytisk mutant av PRMT3 øker H4R3me2a-nivåene i HEK293T-celler. Celler ble transfektert med FLAGG-merket PRMT3 i 24 h. (B) PRMT3 selektiv hemmer, SGC707, reduserer ektopisk PRMT3 avhengig H4R3 asymmetrisk demetylering Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. PRMT4 mobilanalyse. (A) PRMT4 knockdown resulterer i en reduksjon av BAF155-R1064 asymmetrisk arginin dimetylering (HEK293T celler). (B) PRMT4 selektiv hemmer, TP-064, reduserer BAF155-R1064Rme2a nivåer. HEK293T celler ble behandlet med forbindelse i 2 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. PRMT5 mobilanalyse. (A) PRMT5 knockdown resulterer i en reduksjon av globale symmetriske arginin dimetyleringsnivåer (MCF7 celler). (B) PRMT5 selektive hemmere GSK591 og LLY-283, redusere SmBB ' symmetrisk arginin dimetylering (grønn), mens totale nivåer av SmBB ' forblir uendret (rød). MCF7-celler ble behandlet med forbindelser i 2 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. PRMT6 mobilanalyse. (A) Overekspressjonen av villtype (WT), men ikke V86K/D88A katalytisk mutant PRMT6 øker H4R3me2a-, H3R2me2a- og H3R8me2a-nivåene i HEK293T-celler. Celler ble transfektert med FLAGG-merket PRMT6 i 24 timer (B) PRMT6 selektiv hemmer (SGC6870), PRMT type I-hemmer (MS023) og PRMT4/6-hemmer (MS049) reduserer PRMT6-avhengige H3R2me2a-nivåer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. PRMT7 mobilanalyse. (A) PRMT7 knockout resulterer i en reduksjon av HSP70-R469 monometylering (HCT116 celler). (B) PRMT7 selektive hemmere, SGC3027, reduserer HSP70-R469 monometylering i C2C12 celler. Celler ble behandlet med forbindelse i 2 dager. (C) Påvisning av HSP70-R469 metylering av induserbare HSP70 (HSPA1/6) med panmonometyl arginin antistoffer (Rme1) kan være vanskelig på grunn av et overlappende uspesifisert bånd av kjernefysisk opprinnelse. Det anbefales å måle HSP70 metyleringsnivåer i den cytoplasmatiske fraksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. PRMT8 mobilanalyse. (A) PRMT8-metylering av EWS kan oppdages når PRMT1-aktivitet hemmes ved nedslag. HEK293T celler ble transdusert med en induserbar PRMT1 knockdown vektor. Etter 3 dager med doxycyklinbehandling ble PRMT1-nivåene drastisk redusert. (B) Når PRMT1 slås ned, blir eksogen EWS asymmetrisk dimetylert av overekspressert villtype PRMT8, men ikke katalytisk mutant (E185Q) av PRMT8. Metylering reduseres med en høy konsentrasjon av PRMT type I-hemmer (MS023). HEK293T PRMT1KD-celler ble co-transfected med FLAGG-merket PRMT8 wild type eller katalytisk mutant og GFP-merket EWS og behandlet med MS023 i 20 h. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8. PRMT9 mobilanalyse. (A) Wild type, men ikke R508K mutant SAP145 er metylert av PRMT9. HEK293T-celler ble transfektert med GFP-merket SAP145 i 1 dag. (B) Prototypen PRMT9-hemmer (Compound X) reduserer PRMT9-avhengig R508 symmetrisk dimetylering av SAP145 på en doseavhengig måte. HEK293T celler ble behandlet med forbindelsen i 2 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| PRMT | Celler | Tetthet per ml |
| Prmt1 | MCF7 | 1 x 105 |
| PRMT3 | HEK293T | 2 x 105 |
| Prmt4 | HEK293T | 1 x 105 |
| Prmt5 | MCF7 | 1 x 105 |
| PRMT6 | HEK293T | 2 x 105 |
| PRMT7 | C2C12 | 1 x 105 |
| Prmt8 | HEK293T (PRMT1 KD)* | 2 x 105 |
| Prmt9 | HEK293T | 2 x 105 |
| *behandle celler med doksycyklin (2 μg/ml) 3 dager før plating for PRMT8-analyse | ||
Tabell 1. Celletyper og tettheter anbefales for PRMT-analyser.
| PRMT | μg DNA/24-brønn | Addgene # | Flere notater |
| PRMT3 | 0.5 FLAGG-PRMT3 | 164695 | |
| eller 0,5 FLAGG-PRMT3 (E338Q) | 164696 | ||
| PRMT6 | 0.5 FLAGG-PRMT6 | 164697 | |
| eller 0,5 FLAGG-PRMT6(V86K/D88A) | 164698 | ||
| Prmt8 | 0,05 EWS-GFP | 164701 | |
| 0,45 PRMT8-FLAGG | 164699 | ||
| eller 0,45 PRMT8(E185Q)-FLAGG | 164700 | ||
| Prmt9 | 0,05 SAP145-GFP | Na | gave fra Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope |
| eller 0,05 SAP145-R508K-GFP | |||
| 0,45 tom vektor |
Tabell 2. DNA-konsentrasjonen anbefales for transfeksjonseksperiment.
| PRMT | antistoff | Kjemisk sonde (celleaktivitet IC50) | Negativ kontroll |
| Prmt1 | H4R3me2a (1:2000) | MS023 -PRMT type I | MS094 |
| Rme1 (1:1000) | (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = henholdsvis 9, 56, 1000, 5000 nM) | ||
| Rme2s (1:2000) | |||
| Rme2a (1:2000) | |||
| Rme2a (ASYM24, 1:3000) | |||
| Rme2a (ASYM25, 1:2000) | |||
| H4 (1:2000) | |||
| B-aktin (1:500 ) | |||
| PRMT3 | H4 (1:2000) | SGC707 (IC50 = 91 nM) | XY-1 |
| H4R3me2a (1:2000) | |||
| FLAGG (1:5000) | |||
| Prmt4 | BAF155 (1:200) | TP-064 (IC50 = 43 nM) | TP064N |
| BAF155-R1064me2a (1:3000) | SKI-73 (IC50 = 540 nM)* | SKI-73N* | |
| Prmt5 | anti-SmBB' (1:100) | LLY-283 (IC50 = 30 nM) | LLY-284 |
| Rme2s (#13222, 1:2000) | GSK591 (IC50 = 56 nM) | SGC2096 | |
| PRMT6 | H4R3me2a (1:2000) | SGC6870 (IC50 = 0,9 μM) | SGC6870N |
| H4 (1:2000) | MS023 -PRMT type I | MS094 | |
| H3R2me2a ( 1:2000) | (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = henholdsvis 9, 56, 1000, 5000 nM) | ||
| H3R8me2a (1:2000) | MS049 (henholdsvis PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM) | MS049N | |
| H3 ( 1:5000) | |||
| FLAGG ( 1:5000) | |||
| PRMT7 | Rme1 (1:1000) | SGC3027 (IC50 = 1300 nM) * | SGC3027N* |
| Hsp/Hsc70 (1:2000)* | |||
| Prmt8 | GFP (13.3000) | MS023 (50 μM) | MS094 |
| Rme2a (ASYM25,1:2000) | |||
| FLAGG (1:5000) | |||
| Prmt9 | SAP145 (1:1000) | ||
| SAP145-R508me2s -kind gave fra Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013) | |||
| Sekundære antistoffer | geit-anti-kanin IgG-IR800 (1:5000) | ||
| esel anti-mus IgG-IR680 (1:5000) | |||
| *- antistoff gjenkjenner HSPA8, HSPA1 og HSPA6 (testet med overekspresserte GFP-merkede proteiner), *prodrug – IC50 kan variere mellom ulike cellelinjer | |||
Tabell 3. Anbefalte antistoffer og PRMT kjemiske sonde / negativ kontrollverktøyforbindelser.
| PRMT | Biomarkør | Avlesning av analyse | Analysevalidering | Anbefalt cellelinje | Ref. | ||||||||
| Prmt1 | H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a | H4R3me2a nivåer normalisert til totalt H4 global Rme1, Rme2a eller Rme2s nivåer normalisert til B-aktin. | Knockdown av PRMT1 reduserte basale H4R3me2a og globale Rme2a nivåer og økte globale Rme1 og Rme2s nivåer i celler (Fig.1A, B). PRMT Type I kjemisk sonde MS023 reduserte nivåene av H4R3me2a på en doseavhengig måte (fig. 1D). | Cellene varierer i basale H4R3me2a-nivåer (fig. 1C). MCF7-celler har høye basale H4R3me2a-nivåer, noe som gjør det å foretrekke for analyser som overvåker nedgangen i PRMT1-aktiviteten. | 8 | ||||||||
| PRMT3 | H4R3me2a | H4R3me2a metyleringsnivåer forårsaket av eksogent FLAGG-merket PRMT3 WT eller katalytisk E338Q mutant (bakgrunn) normalisert til total histone H4 | Overekspressering av villtype PRMT3, men ikke det katalytiske mutanten (E338Q) økte H4R3me2a (fig. 2A). PRMT3 selektiv hemmer SGC707 redusert PRMT3 avhengig økning i H4R3me2a nivåer (Fig. 2B) | HEK293T-celler har lave basale H4R3me2a-nivåer (fig. 1C), som er å foretrekke for overvåking av eksogen PRMT3-aktivitet | 7 | ||||||||
| Prmt4 | BAF155-R1064me2a | BAF155-R1064me2a-nivåer normalisert til totalt BAF155 | PRMT4-nedslag redusert asymmetrisk dimetylering av BAF155 (fig. 3A). 2 dagers behandling med PRMT4 selektiv kjemisk sonde (TP-064) redusert asymmetrisk dimetylering av BAF155 (fig. 3B). | Hvilken som helst cellelinje | 10 | ||||||||
| Prmt5 | SmBB'-Rme2s | SmBB'-Rme2s nivåer påvist med pan Rme2s antistoffer (CST) normalisert til total SmBB' | Nedslag av PRMT5 resulterte i reduserte SmBB's symmetriske dimetyleringsnivåer (fig. 4A). 2 dagers behandling med PRMT5 selektive kjemiske sonder, GSK591 og LLY285, reduserte SmBB'-Rme2s nivåer (fig. 4B). | Hvilken som helst cellelinje | 11 | ||||||||
| PRMT6 | H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a |
H4R3me2a, H3R2me2a eller H3R8me2a metyleringsnivåer økes av eksogene FLAGG-merkede PRMT6 WT, men ikke katalytiske V86K,D88A mutant (bakgrunn) normalisert til henholdsvis histone H4 eller H3 | Overekspressering av villtype PRMT6, men ikke det katalytiske mutanten (V86K, D88A) økte H3R2me2a-, H3R8me2a- og H4R3me2a-nivåene (fig. 5A). Allosterisk PRMT6-hemmer (SGC6870), PRMT type I-hemmer MS023 , PRMT4/6-hemmer MS049 redusert PRMT6-avhengig økning i H3R2me2a-nivåer (fig. 5B). | HEK293T celler har lave basale H4R3me2a, H3R2me2a og H3R8me2a nivåer, som er å foretrekke for overvåking eksogen PRMT6 aktivitet | 8,9 | ||||||||
| PRMT7 | HSP70-R469me1 | HSP70-Rme1 metyleringsnivåer normalisert til total HSP70 | PRMT7 knockout eller knockdown redusert HSP70 monometylering (fig. 6A). 2 dagers behandling med PRMT7 selektiv kjemisk sonde SGC3027 redusert PRMT7-avhengig HSP70 monometylering på en doseavhengig måte (fig. 6B). | C2C12, HT180 Flere kreftcellelinjer uttrykker en inducible form for HSP70 hvis metyleringssignal overlapper med et uspesifisert protein av kjernefysisk opprinnelse (fig. 6C). I dette tilfellet anbefaler vi å analysere HSP70 metyleringsnivåer i den cytoplasmatiske fraksjonen. |
12 | ||||||||
| Prmt8 | EWS-Rme2a | Eksogene GFP-merkede EWS-metyleringsnivåer forårsaket av eksogent FLAGG-merket PRMT8 WT eller E185Q katalytisk mutant (bakgrunn), normalisert til totalt GFP-signal i PRMT1 KO-celler. | Overekspressering av villtype PRMT8, men ikke katalytisk E185Q mutant metylert ektopisk EWS bare i PRMT1 KD-celler (fig. 7A). PRMT type I kjemisk sonde MS023 hemmet asymmetrisk dimetylering av eksogen EWS av PRMT8 (fig. 8B). | HEK293T PRMT1 KD (inducible). PRMT1 knockdown resulterer i celledød derfor anbefaler vi å bruke et inducible system. |
8 | ||||||||
| Prmt9 | SAP145-R508me2s | PRMT9-avhengig SAP145 symmetrisk dimetylering ved R508 normalisert til SAP145 | Tapet PRMT9, men ikke PRMT5 fører til redusert symmetrisk dimetylering av SAP145. GFP-merket SAP145 WT, men ikke SAP145mut (R508K) ble metylert av PRMT9 (fig. 8A). 2-dagers behandling med Copound X, prototypen PRMT9-hemmer, reduserte SAP145-R508me2s nivåer på en doseavhengig måte Fig 8B). | Hvilken som helst cellelinje | 21 | ||||||||
Tabell 4. PRMT-analysesammendrag.
Discussion
Her beskrives de detaljerte cellulære analyseprotokollene for medlemmer av PRMT-familien som bruker fluorescerende vestlige blottingsmetoder. Unike substrater som endringene i argininmetylering lett kan oppdages ved individuelt PRMT-tap eller katalytisk hemming og ikke kan kompenseres av andre familiemedlemmer ble valgt. Noen proteiner metyleres av flere PRMTer21,23, noe som tyder på en overlapping i substratspesifikkitet der noen PRMT-er bare bidrar med en liten mengde cellulært merke i et gitt proteinsubstrat24,25,26,27, for eksempel bidrar både PRMT8 og PRMT1 til metylering av EWS. Derfor krevde hver analyse grundig validering av substrater og antistoffer med knockdown og / eller overekspressjonsforsøk og ytterligere validering med godt karakteriserte selektive hemmere. PRMT-spesifikke substrater ble identifisert for hvilke metyleringsmerkeendringer som kunne oppdages innen 2-3 dager etter PRMT-tap / hemming for å unngå sammensatte effekter av redusert celle levedyktighet og spredning som indirekte kan påvirke metyl-argininmerkenivåene. Selv om det var mulig å finne unike substrater for PRMT1, 4, 5, 7 og 9; for PRMT3, 6 og 8 måtte funksjonsgevinsten benyttes. Flere argininmetylspesifikke antistoffer ble testet for ulike cellulære mål, men ingen var i stand til å oppdage betydelige endringer innen 3 dager etter PRMT3 og PRMT6 knockdown; Derfor ble biomarkøranalyser utviklet ved hjelp av ektopisk uttrykte enzymer sammen med katalytisk inaktive mutanter, som fungerte som en kontroll for baseline substratmetylering. PRMT8 er en nær PRMT1 homolog og deler lignende substratpreferanser. Som en PRMT8 selektiv biomarkør ikke kunne identifiseres, ble en analyse i PRMT1 knockdown celler utviklet, hvor PRMT8 ble co-uttrykt sammen med EWS. PRMT1 er også et stort enzym ansvarlig for H4R3 asymmetrisk metylering, derfor, for å bruke H4R3me2a som biomarkør for PRMT3 og PRMT6 cellulære analyser, celler med lav basal H4R3me2a nivåer ble valgt samt katalytisk inaktive mutanter ble brukt som bakgrunnskontroll. Selv om endogene analyser foretrekkes, viser eksogene analyser seg uvurderlige for å teste cellulær styrke av flere selektive PRMT-hemmere7,8,9. Med økende kunnskap om PRMT-biologi forventer vi å forbedre analysene ved å finne mer spesifikke biomarkørproteiner for PRMT3, PRMT6 og PRMT8.
Bruk av validerte antistoffer og passende kontroller er avgjørende for PRMT-analysens ytelse. Alle antistoffer som anbefales her har blitt grundig validert av knockdown og overekspression eksperimenter, men batch-til-batch forskjeller, spesielt i tilfelle av polyklonale antistoffer, kan fortsatt påvirke deres ytelse. Derfor er det avgjørende å bruke genetiske metoder og kjemiske sonder sammen med deres nært beslektede negative kontroller for å bekrefte analysens pålitelighet. I tillegg, for PRMT-analyser som krever proteinovertrykk, er det avgjørende å bruke katalytisk inaktive mutanter sammen med villprotein for å bestemme basal metyleringsnivåene.
Denne samlingen av kvantitative analyser for profilering av PRMTs aktivitet i celler kan være bredt nyttig for det vitenskapelige samfunnet siden det raskt og enkelt kan implementeres med minimalt utstyr og begrenset teknisk ekspertise, som bare involverer grunnleggende cellekultur og fluorescerende vestlige blottingsteknikker. De anbefalte antistoffene og kjemiske sondene for PRMT-er kan også brukes til aktivitetsbaserte proteinprofileringsanalyser (ABPP) for å fastslå egnetheten til en gitt ABPP-sonde, overvåke målengasjement og vurdere off-target effekter ved å bruke det konkurransedyktige ABPP-formatet. Analyseutviklingsmetodene som diskuteres her, kan også ekstrapoleres for andre enzymfamilier som proteinlyse-metyltransferaser og acetylktransferaser.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre motstridende interesser å erklære.
Acknowledgments
Structural Genomics Consortium er en registrert veldedighetsorganisasjon (nei: 1097737) som mottar midler fra AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada gjennom Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU og EFPIA gjennom Innovative Medicines Initiative 2 Joint Foretak [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (også kjent som EMD i Canada og USA), Pfizer, Takeda og Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
| 24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
| Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
| anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
| anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
| anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
| anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
| anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
| anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
| anti-GFP | Clontech | 632381 | |
| anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
| anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
| anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
| anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
| anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
| anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
| anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
| anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
| anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
| anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
| anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
| anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
| anti-Rme1 | CST | 8015 | |
| anti-Rme2a | CST | 13522 | |
| anti-Rme2s | CST | 13222 | |
| anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
| anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
| anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
| anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
| benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
| BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
| C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
| donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
| doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
| EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| FBS | Wisent | 80150 | |
| glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
| goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
| HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
| Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
| Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
| MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
| Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
| PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
| PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
| penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
| SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
| skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
| Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
| Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
| Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
| trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |
References
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine Methylation: The Coming of Age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bedford, M. T., Richard, S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S.
- Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Science Reports. 3, 1311 (2013).
- Kaniskan, H. U., et al. A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3). Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).
- Eram, M. S., et al. A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).
- Shen, Y., et al. Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).
- Nakayama, K., et al. TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma. Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).
- Bonday, Z. Q., et al. LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).
- Szewczyk, M. M., et al. Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response. Nature Communications. 11 (1), 2396 (2020).
- Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).
- Siarheyeva, A., et al. An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3. Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).
- Stefansson, O. A., Esteller, M. CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer. Breast Cancer Research. 16 (3), 307 (2014).
- Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).
- Guccione, E., et al. Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive. Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).
- Yudao Shen,, L, F., et al. A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6). BioRxiv. , 1-21 (2020).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state. Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).
- Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family. Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).
- Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8. International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).
- Yang, Y., et al. PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145. Nature Communications. 6, 6428 (2015).
- Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates. Methods. 1175, 53-65 (2020).
- Musiani, D., et al. Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity. Science Signaling. 12 (575), (2019).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Shishkova, E., et al. Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition. Nature Communications. 8, 15571 (2017).
- Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly. Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).
